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ilustraciones, gráficas, tablas El proceso de implantación placentaria depende de una minuciosa regulación de la invasión de la decidua materna por parte del subtipo celular denominado trofoblasto extravelloso, la evasión del sistema inmune de la madre y la remodelación de la vasculatura local. Estos y otros procesos hacen que la implantación placentaria sea notablemente similar a la invasión tumoral. Las células de cáncer deben su origen a una pérdida de la identidad celular somática acompañada del desarrollo de un fenotipo aberrante que se alcanza como consecuencia de la reactivación de programas de desarrollo embrionario. Se cree que la pérdida de la identidad celular, así como la reactivación de los programas de desarrollo se deben en gran medida a una pérdida de la estabilidad genómica, que a su vez depende del panorama de metilación a nivel genómico. Se sabe que diversos estímulos extracelulares son capaces de promover una remodelación del panorama de metilación de células somáticas tal que contribuye a una transición maligna hacia un fenotipo altamente proliferativo e invasivo, que se debe tanto a la activación estocástica de oncogenes, como a un silenciamiento de genes supresores de tumores. Utilizando la línea celular derivada de trofoblasto, HTR-8/SVneo, por su fenotipo pseudomaligno y como modelo para el estudio de la biología placentaria y de la progresión tumoral, el propósito de este trabajo fue analizar la respuesta funcional de la línea ante un estímulo mitogénico con el péptido IGF2, y determinar cómo esta respuesta se relaciona con la variación en el panorama de metilación genómico y la expresión de RNA mensajero. A través de la interrogación del panorama de metilación genómico y la actividad transcripcional de la línea celular se identificaron variaciones que aparecen por efecto del estímulo y que ocurren de manera simultánea con un aumento de la actividad proliferativa, migratoria e invasiva de la línea celular. Muchos de los genes comprometidos en estas variaciones han sido descritos previamente en cáncer y más aún, hacen parte de vías de señalización a través de las cuales podría estar procediendo el estímulo con IGF2 y que además, son importantes para la adquisición de un fenotipo maligno en diversos tipos de cáncer. En conclusión, el péptido IGF2 tiene la capacidad de aumentar la actividad proliferativa, migratoria e invasiva de la línea celular, y estos cambios ocurren de manera paralela, y probablemente como consecuencia de alteraciones a nivel epigenético y transcripcional. (Texto tomado de la fuente) The process of placental implantation depends on a thorough regulation of the invasion of the maternal decidua by the cellular subtype known as extravillous trophoblast, invasion of the maternal immune system and remodeling of the local vasculature. These and other processes make the placental implantation remarkably similar to tumor invasion. Cancer cells owe their origin to a loss of somatic cellular identity, accompanied by the development of an aberrant phenotype achieved as a consequence of the stochastic reactivation of embryonic development programs. It is believed that this loss of cellular identity, as well as the reactivation of these programs is owed to a great extent to a loss of genomic stability, which in turn depends on the DNA methylation landscape at the genomic level. It has been observed that extracellular stimuli of diverse kinds are capable of promoting a remodeling of the DNA methylation landscape in somatic cell such that it contributes to a malignant transformation to a highly proliferative, migratory and invasive phenotype, which is owed both to a stochastic activation of oncogenes and a silencing of tumor-repressor genes. Using trophoblast-derived HTR-8/SVneo cell line because its pseudo malignant phenotype and as model for the study of placental biology and tumor progression, the purpose of this work was to analyze the functional response of the cell line as a response to a mitogenic stimulus with IGF2, and to determine how this response is related to the variation of the methylation landscape and the transcriptional activity of the cell line. Through interrogation of the genomic methylation landscape and the transcriptional activity of the cell line, some alterations were identified that appear as a consequence of the stimulus and that occur simultaneously with an increase of the proliferative, migratory and invasive activity of the cell line. Many of the genes compromised in these alterations have been previously described in cancer and moreover, take part in signaling pathways through which the IGF2 stimulus could be proceeding and that are important for the acquisition of a malignant phenotype in several types of cancer. In conclusion, IGF2 peptide has the capacity of promoting the proliferative, migratory and invasive capacities of the cell line and these changes happen simultaneously, and probably as a consequence of alterations at epigenetic and transcriptional levels. Maestría Magíster en Ciencias - Bioquímica Factores de crecimiento, diferenciación y cáncer

Resumen: Introducción: En pacientes con enfermedad renal crónica (ERC), la hiperfosfatemia agrava tanto la hiperplasia paratiroidea como la síntesis y secreción de PTH. La mayor hiperplasia se asocia a descensos en la expresión génica de los receptores de calcio (CaSR), vitamina D (VDR) y también de α-Klotho, induciendo resistencia de la glándula paratiroides para responder tanto al tratamiento como a los aumentos de FGF23. Este estudio examinó la posible contribución epigenética del fósforo elevado en agravar el hiperparatiroidismo secundario (HPTS). Material y métodos: Se comparó el grado de metilación mediante pirosecuenciación de bisulfito en secuencias ricas en CpG de los promotores en los genes del CaSR, VDR, PTH y α-Klotho en ADN de glándulas paratiroides de ratas urémicas alimentadas con dieta con contenido normal y elevado en fósforo. Resultados: La dieta rica en fósforo incrementó la expresión de PTH y causó una marcada reducción del grado de metilación en el promotor del gen de PTH. En cambio, las regiones promotoras de los genes de CaSR, VDR y α-Klotho no mostraron diferencias significativas en el porcentaje de metilación entre ambos grupos de ratas, no siendo, por tanto, éste el mecanismo determinante de la disminución de la expresión de estos genes observada en el HPTS. Conclusiones: Las alteraciones epigenéticas inducidas por la dieta rica en fósforo en el HPTS, en particular la hipometilación del gen de la PTH, podrían contribuir a los aumentos que se producen en la síntesis y secreción de esta hormona. La identificación de los mecanismos implicados permitiría diseñar mejores tratamientos para el HPTS en fases tempranas de la ERC.

338 p.-69 fig.-41 p.-3 anexos., [EN]DNA methylation is a conserved epigenetic modification that is important for gene regulation and genome stability, and it is triggered in response to environmental stimuli. DNA methylation is involved in regulating transposon silencing, gene expression and chromosome interactions. In addition, DNA methylation has important roles in plant responses to biotic and abiotic stress conditions and in plant development. The main objective of this thesis is to study the role of DNA methylation in Arabidopsis plants infected with Tobacco rattle virus (TRV). Our results reveal that the TRV infection causes significant changes in the expression of key components of the DNA methylation machinery, which are accompanied by local changes in genome methylation, mainly in the CG and CHG methylation contexts, which makes that some parts of the DNA turn into differentially methylated regions (DMRs). TRV corregulates the expression of plant defence genes and TEs located in the promotor regions in both, wild type plants (Col-0) and defective DNA methylation mutants ddc, ago4 and ros1. The susceptibility/resistance to the TRV infection is altered in DNA methylation mutants, suggesting a significant role of the DNA methylation/demethylation in the regulation of the viral proliferation. This study also shows that TRV is vertically transmitted in Arabidopsis plants. However, this mechanism is altered in mutants deficient in DNA methylation, suggesting that viral transmission is modulated by changes in DNA methylation, particularly at CHG context. Additionally, serial passages of TRV performed in Col-0 and ago mutant Arabidopsis plants show a coevolution between the host and TRV populations reaching a final equilibrium in which the biological efficiency is not compromised., [ES]La metilación del ADN desempeña una función crucial en la regulación de la expresión génica en respuesta a estímulos ambientales. La ruta de metilación del ADN mediada por ARN (RdDM, del inglés RNA-directed DNA methylation) previene la transcripción y el movimiento de transposones (TEs, del inglés transposable elements) así como regula la respuesta de defensa y la transmisión de caracteres asociados a la resistencia de la planta. En esta tesis doctoral estudiamos el papel del silenciamiento epigenético, mediado por la metilación del ADN en plantas de Arabidopsis tras la infección del virus del cascabeleo del tabaco (TRV, Tobacco rattle virus). Nuestros resultados revelan que la infección de TRV altera el patrón de expresión génica de algunos componentes conservados en la vía de metilación del ADN que coinciden con cambios puntuales en el perfil de metilación de la planta, principalmente en los contextos de metilación CG y CHG, constituyendo regiones diferencialmente metiladas (DMRs, del inglés differentially methylated regions). TRV corregula la expresión de genes de defensa y y de los TEs localizados en sus regiones promotoras tanto en plantas silvestres Col-0 como en los mutantes ddc, ago4 y ros1 defectivos en la metilación del ADN. Además, la susceptibilidad/resistencia a la infección de TRV está alterada en mutantes deficientes en la metilación del ADN, sugiriendo un papel relevante de la metilación/desmetilación del ADN en la regulación de la proliferación viral. En nuestro trabajo demostramos que TRV se transmite verticalmente a la descendencia en plantas de Arabidopsis infectadas. Esta capacidad, se encuentra alterada en los mutantes defectivos en metilación analizados, indicando que el perfil de metilación del ADN modula la transmisión viral. La metilación en contexto CHG parece ser crucial en este proceso. Además, el estudio de la herencia epigenética en generaciones seriadas de Arabidopsis Col-0 y mutantes ago infectadas con TRV mostró una coevolución entre el hospedador y la población viral que permitió alcanzar un equilibrio en el que la eficiencia biológica de ambos no estaba comprometida., Proyectos BIO2012-39973 y BIO2015-70752-R del Plan Nacional de Investigación de la Secretaría de Estado de Investigación, Desarrollo e Innovación del Ministerio de Economía y Competitividad.

Premio extraordinario de Trabajo Fin de Máster curso 2015-2016. Biotecnología El término epigenética se define como "los cambios heredables en la expresión génica que ocurren sin una alteración en la secuencia de nucleótidos del DNA". Entre otras funciones, los mecanismos epigenéticos asignan un papel crucial a la organización de la cromatina en el establecimiento de patrones específicos de expresión génica. Entre las diferentes marcas epigenéticas se incluyen la metilación del DNA, que se asocia con silenciamiento génico, y las modificaciones post-traduccionales de las histonas, que producen estados de activación o de represión. Uno de los objetivos de este trabajo ha sido determinar si la metilación de un DNA ectópico causa su silenciamiento génico en células humanas. Para ello, se ha llevado a cabo una metilación in vitro del gen reportero EGFP y ha sido transfectado en células HEK293, utilizando como control el correspondiente gen nativo sin metilar. A continuación, se analizó la capacidad de reactivación génica mediante el uso de modificadores epigenéticos tales como el 5-Aza-2’-desoxicitidina (5-Aza-dC), que inhibe la acción de la DNA-metiltransferasa DNMT1, y la Tricostatina A (TSA), un compuesto que inhibe la acción de las histonas deacetilasas. Los resultados de este trabajo indican que la metilación del gen ectópico promueve el silenciamiento génico y éste se incrementa en función del tiempo. Esta observación sugiere que la represión podría estar sucediendo mediante un mecanismo indirecto de silenciamiento en el que participan proteínas con afinidad por DNA metilado responsables de reclutar represores de la transcripción y/o factores remodeladores de la cromatina. Tras el tratamiento con TSA, se ha observado una reactivación del gen metilado sugiriendo que el plásmido ectópico una vez introducido en la célula se podría reorganizar dando lugar a una estructura de tipo nucleosómico. Por último, el tratamiento con 5-Aza-dC produce una reactivación indirecta del gen debido probablemente a la activación de nuevas vías de señalización celular.

Grado en Medicina., [ES]: La epigenética se refiere al estudio de los cambios de la expresión génica heredables a través de la división celular que tienen lugar sin cambios en la secuencia de DNA. El epigenoma constituye el estado epigenético global de una célula. Los principales mecanismos epigenéticos incluyen las modificaciones de las histonas, la metilación del DNA y el remodelado de la cromatina. Estudios recientes están contribuyendo a descifrar el epigenoma humano y cómo éste está alterado en cáncer. Las alteraciones epigenéticas en cáncer tales como patrones alterados de modificaciones de histonas o silenciamiento de genes supresores de tumores por hipermetilación de sus promotores están frecuentemente relacionadas con mutaciones en genes que controlan el empaquetamiento del DNA dentro de la cromatina. La terapia epigenética incluye inhibidores de enzimas responsables de la metilación del DNA o de la deacetiilación de histonas, además de nuevos agentes dirigidos hacia modificadores epigenéticos. Este trabajo presenta los avances recientes sobre el epigenoma en las células normales, cómo las alteraciones en modificadores epigenéticos mutados frecuentemente promueven la tumorogénesis y cómo estas alteraciones están siendo utilizadas como dianas terapéuticas contra el cáncer., [EN]: Epigenetics refers to the study of the changes in the gene expression which are inherited upon cell division without changes in the DNA sequence. The epigenome constitutes the global epigenetic state of a cell. The main epigenetic mechanisms include histone modifications, DNA methylation and chromatin remodeling. Recent studies are contributing to understand the human epigenome and how it is altered in cancer. Epigenetic abnormalities in cancer such as alteration in histone modification patterns or silencing of tumor suppressor genes by promoter hypermethylation are frequently related to mutations in genes that control the packaging of DNA in chromatin. Epigenetic therapy includes inhibitors of enzymes responsible of DNA methylation or histone deacetylation as well as new agents targeting epigenetic modifiers. This work presents the recent progress on the epigenome in normal cells, how alterations in frequently mutated epigenetic modifiers promote tumorigenesis and how these alterations are being used as targets for cancer therapy.

Los cambios epigenéticos son responsables de la aparición de muchas patologías humanas y sus causas son debido a factores ambientales como genéticos. Se ha descrito en enfermedades crónicas como la Diabetes Mellitus tipo 2 (T2DM) que se caracteriza por los estados de hiperglucemia y el incremento en el estrés oxidativo que conlleva a complicaciones micro y macro vasculares, asociado a una desmetilación global del genoma. Nuestra hipótesis corresponde a que los órganos diana son afectados por las alteraciones como la metilación e hidroximetilación como consecuencia del estrés oxidativo que luego repercuten en la persistencia de la enfermedad. Métodos: A partir de sangre periférica se analizaron los cambios globales en la metilación del DNA que son afectados por el estado metabólico de 60 individuos (40 pacientes, 20 controles sanos). Por técnicas de cuantificación se compararon los resultados obtenidos con los de la expresión de las enzimas involucradas. Por último, se realizó un estudio de microarreglos de metilación del DNA y de expresión obtenidos de la base de datos GEO para así comparar los resultados con nuestros datos experimentales. Resultados: Los pacientes diabéticos con pobre control metabólico presentaron mayores niveles de metilación que el grupo control y no se encontró alteración en las enzimas involucradas en este proceso. Los resultados fueron concordantes con el estudio de microarreglos. Conclusión: Los estudios experimentales y de microarreglos demostraron que la metilación es tejido específico y que existe una mayor oxidación en pacientes. Por ello proponemos una vía alterna de desmetilación no enzimática, basada en la oxidación directa de los grupos metilos generados por los estados oxidativos característicos de esta enfermedad. 29 jul 2019 No es del Plan de Poblamiento, esta con Anonymous, no se encuentra correo de solicitud de bloqueo por información confidencial, se deja abierto

Borrando la memoria celular: mecanismos de desmetilación del ADN La metilación de DNA desempeña un papel esencial durante el desarrollo y la diferenciación celular, así como en la defensa del genoma frente a elementos transponibles. El DNA se metila por acción de DNA metiltransferasas que transfieren un grupo metilo al carbono 5 de la citosina. La 5-metilcitosina resultante (5-meC) es una marca epigenética estable, pero reversible, que promueve el silenciamiento transcripcional bloqueando el acceso de factores de transcripción a sus secuencias diana y/o reclutando factores co-represores o remodeladores de la cromatina. La alteración de los patrones de metilación tiene consecuencias importantes para las células y es un componente crucial en diversas patologías humanas. En especial, la presencia de patrones de metilación aberrantes es una característica generalizada de muchos tipos comunes de cáncer. Aunque el estado de metilación del DNA celular depende de los procesos de metilación y desmetilación, la información sobre éstos últimos es aún muy fragmentaria en células humanas. Ello contrasta con los avances registrados en plantas, donde se ha identificado un mecanismo enzimático activo de desmetilación de DNA. Nuestro grupo, junto con otros, ha aportado evidencias bioquímicas y genéticas de que las plantas poseen 5-meC DNA glicosilasas, tipificadas por las proteínas ROS1 y DME de Arabidopsis thaliana, que inician el proceso de desmetilación mediante un mecanismo de reparación por excisión de bases. Hemos caracterizado en profundidad la actividad de esta nueva familia de glicosilasas e identificado otras proteínas que participan en la ruta de desmetilación de ADN. Esto ha situado los procesos de reparación de DNA en el centro de la investigación epigenética y ha abierto nuevas perspectivas para la identificación de posibles mecanismos análogos en animales. Nuestro progreso en la comprensión de los mecanismos de desmetilación en plantas ofrece una oportunidad única para diseñar estrategias que permitan modificar los perfiles de metilación alterados característicos de ciertas patologías humanas, en particular aquellas de naturaleza tumoral. Departamento de Biología Celular, Genética y Fisiología. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Las modificaciones epigenéticas regulan la expresión génica pero no producen cambios en la secuencia nucleotídica. La metilación del DNA es la modificación epigenética mejor estudiada en cáncer, y en concreto el sileciamiento de genes por hipermetilación de su promotor, que es un cambio importante que puede ser de utilidad para el diagnostico precoz de la enfermedad. En este trabajo nos hemos centrado en el análisis de la metilación y expresión de CFTR, HTR1B, GSTM2 y PENK, en líneas celulares de cáncer de próstata, mama, neuroblastoma, piel, colon, pulmón, cervix y tiroides. Los resultados obtenidos nos indican que la metilación de estos genes no es un hecho específico de un solo tipo tumoral ya que se encuentran metilados en al menos una línea celular de todos los tipos de tumores analizados. En la mayor parte de los casos la metilación del promotor provoca una disminución en los niveles de mRNA y proteína. Además, la pérdida de metilación inducida por el tratamiento con agentes desmetilanes provoca la reexpresión de los genes metilados, lo que confirma la relación entre metilación y pérdida de expresión

El cáncer es un conjunto de trastornos que comparten la característica común de un crecimiento celular descontrolado, teniendo la facultad de comenzar en las células, generando dos procesos sucesivos: el aumento de la proliferación celular (tumor o neoplasia) y la capacidad invasiva de estas células, proliferando y colonizando otros tejidos (metástasis). La metilación del DNA es un proceso epigenético que recurrentemente ha sido involucrado como un factor importante en la patogenia de esta enfermedad el cual participa en la regulación de la expresión génica directamente al impedir la unión de factores de trascripción, e indirectamente propiciando la estructura “cerrada” de la cromatina. El objetivo de este trabajo fue determinar regiones hipermetiladas en muestras de extendidos cromosómicos mediante la utilización de la endonucleasa de restricción Alu I y relacionar estas regiones con sitios de localización de genes supresores de tumores relacionados con el cáncer de mama. Se analizaron 60 muestras de sangre periférica de mujeres con diagnóstico de cáncer de mama a las cuales se les realizó cultivo celular; los extendidos cromosómicos fueron teñidos con Giemsa previamente digeridos con la enzima Alu I. Se observaron cromosomas con regiones centroméricas y no centroméricas teñidas en el 37% de los casos, comprobándose que en el 95,46% de los casos existen genes asociados descritos, como metilados en cáncer de mama. Ejemplo de ellos son los localizados en los cromosomas 1q, 2q, 6q, y regiones centroméricas no teñidas usualmente como en los cromosomas 3, 4, 8, 13, 14, 15, y 17. Se sugiere la importancia de esta técnica ya que permite la visualización total del genoma, pudiendo localizar genes metilados relacionados con cáncer de mama y, de esta manera dirigir la terapia de forma específica, logrando una mejor respuesta terapéutica Cancer is a group of disorders characterized by uncontrolled cell growth which is produced by two successive events: increased cell proliferation (tumor or neoplasia) and the invasive capacity of these cells (metastasis). DNA methylation is an epigenetic process which has been involved as an important pathogenic factor of cancer. DNA methylation participates in the regulation of gene expression, directly, by preventing the union of transcription factors, and indirectly, by promoting the “closed” structure of the chromatine. The objectives of this study were to identify hypermethyled chromosomal regions through the use of restriction Alu I endonuclease, and to relate cytogenetically these regions with tumor suppressive gene loci. Sixty peripheral blood samples of females with breast cancer were analyzed. Cell cultures were performed and cytogenetic spreads, previously digested with Alu I enzyme, were stained with Giemsa. Chromosomal centromeric and not centromeric regions were stained in 37% of cases. About 96% of stained hypermethyled chromosomal regions (1q, 2q, 6q) were linked with methylated genes associated with breast cancer. In addition, centromeric regions in chromosomes 3, 4, 8, 13, 14, 15 and 17, usually unstained, were found positive to digestion with Alu I enzime and Giemsa staining. We suggest the importance of this technique for the global visualization of the genome which can find methylated genes related to breast cancer, and thus lead to a specific therapy, and therefore a better therapeutic response

Numerosos estudios se llevan a cabo en todo el mundo para conocer las causas y el comportamiento del cáncer y aplicar este conocimiento a la mejora de la prevención, diagnóstico y tratamiento de las personas afectadas. Es en este contexto en el cual nuestro grupo pretende contribuir con estos objetivos, aportando nuevos conocimientos sobre los procesos involucrados en el desarrollo tumoral en el cáncer de tiroides en particular y en la carcinogénesis en general. El objetivo principal de este trabajo de tesis es estudiar la implicación de los genes WDR3 y TBX15 en el cáncer. El estudio de estos genes surge debido a que estudios previos llevados a cabo en nuestro laboratorio identificaron dos polimorfismos marcadores de la susceptibilidad al cáncer de tiroides en la región cromosómica 1p12, donde se encuentran estos genes. Además, esta región cromosómica ha sido asociada frecuentemente con numerosos tipos de cáncer. Uno de los polimorfismos identificados se encuentra en el intrón 24 del gen WDR3 y el otro en una región vacía de genes ubicada a 460 Kb del gen TBX15. La función de estos genes no ha sido completamente dilucidada, sin embargo, se ha propuesto que WDR3 estaría involucrado en la proliferación del ciclo celular a través de la interrupción de la biogénesis del ribosoma, además, varios estudios han mostrado una expresión irregular de las proteínas con motivos WD en determinados tipos de cáncer. Por otra parte, el gen TBX15, al igual que los demás miembros de la familia T-box, ha sido asociado a procesos del desarrollo, además, en los últimos años han surgido evidencias que indican una relación entre los genes T-box y la tumorigénesis, con efectos sobre la proliferación celular, invasión y metástasis. Es por ello que hipotetizamos que los genes WDR3 y TBX15 podrían estar relacionados con el cáncer. Numerosos estudios se llevan a cabo en nuestro laboratorio con el fin de dilucidar el papel de estos genes en la etiología del cáncer de tiroides en particular y también en el cáncer en general. En el presente trabajo de tesis realizamos un estudio de asociación de los genes WDR3 y TBX15 con la susceptibilidad al cáncer de tiroides y, seguidamente, analizamos su expresión y regulación principalmente en cáncer de tiroides y también en cáncer de colon y tumores cerebrales. El estudio de asociación del gen WDR3 con el cáncer de tiroides indica que este gen es un factor de susceptibilidad a este tipo de cáncer. Además, los análisis de expresión de WDR3 evidencian una sobre-expresión de este gen en el cáncer de tiroides y de colon. Los análisis de metilación de la región promotora de WDR3 indican que esta modificación epigenética no está involucrada en la regulación de la expresión de WDR3 a nivel transcripcional, sin embargo, el análisis de factores de transcripción de unión al promotor muestran que los factores c-Myc y CTCF actúan regulando la expresión de WDR3. Por otra parte, el estudio de asociación del gen TBX15 con el cáncer de tiroides indica que este gen no es un factor de susceptibilidad a este tipo de cáncer. Los análisis de expresión de TBX15 evidencian una expresión disminuida de este gen en el cáncer de tiroides. Los análisis de metilación de la región promotora de TBX15 en tejidos de tiroides y tejidos cerebrales, indican que esta modificación epigenética está involucrada en la regulación de la expresión de TBX15 a nivel transcripcional. El presente trabajo de tesis pone en evidencia el papel de los genes WDR3 y TBX15 en la etiología del cáncer de tiroides y sugieren su implicación en la carcinogénesis en general., There are numerous studies dedicated to find out the causes of cancer and its progression and the application of this knowledge to improving the prevention, diagnosis and treatment. In this context our group contributes to these objectives, providing new insights into the processes involved in tumor development of thyroid cancer in particular and carcinogenesis in general. The main objective of this thesis is to study the involvement of the genes WDR3 and TBX15 in cancer. The study of these genes arises from studies conducted in our laboratory that identified two polymorphisms markers of thyroid cancer susceptibility in the chromosomal region 1p12, where these genes have been mapped. Additionally, this chromosomal region has often been associated with many types of cancer. One of the polymorphisms identified is located in WDR3 (intron 24) gene and the other in a region located at 460 Kb from TBX15 gene. The function of these genes has not been completely known, however, it has been proposed that WDR3 is involved in the proliferation of the cell cycle through the disruption of the ribosome biogenesis. In addition, several studies have shown an irregular expression of WD repeat proteins in certain types of cancer. Moreover, the TBX15 gene, like other members of the T-box family, has been related to developmental processes and several evidences suggest a relationship between the T-box genes and tumorigenesis, with effects on cell proliferation, invasion and metastasis. That is why we hypothesize that genes WDR3 and TBX15 may be related to cancer. Numerous studies are conducted in our laboratory to elucidate the role of these genes in the etiology of thyroid cancer in particular and also in cancer in general. In this thesis was performed an association study of genes WDR3 and TBX15 with thyroid cancer susceptibility, and their expression and regulation were analyzed in thyroid cancer, colon cancer and brain tumors. The gene association study of WDR3 with thyroid cancer indicates that this gene is a susceptibility factor for this cancer. The expression analysis shows that the WDR3 is over-expressed in thyroid cancer and colon cancer. The methylation analysis of the promoter region of WDR3 indicates that this epigenetic modification is not involved in the regulation of WDR3 expression at transcriptional level, however, analysis of transcription factors binding to the promoter shows that the c-Myc and CTCF factors could act as regulators of the WDR3 expression. Moreover, the association study of TBX15 gene with thyroid cancer indicates that this gene is not a susceptibility factor for this cancer. The expression analysis of TBX15 shows decreased expression of this gene in thyroid cancer. The methylation analysis of the promoter region of TBX15 in thyroid tissues and brain tissues, indicates that this epigenetic modification is involved in the regulation of TBX15 expression at transcriptional level. This thesis highlights the role of genes WDR3 and TBX15 in the etiology of thyroid cancer and suggests their involvement in carcinogenesis in general.

422 p.-117 fig.-21 tab., DNAEl desarrollo del grano de polen es un proceso estrictamente regulado a nivel génico que conduce a la formación de un organismo haploide, el gametofito masculino o grano de polen, cuyas células poseen una alta especialización, necesaria para su importante función en la germinación del tubo polínico y doble fecundación de las plantas con flores. Mediante la aplicación de un tratamiento de estrés in vitro en la etapa adecuada del desarrollo, concretamente en la fase de microspora vacuolada, la microspora puede desviar su ruta de desarrollo gametofítico hacia una rutaembriogénica con la formación de un embrión haploide, proceso conocido como embriogénesis del polen, que representa una importante herramienta biotecnológica en mejora vegetal para la obtención rápida de plantas doble haploides, líneas isogénicas y nuevas variedades. Este proceso se ha puesto a punto en numerosas especies, sin embargo, su rendimiento es muy bajo en algunas plantas de interés económico, ya que todavía son poco conocidos los mecanismos celulares y moleculares que intervienen en el cambio de programa de desarrollo. El desarrollo esporofítico y gametofítico del polen en la antera está asociado al correcto desarrollo del tapetum o tejido nutricio de la antera, que una vez finalizada su función sufre una degeneración mediante muerte celular programada (MCP)., En esta Tesis se plantea el estudio de diferentes aspectos de la fisiología del proceso de embriogénesis del polen en comparación con el desarrollo gametofítico del polen, con el objetivo de comprender los mecanismos que controlan la reprogramación celular, la adquisición de competencia embriogénica y la identidad celular mediante tratamientos de estrés, centrándose el estudio en la identificación de marcadores de embriogénesis, la dinámica de la pared celular, la metilación del DNA y los sucesos de muerte celular programada (MCP). Por otro lado, debido a la importancia de la MCP y la metilación del DNA durante la reprogramación a embriogénesis inducida por estrés, se plantea también el estudio de la dinámica de estos dos procesos durante la diferenciación del polen in vivo, especialmente, durante el desarrollo y MCP del tapetum. El material empleado para este estudio han sido diferentes sistemas vegetales, en función de los objetivos perseguidos en cada caso. Así, por un lado, se han utilizado especies herbáceas, modelos del proceso, en las cuales se han establecido eficientes sistemas de cultivo in vitro como Brassica napus y Nicotiana tabacum, y por otro lado, un árbol frutal, Olea europaea, con un mayor interés aplicado, en el que los sistemas de cultivo in vitro, están todavía en desarrollo. La comparación entre especies modelo y árboles, puede ser muy útil en el desarrollo y mejora de nuevos sistemas in vitro, por extensión de conocimientos entre especies. El abordaje experimental ha consistido en el desarrollo de cultivos in vitro de microsporas aisladas y el empleo de diversas técnicas: a)citoquímicas para la detección in situ de diferentes componentes celulares (Calcofluor White para celulosa, I KI para almidón y Azul de Evans para detección de muertecelular), 2b) inmunocitoquímicas con anticuerpos específicos que reconocen pectinas con diferente grado de esterificación (Jim7 y Jim), RNA total (anti-RNA), citosinas metiladas (anti-5mdC) y MCP (caspasa 3), c)ensayos inmunoquímicos de “Dot blot” y ”Western blot”, d)ensayos de actividad enzimática, e)estudios de expresión mediante hibridación in situ fluorescente (FISH) y PCR semicuantitativa, f)electroforesis capilar de alta resolución (HPCE) para cuantificar el grado de metilación global del DNA y g)herramientas de transformación transitoria con GFP. Para ello, se emplearon diferentes métodos de procesamiento de muestras, los cuales fueron adaptados para el material objeto de estudio en cada momento., Después del tratamiento de estrés inductor de la embriogénesis, las microsporas que reprograman su ruta abandonan su programa de desarrollo y adquieren competencia embriogénica, sin embargo, aquellas otras que no son capaces de reprogramarse hacia embriogénesis, se paran y mueren. En esta Tesis, se ha optimizado el sistema de cultivo in vitro de microsporas aisladas de Brassica napus para una mayor eficiencia de inducción a embriogénesis mediante estrés a 32ºC, junto con el desarrollo de una metodología óptima para la germinación de embriones y su conversión a plantas adultas. Al mismo tiempo, se ha desarrollado un nuevo sistema de cultivo in vitro en Brassica napus para la inducción eficiente de la embriogénesis a 18ºC, sistema en el que la microspora sigue dos rutas de desarrollo embriogénico diferentes y permitirá abordar el desarrollo de estudios comparativos entre ellas. Se han estudiado otras posibles respuestas al tratamiento de estrés inductor de las microsporas que no reprograman su ruta de desarrollo hacia embriogénesis, mediante el análisis de los niveles de muerte celular y marcadores de MCP durante las primeras etapas del cultivo embriogénico, identificándose por primera vez la localización y actividad enzimática tipo caspasa. Los resultados muestran que las primeras etapas del cultivo se caracterizan por elevados niveles de muerte celular e indican que algunas de las células que no responden al tratamiento de estrés inductor de embriogénesis, siguen una ruta dependiente de “actividad caspasa 3 like”, sugiriendo que parte de los elevados niveles de muerte celular detectados en las primeras etapas del cultivo, podrían deberse a procesos de muerte celular programada (MCP), posiblemente desencadenados por el tratamiento de estrés. La identificación de rutas de muerte celular programada como respuesta al tratamiento de estrés en cultivos de polen, serán de gran ayuda en el diseño de estrategias in vitro que puedan bloquear la MCP y que aumenten la viabilidad y la inducción de embriogénesis. Se han establecido marcadores moleculares y celulares que cambian con la identidad celular y diferencian las células reprogramadas a embriogénesis en las primeras etapas del proceso, como son: la organización estructural idéntica de los núcleos, la tabicación citoplásmica, la ausencia de almidón y la diferente composición de pectinas y celulosa de la pared celular. Los marcadores identificados son comunes para olivo y colza, sugiriendo que los mecanismos implicados en la reprogramación a embriogénesis son análogos en ambas especies pudiendo ser empleados como herramientas para la monitorización de procesos metabólicos implicados en la reprogramación y para la identificación de células destinadas al programa de desarrollo embriogénico frente a aquellas otras células que no responden al tratamiento inductor., Las pectinas son un componente principal de las paredes celulares, su modificación por la enzima pectinmetilesterasa (PME) actúa regulando la estructura y la rigidez de la pared celular. En este trabajo, se ha analizado la dinámica de la esterificación de pectinas y el patrón de expresión de la BnPM E durante los dos programas de desarrollo del polen, el desarrollo gametofítico y la embriogénesis de polen inducida mediante tratamientos de estrés. Los resultados obtenidos indican que las pectinas esterificadas y no esterificadas tienen patrones de distribución opuestos durante los dos programas de desarrollo, en relación a los procesos de proliferación y diferenciación. Así, el polen maduro y las etapas más avanzadas del desarrollo embriogénico, con una mayor diferenciación celular, se caracterizan por elevados niveles de pectinas desmetilesterificadas, así como de una alta expresión de BnPME; mientras que las microsporas inmaduras y las primeras fases de embriogénesis, asociadas con procesos de proliferación, presentan una mayor proporción de pectinas altamente esterificadas y una expresión baja de BnPME. En base a estos resultados, los altos niveles de pectinas no esterificadas pueden ser considerados como marcadores del desarrollo gametofítico, mientras que la presencia de pectinas esterificadas pueden emplearse como un marcador del desarrollo embriogénico del polen, permitiendo la identificación de las microsporas inducidas y los primeros proembriones. El análisis de localización in vivo de la proteína de fusión GFP-PME en el microscopio confocal en hojas de tabaco transformadas transitoriamente, indica que la proteína PME es dirigida a las paredes celulares diferenciadas de las células epidérmicas y del mesófilo, donde presumiblemente realiza su actividad enzimática sobre las pectinas in muro. Los mecanismos que subyacen a la reprogramación nuclear, implican cambios en la estructura de la cromatina y la expresión génica de todo el genoma. Los cambios epigenéticos o modificaciones covalentes de los constituyentes de la cromatina, como la metilación del DNA, modulan la conformación de la cromatina y por tanto son un factor clave de regulación de estos cambios y como consecuencia, de la actividad génica. En este trabajo se ha analizado los niveles y dinámica de metilación del DNA durante el desarrollo y embriogénesis del polen. Se ha puesto a punto el ensayo para cuantificar el nivel de metilación de DNA genómico mediante electroforesis capilar de alta resolución (HPCE) en anteras y microsporas aisladas en diversas etapas del desarrollo gametofítico del polen y del cultivo embriogénico. Los resultados indican cambios en la metilación del DNA y en la arquitectura nuclear durante la diferenciación, proliferación y MCP. Así, durante el proceso de maduración del polen y MCP del tapetum, se produce un aumento del nivel de metilación, asociado a la heterocromatinización que tiene lugar durante estos procesos. Sin embargo, tras la reprogramación a embriogénesis de las microsporas, los niveles de metilación disminuyen, en relación al proceso de proliferación que se inicia como consecuencia del cambio de programa de desarrollo., En etapas posteriores del proceso de embriogénesis, se aprecia un incremento en los niveles de metilación de DNA, asociado a la diferenciación que tiene lugar en las etapas avanzadas del desarrollo embriogénico. Además, los resultados obtenidos muestran cambios específicos en los patrones de distribución nuclear de la 5-metil- deoxicitidina (5mdC), durante los programas de desarrollo estudiados, en relación a los patrones de condensación cromatínica. En este trabajo también se ha analizado la expresión del gen de la enzima DNA metiltransferasa 1, NtMET1, principal responsable de la metilación del DNA, en etapas específicas de los cultivos embriogénicos, del desarrollo del polen y de la MCP del tapetum. Los resultados muestran que la expresión de NtMET-1 está regulada durante el desarrollo gametofítico y la embriogénesis del polen; los cambios de nivel de expresión están asociados a las variaciones de metilación global del DNA que suceden con el cambio de programa de desarrollo y a procesos de diferenciación y proliferación, aumentando su expresión en fases de alto grado de metilación y disminuyendo cuando la metilación global del DNA es baja. Durante la microsporogénesis y desarrollo in vivo del polen, el tapetum, tejido nutricio de la antera, tiene una función fundamental y una vez terminada inicia un proceso de degradación mediante MCP. En este trabajo, se han analizado los cambios en núcleo y citoplasma para la caracterización de la MCP y la identificación de marcadores de apoptosis en el tapetum. Los resultados muestran por primera vez, la localización y determinación de actividad enzimática de proteínas tipo caspasa 3 en el tapetum, indicando que las células del tapetum sufren un proceso de MCP a través de una ruta dependiente de proteínas tipo caspasa 3. El proceso se caracteriza por una progresiva condensación cromatínica, lobulación nuclear, contracción citoplásmica y cambios en la distribución de RNA y segregación de ribonucleoproteínas (RNPs), características propias de los procesos de apoptosis de células animales., También se ha analizado la metilación del DNA durante el desarrollo y MCP del tapetum, observándose un incremento de los niveles de metilación global del DNA y un cambio en el patrón de distribución de 5mdC, desde pequeños spots en etapas metabólicamente activas hasta su concentración en grandes masas de cromatina condensada en MCP avanzada. El análisis de expresión de NtM ET1 indica un incremento de la expresión durante el desarrollo y MCP del tapetum. En este trabajo se han estudiado los niveles y distribución de marcadores nucleares específicos implicados en la síntesis, procesamiento y degradación de RNA durante la diferenciación in vivo del polen y MCP del tapetum. Se ha analizado la distribución de híbridos DNA:RNA, CstF (“cleavage stimulation factor”), RNAs poliadenilados y RNasa A. Los resultados obtenidos, muestran que durante la diferenciación del polen in vivo tiene lugar una remodelación del dominio intercromatínico que conlleva una disminución gradual de la actividad transcripcional. El incremento de los niveles de metilación detectados en estos procesos aparecen asociados a esta disminución de la actividad transcripcional. Durante el desarrollo y MCP del tapetum, nuestros resultados aportan nuevos datos sobre la organización estructural y funcional del núcleo. La disminución de híbridos DNA:RNA, transcritos poliadenilados y de los factores de splicing como CstF en comparación con células transcripcionalmente activas, indican una disminución de la actividad transcripcional asociado al proceso de MCP, al mismo tiempo que sugieren la participación de la enzima RNasa A en la degradación de RNA en etapas tempranas de la MCP del tapetum apoyando la idea de que durante el desarrollo y MCP del tapetum se produce una disminución de la síntesis y procesamiento de RNAm, acompañado de un proceso de degradación masiva de RNA. Los resultados obtenidos en esta Memoria Doctoral aportan una información clave sobre la fisiología de la reprogramación celular y la adquisición de competencia embriogénica, procesos de gran interés básico y que además podrán ser empleados en el diseño y optimización de nuevos sistemas in vitro con mayor eficiencia, además de establecer las bases para el diseño de estrategias de transformación.

Mi trabajo ha estado enfocado en la implicación de los diferentes mecanismos epigenéticos de PML-RARa en la inducción de la leucemia promielocítica aguda (APL).En particular yo estudié el rol de MBD1, un miembro de la conservada familia de proteinas capaces de unirse al DNA metilado, demostrando que desempeña un papel importante en la progresión de la leucemia. De hecho, mostré que MBD1 es recruida por PML-RARa a sus promotores diana a través de los mecanismos mediados por HDAC3, participando por tanto en la represión transcripcional. Además, investigué hasta donde la metilación de la H3K27 mediada por Polycomb contribuye a la tumorgénesis mediada por PML-RARa. Demostré que PML-RARa dirige al PRC2 hacia el locus del tumor supresor causando la metilación de la H3K27. Fue interesante ser capaz de mostrar que tanto la metilación del DNA como la de las histonas era requerida para mantener el aberrante silencio génico. Esto apuntaba hacia una intercomunicación entre estos diferentes marcadores epigenéticos contribuyendo a la patología molecular de la leucemia. Resumiendo, estos resultados nos proporcionan elementos nuevos para comprender los mecanismos moleculares esenciales en la tumorgénesis y progresión de la APL., My work was focused on the involvement of different epigenetic mechanisms in PML-RARa-induced acute promyelocytic leukemia (APL). In particular, I studied the role of MBD1, a member of a conserved family of proteins able to bind methylated DNA, demonstrating that has an important function in leukemia progression. Indeed, I showed that MBD1 is recruited by PML-RARa to its target promoters through an HDAC3-mediated mechanism, thus participating in transcriptional repression.. Furthermore, I investigated how far Polycomb-mediated H3K27 methylation contributes to PML-RARa mediated tumorigenesis. I demonstrated that PML-RARa targets the PRC2 to tumor suppressor loci causing H3K27 methylation. Interestingly, I was able to show that both DNA and histone methylation are required to maintain PML-RARa aberrant gene silencing, pointing towards a crosstalk among these different epigenetic layers that contributes to the molecular pathology of leukemia. In summary these results provide new insights into the molecular mechanisms underlying APL tumorigenesis and progression.