O uso de biomassas lignocelulósicas para a produção de etanol de segunda geração é o foco de estudo de diversas pesquisas na área de Biotecnologia. Um dos gargalos para a vasta utilização desta tecnologia se encontra na dificuldade de desenvolver coquetéis enzimáticos que sejam economicamente viáveis e eficientes. Dois gêneros de fungos filamentosos são relatados na literatura como grandes produtores de enzimas do complexo celulolítico e hemicelulolítico: Penicillium e Trichoderma. Com o intuito de reduzir o volume de resíduos gerados durante o cultivo de microrganismos e o tempo de produção de enzimas em cultivo em estado sólido, bem como aumentar a atividade enzimática, foi proposta uma estratégia de reuso do substrato utilizado e de micélio fúngico. O sistema de reuso de micélio e substrato em cultivo em estado sólido consiste na utilização de um único inóculo de cada microrganismo e posterior reutilização do substrato e de seu micélio para conduzir um cultivo de maior duração de tempo e produção enzimática, fazendo uso de ciclos de extrações enzimáticas e reposição de nutrientes realizadas em um biorreator do tipo seringa. O meio de cultivo testado foi constituído de eucalipto pré-tratado por explosão a vapor, farelo de arroz, farelo de soja e solução mineral. Inicialmente foi realizada a análise de crescimento e produção enzimática dos fungos P. echinulatum e T. reesei ao longo de oito dias de cultivo para definir o dia de início das extrações enzimáticas. Após, foram testadas diferentes formulações para reposição de nutrientes durante os ciclos: adição de solução de sais; mistura do meio de produção; e uma combinação da solução de sais e mistura do meio de produção. Definida a melhor condição de suplementação, diferentes materiais foram utilizados visando a redução da compactação do meio de cultivo e promovendo uma melhor aeração do sistema: espuma de poliuretano, bagaço de cana-de-açúcar e casca de arroz. A partir da cinética de produção enzimática, definiu-se que as extrações enzimáticas e reposição de nutrientes devem ser realizadas nos dias 4, 7, 10 e 13 para o cultivo de P. echinulatum, e para o cultivo de T. reesei nos dias 3, 5, 6 e 7. As condições mais promissoras de suplementação e suporte foram, respectivamente, a reposição de solução mineral de sais e utilização de casca de arroz. Nessas condições, as atividades sobre papel filtro foram cinco e duas vezes superiores à produção convencional das enzimas, respectivamente pelo cultivo de P. echinulatum e T. reesei. Além disso, atividade de xilanase de 1303 U.g-1 foi registrada por P. echinulatum ao final dos ciclos de extração e reposição de nutrientes. Esse sistema se mostrou uma promissora estratégia para redução de custos, tempo de processo e resíduos, além de possibilitar aumentos significativos na produção enzimática em cultivo em estado sólido de P. echinulatum e T. reesei. [resumo fornecido pelo autor] Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES The usage of lignocellulosic biomass for second-generation ethanol production is the target of many studies in Biotechnology. One of the bottlenecks to the wide application of this technology lays on the difficulty of developing economically viable and efficient enzymatic cocktails. Two genres of filamentous fungi are related on literature as great producers of the cellulolytic and hemicellulolytic complex: Penicillium and Trichoderma. With the goal of reducing debris generated during the microorganism cultivation and time of enzyme production on solid state cultivation, as well as increasing enzymatic activities, a strategy of reusing substrate and fungal mycelium was proposed. The system of mycelium and substrate reuse in solid state cultivation consists of the utilization of one microorganism inoculum for each fungus, and subsequent utilization of substrate and its mycelium for the enzyme production. Therefore, only one inoculum of the microorganisms and raw material usage was made to proportionate a longer cultivation and enzymatic production. The cultivations were conducted in cycles of enzymatic extraction with nutrient reposition in a syringe-type bioreactor. The tested cultivation medium included eucalyptus pretreated by steam explosion, rice bran, soy bran and mineral solution. Initially, a growth and enzymatic production analysis of P. echinulatum and T. reesei was carried out through eight cultivation days in order to define the initial enzymatic extraction day. After that, different formulations of nutrient reposition were tested: addition of mineral solution, addition of a mixture of cultivation medium, and addition of the mixture and mineral solution. Having defined the best condition of supplementation, different materials were used aiming the reduction of the culture medium compaction and promoting a better system aeration: polyurethane sponge, sugar cane bagasse and rice husk. Considering the enzymatic production kinetics, it was defined that the enzymatic extractions and nutrient reposition must be done in days 4, 7, 10 and 13 for P. echinulatum and 3, 5, 6 and 7 for T. reesei. The most promising supplementation and support were, respectively, the reposition of mineral solution and rice husk. In these conditions, enzymatic activities of FPA were five and two times bigger than the conventional production of these enzymes, respectively for P. echinulatum and T. reesei. Furthermore, xylanase titers of 1303 U.g-1 were registered by P. echinulatum at the end of the four extraction and reposition cycles. It has proved to be a promising strategy to reduce the cost, process time and debris, increasing significatively the enzymatic production of P. echinulatum and T. reesei. [resumo fornecido pelo autor]