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Le dépistage prénatal de la trisomie 21 a beaucoup évolué ces dernières années avec l’arrivée des tests de dépistage prénatal non invasif par analyse de l’ADN libre circulant dans le sang maternel. Si l’intérêt de ces tests pour le dépistage des trisomies communes, impliquant les chromosomes 13, 18 et 21, n’est plus à remettre en question aujourd’hui, l’évolution de l’étendue des anomalies détectables ainsi que les contraintes liées à l’origine de l’ADN analysé requièrent deux exigences : une bonne connaissance des limites du test pour en éviter les écueils ; un travail collégial en amont pour encadrer au mieux les pratiques, dans l’intérêt des femmes enceintes. Prenatal screening for trisomy 21 has considerably evolved in recent years thanks to the advent of non-invasive prenatal screening tests based on cell free DNA analysis. Today, the interest of these tests for the screening of common trisomies, involving chromosomes 13, 18 and 21, is no longer to be questioned. However, the technical and analytical developments allowing for the detection of additional chromosomal aberrations along with the constraints due to the origin of the analyzed DNA require, first, a good knowledge of the limits of the test in order to avoid its pitfalls, and second, collective discussions to elaborate best practice recommendations in the interest of pregnant women.

Since the new recommendations of the « Groupe Génétique et Cancer » (GGC) to perform a panel of 13 genes (including BRCA1, BRCA2 and TP53), for the diagnosis of breast and ovarian cancers predispositions, deleterious variants of low variant allele fraction (VAF) are regularly detected. It raises the question of the differential diagnoses of mosaic neomutation, clonal hematopoiesis (CH), and circulating tumor DNA (ctDNA). To answer this question, a search of patients with low VAF variants was performed on 2007 index cases analyzed by high throughput sequencing. The presence of these variants was verified by Sanger sequencing and/or SNaPshot on different available tissues such as blood, oral smear and tumor. Among the 20 patients with potentially pathogenic low VAF variants, it was possible to document a case of BRCA1 mosaic, to detect ctDNA in a patient carrying a TP53 and a PTEN variant with a VAF close to 30%, and 9 cases of CH. For the other patients, the preferred hypothesis was CH subject to accessibility to different tissues. More women were diagnosed with ovarian cancer in carriers of low VAF TP53 variants (11/18) relative to the control group (310/1388) (p < 0 .001) and they were older (67.6 vs 55.7 years, p < 0.001). This study highlights the complexity of interpreting these variants. Mosaic remains a rare event that should be explored before testing the offspring in order to avoid traumatic diagnostic errors that would result from the presence of HC or ctDNA, particularly in the cases of TP53 variants.; Depuis que le Groupe Génétique et Cancer (GGC) recommande d’effectuer le diagnostic des prédispositions aux cancers du sein et de l’ovaire par l'étude de 13 gènes par séquençage à haut débit (notamment BRCA1, BRCA2 et TP53), des variants ayant un ratio allélique (ou VAF pour "variant allele fraction") faible sont détectés régulièrement posant la question du diagnostic différentiel de néomutation en mosaïque, d'hématopoïèse clonale (HC) et d'ADN tumoral circulant (ADNtc). Pour y répondre, une recherche des patients porteurs de variants de VAF faibles a été effectuée sur 2007 cas index. La présence de ces variants a été vérifiée par Sanger et/ou SNaPshot sur différents tissus disponibles tels que le sang, les cellules jugales et la tumeur. Parmi 20 patients porteurs d’un variant potentiellement pathogène présentant une VAF faible, ont été prouvés un cas de mosaïque de BRCA1, la présence d'ADNtc chez une patiente porteuse d’un variant de TP53 et de PTEN avec une VAF proche de 30 %, et 9 cas d’HC. Pour les autres patients, l’hypothèse était l’HC sous réserve de l'accessibilité à des tissus différents. Plus de femmes étaient atteintes d'un cancer de l’ovaire chez les porteuses de variants de TP53 de faible VAF (11/18) par rapport au groupe contrôle (310/1388) (p < 0,001) et elles étaient plus âgées (67,6 vs 55,7 ans ; p < 0,001). Cette étude met en évidence la complexité d’interpréter ces variants. Les états de mosaïque restent des événements rares qu'il faut démontrer par des analyses complémentaires avant de tester les descendants pour éviter les erreurs diagnostiques traumatisantes qu'induiraient la présence d'une HC ou d'ADNtc notamment en cas de variant de TP53.

Mosaicism in domestic carnivores. Mosaicism is a common genetic phenomenon that occurs in many pluricellular organisms and more particularly in female mammals. They are mosaics because of the X-chromosome inactivation. In domestic cats, this epigenetic phenomenon can moreover be seen at first glance on some individuals : tortie and calico cats. In fact, some males are very rarely seen with such a coat color, but they are most of the time sterile because of a chromosomic anomaly. Moreover, in dogs and cats, sex chromosome mosaicism, often described, may induce disorders of sexual development leading to sterility. Genetic tests could be a useful tool for clinicians in order to identify and distinguish mosaicism or chimerism., Le mosaïcisme est un phénomène génétique retrouvé dans l’ensemble du monde vivant et notamment chez toutes les femelles de mammifères, qui sont des mosaïques du fait du phénomène d’inactivation aléatoire du chromosome X. Chez le chat, ce phénomène épigénétique a la particularité de pouvoir être directement visible sur la robe de certains individus : les chats à robe écaille de tortue et tricolore. Les rares mâles portant ces robes sont le plus souvent stériles du fait d’une anomalie chromosomique. Chez le chien, comme chez le chat, un mosaïcisme fréquemment décrit concerne les chromosomes sexuels et peut être la cause de troubles du développement de l’appareil génital entraînant le plus souvent une stérilité. Les tests génétiques sont un nouvel outil à envisager par le praticien face à des hypothèses de mosaïcisme, voire de chimérisme., Jaraud-Darnault Ambre, Abitbol Marie. Le mosaïcisme chez les carnivores domestiques. In: Bulletin de l'Académie Vétérinaire de France tome 170 n°1, 2017. pp. 70-76.

The rapid development of high-throughput sequencing technologies pushed forward the fields of medical genomics and precision medicine, creating many new applications for diagnostics and clinical studies that require high quality data and highly accurate analysis methods. Distinguishing errors from real variants in Next Generation Sequencing data is a challenge when systematic errors, random sequencing errors, germline variants or somatic variants at very low allele frequency are present in the same data. In the first part of this thesis, we developed a genotype callability filter (ABB) able to identify systematic variant calling errors that were not found by state-of-the art methods. This tool cleans false positive calls from somatic and germline variant callsets, as well as detects false gene-disease associations in case-control studies. Secondly, we developed a set of novel methods able to distinguish and correct sequencing and PCR errors with the use of molecular barcodes, permitting us to build error rate models for the detection of somatic mutations at extremely low allele frequencies in liquid biopsies. As final part of this thesis, we characterized mosaic mutations in a multi-tissue, multi-individual study using a cohort of thousands of samples from hundreds of healthy individuals. El ràpid desenvolupament de les tecnologies de seqüenciació d’alt rendiment ha impulsat els camps de la genòmica mèdica i la medicina d’alta precisió, creant una gran varietat de noves aplicacions, les quals requereixen dades d’una qualitat excel·lent i mètodes d’anàlisi altament precisos. La distinció entre errors i variants reals en dades de seqüenciació de propera generació (NGS) és un repte quan hi ha errors sistemàtics o aleatoris mesclats amb variants germinals o somàtiques a freqüències al·lèliques molt baixes. En la primera part d'aquesta tesi, hem desenvolupat un filtre per al genotipatge de variants (ABB) capaç d'identificar errors sistemàtics durant el procés de detecció de variants que altres mètodes convencionals no poden trobar. Aquesta eina filtra falsos positius del conjunt de variants finals en estudis de variacions somàtiques i germinals, així com també detecta falses associacions de malalties gèniques en estudis de casos-controls. En segon lloc, hem desenvolupat un conjunt de nous mètodes capaços de distingir i corregir els errors de seqüenciació i PCR amb l’ús d’identificadors moleculars. Aquests ens permeten modelar les taxes d’error i conseqüentment detectar mutacions somàtiques a freqüències al·lèliques extremadament baixes en l’anàlisi de biòpsies líquides. Per finalitzar aquesta tesi, hem caracteritzat les mutacions mosaiques en un estudi multi-teixit multi-individu utilitzant una cohort de centenars d'individus sans amb milers de mostres.

Neurodevelopmental disorders are a group of conditions with impairments of the personal, social, academic or occupational behaviour. Autism spectrum disorder is a neurodevelopmental disorder with a high genetic component with a large fraction still unknown. In this dissertation we analyse two unexplored genomic variants: Chromosomal mosaicism and Ancestral polymorphic inversions. Chromosomal mosaic events are responsible for a small but significant proportion of patients with ASD (0.45%), with the additional detection of two loss of chromosome Y events. In addition, we developed a bioinformatic tool that improves previous methods to detect loss of chromosome Y: MADloy. In the study of ancestral polymorphic inversions, inv8p23.1 and inv17q21.31 inversions were associated with autism risk. Improvements on the method to genotype ancestral polymorphic inversions allowed the prediction of a novel inversion in 22q11.21 region which has been validated by fiber-FISH. Els trastorns del neurodesenvolupament son un grup de condicions amb discapacitats conductuals en els àmbits personals, socials, acadèmics o ocupacionals. Els trastorns d’espectre autista són un trastorn del neurodesenvolupament amb una gran component genètica, part de la qual encara es desconeguda. En aquest treball analitzem dues variants genòmiques poc explorades: els reordenaments cromosòmics en mosaic I les inversions ancestrals polimòrfiques. Els reordenaments cromosòmics en Mosaic son responsables d’una significant però petita proporció dels pacients amb trastorn d’espectre autista (0.45%), amb la detecció addicional de dues pèrdues del cromosoma Y. Addicionalment, s’ha desenvolupat una eina bioinformàtica que millora els mètodes previs per detectar la pèrdua de cromosoma Y: MADloy. En l’estudi de les inversions ancestrals polimòrfiques, les inversions inv8p23.1 i inv17q21.31 s’han associat amb el risc d’autisme. Millores en el mètode de genotipació de les inversions ha permès la predicció de una nova inversió localitzada a la regió 22q11.21 que s’ha validat per fiber-FISH.

Cryopyrin-associated periodic syndrome are three clinical forms of a rare autoinflammatory disorder from familial cold urticaria, the mild form, to the most severe form called chronic infantile neurological cutaneous and articular syndrome (CINCA), throught Muckle-Wells syndrome (MWS), the intermediate phenotype. Sensorineural hearing loss and renal amyloidosis can occur during the evolution. CAPS are due to gain-of-function mutations of NLRP3 gene, predominantly germline mutations. This results in an excessive activation of NLRP3 inflammasome and interleukin 1β processing leading to biological and clinical manifestations. These germline mutations are detectable with Sanger sequencing method. Sometimes, classically severe phenotypes of MWS and CINCA remain germline-mutation-negative patients. However, genetic diagnosis is crucial to access to interleukin 1 inhibitors that drastically improved quality of life of patients, and for genetic counselling. A finer analysis of Sanger sequence trace could suggest mosaicism, two or more populations of cells with distinct genotypes. Next-generation sequencing are recent technological advances that have provided us to assess mosaicism. In the literature, this genetic mechanism is involved in some CAPS and others auto-inflammatory diseases (MAI) physiopathology. Here, we present a CAPS review, mosaicism case reports of CAPS and MAI described in the literature and a description of french CAPS with mosaicism.; Les cryopyrinopathies (CAPS) regroupent trois entités, continuum phénotypique depuis la forme bénigne d’urticaire familiale au froid jusqu’au syndrome Chronique Infantile, Neurologique, Cutané et Articulaire (CINCA) en passant par le phénotype intermédiaire de syndrome de Muckle-Wells (MWS). Deux complications grèvent l’évolution : la surdité et l’amylose AA, notamment rénale. Sur le plan physiopathologique, les CAPS sont la conséquence de mutations « gain de fonction », majoritairement germinales, du gène NLRP3, impliquant une activation constitutive de l’inflammasome NLRP3. Il en résulte une hyperproduction de cytokines pro-inflammatoires, notamment les interleukines 1β et 18, responsables des manifestations clinico-biologiques des CAPS. Ces mutations germinales sont détectables en séquençage conventionnel de Sanger. Parfois, de telles mutations sont absentes, notamment dans les phénotypes sévères de MWS et CINCA. Or, établir le diagnostic génétique de CAPS est primordial, notamment pour l’accès en AMM aux anti-interleukine 1, pierre angulaire du traitement, et pour le conseil génétique. L’analyse fine des tracés issus du séquençage de Sanger pouvait suggérer l’existence de mosaïcisme, présence de plusieurs clones cellulaires chez un même individu avec allèles sauvage et muté. Grâce aux techniques de séquençage nouvelles générations, il est désormais possible d’identifier ces mosaïcismes. Dans la littérature, ce mécanisme génétique est impliqué dans la physiopathologie des CAPS et d’autres maladies auto-inflammatoires (MAI). Nous proposons ici une revue de la littérature des CAPS, des CAPS et MAI par mosaïcisme, et rapportons les CAPS français par mosaïcisme.

National audience; Introduction L’hypomélanose d’Ito est définie par l’association d’une hypopigmentation qui suit les lignes de Blaschko et de manifestations principalement neurologiques. Les autres atteintes associées sont variables. Elle peut être associée à diverses anomalies chromosomiques en mosaïque ou à des mutations MTOR lorsqu’elle s’associe à une hémimégalencéphalie. Nous rapportons un nouveau syndrome clinique avec hypomélanose d’Ito et atteinte neuroectodermique en lien avec des mutations postzygotiques de RHOA . Matériel et méthodes Dans le cadre de la cohorte Mosaic Unknown Skin Traits And Related Disorders (MUSTARD), nous avons étudié 5 patients par séquençage haut débit de l’exome complet ou ciblé, sur peau atteinte et dans le sang. Observations Les 5 patients, non apparentés, présentaient tous une hypopigmentation ou une hypotrichose linéaire, associée à une atteinte faciale bilatérale ou unilatérale (hypoplasie malaire, élargissement de la pyramide nasale), malformations dentaires avec dysplasie de l’émail, doigts et orteils courts, atteinte oculaire avec choroïdose myopique. L’IRM réalisée chez 3 patients a montré une leucoencéphalopathie asymptomatique avec hypersignal de la substance blanche et dilatation des espaces de Virchow. Résultats Chez les deux premiers patients, le séquençage de l’exome en profondeur (144X à 228X) sur peau atteinte a identifié une même mutation en mosaïque p.Glu47Lys du gène RHOA , confirmée par séquençage ciblé (taux allélique : 33,5 % et 23,1 %), absente du sang. Cette mutation a également été identifiée par séquençage ciblé chez deux des autres patients ayant un phénotype similaire. Le cinquième patient était porteur d’une autre mutation postzygotique de RHOA , Pro71Ser, identifiée par séquençage de l’exome. La transfection de plasmides porteurs de ces mutations de RHOA dans des cellules NIH 3T3 en culture a montré une diminution de l’étalement cellulaire, de la formation de fibre de stress, et de la phosphorylation des effecteurs de RhoA , MYPT1 et MLC2, suggérant un effet dominant-négatif de ces mutations. Discussion Nous avons identifié une affection neuroectodermique jamais décrite à notre connaissance, causée par des mutations en mosaïque de RHOA , qui code la protéine RhoA , une petite GTPase de la superfamille Ras, impliquée dans le chimiotactisme, le guidage axonal, et le contrôle du cycle cellulaire. En plus des anomalies fonctionnelles mises en évidence, la forte conservation de la séquence de RHOA au cours de l’évolution est en faveur du caractère pathogène des mutations identifiées. Conclusion Cette dysplasie ectodermique en mosaïque liée à RHOA s’ajoute aux syndromes causés par des mutations létales, pour lesquelles la survie embryonnaire n’est possible que par mosaïcisme. Il s’agit d’une de premières caractérisations moléculaires d’un mosaïcisme pigmentaire, qui souligne l’importance de RHOA dans le développement cutané.

Le développement sexuel est un processus complexe qui dépend de nombreux gènes, une mutation pouvant entraîner un développement sexuel anormal. Par ailleurs, des anomalies chromosomiques peuvent avoir des répercussions importantes sur la détermination gonadique, surtout lorsqu'il s'agit du chromosome Y puisqu'il porte le gène clé du développement sexuel masculin. Premièrement, nous avons identifié par cytogénétique moléculaire le point de cassure chez 5 patients avec une translocation X;Y et 10 patients avec un chromosome Y isodicentrique. Nous avons ainsi démontré que certaines régions sont plus à risque d'être remaniées, notamment lorsqu'elles contiennent des palindromes ou d'autres séquences répétées. Nous avons également établi une relation entre la distance séparant le centromère et le point de cassure et l'instabilité des chromosomes Y isodicentriques lors des divisions cellulaires. Deuxièmement, nous avons étudié en cytogénétique les gonades de 22 patients avec un chromosome Y normal ou remanié et présentant un développement sexuel anormal. Nous avons mis en évidence la perte du chromosome Y remanié dans une majorité de cellules gonadiques des 10 patients étudiés, expliquant leur phénotype sexuel anormal. Cependant, chez 11 des 12 patients avec un chromosome Y normal, aucun mosaïcisme expliquant clairement leur détermination gonadique anormale n'a été retrouvé. Finalement, nous avons analysé par immunohistochimie les gonades dysgénésiques de 30 patients avec une anomalie du développement sexuel et un chromosome Y normal ou remanié. Nos travaux ont montré la présence de cellules germinales immatures au sein de cordons sexuels primitifs sous forme de tissu gonadique indifférencié dans 15 gonades, dont 9 ont évolué en tumeur gonadique. Dans 13 autres gonades, ces cellules germinales immatures avaient disparues par apoptose. Dans l'ensemble, notre recherche met en évidence la susceptibilité du chromosome Y à subir des remaniements et à être instable lors des divisions cellulaires, et indique que le mosaïcisme peut avoir des répercussions sur la détermination gonadique. Nos travaux montrent également que le tissu gonadique indifférencié peut évoluer vers deux entités, une tumeur gonadique ou une bandelette suite à l'apoptose des cellules germinales, mettant en lumière la nécessité d'analyser le tissu gonadique des patients XY avec dysgénésie gonadique dont les gonades sont laissées en place., Sexual development is a complex process which depends on numerous genes, mutations possibly resulting in an abnormal sexual development. Furthermore, chromosome abnormalities can have important repercussions on gonadal determination, especially when it comes to the Y chromosome since it carries the master gene of male sexual development. First, we identified by molecular cytogenetics the breakpoint in 5 patients with an X;Y translocation and 10 patients with an isodicentric Y chromosome. We were thus able to show that some regions are more at risk of being rearranged, especially when they contain palindromes or other repeated sequences. We were also able to establish a relationship between the distance separating the centromere from the breakpoint and instability of isodicentric Y chromosomes during cell divisions. Second, we studied by cytogenetics the gonads of patients with a normal or rearranged Y chromosome and presenting an abnormal sexual development. We demonstrated loss of the rearranged Y chromosome in a majority of gonadal cells of the 10 analyzed patients, explaining their abnormal sexual phenotype. On the other hand, in 11 of the 12 patients with a normal Y chromosome, no mosaicism clearly explaining their abnormal gonadal determination was found. Finally, we also analyzed by immunohistochemistry the dysgenetic gonads of 30 patients with an abnormal sexual developement and a normal or rearranged Y chromosome. We showed the presence of immature germ cells in primitive sex cords as undifferentiated gonadal tissue in 15 gonads, including 9 that evolved in a gonadal tumor. In 13 other gonads, these immature germ cells had disappeared through apoptosis. Altogether, our research demonstrates that the Y chromosome is susceptible to rearrangements and can be unstable through cell divisions, and that mosaicism may have repercussions on gonadal determination. Our work also shows that undifferentiated gonadal tissue can evolve in two entities, a gonadal tumor or a streak following apoptosis of germ cells, thus emphasizing the necessity of studying the gonads of XY patients with gonadal dysgenesis when gonads are left in place.

Lors de la réalisation d'un caryotype, la présence d'un fragment chromosomique surnuméraire dont on ne sait pas déterminer l'origine est parfois mise en évidence. Il s'agit d'un Marqueur Chromosomique Surnuméraire (MCS). Ces chromosomes additionnels de structure indéterminée font l'objet d'études approfondies car ils peuvent être associés à des phénotypes anormaux. La difficulté réside en l'identification et la caractérisation de ce MCS afin d'établir une corrélation génotype-phénotype. L'étude présentée dans ce travail, réalisée sur 10 patients présentant un retard mental et porteurs d'un MCS révélé sur leur caryotype mais non identifié en FISH, a eu pour objectif d'évaluer l'utilité de la CGH-array dans l'identification et la caractérisation des MCS. Cette technique a permis de caractériser précisément le MCS dans 8 cas sur 10. Ces 8 MCS étaient constitués d'euchromatine, et avec l'aide de la littérature, une corrélation génotypephénotype a pu être établie. En revanche, lorsque le MCS est en mosaïque faible (cas 1 et 4), il peut échapper à la détection en CGH-array. Des techniques alternatives doivent alors être utilisées.

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