Search

Makrolidni antibiotici pripadaju skupni makrolida koji se široko primjenjuju za liječenje infekcija gornjih i donjih dišnih puteva. Mehanizam djelovanja makrolida temelji se na vezanju za 23S rRNA u peptidil-transferaznom centru bakterijskog ribosoma ili u njegovoj blizini, što sprječava izlaz novosintetiziranih peptida i inhibira sintezu proteina. Pojava višestruke bakterijske rezistencije predstavlja ozbiljnu prijetnju za ljudsko zdravlje, što je potaknulo sintezu novih derivata makrolida koji će pokazivati bolju bioaktivnost. Vezanjem poznatih makrolida i bioaktivnih tiosemikarbazona dobiveni su novi konjugati, makrozoni, koji uspješno djeluju protiv nekih rezistentnih bakterijskih sojeva. U ovom radu okarakterizirane su interakcije nekoliko 4''-aril-makrozona s biološkim metama, poput albumina iz goveđeg seruma te ribosoma iz bakterije Escherichia coli. Istraživanja su provedena kombinacijom metoda spektrofluorimetrije, spektrofotometrije i cirkularnog dikroizma. Kao kompetitor u fluorimetrijskim mjerenjima korišten je flourescirajući derivat azitromicina, 9a-NBD-azitromicin. Podaci su zatim obrađeni metodama multivarijatne analize kako bi se odredile konstante vezanja. Due to their anti-infective activity, macrolide antibiotics (macrolides) are widely used for the treatment of upper and lower respiratory tract infections. Their mechanism of action is based on reversible binding to 23S rRNA at or near the peptidyl-transferase center of the bacterial ribosome, which prevents the release of newly synthesized peptides and inhibits the protein synthesis. The emergence of bacterial resistance represents a serious threat to human health, which prompted the synthesis of new macrolide derivatives with a better bioactivity. Linking known macrolides to bioactive thiosemicarbazones resulted with new conjugates, macrozones, active against some resistant bacterial strains. In this work, the interactions of several 4''-aryl-macrozones with biological targets, such as bovine serum albumin and Escherichia coli ribosomes, were characterized. The studies were carried out by combining spectrofluorimetric, spectrophotometric and circular dichroism methods. Competition fluorimetric experiments were conducted using a fluorescent derivative of azithromycin, 9a-NBD-azithromycin. The data were further processed with multivariate analysis methods to determine the binding constants.

Urogenitalne mikoplazme, kot so patogena Mycoplasma genitalium in potencialno patogene Mycoplasma hominis ter Ureaplasma spp., povzročajo urogenitalna obolenja. Težavo pri zdravljenju teh okužb predstavlja odpornost bakterij proti antibiotikom. Mikrobiološka diagnostika mutacij, ki posredujejo odpornost M. gentalium, poteka z molekularnimi metodami, kot je PCR, diagnostika odpornosti M. hominis in Ureaplasma spp. proti antibiotikom pa z metodo kultivacije. V magistrski nalogi smo ovrednotili in primerjali testa PCR za ugotavljanje občutljivosti bakterije M. genitalium za makrolide dveh proizvajalcev, Allplex MG & AziR (Seegene) in Multiplex Tandem PCR Assays (AusDiagnostic). Testirali smo 228 vzorcev DNA bakterije M. genitalium. Ugotovili smo, da ima test proizvajalca AusDiagnostics v primerjavi s testom proizvajalca Seegene slabšo občutljivost in nizko specifičnost za določanje mutacije, ki posreduje odpornost proti makrolidom. V drugem delu naloge smo z uporabo 100 vzorcev s prisotno M. hominis ali Ureaplasma spp. validirali nov test Mycofast RevolutioN 2 (ELITech Group) in ga primerjali s starejšo različico testa Mycofast RevolutioN ATB+. Ugotovili smo, da je novejši test primernejši za uporabo v laboratoriju, saj se bolje sklada z smernicami CLSI, vsebuje pa tudi boljši nabor, koncentracije in razpored antibiotikov. Urogenital mycoplasmas, such as pathogen Mycoplasma genitalium and potentially pathogenic Mycoplasma hominis and Ureaplasma spp., cause urogenital diseases. A problem in treating these infections is the resistance of bacteria to antibiotics. Microbiological diagnosis mutations that mediate resistance of M. genitalium is performed by molecular methods such as PCR. Diagnosis of resistance of M. hominis and Ureaplasma spp. to antibiotics is preformed by the method of cultivation. In the master's thesis, we evaluated and compared two PCR tests to determine the susceptibility of M. genitalium to macrolides from two manufacturers, Allplex MG & AziR (Seegene) and Multiplex Tandem PCR Assays (AusDiagnostic). We tested 228 samples of M. genitalium DNA. We found that the AusDiagnostics test has lower sensitivity and specificity for determining the mutation that mediates resistance to macrolides compared to the Seegene test. In the second part of the master's thesis, we validated the new Mycofast RevolutioN 2 test (ELITech Group) and compared it with the older version of the test, Mycofast RevolutioN ATB +, using 100 samples with presence of M. hominis or Ureaplasma spp. We found that the newer test is more suitable for use in the laboratory, as it better complies with CLSI guidelines and contains a better set, concentrations and separation of antibiotics.

Značajan porast bakterijske rezistencije utječe na sve veću potrebu za istraživanjem i razvojem novih antibiotika. U sklopu ovog rada pripravljene su tri nove klase makrozona, konjugata makrolidnog antibiotika azitromicina i tiosemikarbazona. Tiosemikarbazoni su korišteni za kemijsku modifikaciju azitromicina na tri različita položaja. Cilj rada je priprava novih derivata makrolida sa širim spektrom biološke aktivnosti. Pripravljenim spojevima određena je biološka aktivnost in vitro na susceptibilne i rezistentne Gram-pozitivne i Gram-negativne bakterije te su istražene interakcije s biološkim receptorima. Za proučavanje interakcija primijenjena je spektroskopija NMR, cirkularni dikroizam, fluorescencijska spektroskopija i molekulsko modeliranje. Makrozoni su pokazali zadovoljavajuću biološku aktivnost, posebice na neke rezistentne bakterijske sojeve na koje azitromicin nije aktivan. Rezultati dobiveni spektroskopskim metodama i molekulskim modeliranjem ukazuju na odnos strukture i aktivnosti novih derivata azitromicina, što može poslužiti za dizajn i otkriće biaktivnijih derivata makrolida. Owing to a significant increase in bacterial resistance, a high need for discovery and development of new antibiotics has emerged. As part of this work, three novel classes of macrozones, conjugates of macrolide antibiotic azithromycin and thiosemicarbazones, were prepared. Thiosemicarbazones were used to chemically modify azithromycin at three different positions. The aim of this thesis was to prepare compounds with a wider range of biological activity including resistant bacterial strains. In vitro biological activity of the prepared compounds was determined against susceptible and resistant Gram-positive and Gram-negative bacteria, and interactions with biological receptors were investigated. Macrozones showed satisfactory biological activity, especially against some resistant bacterial strains to which azithromycin is inactive. NMR spectroscopy, circular dichroism, fluorescence spectroscopy, and molecular modeling were further used to study interactions of selected compounds with biological targets. The results obtained by spectroscopic methods and molecular modeling indicate a relationship between structure and activity of new azithromycin derivatives, which can be used for design and discovery of more active macrolide derivatives.

CILJ ISTRAŽIVANJA: Glavni cilj ovog istraživanja bio je procijeniti stavove i znanja liječnika obiteljske medicine Splitsko-dalmatinske županije o propisivanju antibiotske terapije COVID-19 oboljelim pacijentima, te upoznatost sa najrecentnijim smjernicama za liječenje koronavirusne bolesti i nadomjesnom terapijom vitaminom D. ISPITANICI I METODE: Provedeno je istraživanje u svrhu ispitivanja stavova i znanja liječnika obiteljske medicine Splitsko-dalmatinske županije o upotrebi antibiotske terapije kod COVID-19 pozitivnih osoba. Podaci su prikupljeni pomoću anketnog upitnika kojem se pristupalo putem Google forms internetske aplikacije tijekom svibnja 2022. Upitnik se sastojao od 23 pitanja. Za analizu podataka korišten je statistički software STATISTICA 12, Tibco, Kalifornija. REZULTATI: Sa zadnjim smjernicama za liječenje oboljelih od koronavirusne bolesti (verzija 5 od 8.veljače 2022. godine) je upoznato 100 (87%) liječnika obiteljske medicine. Od 115 liječnika, njih 88 (77,2%) se u potpunosti slaže sa preporukom da je osnova liječenja COVID-19 infekcije ublažavanje simptoma, sprječavanje komplikacija i progresije bolesti te simptomatsko i suportivno liječenje. Najveći broj LOM smatra da su propisali antibiotsku terapiju za 10-30% oboljelih (41,67%). Na pitanje o izboru i trajanju antibiotske terapije kod COVID-19 pozitivnih pacijenata 80 (70,80%) LOM bi se odlučilo na makrolide (azitromicin) u trajanju od 3 dana, njih 20 (17,70%) na makrolide (azitromicin) u trajanju od 5 do 6 dana, a njih 13 (11,50%) bi se odlučilo na neku drugu skupinu antibiotika. Ispitivanjem nije utvrđena povezanost između odabira i trajanja antibiotske terapije s obzirom na dob (P=0,182) i specijalistički status liječnika (P=0,650). Ispitivanjem je utvrđena statistički značajna razlika u zastupljenosti stava liječnika kako nitko iz skupine pacijenata sa nekompliciranom infekcijom koji može imati vrućicu, opću slabost, glavobolju, mialgiju, hunjavicu, grlobolju i/ili kašalj ne treba dobiti antibiotik (P, OBJECTIVES: The main goal of this research was to assess the attitudes and knowledge of family medicine doctors in the Split-Dalmatia County regarding the prescription of antibiotic therapy to patients with COVID-19, as well as their familiarity with the most recent guidelines for the treatment of coronavirus disease and vitamin D replacement therapy. PATIENTS AND METHODS: A study was conducted to examine the attitudes and knowledge of family medicine doctors in the Split-Dalmatia County regarding the use of antibiotic therapy in COVID-19 positive patients. The data was collected by solving a questionnaire via the Google forms internet application during May 2022. The questionnaire consisted of 23 questions. The statistical software STATISTICA 12, Tibco, California, was used for data analysis. RESULTS: The majority of family medicine doctors, 100 (87%), are familiar with the latest guidelines for the treatment of patients with the coronavirus disease (version 5 of February 8, 2022). Out of 115 doctors, 88 of them (77.2%) fully agree with the recommendation that the basis of the treatment of the COVID-19 infection is the alleviation of symptoms, complications and progression of the disease, as well as symptomatic and supportive treatment. The largest number of LOMs believe that they prescribed antibiotic therapy for 10-30% of patients (41.67%). When asked about the choice and duration of antibiotic therapy in COVID-19 positive patients, 80 (70.80%) LOM would decide on a macrolide (azithromycin) for 3 days, 20 of them (17.70%) on a macrolide (azithromycin) in lasting from 5 to 6 days, and 13 of them (11.50%) would have opted for another group of antibiotics. The examination did not establish a connection between the selection and duration of antibiotic therapy with regard to age (P=0.182) and specialist status of the doctor (P=0.650). The examination revealed a statistically significant difference in the representation of the physician's opinion that no one from the group of patients with an uncomplicated infection who may have fever, general weakness, headache, myalgia, wheezing, sore throat and/or cough should receive antibiotics (P

Makrozoni su novi konjugati azitromicina i derivata tiosemikarbazona koji pokazuju izvrsno antibakterijsko djelovanje in vitro na odabrane Gram-pozitivne i Gram-negativne bakterije. Zbog sve većeg razvoja bakterijske rezistencije na dosadašnje antibiotike cilj mnogih istraživanja u medicinskoj i farmaceutskoj kemiji je razvoj novih spojeva s poboljšanom biološkom aktivnošću. Nikal je element u tragovima bitan za bakterije, biljke životinje i ljude i kao kofaktor ima važnu ulogu u mnogim enzimima. U nizu slučajeva su kompleksi nikla s tiosemikarbazonima pokazali veću biološku aktivnost od nekompleksiranih liganada. U ovom je radu uspješno pripravljen kompleks nikla(II) s makrozonskim 4'' derivatom azitromicina, koji je dobiven konjugacijom 4''-aminopropilnog derivata azitromicina i kompleksa nikla(II) s tiosemikarbazonom. Pripravljeni spoj okarakteriziran je spektroskopijom NMR. Također je određena biološka aktivnost spoja in vitro na susceptibilne i rezistentne sojeve bakterija. Macrozones are new conjugates of azithromycin and thiosemicarbazones that possess excelent in vitro antibacterial activity against selected Gram-positive and Gram-negative bacteria. Due to the increasing number of macrolide-resistant bacteria, the aim of many studies in medicinal and pharmaceutical chemistry is development of new compounds with improved biological activity. Nickel is a trace element essential for bacteria, plants, animals and humans. In multiple cases, nickel complexes with thiosemicarbazones showed increased biological activity than uncomplexed ones. In this study succesful synthesis and structural characterisation of nickel(II) coordination compounds with macrozone 4'' derivative of azithromycin have been performed using NMR spectroscopy. In vitro biological activity of the compound against susceptible and resistant bacterial strains was also determined and discussed.

Chlamydia trachomatis je najpogostejša bakterijska povzročiteljica spolno prenosljivih okužb v svetovnem merilu. Večinoma okužbe potekajo asimptomatsko, ki v odsotnosti zdravljenja vodijo v resne zdravstvene zaplete. Za zdravljenje klamidijske okužbe se priporoča azitromicin ali doksiciklin. Oba antibiotika spadata v skupino bakteriostatičnih antibiotikov, ki z vezavo na 23S rRNK in 16S rRNK blokirajo sintezo beljakovin. Stopnje neuspešnega zdravljenja so dokaj visoke (8–23 %), najpogostejša vzroka sta ponovna okužba po prekinitvi zdravljenja ali razvoj heterotipske odpornosti. Odpornost proti makrolidom je lahko posledica mutacij v genu za 23S rRNK, ki ovirajo vezavo in interakcijo antibiotika s tarčnim mestom delovanja. Za ugotavljanje občutljivosti klamidije za antibiotike in določanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) se najpogosteje uporablja metoda gojenja v celični kulturi ob prisotnosti antibiotika v različnih koncentracijah, vendar se test zaradi zahtevnosti izvedbe in manjše občutljivosti uporablja le izjemoma. Namen magistrske naloge je vzpostavitev učinkovite metode za preverjanje prisotnosti mutacij v domeni V 23S rRNK, ki posredujejo odpornost proti makrolidom. V raziskavo smo vključili 58 vzorcev DNK kliničnih izolatov z večkrat potrjeno okužbo s C. trachomatis, kljub antibiotični terapiji. 36 vzorcev DNK smo uspešno pomnožili z alelno specifičnimi oligonukleotidi in izvedli sekvenciranje. Na podlagi bioinformacijske analize na pozicijah A2057, A2058, A2059 in T2611 (štetje po E. coli) nismo našli mutacij, ki vodijo v razvoj odpornosti proti makrolidom. V skladu s pričakovanji smo uspešno uvedli molekularno metodo, ki nam omogoča dokazovanje mutacij, ki posredujejo odpornost proti makrolidom. Chlamydia trachomatis is the most common sexually transmitted bacterial infection worldwide. Often, infections occur asymptomatically, leading to serious health complications in the absence of treatment. The use of azithromycin and doxycycline is recommended for the treatment of sexually transmitted chlamydial infections. Both antibiotics belong to the group of bacteriostatic antibiotics that bind to 23S rRNA and 16S rRNA, blocking protein synthesis. Treatment failure rates are high (8-23 %), for which the most common cause is re-infection after discontinuation of treatment or the development of heterotypic resistance. The most commonly used test for antibiotic susceptibility and MIC determination is cultivation in cell culture in the presence of antibiotics in various concentrations. Resistance to macrolides may be due to mutations in the 23S rRNA gene that cause reduction in interaction of antibiotics with target site of action. The aim of this master's thesis is to establish an effective method for determination of mutations in the domain V of 23S rRNA that mediate resistance to macrolides, so we included 58 DNA samples of clinical isolates with confirmed C. trachomatis infection after antibiotic treatment. 36 DNA samples were successfully amplified with allele-specific oligonucleotides and sequencing was performed. Based on bioinformatics analysis at positions A2057, A2058, A2059 and T2611 (E. coli numbering), we did not find mutations that are important for the development of resistance to macrolides. Based on expectations, we have successfully established a molecular method to obtain nucleotide sequences, whereby the presence of important mutations that mediate resistance to macrolides can be determined based on alignments with reference sequences.

Klaritromicin je predstavnik druge generacije makrolidnih antibiotika, u koju spada i poznatiji azitromicin. Makrolidni antibiotici (makrolidi) se koriste u liječenju infekcija uzrokovanih Gram-pozitivnim i Gram-negativnim bakterijama. Vezanjem za veliku podjedinicu bakterijskog ribosoma makrolidi inhibiraju translaciju proteina čime ubijaju bakterijske stanice. Učestalom primjenom makrolida bakterije su razvile različite mehanizme otpornosti na njihovo djelovanje. Stoga je interes znanosti preusmjeren na razvoj novih makrolidnih antibiotika. Za uspješan dizajn novog makrolida važno je razumjeti njegove interakcije s bakterijskim ribosomom. Stoga je cilj ovog rada okarakterizirati strukturu i interakcije klaritromcina s ribosomom izoliranim iz bakterije Escherichia coli u otopini primjenom jedno- i dvodimenzijskih tehnika NMR. Tehnikama NOESY (engl. nuclear Overhauser effect spectroscopy) i ROESY (engl. rotating frame Overhauser effect spectroscopy) određena je konformacija klaritromicina u slobodnom stanju, a pomoću prijenosnog NOESY određena je konformacija vezanog klaritromicina. Nadalje, metodom STD (engl. saturation transfer difference) proučene su interakcije klaritromicina s ribosomom iz bakterije E. coli i određeni su vezni epitopi. Clarithromycin is a representative of the second generation of macrolide antibiotics, which includes better-known azithromycin. Macrolides are used for treating infections caused by Gram-positive and Gram-negative bacteria. Binding of macrolides to a large subunit of the bacterial ribosome inhibits protein translation and kills bacterial cells. Due to a frequent use of macrolides, bacteria have developed different resistance mechanisms. For this reason, the interest of science has been redirected to the development of new macrolide antibiotics. For a successful design of a new macrolide, it is important to understand its interactions with the bacterial ribosome. Therefore, the purpose of this study is to characterize the structure and interactions of clarithromycin with ribosome isolated from Escherichia coli in solution using one- and two-dimensional NMR techniques. Conformational studies of clarithromycin in the free-state were carried out using NOESY and ROESY techniques, while the bound-state conformation was determined from trNOESY correlations. Furthermore, the interactions of clarithromycin with the E. coli ribosome were studied by STD method, which allowed the assessment of binding epitopes.

Mnoga istraživanja u područjima medicine, biologije, kemije i farmacije temeljena su na proučavanju interakcija bioaktivnih molekula budući da daju uvid u funkciju bioloških procesa u živim organizmima. Za uspješan dizajn lijekova i bioaktivnih molekula potrebno je odrediti funkcijske skupine, strukturne elemente odgovorne za biološku aktivnost, mjesta i način vezanja liganda na makromolekule te trodimenzijsku strukturu. Iako postoje mnoge tehnike poput infracrvene i elektronske spektroskopije, koje mogu u grubo strukturno okarakterizirati biomolekule i njihove interakcije, najčešće se primjenjuje spektroskopija NMR koja daje detaljan uvid u strukturu i interakcije bez potrebe za uništavanjem uzorka. Također, primjenom eksperimenata NMR koji se uglavnom provode u otopini, čime se oponašaju uvjeti in vivo, biomolekule zadržavaju svoju izvornu konformaciju ne utječući na afinitet i način vezanja. U ovom su radu na konkretnim primjerima opisane neke od interakcija ( protein-ligand, membrana-ligand, makrolid-membrana) te rezultati kojima se potvrđuje interakcija i značenje biomolekula.

Makrolidni antibiotici u širokoj su upotrebi od pedesetih godina dvadesetog stoljeća. Tijekom njihove dugogodišnje upotrebe u medicini i veterini došlo je do pojave rezistencije. Cilj ovog diplomskog rada bio je istražiti vezanje deset strukturnih derivata azitromicina u regiju PTAR ribosoma bakterije Escherichia coli metodom molekulskog uklapanja. Prvi korak bio je pretražiti konformacijski prostor svakog liganda metodom Monte Carlo uz korištenje četiri različita modela otapala. Najzastupljeniji konformeri korišteni su kao početne strukture u računima molekulskog uklapanja u regiju PTAR bakterijskog ribosoma. Računima molekulskog uklapanja izračunat je afinitet svih deset liganada za vezanje u vezno mjesto PTAR bakterijskog ribosoma. S obzirom da se rezistencija na makrolide temelji na dimetilaciji A2058 ili A2058G supstituciji, pronađen je ligand s najvećim potencijalom za aktivnost protiv bakterija rezistentnih na makrolide. Kod tog liganda, pet pronađenih energijski najpovoljnijih načina vezanja ne ostvaruje interakcije s A2058. Analiza rezultata računa molekulskog uklapanja za svih deset liganada ukazala je na važnost π-π interakcija za stabilizaciju liganda u veznom mjestu. Predložena su tri nova liganda kod kojih bi potencijal za ostvarivanje π-π interakcija u veznom mjestu PTAR ribosoma bakterije Escherichia coli trebao biti još izraženiji. Macrolides are widely used antibiotics since 1950s. Their extensive use in medicine and veterinary medicine has led to the development of resistance. Goal of this thesis is to study binding of ten structural derivatives of azitromycin to PTAR region of Escherichia coli ribosome using computational methods, primarily docking. First step was to conduct Monte Carlo conformational searches of all ten ligands using four different solvent models. The representative conformers were used as input structures for docking study of their binding into bacterial PTAR. Binding affinities of all ten ligands into E. coli PTAR were obtained. Ligand that does not interact with A2058 within its five best binding modes was identified. That ligand is considered as the one with the greatest potential of effectiveness against macrolide resistant bacteria since bacterial resistance to macrolides is based on A2058 dimethylation or A2058G substitution. Analysis of the results obtained by docking pointed to the importance of π-π interactions for ligand stabilisation within bacterial PTAR. Three ligands with enhanced potential for π-π interactions within Escherichia coli PTAR are proposed proposal for further research

Makrolidni antibiotici, poput azitromicina, koriste se u liječenju infekcija uzrokovanih Gram-pozitivnim i Gram-negativnim bakterijama. Djeluju kao inhibitori sinteze bakterijskih proteina tako što se vežu na 50S podjedinicu bakterijskog ribosoma u blizini centra peptidil-transferaze. Učestalo korištenje makrolidnih antibiotika dovelo je do pojave i razvoja bakterijske rezistencije. Iz tog razloga javlja se potreba za otkrićem i razvojem novih antibiotika. Za razumijevanje cjelokupnog biološkog profila novog potencijalnog lijeka važno je odrediti konformaciju molekule u slobodnom i vezanom stanju te istražiti interakcije s biološkim metama. U ovom radu uspješno je pripravljen 3-aminopropil dekladinozil derivat azitromicina (S6), prekursor u sintezi makrozona, novih bioaktivnih konjugata azitromicina i tiosemikarbazona. Pripravljeni spoj okarakteriziran je spektroskopijom NMR i spektrometrijom masa. Upotrebom tehnike ROESY određena je konformacija prekursora u slobodnom stanju, a pomoću tehnika tr-NOESY i STD istražene su interakcije prekursora s ribosomom izoliranim iz bakterije Escherichia coli te je određena konformacija u vezanom stanju. Macrolide antibiotics, such as azithromycin, are used to treat infections caused by Gram-positive and Gram-negative bacteria. They act as inhibitors of bacterial protein synthesis by binding to the 50S subunit of the bacterial ribosome at or near the peptidyl transferase center. Frequent use of macrolide antibiotics has led to the emergence of bacterial resistance. For this reason, there is a need to discover and develop new antibiotics. To understand the overall biological profile of a new potential drug, it is important to determine the conformation of molecules in the free and bound state and to investigate interactions with biological targets. In this work, 3-aminopropyl decladinosyl derivative of azithromycin (S6), a precursor in the synthesis of macrozones, a new bioactive conjugate of azithromycin and thiosemicarbazone, was successfully prepared. The compound S6 was characterized by NMR spectroscopy and mass spectrometry. ROESY technique was applied to estimate free conformation in solution. The interactions of S6 with the ribosome isolated from Escherichia coli were investigated by using tr-NOESY and STD techniques. The analysis of the recorded spectra enabled determination of conformation in bound state.

U sklopu ovog diplomskog rada istražene su interakcije izmeĎu 10 različitih azitromicinskih derivata i veznog mjesta PTAR-a (engl. peptidyl transferase-associated region) velike podjedinice ribosoma bakterije Escherichia coli s ciljem dizajniranja novih, potencijalno efikasnih antibiotika. Vezanje azitromicinskih derivata u veznog mjesta PTAR-a istraženo je s pomoću računalnih metoda molekulskog uklapanja i Monte Carlo konformacijske pretrage. Prije računalnog istraživanja interakcija azitromicinskih derivata i veznog mjesta PTAR-a, konformacijski prostor svakog od 10 liganada pretražen je Monte Carlo algoritmom uz 4 različita modela otapala. Najpovoljniji konformeri pronaĎeni u svakom od modela otapala, kao i konformeri koji najbolje reprezentiraju grupe dobivene klaster analizom, korišteni su kao početne strukture prilikom istraživanja interakcija vezanja liganada u vezno mjesto PTAR-a. Rezistencijski mehanizmi patogenih bakterija otežavaju primjenu makrolidnih antibiotika u kliničkoj praksi. Jedan od najčeščih oblika rezistencije koji nalazimo kod bakterijskih patogena je dimetilacija A2058 ili A2058G supstitucija unutar 23S rRNA. Temeljem provedenog računalnog istraživanja vezanja liganada u PTAR velike podjedinice prokariotskog ribosoma utvrĎeno je da se ligand D efikasno veže u PTAR i u prisutnosti dimetiliranog A2058 što bi moglo značiti efikasnu primjenu ovog spoja i kod sojeva koji su razvili rezistenciju putem dimetiliranja A2058. Štoviše, ligand D u PTAR-u s dimetiliranim A2058 ima nižu energiju vezanja nego ligand D vezan u PTAR s A2058 koji nije metiliran. Efikasno vezanje liganda D uzrokovano je prvenstveno hidrofobnim interakcijama koje makrolaktonski prsten stvara s aminokiselinama Lys 90, Lys 91 i Arg 92, te s nukleotidom A751. Navedeni aminokiselinski i nukleotidni ogranci grade izlazni kanal PTAR-a te stoga spomenute interakcije predstavljaju potencijalno efikasni način blokiranja izlaznog kanala PTAR-a. The aim of this graduate thesis is the designing of new, potentially effective antibiotics. Interactions between 10 different azithromycin derivatives and peptidyl-transferase center of the Escherichia coli ribosome were investigated by computational methods consisting of docking and Monte Carlo conformational searches. Prior to study of interactions between azithromycin derivatives and the PTAR binding site, the conformational space of each of the 10 ligands was investigated with Monte Carlo algorithm using 4 different solvent models. The energetically most favourable conformers of each ligand for each solvent model, as well as the cluster representatives obtained by cluster analysis, were used as starting structures for investigation of ligand binding into the PTAR binding site. Resistance mechanisms of pathogenic bacteria are a growing issue for the application of macrolide antibiotics in clinical practice. One of the most common forms of resistance found in bacterial pathogens is dimethylation A2058 and A2058G substitution within 23S rRNA. Results obtained in the frame of this thesis suggest that ligand D effectively binds to PTAR regardless of the presence of dimethylated A2058. This means that ligand D could potentially be an efficient antibiotic compound even against strains that have developed resistance to dimethylation A2058. Furthermore, ligand D, in PTAR with dimethylated A2058, has lower binding energy than ligand D bound to the PTAR with non-methylated A2058. Effective binding of ligand D is caused primarly by the hydrophobic interactions between macrolactone ring with Lys 90, Lys 91, Arg 92 and A751. Since the exit channel of PTAR consists of mentioned amino acids and nucleotides, these interactions of ligand D might represent a potentially effective way of blocking the PTAR exit channel.

Unatoč rastućoj rezistenciji na makrolide među najčešćim respiratornim patogenima, osobito u zemljama s dugotrajnom primjenom makrolida, azitromicin ima važnu ulogu u liječenju čestih dječjih infekcija. Respiratorne infekcije, ponajprije upala pluća iz opće populacije, posebice među djecom starijom od 5 godina, kao i terapijska kombinacija za liječenje pneumonije u mlađe djece ako postoji sumnja na miješanu infekciju, odnosno teži / komplicirani klinički tijek bolesti, ostaju važno indikacijsko područje za azitromicin. Također, dokazi o ulozi atipičnih bakterija (Mycoplasma pneumoniae i Chlamydia pneumoniae) u etiologiji akutnoga tonzilofaringitisa i astme, kao i kontinuirana prisutnost hripavca u populaciji ističu jasne indikacije za primjenu makrolida / azalida u pedijatrijskoj medicini. Liječenje streptokoknog tonzilofaringitisa u Hrvatskoj, u kojoj rezistencija Streptococcusa pyogenesa na makrolide iznosi oko 7%, također ostaje indikacija za primjenu makrolida / azalida, osobito u slučaju alergije na beta-laktamske antibiotike i u slučajevima kada se liječenje može otpočeti nakon prijma bakteriološkog nalaza obriska ždrijela. Azitromicin ima nedvojbeno mjesto i u liječenju nerespiratornih infekcija poput bolesti mačjeg ogreba (infekcije uzrokovane Bartonellom henselae), antimikrobnog liječenja bakterijskog proljeva i proljeva putnika, solitarnoga migratornog eritema (lajmske borelioze), nekih neonatalnih infekcija (klamidijskog konjunktivitisa i pneumonije), kao i nekih drugih infekcija (infekcije kože i mekih česti (impetigo, erizipel, celulitis, folikulitis, paronihija), kriptosporidioza, profilaksa meningokokne bolesti, egzacerbacije kod cistične fibroze)., Despite the increasing macrolide resistance among the most common respiratory pathogens, especially in countries with a long-term use of macrolides, azithromycin plays an important role in the treatment of frequent infections in children. Respiratory infections, primarily community-acquired pneumonia, among children above the age of 5 in particular, as well as therapeutic combination for the treatment of pneumonia in younger children with suspected mixed infection or severe/complicated course of clinical disease, remain an important indication area for azithromycin. Moreover, evidence of the role of atypical bacteria (Mycoplasma pneumoniae and Chlamydia pneumoniae) in the aetiology of acute tonsillopharyngitis and asthma, as well as the continuous presence of whooping cough in population, point out clear indications for the use of macrolides/azalides in paediatric medicine. The treatment of streptococcal tonsillopharyngitis in Croatia, where macrolide resistance in Streptococcus pyogenes is about 7%, also remains an indication for the administration of macrolides/azalides, particularly in the case of beta-lactame antibiotic allergy and in the cases where treatment can be initiated following the receipt of bacteriological findings for throat swab. Azithromycin should undoubtedly be used in the treatment of non-respiratory infections such as cat-scratch disease (infections caused by Bartonella henselae), antimicrobial therapy of bacterial diarrhoea and traveller's diarrhoea, solitary erythema migrans (Lyme borreliosis), some neonatal infections (chlamydial conjunctivitis and pneumonia), as well as some other infections (skin and soft tissue infections such as impetigo, erysipelas, cellulitis, folliculitis and paronychia, and cryptosporidiosis, meningococcal prophylaxis, cystic fibrosis exacerbations).

Antibiotici koji sadrže makrociklički laktonski prsten na koji su najčešće α-L i β-D glikozidnim vezama vezane jedna do tri molekule šećera, među kojima se obično susreću aminošećeri i neutralni šećeri, nazivaju se makrolidni antibiotici. Razlikuju se prirodni i polusintetski makrolidi. U principu, radi se o 12, 14 ili 16-eročlanim laktonskim prstenovima. Makrolidi selektivno djeluju na bakterijske ribosome reverzibilnim vezanjem za podjedinice 50S. U bakterijskom protoplastu koče sintezu proteina inhibirajući aktivnost peptidil- transferaznog centra koji stvara peptidne veze između aminokiselina. Visoka učinkovitost i sigurnost makrolida, kao i njihova upotreba kao alternativna terapija za pacijente intolerantne na penicilin, učinila ih je često korištenim lijekovima. Široka upotreba tih antibiotika neizbježno je dovela do širenja otpornih sojeva. Eritromicin A je glavni predstavnik makrolida i prvi klinički korišteni makrolidni antibiotik. Pojava rezistencije i osjetljivosti same eritromicinske baze u kiselom mediju doveli su do istraživanja i sinteze novih derivata eritromicina A s povećanom stabilnošću u kiselom mediju, produljenom biološkom poluživotu i zadržanom antimikrobnom aktivnošću. Takvi spojevi su 14-eročlani polusintetski makrolidni antibiotici (roksitromicin, klaritromicin, diritromicin i ostali), azitromicin i ketolidi. Azitromicin je 15-eročlani makrolidni antibiotik, glavni predstavnik klase azalida, kojeg je razvio tim hrvatskih znanstvenika iz tvornice lijekova PLIVA. Karakterizira ga metil-supstituirani atom dušika umetnut u aglikon eritromicina A i širok spektar djelovanja. Ketolidi su nova klasa makrolidnih antibiotika izvedenih iz eritromicina A zamjenom šećera kladinoze s karbonilnom skupinom i vezanjem cikličkog karbamata u laktonski prsten. Ove modifikacije daju ketolidima mnogo širi spektar djelovanja od ostalih makrolida i veću učinkovitost protiv rezistentnih bakterija. Prvi klinički korišteni ketolid je telitromicin. Danas su u kliničkoj upotrebi i 16-eročlani makrolidni antibiotici poput josamicina i spiramicina. Iako imaju sličan antibakterijski profil, 16-eročlani makrolidi pokazuju neke prednosti u odnosu na ostale makrolide, uključujući bolju aktivnost protiv određenih rezistentnih bakterija i agresivniju inhibiciju sinteze proteina zbog dodatnih interakcija s ribosomom. Danas se intenzivno istražuju novi, jednostavniji i jeftiniji načini sinteze makrolidnih antibiotika kako bi se održao korak s bakterijskom rezistencijom. Nedavno je otkriveno da makrolidi posjeduju protuupalno djelovanje. To je polje još neistraženo i predstavlja budućnost ove klase lijekova.

Zbog jedinstvene farmakokinetike, odnosno kliničke učinkovitosti, jednostavnog doziranja i dobre podnošljivosti azitromicin je dvadesetak godina imao status izuzetno poželjnog antibiotika, posebno u liječenju akutnih respiratornih infekcija. Pojavom sve učestalije rezistencije pneumokoka na penicilin i makrolide taj je primat sada potisnut, no i danas je azitromicin vrlo važan i nezaobilazan antibiotik. Zbog neučinkovitosti beta-laktamskih antibiotika azitromicin je ostao antibiotikom prvog izbora u liječenju atipičnih pneumonija i hripavca. Također ima vrlo važnu ulogu u liječenju težih oblika pneumonija u kombinaciji s beta-laktamskim antibioticima. U liječenju bakterijskih infekcija gornjeg dijela dišnog sustava (faringitis, sinusitis, otitis media) te akutnih egzacerbacija kronične opstruktivne plućne bolesti azitromicin je alternativni izbor pri alergiji na betalaktamske antibiotike. Nova saznanja o imunomodulaciji i protuupalnom ucinku makrolida pozicionirala su uporabu azitromicina u cističnoj fibrozi i drugim kroničnim bolestima dišnog sustava., For over twenty years, due to its unique pharmacokinetic profile, i. e. clinical efficacy, simple dosing and good tolerability, azithromycin was the preferred antibiotic, especially for the treatment of acute respiratory infections. As a result of an increasing trend in pneumococcal resistance to penicillin and macrolides, azithromycin has lost this prime position, but it still remains an important and indispensable antibiotic. Due to the inefficacy of beta-lactam antibiotics, azithromycin remained the first-line antibiotic for the treatment of atypical pneumonia and pertussis. Furthermore, combined with beta-lactam antibiotics, it plays a major role in the treatment of severe cases of pneumonia. Azithromycin is an alternative choice for the treatment of upper respiratory tract infections (pharyngitis, sinusitis, and otitis media) and acute COPD exacerbations in patients allergic to beta-lactam antibiotics. New discoveries regarding immunomodulatory and anti-inflammatory effect of macrolides have led to the use of azithromycin in patients with cystic fibrosis and other chronic respiratory diseases.

The aim of the study was to evaluate the effect of tylosin, tilmicosin and roxithromycin on viability, nitro blue tetrazolium reduction (NBT) assay, chemotaxis, apoptosis and oxidative stress in bovine leukocytes in vitro conditions. The material for the study consisted of blood collected into EDTA tubes from the external jugular vein of Holstein-Friesian cattle aged 1 week to 2.5 years, during routine veterinary examinations. In leukocytes the percent of viability, nitrate ion concentration (NO), metabolic activity (NBT, nitrotetrazolium blue reduction assay), chemotactic activity and apoptosis were determined. The results indicated a slight negative effect of these macrolides on the viability of the leukocytes, and confirmed the ability of macrolides to induce apoptosis in leukocytes in vitro. These results indicate that all of the macrolides investigated exhibit a modulatory effect on the functions of leukocytes isolated from cattle of different ages. The strongest inhibitory effect on the NBT reduction assay and chemotaxis of the leukocytes was exhibited by roxithromycin, which at the same time had the least negative effect on the leukocytes., Cilj je ovog istraživanja bio procijeniti učinak tilozina, tilmikozina i roksitromicina na preživljavanje, test redukcije “nitro-tetrazol-modrog” (NBT), kemotaksiju, apoptozu i oksidacijski stres goveđih leukocita u uvjetima in vitro. Prilikom rutinskog veterinarskog pregleda, u epruvete s EDTA bila je uzeta krv iz jugularne vene goveda holštajnsko-frizijske pasmine u dobi od tjedan dana do 2,5 godine. Određen je postotak preživljavanja leukocita, koncentracija iona nitrata (NO), metabolička aktivnost (test redukcije “nitro-tetrazol-modrog”, NBT), kemotaksijska aktivnost i apoptoza. Rezultati su pokazali blagi negativni učinak spomenutih makrolida na preživljavanje leukocita i potvrdili sposobnost makrolida da potaknu njihovu apoptozu in vitro te naznačuju da svi pretraženi makrolidi imaju modulacijski učinak na funkciju leukocita goveda različite dobi. Najjači inhibicijski učinak na test redukcije NBT i kemotaksiju leukocita pokazao je roksitromicin, koji je istodobno imao najmanje negativan učinak na leukocite.

Uvod: U prošlosti žučne kiseline su uglavnom razmatrane sa stanovišta njihove funkcije koju obavljaju u crevima jer posreduju u varenju masti i apsorpciji liposolubilnih vitamina. Nedavne studije potvrđuju da žučne kiseline ne igraju samo ulogu u varenju masti, nego se ponašaju i kao signalni molekuli koji stupaju u interakciju sa raznim receptorima uključujući nuklearne receptore i receptore vezane za G-proteine. Kao amfipatični molekuli one su sposobne da reaguju sa fosfolipidima ćelijskih membrana i da poboljšavaju prolazak lekova kroz njih. Stoga se žučne kiseline razmatraju kao promoteri u bukalnim, okularnim i nazalnim farmaceutskim formulacijama. Cilj: Svrha ovog istraživanja je bila da se ispitaju žučne kiseline i njihovi okso derivati kao jedinjenja koja utiču na propustljivost ćelijskih membrana i prolazak lekova do ciljnih tkiva. Materijal i metod: Interakcije makrolidnih antibiotika i žučnih kiselina su ispitivane uz pomoć NMR difuzionih merenja i relaksacije paramagnetičnim jonima. Retencioni parametri odabranih žučnih kiselina su dobijeni korišćenjem hromatografije na normalnim fazama i evaluisani su primenom pet različitih softvera. In vivo ekaperimenti su sprovedeni na 126 eksperimentalnih životinja koje su bile podeljene u 21 grupu. Rezultati: Vezivanje žučnih kiselina za micele je indikovano razlikama u hemijskom pomeranju makrolida i proširenju signala kao posledica redukovane mobilnosti unutar micela. Dodatak micela žučnih kiselina povećava solubilizaciju makrolida za faktor približno 2-3. Sprovedena korelaciona analiza pokazala je značajnu zavisnost između faktora retencije i intestinalne apsorpcije, prodora u MDCK epitelne ćelije, permeabilnost kroz kožu, logBB i PPB%. Putem implementacije in vivo eksperimentalnog dela pokazano je da žučne kiseline utiču na prolazak makrolida u tkivo mozga, bubrega i jetre. Zaključak: Ispitivane žučne kiseline pokazuju dobre farmakokinetske karakteristike i olakšavaju prolazak makrolida kroz različite ćelijske membrane., Introduction: In the past, bile acids were mostly considered to function in the intestine where they play a role in digestion of fats and mediate absorption of fat-soluble vitamins. Recent studies confirm that bile acids not only facilitate solubilization of fats but behave as signal molecules that interact with various receptors including nuclear receptors and G protein-coupled receptors. As amphipathic molecules they are able to interact with phospholipids of cells membranes and enhance drugs permeation. Thus, bile acids are considered as drug promoters in buccal, ocular, nasal, and transdermal dosage forms. Purpose: The purpose of this research was to investigate bile acids and its oxo derivatives as enhancers in drug permeability. Three research methods to evaluate the characteristics of bile acids and its properties were used. Material and method: The interaction between macrolide antibiotics and bile acids was investigated by NMR chemical-shift titration, self-diffusion measurements and paramagnetic relaxation enhancements. Retention parameters of selected bile acids are acquired by normal-phase thin layer chromatography and evaluated using five different softwares. In vivo experiments were conducted on 126 animals which were divided in 21 groups. Results: Binding bile acids to the micelles is indicated by differences in the chemical shift of the macrolides and line broadening as a consequence of reduced mobility in the micelle. Addition of bile micelles increases the solubility of macrolide antibiotics by a factor of approximately 2–3. Examined correlation analysis confirmed significant dependence between retention factor and intestinal absorption, MDCK epithelial cells, skin permeability, logBB and PPB%. Through the implementation of in vivo experiments it is shown that bile acids promote penetration of macrolides in brain tissue, kidney and liver. Conclusion: Investigated bile acids showed good pharmacokinetic properties and facilitate in macrolides permeation through various membranes.

Streptococcus pneumoniae (pneumokok) je jedan od vodećih uzroka morbiditeta i mortaliteta širom sveta, kada su u pitanju infektivne bolesti. Pretežno izaziva infekcije gornjih respiratornih puteva (sinuzitis, otitis) i konjunktivitis. Vodeći je uzročnih vanbolničkih pneumonija, bakterijskog meningitisa i sepse. Lekovi izbora u terapiji pneumokoknih bolesti su beta laktamski antibiotici i makrolidi. Iako se makrolidni antibiotici uveliko koriste u lečenju pneumokoknih infekcija širom sveta, porast rezistencije na makrolide bi mogao da kompromituje njihovu upotrebu. Rezistencija pneumokoka na makrolide je posredovana putem dva glavna mehanizma: modifikacija ciljnog mesta delovanja leka i aktivni efluks leka. Metilaciju 23S ribozomalne ribonukleinske kiseline (rRNK) obavlja enzim metilaza, čiju sintezu kodira ermB gen. Kod ovog tipa rezistencije dolazi do ukrštene rezistencije na makrolide (M), linkozamide (L) i streptogramine B (Sb). Ovakav vid rezistencije se ispoljava kao MLSb - fenotip i karakteriše ga visok nivo rezistencije. Može se javiti kao konstitutivni (cMLS) i inducibilni (iMLS). Drugi mehanizam rezistencije na makrolide je aktivni efluks leka, kodiran od strane mefA gena. Efluks antibiotik a determiniše rezistenciju samo na 14-člane i 15-člane makrolide, bez ukrštene rezistencije. Ispoljava se kao M-fenotip, a karakteriše ga niži stepen rezistencije. Cilj ove studije je bio da se odredi u čestalost makrolidne rezistencije Streptococcus pneumoniae među invazivnim i neinvazivnim izolatima kod dece i odraslih, da se odrediti u čestalost korezistencije i multiple rezistencije kod makrolid rezistentnih sojeva Streptococcus pneumoniae, da se fenotipski odredi tip rezistencije na makrolide i da se ispita genska osnova makrolidne rezistencije (detektovati prisustvo ermB i mefA gena). Analizirani su podaci o 326 sojeva Streptococcus pneumoniae rezistentnih na makrolide (MRSP) sakupljenih širom Srbije u periodu od januara 2010. do decembra 2012. godine. Sakupljeni MRSP izolati su transportovani u Nacionalnu referentnu laboratoriju za streptokok radi daljih ispitivanja. Identifikacija je vršena na osnovu mikroskopskih, kulturelnih i biohemijskih osobina. Konzervacija je vršena u moždano-srčanom bujonu sa 10% sadržajem glicerola na -80°C. Dvostruki disk difuzioni test, kombinovani difuzion odilucioni test i automatizovani VITEK 2 sistem su korišćeni za određivanje fenotipova rezistencije na makrolide. Geni koji kodiraju rezistenciju na makrolide su detektovani PCR metodom. Ukupna rezistencija sojeva S.pneumoniae na makrolide u Srbiji je iznosila 34%. Sojevi S.pneumoniae rezistentni na makrolide su češće bili izolovani kod dece (36%) u odnosu na odrasle (29%) osobe, i češće su izolovani iz neinvazivnih (35,5%) u odnosu na invazivne (27,4%) materijale. Dominantan fenotip rezistencije na makrolide je bio MLSb fenotip (78,5%). Konstitutivan MLS fenotip je bio zastupljen kod 73,9%, a inducibilan MLS kod 4,6% MRSP izolata. Potvrđena je udruženost mefA gena i M fenotipa; ermB gena i iMLS fenotipa, kao i ermB gena i cMLS fenotipa. Prisustvo oba ermB i mefA gena rezistencije je potvrđeno kod 43,9 % izolata. Svi izolati sa koji su imali oba gena rezistencije su ispoljili MLSb fenotip. Istovremena neosetljivost na penicilin je bila zastupljena kod 16% MRSP sojeva. Visok nivo rezistencije na penicilin je imalo svega 5,8% MRSP izolata. Među MRSP sojevima je bio prisutan visok nivo rezistencije na tetraciklin (81,3%) i trimetoprim-sulfametoksazol (74,3%). Multirezistenti sojevi, koji su bili rezistentni na tetracikline i trimetoprim-sulfametoksazol su predstavljali dve trećine (66,1%) MRSP izolata. Zastupljenost udružene rezistencije MRSP na tetraciklin i trimetoprim-sulfametoksazol je bila veća kod sojeva sa MLS fenotipom (73,1%) u odnosu na sojeve sa M fenotipom (36,7%). Zastupljenost istovremene rezistencije na makrolide i druge antibiotike među kojima su penicilin, amoksicilin, cefotaksim, tetraciklin, trimetoprim-sulfametoksazol, kao i multirezistentnih sojeva je bila veća kod pedijatrijskih izolata pneumokoka u odnosu na sojeve dobijene kod odraslih. U čestalost istovremene rezistencije na makrolide i druge antibiotike među kojima su tetraciklin i ofloksacin je bila više prisutna među neinvazivnim u odnosu na invazivne MRSP izolate. Invazivni MRSP izolati iz likvora su pokazivali veću rezistenciju na beta laktamske antibiotike u odnosu neinvazivne sojeve. MRSP sojevi su pokazali veoma visok nivo osetljivosti na levofloksacin (99,6), telitromicin (98,4%), cefotaksim (93,5%), i mipenem (97,3%). MRSP sojevi su u potpunosti bili osetljivi na vankomicin, linezolid, moksifloksacin, sparfloksacin, rifampicin i pristinamicin. Među invazivnim sojevima S.pneumoniae rezistentnim na makrolide je nađeno 12 različitih serotipova. Polovina izolata je pripadala serotipovima 19F (25%) i 14 (23%), dok su sledeći po učestalosti bili 6A (10,4%) i 23F (8,3%). Istovremena rezistencija na makrolide, penicilin, tetracikline i trimetoprim-sulfametoksazol je nađena kod serotipova 19F, 14 i 23F, dok su serotpovi 12F i 31 bili neosetljivi samo na makrolide. Naše istraživanje predstavlja prvu detaljnu analizu fenotipskih i genotipskih osobina sojeva pneumokoka rezistentnih na makrolidne antibiotike u Srbiji. Dobijeni rezultati ukazuju na potrebu za aktivnim nadzorom nad pneumokoknim infekcijama u Srbiji., Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is one of the leading morbidity and mortality causes all over the world with respect to infectious diseases. Streptococcus pneumoniae is a leading cause of upper respiratory tract infections ( sinusitis, otitis) and conjunctivitis. It is also the most common cause of community-acquired pneumonia, bacterial meningitis and sepsis. Beta lactam and macrolide antibiotics remained a first choice for empirical treatment of pneumococcal infections. Although macrolides are widely used for treatment of pneumococcal infections, an increase in macrolide resistance might compromise their use. Pneumococcal macrolide resistance is mediated by two major mechanisms: target site modification and active drug efflux. Methylation of the 23S ribosomal ribonucleic acid (rRNA) is performed by the enzyme methylase, encoded by the ermB gene. Modification of ribosomal targets leads to cross-resistance to macrolides (M), lincosamides (L) and streptogramins B (Sb). It is expressed as the MLSb –phenotype, which confers a high-level resistance. This phenotype can be either constitutively (cMLS) or inducibly (iMLS). expressed. Another macrolide resistance mechanism is the active drug efflux, encoded by the mefA gene. The drug efflux confers resistance to 14- and 15-membered macrolides only, with no cross-resistance. It is expressed as the M-phenotype, which confers low-level resistance. The objective of this study was : 1) to examine the prevalence of macrolide resistant Streptococcus pneumoniae (MRSP) among invasive and noninvasive isolates in children and adults, 2) to examine the prevalence of coresistance and multiple-resistance among MRSP strains, 3) to examine the prevalence of macrolide resistant phenotypes, and 4) to examine the prevalence of macrolide resistant genotypes (detect the presence of the ermB and mefA gene). A total of 326 MRSP strains were analyzed, which were collecte dall over Serbia in the period from January, 2010 - December, 2012. The collected MRSP isolates were referred to the National Reference Laboratory for streptococci and pneumococci for further investigation. Identification based on microscopic, culture and biochemical features of the isolates. Conservation was performed in the brain-heart infusion broth with a 10% glycerol content at -80°C. Macrolide resistance phenotypes were determined by a double disc diffusion test, combine d diffusion-dilution test and automatized VITEK 2 system. Macrolide resistance genes were determined by PCR. Overall, macrolide nonsusceptibility rate in Serbia was 34%. MRSP isolates were more prevale nt among children (36%) than adults (29%), and were more prevalent among noninvasive (35.5%) than invasive (27.4%) samples. Predominant macrolide resistance phenotype was the MLS b phenotype (78.5%), from which 73.9 % belonged to cMLS and 4.6% to iMLS phenotype. All the strains assigne d to the MLSb phenotype harbored ermB gene, while all the strains with M phenotype had the mefA gene. The presence of both ermB and mefA resistance genes was confirmed in 43.9 % of isolates. All the isolates which harbored both resistance genes expressed the MLSb phenotype. Among macrolide resistant strains, penicillin nonsusceptiblility was observed in 16% . A high level resistance was confirmed in 5. 8% of MRSP isolates. MRSP strains showed high resistance rates to tetracyclin (81.3%) and trimethoprim-sulfamethoxazole (74.3%). Multiresistant strains, resistant to tetracyclines and trimethoprim-sulfamethoxazole, made two thirds (66.1 %) of MRSP isolates. Among MRSP, co-resistance to tetracycline and trimethoprim-sulfamethoxazole was more prevalent among MLS phenotypes (73.1%) than M phenotypes (36.7%). Co-resistance strains to macrolides and other antibiotics including penicillin, amoxicillin, cefotaxime, tetracyclin, trimethoprim-sulfamethoxazole and multiresistant strains were more prevalent among children than adult. Coresistance to macrolides and other antibiotics including tetracycline and ofloxacin was more prevalent among noninvasive than invasive strains. Invasive MRSP isolates from the cerebrospinal fluid showed a higher resistance rate to beta lactam antibiotics than noninvasive strains. MRSP strains had a high susceptibility rates to levofloxacin (99.6), telithromycin (98.4%), cefotak sime (93.5%) and imipenem (97.3%). MRSP strains were fully susceptible to vancomycin, linezolid, moxifloxacin, sparfloxacin, rifampicin a nd pristinamycin. Among macrolide resistant S.pneumoniae strains, 12 different serotypes were identified. One half of these isolates belonged to the 19F (27.1%) and 14 (22. 9%) serotype, followed in frequency by the 6A (10.41%) and 23F (8.3%) serotype . Multiresistant strains (macrolides, penicillin, tetracyclines and trimethoprim-sulfamethoxazole) belonged to serotypes 19F, 14 and 23F, while the 12F and 31 serotype were resistant to macrolides only. This in vestigation represents the first detailed analysis of phenotypes and genotypes of macrolide resistant pneumococcal strains in Serbia. The obtained results suggest the need for an active surveillance of pneumococcal infections in Serbia.

Uvod: S. pyogenes je najčešći bakterijski uzročnik akutnih tonzilofaringitisa. Iako su penicilinski preparati prva terapijska linija u lečenju streptokoknih faringitisa, u slučajevima preosetljivosti na penicilin, propisuju se makrolidi. Početkom 21. veka, uočen je porast rezistencije grupe A streptokoka (GAS) na eritromicin, širom sveta. Dva glavna mehanizma rezistencije S. pyogenes na makrolide su aktivni efluks antibiotika i izmena ciljnog mesta delovanja. Gen mefA, kodira proteine efluksne pumpe, koji dovode do umerenog stepena rezistencije na 14-člane i 15-člane makrolide (M fenotip). Drugi mehanizam rezistencije je metilacija ciljnog mesta delovanja makrolida. On se odlikuje ukrštenom rezistencijom na makrolide, linkozamide i streptogramine (MLS fenotip). Inducibilan MLS fenotip (iMLS) najčešće determiniše ermA, a konstitutivan MLS fenotip (cMLS) ermB gen. Najčešće korišćena metoda za tipizaciju GAS je emm tipizacija. Ova metoda se zasniva na sekvenciranju hipervarijabilnog dela emm gena, koji kodira M protein, glavni faktor virulencije GAS. MLST (engl. multilocus sequence typing) je metoda genotipizacije, koja se bazira na umnožavanju i sekvenciranju 7 visoko konzerviranih, tzv. „house-keeping” gena, koji kodiraju enzime od vitalnog značaja. RAPD (engl. random amplified polymorphic DNA) metoda se bazira na nasumičnom umnožavanju fragmenata DNK i elektroforetskom razdvajanju dobijenih produkata. Cilj ove studije je bio da se proceni učestalost rezistencije grupe A streptokoka na makrolide u Srbiji, da se odrede fenotipovi rezistencije na makrolide, da se odredi distribucija gena koji kodiraju rezistenciju na makrolide i tetracikline, da se utvrdi klonska distribucija i eventualna klonska veza među sojevima GAS rezistentnih na makrolide (MRGAS), kao i da se proceni osetljivost MRGAS sojeva na druge klase antibakterijskih lekova. Materijal i metode: Analizirani su podaci o rezistenciji 3893 sojeva izolovanih od pacijenata sa faringitisom, širom Srbije, u periodu od decembra 2007. do decembra 2008. godine. Sedamdeset sedam MRGAS izolata je poslato u Nacionalnu referentnu laboratoriju za streptokok radi daljih ispitivanja. Identifikacija je vršena na osnovu mikroskopskih, kulturelnih i biohemijskih osobina. Konzervacija je vršena u Todd Hewitt bujonu sa 10% sadržajem glicerola na -80°C... Introduction: S. pyogenes is the most common causative agent of bacterial tonsillopharyngitis. Penicillin is a first choice therapy for infections caused by GAS, since penicillin resistance in streptococci has not yet emerged. Macrolides are preferred for treatment of GAS infections in patients with beta-lactam hypersensitivity. At the beginning of 2000s, significant increase in macrolide resistance has been reported from many countries. Two main well-described molecular mechanisms are responsible for macrolide resistance among streptococci: target site modification and antibiotic efflux. Target site modification due to methylase activity has been linked to the presence of erm gene. This mechanism confers cross-resistance to macrolides, lincosamides and streptogramin (MLS resistance). It can be constitutive (cMLS), usually mediated by the ermB gene or inducible (iMLS), mediated by the ermA gene. The other mechanism of resistance, macrolide efflux is encoded by mefA gene and confers low-level resistance to 14- and 15-membered macrolides. The most common tool used to characterize isolates of S. pyogenes today is emm typing, which is based on sequence at the 5’ end of emm gene that encode M protein, one of the major virulence factor in GAS. Multilocus sequence typing (MLST) is genotyping scheme based on nucleotide sequences of internal fragments of seven selected housekeeping loci. Randomly amplification of polymorphic DNA (RAPD) analysis is genotyping gel based method, with relatively high discriminatory index. The aim of this study was to asses prevalence of macrolide resistance group A streptococci (MRGAS) in Serbia, to determine genotypes and phenotypes of macrolide resistance, as well as to evaluate resistance to tetracycline and to determine tetracycline resistance genes. We were also investigated the clonal relatedness of macrolide resistance strains and their susceptibility to other antimicrobial agents. Material and methods: We evaluated resistance rate of MRGAS in Serbia by analyzing data of 3893 pharyngeal isolates of GAS. A total of 77 MRGAS isolates, originated from patients with pharyngitis, were collected from 7 regional laboratories between December 2007 and 2008. Strains were sent to the National Reference Laboratory for streptococci for further testing...

Currently, there is a large interest in macrocycles due to their structural uniqueness and high potential for difficult targets. In order to preserve favourable ADME properties of novel macrocyclic compounds, high-throughput chromatographic determination of lipophilicity and permeability parameters was used to monitor PhysChem properties. Standard computational tools for lipophilicity prediction are not applicable for 3D enriched macrocyclic compounds, therefore measured PhysChem data were used to guide design of novel compounds. Chromatographic Hydrophobicity Index by gradient reverse-phase HPLC was used at different pH values. An LC-MS system was used due to significant number of compounds lacking chromophores. The advantage of high-throughput PhysChem determination is the small amount of sample needed, which is favourable for the early stage of drug discovery.

Povrh poznatog bakteriostatskog učinka makrolidi, uključujući azitromicin, mogu ublažiti kroničnu upalu i modulirati imunosni odgovor domaćina, a da ne utječu na njegovu sposobnost obrane od infekcija. Ovakva imunomodulacijska svojstva makrolida sve se više rabe u liječenju kroničnih upalnih bolesti dišnih putova u djece i odraslih. Danas je dugotrajna niskodozna primjena azitromicina široko prihvaćena i preporučuje se u liječenju cistične fibroze i bronhiektazija. Makrolidi se ispituju i rabe u liječenju kronične neutrofilne upale dišnih putova koja se često viđa u bolesnika s astmom rezistentnom na kortikosteroide i kroničnom opstruktivnom plućnom bolesti. Međutim potrebna su daljnja klinička ispitivanja koja trebaju prepoznati grupe bolesnika za koje je izgledno da će reagirati na takvo imunomodulacijsko liječenje., Besides their known bacteriostatic activity, macrolides, including azithromycin, can reduce chronic inflammation and modulate immunity without impairing host response against infection. These immunomodulatory properties of macrolides have been increasingly used to treat chronic inflammatory airway diseases in children and adults. Low-dose, long-term therapy with azithromycin is now recommended and widely adopted for the treatment of cystic fibrosis and bronchiectasis. Macrolides are also being investigated and used to treat chronic neutrophilic airway infl ammation, often seen in patients with steroid-resistant asthma and chronic obstructive pulmonary disease. However, further clinical trials are required to identify groups of patients most likely to respond to such immunomodulatory therapy.

Povrh poznatog bakteriostatskog učinka makrolidi, uključujući azitromicin, mogu ublažiti kroničnu upalu i modulirati imunosni odgovor domaćina, a da ne utječu na njegovu sposobnost obrane od infekcija. Ovakva imunomodulacijska svojstva makrolida sve se više rabe u liječenju kroničnih upalnih bolesti dišnih putova u djece i odraslih. Danas je dugotrajna niskodozna primjena azitromicina široko prihvaćena i preporučuje se u liječenju cistične fibroze i bronhiektazija. Makrolidi se ispituju i rabe u liječenju kronične neutrofilne upale dišnih putova koja se često viđa u bolesnika s astmom rezistentnom na kortikosteroide i kroničnom opstruktivnom plućnom bolesti. Međutim potrebna su daljnja klinička ispitivanja koja trebaju prepoznati grupe bolesnika za koje je izgledno da će reagirati na takvo imunomodulacijsko liječenje., Besides their known bacteriostatic activity, macrolides, including azithromycin, can reduce chronic inflammation and modulate immunity without impairing host response against infection. These immunomodulatory properties of macrolides have been increasingly used to treat chronic inflammatory airway diseases in children and adults. Low-dose, long-term therapy with azithromycin is now recommended and widely adopted for the treatment of cystic fibrosis and bronchiectasis. Macrolides are also being investigated and used to treat chronic neutrophilic airway infl ammation, often seen in patients with steroid-resistant asthma and chronic obstructive pulmonary disease. However, further clinical trials are required to identify groups of patients most likely to respond to such immunomodulatory therapy.

Posljednjih godina zabilježen je značajan porast udjela sojeva Streptococcus pneumoniae rezistentnih na makrolide među izolatima uzgojenim iz nazofarinksa djece od 1-5 godina u zagrebačkoj regiji, pa se rezistencija kreće od 35-40%. Svrha ovog istraživanja bila je stoga utvrditi koji fenotip makrolidne rezistencije pokazuju rezistentni sojevi. U istraživanje je uključeno 94 izolata S. pneumoniae, od kojih je 35 (37, 2%) bilo rezistentno na makrolide. Fenotip rezistentnih sojeva ispitivan je standardnim metodama mikrodilucije, te disk-difuzije upotrebom diskova eritromicina i klindamicina. Utvrđeno je da su svega 6/35 sojeva pokazali M-fenotip kod kojeg je rezistencija na makrolide uvjetovana efluksom antibiotika iz bakterijske stanice, te da je MLSB fenotip bio dominantan. Od 29 sojeva s MLSB fenotipom u samo jednog utvrđen je inducibilni tip rezistencije, dok je 28 sojeva pokazivalo konstitutivni tip MLSB rezistencije. Da bi se utvrdilo ima li među sojevima MLSB fenotipa sojeva koji uz erm(B) gene posjeduju istovremeno i mef(E) ili mef(A) gene odgovorne za rezistenciju pneumokoka na 14- i 15- člane makrolide efluksnim mehanizmom, potrebna su daljnja genetska istraživanja. Genotipizacija je neophodna da bi se utvrdilo je li riječ o klonalnom širenju rezistentnih sojeva u zagrebačkoj regiji.

Razvoj novih lijekova dugotrajan je i skup proces koji uspješno prolazi zanemarivo mali broj ispitivanih molekula. Jedan od značajnih razloga za odbacivanje perspektivnih molekula u kasnijim fazama istraživanja bio je i neodgovarajući farmakokinetički profil. Ovo je ukazalo na važnost ispitivanja farmakokinetičkih parametara u ranim fazama istraživanja, što uvelike pridonosi ekonomičnosti procesa. Azitromicin, lijek s vrlo povoljnim farmakokinetičkim svostva, pripada grupi 15-članih makrolida na koji su glikozidno vezana dva šećera: desozamin i dekladinoza. Cilj ovog rada je bio ispitati utjecaj ova dva šećera na farmakokinetičke parametre azitromicina i njegove derivate. ADME svojstva ovih spojeva su ispitivana in vitro i in vivo metodama uz prethodno ispitivanje fizikalno kemijskih svojstava molekula (topljivost, pK, logP, logD, Chrom logD, CHI IAM, HSA i AGP). In vito istraživanja su uključivala određivanje pasivne permeabinosti, P-gp interakcije, određivanja metaboličke stabinosti na izoliranim jetrenim mikrosomima i izoliranim hepatocitima, stabilnosti u krvi i plazmi te vezanje na proteine plazme. In vivo ispitivanja su uključivala PK pokuse na BALB/c miševima, Crl:CF1-Abcb1a mds-/- miševima te Sprague-Dawley štakorima. Rezultati istraživanja ukazali su na značanju promjenu lipofilnosti uklanjanem kladinoze, dok dodatno uklanjanje desozamina ima manje efekta na ukupnu lipofilnost. Pasivna permeabilost ispitivanih spojeva je niska ali značajne rezlike u permeabinosti ispitivanih spojeva ukazuju da se uklanjanjem šećernih komponenti permeabilnost smanjuje. Rezultati ne ukazuju na jednokratan utjecaj šećernih komponenti na interakcije s P-gp pumpom, jer su derivati s dvije šećerne komponente i bez šećernih komponenti supstrati, dok spoj s jednom šećernom komponentom nije supstrat P-gp-a. Ispitivani spojevi su metabolički stabilni, ali odsustvo šećernih komponenti ima utjecaj na metaboličku stabilnost, pa je tako azitromicin aglikon nestabilniji od preostala dva ispitivana spoja. Isti je utjecaj na stabilnost spojeva u plazmi, dok su svi ispitivani spojevi stabilni u krvi i hepatocitima. Ispitivani se spojevi svarstavaju u spojeve s niskim vezanjem na proteine plazme, a međusobne razlike ne ukazuju na utjecaj šećernih komponenti na PPB. Promjene u lipofilnosti dekladinozil derivata ne reflektiraju se na farmakokinetičke parametre, te ovaj derivat ima farmakokinetičke parametre slične azitromicinu. Uklanjanje obje šećerne komponente značajno utječu na stabilnost ovog derivate u plazmi te je aztromicin aglikon znatno nestabilniji od azitromicina što se reflektira na farmakokinetičke parametre. Metabolizam aziromicina i dekladinozil azitromicina se svodi na N-dealkilaciju položaja 9a i 3’, dok azitromicin aglikon, uz 3’-demetil derivate, pokazuje i više oksidiranih metabolita. Rezultati istraživanja ukazuju da šećerne komponente imaju značajan učinak na PK svojstva makrolidnih spojeva, što ukazuje na potrebu sintetiziranja novih derivata s promjenama na šećernim komponentama u cilju iznalaženja derivata s optimalnim PK profilom.

In spite of a numerous existing macrolide antibiotics, such as azithromycin (1), the emerging multidrug resistant microbial pathogens present serious and challenging problems in medical treatment which demand novel and more effective antimicrobial agents to be discovered. A series of novel sulfonylureas, ureas and thioureas of 15-membered azalides, were discovered, structurally characterized and biologically evaluated[1]. These include 9a-N-[N’-(aryl)sulfonylcarbamoyl]- (2), 9a-N-{;N’-[(aryl)- sulfonylcarbamoyl-γ-aminopropyl]};- (3), and 9a-N-{;N’-(β-cyanoethyl)-N’-[(aryl)sulfonyl- carabamoyl-γ-aminopropyl]};- (4), N’’ substituted 9a-(N’-carbamoyl-γ-aminopropyl)- (5, 7), 9a-(N’-thiocarbamoyl-γ-aminopropyl)- (6, 8), 9a-[N’-(β-cyanoethyl)-N’-(carbamoyl-γ-aminopropyl)]- (9, 11), 9a-[N’-(β-cyanoethyl) -N’-(thiocarbamoyl-γ-aminopropyl)]-(10, 12) derivatives. Ureas 5, 7 and thioureas 6, 8 displayed an excellent overall antibacterial in vitro activity against erythromycin sensitive Gram-positive strains, S. pneumoniae, S. pyogenes, S. aureus, and good against negative strains, M. catarrhalis and H. influenzae. Several sulfonylureas 2 and ureas 5 showed significant improvements in antibacterial activity against inducible resistant Streptococcus pyogenes strain. Among the synthesized compounds some thioureas 8 and urea 11 have shown substantially improved activity comparable to 1 against efflux-mediated resistant S. pneumoniae.

NMR metoda prijenosa magnetizacije (STD NMR) prilagođena je za istraživanje interakcija makrolida i ribosoma. Dobiveni STD NMR podaci za azitromicin uspoređeni su s kristalnom strukturom kompleksa azitromicia i ribosoma. Na temelju tih rezeltata proveden je kompeticijski STD NMR eksperiment koji je po prvi puta pokazao da se ovom metodom može istraživati specifično vezanje makrolida u aktivno mjesto ribosoma. Slijedeći ove rezultate različite NMR tehnike (1H, trNOESY i STD NMR) upotrijebljene su za istraživanje vezanja nekoliko 6-O-metil-homoeritromicina na 70S ribosom E. coli. 1H NMR spektri navedenih molekula nakon dodatka 70S ribosoma E. coli nisu pokazali očekivano širenje linija vjerojatno zbog niske konstante ravnoteže disocijacije kompleksa makrolida i ribosoma. Nakon provedene konformacijske analize molekula u slobodnom stanju (pomoću ROESY NMR spektara) i usporedbe s trNOESY spektrima (konformacija molekule vezane na ribosom), zaključeno je da su konformacije u veznom i slobodnom stanju gotovo identične, time pokazujući da makrolidi prirodno poprimaju 3D oblik koji im omogućuje ulazak u aktivno mjesto ribosoma. Nastavak istraživanja uključivao je mapiranje epitopa vezanja 6-O-metil-homoeritromicina pomoću STD NMR tehnike. Određena su tri glavna područja koja su najbliža površini ribosoma: desosamin, kladinoza i metilna skupina na položaju 15 makrolaktonskog prstena. Nadalje, utvrđena je korelacija između STD pojačanja i biokemijskih podataka (in vitro inhibicija sinteze proteina). Uloga i važnost određenih epitopa vezanja pokazana je primjenom STD NMR metode na setu novoodabranih derivata azitromicina. Ovo istraživanje po prvi je puta pružilo dokaze da hidrofobne interakcije kladinoze i metilne skupine u položaju 15 makrolaktonskog prstena igraju esencijalnu ulogu u vezanju makrolida na ribosom.

Infekcije dišnog sustava jedan su od najvećih javnozdravstvenih problema koji rezultira visokom potrošnjom antibiotika i značajnim troškovima liječenja. Etiologija ovih bolesti u oko 50% slučajeva uključuje bakterijske uzročnike, a lijek izbora predstavljaju β-laktamski i makrolidni antibiotici. Zbog kontinuiranog porasta otpornosti koja ograničava učinkovitost klinički značajnih antibiotika od posebnog su značaja istraživanja usmjerena ka pronalaženju novih, djelotvornih supstanci. Ovim radom obuhvaćeni 4''-esterski derivati makrolida s kinolonskom podjedinicom – makroloni predstavljaju učinkovitu klasu antibakterijskih supstanci aktivnu ne samo prema osjetljivim, nego i makrolidno otpornim sojevima najznačajnijih bakterijskih patogena dišnog sustava. Učinak in vivo pokazan je u mišjem modelu upale pluća uzrokovane bakterijom S. pneumoniae. Dok pojedini makroloni imaju izrazito nisku oralnu bioraspoloživost, spoj 6 s oralnom bioraspoliživošću od 12%, učinkovitim se pokazao nakon peroralne primjene u spomenutom modelu. Kao i ostali makrolidni antibiotici, makroloni inhibiraju sintezu proteina na razini ribosoma, ali ih izrazito brz baktericidni učinak na H. influenzae izdvaja od ostalih makrolida i ketolida. Testirani spojevi imaju vrlo nisku sposobnost probira otpornih mutanata, a kod izoliranih mutanata bakterije S. pneumoniae zabilježene su promjene u ribosomskom proteinu L22 i domeni V 23S rRNA.

Iako literaturni podaci pokazuju da makrolidni antibiotici pored protubakterijskih ispoljavaju protuupalne i imunomodulatorne učinke, mehanizam njihovog protuupalnog djelovanja i dalje je nepoznat. Većina in vivo rezultata temelji se na lokalnim upalnim modelima dišnog sustava ili životinjskim modelima s površno ispitanim patofiziološkim mehanizmima, molekularnim čimbenicima i biljezima. Rezultati ovog ispitivanja ukazuju na molekularne mehanizme životinjskih modela lokalne upale kože neposrednog i odgođenog tipa, plućne neutrofilije te sustavne upale u vidu endotoksemije i septičkog šoka i predstavljaju osnovu za ispitivanje protuupalnog i imunomodulatornog djelovanja makrolida. Azitromicin i klaritromicin u navedenim modelima lokalne i sustavne upale utječu na koncentraciju Th1 i Th2 citokina, kemokina, mijeloperoksidaze, serumskog imunoglobulina E i serumskog amiloida A te na hematološke parametre, kemotaksiju upalnih stanica i pojavnost patohistoloških obilježja psorijaze i atopičkog dermatitisa. Imunomodulatorni učinak uočen je u modelu endotoksemije u smislu početnog proupalnog djelovanja koje u kasnijoj fazi upalne rekacije prelazi u protuupalno.

S ciljem otkrića novih spojeva s poboljšanom antibakterijskom aktivnošću protiv MLSB- rezistentnih sojeva pripravljeni su novi 4''-O- acil, 3-O-acil i 3-keto derivati 6-O-alkil-8a-aza- 8a-homoeritromicina A (eritromicin 8a-laktama) i 6-O-alkil-9a-aza-9a-homoeritromicina A (eritromicin 9a-laktama) koji sadrže (hetero)aril- alkilni ili (hetero)aril-alkenilni bočni lanac. Polazeći od eritromicin A 9(E)-oksima selektivnom zaštitom i O-alkiliranjem pripravljeni su 6-O- alkileritromicin A 9(E)- i 9(Z)-oksimi koji su podvrgnuti Beckmannovoj pregradnji dajući 6-O- alkil-8a-aza-8a-homoeritromicine A (8a-laktame) i 6-O-alkil-9a-aza-9a-homoeritromicine A (9a- laktame). Njihovim regioselektivnim O-aciliranjem pripravljeni su 4''-O-acilni derivati (acilidi). Kiselom hidrolizom šećera kladinoze u 6-O- alkileritromicin 8a- i 9a-laktamima dobiveni su 3- dekladinozilni derivati. Selektivnom oksidacijom nastale 3-OH skupine pripravljeni su 3-keto derivati (ketolidi). Regioselektivnim aciliranjem 3-OH skupine 3-dekladinozilnih derivata pripravljeni su 3-O-acilni derivati. Novopripravljenim spojevima strukture su potvrđene spektroskopskim metodama (IR, jedno- i dvodimenzijski NMR) i spektrometrijom masa. Dobiveni spojevi testirani su na širokom spektru Gram-pozitivnih i nekim Gram-negativnim bakterijama te na in vivo modelima s ciljem zadržavanja aktivnosti i farmakokinetike azalida. Neki spojevi pokazali su in vitro aktivnost sličnu azitromicinu s dodatnom aktivnošću na inducibilne MLSB-rezistentne S. aureus sojeve. 4''-O-Acilni derivati pokazali su uglavnom bolju aktivnost od 3-O-acilnih i 3-keto derivata. Produljenje alkilnog lanca na položaju 6-O uglavnom smanjuje aktivnost na testirane mikroorganizme. Odabrani predstavnici novih 3-keto i O-acil derivata testirani su in vivo u miševima i štakorima i prikazani su njihovi farmakokinetički parametri.

Makrolidni antibiotici, osim antibakterijskog, pokazuju i protuupalne učinke u mnogim istraživanjima in vitro i in vivo. Unatoč tome njihov mehanizam protuupalnog djelovanja i biološke mete nisu poznati. Cilj ove doktorske disertacije je određivanje proteinskih bioloških meta azitromicina i klaritromicina odgovornih za njihovo protuupalno djelovanje. Metoda korištena za tu svrhu je afinitetna kromatografija s imobiliziranim spojem koja se sastojala od derivatiziranja azitromicina i klaritromicina, vezanja derivata na čvrsti nosač, afinitetnog pročišćavanja i razdvajanja elektroforezom vezanih proteina iz različitih proteinskih smjesa te identifikacije proteina masenom spektrometrijom. Rezultati određivanja proteina koji se vežu na derivate azitromicina i klaritromicina u uzorcima čovjeka i miša ukazali su da je protein koji sadrži valozin (VCP) potencijalna biološka meta navedenih makrolida. Iako je u procesu validacije biološke mete potvrđeno međudjelovanje makrolida s VCP-om, u različitim staničnim testovima nije potvrđeno da azitromicin i klaritromicin ostvaruju svoje protuupalno djelovanje vezanjem na VCP.

U ovom završnom radu prikazan je postupak ekstrakcije farmaceutika čvrstom fazom iz vode. Farmaceutici su ekstrahirani iz uzoraka vode primjenom sorbensa različitih vrsta (Oasis HLB, C18, C8, SDB-L i Strata-X) i masa punjenja (60 mg, 200 mg i 500 mg) uz različita organska otapala (metanol, etanol, acetonitril) i različite pH vrijednosti (pH 7, 00 ; 8, 00 ; 9, 00) uzoraka vode. Ispitivani farmaceutici pripadaju skupini makrolida (azitromicin, roksitromicin, klaritromicin i tilozin) i tiamulin. Iskoristivosti ekstrakcije određene su kapilarnom elektroforezom. Pri tome je utvrđeno da je najveća iskoristivost ekstrakcije ispitivanih farmaceutika ostvarena primjenom 200 mg/3 mL C18 kolonice uz metanol kao otapalo za eluiranje pri pH vrijednosti uzorka od 9, 00. Na taj način dobivena su sljedeća optimalna iskorištenja: 68, 3  13, 1 za azitromicin, 80, 0 5, 6 za tiamulin, 76, 25, 0 za klaritromicin, 80, 4 7, 4 za roksitromicin te 80, 2 7, 0 za tilozin.

Razvijena je analitička metoda za određivanje sulfonamida, fluorokinolona, makrolida i trimetoprima u otpadnim i prirodnim vodama vezanim sustavom tekućinska kromatografija – tandemna spektrometrija masa (LC-MS/MS). Ciljani antibiotici razdvojeni su primjenom tekućinske kromatografije obrnutih faza, a za detekciju i kvantitativno određivanje upotrijebljeno je praćenje višestrukih tranzicijskih reakcija. Vodeni uzorci obogaćeni su ekstrakcijom na čvrstoj fazi na kolonicama Oasis HLB. Apsolutni analitički povrati iz realnih uzoraka bili su između 54 % i 119 % uz dobru ponovljivost (RSD od 1 % do 18 %). Granice određivanja bile su između 1, 5 ng L-1 i 69 ng L-1. Primjena metode pokazala je široku rasprostranjenost proučavanih antibiotika u otpadnim vodama hrvatskih gradova u koncentracijskom rasponu od nekoliko desetaka ng L-1 do nekoliko µ ; ; g L-1. Njihovo uklanjanje u konvencionalnim uređajima za obradu otpadnih voda bilo je nepotpuno. Membranski bioreaktori pokazali su se učinkovitijim, ali samo za dio proučavanih antibiotika, dok je za teškorazgradljive sastojke visoke stupnjeve uklanjanja omogućila tek primjena nanofiltracije, reverzne osmoze i ozoniranja. Tragovi antibiotika detektirani su i u hrvatskim rijekama, pri čemu su visoke koncentracije pojedinih makrolida u rijeci Savi ukazale na problem zagađenja okoliša otpadnim vodama farmaceutske industrije.

Legionarska bolest je pneumonija koju uzrokuje Legionella pneumophila. Čovjek se inficira inhalacijom kontaminiranoga vodenog aerosola. Legionellla je odgovorna za 2 do 15% pneumonija u općoj populaciji. Od legionjarske bolesti obolijevaju sve dobne skupine, a češće stariji ljudi, poglavito oni s kroničnim bolestima srca, pluća i bubrega. Posebno su ugroženi bolesnici s oslabljenim imunosnim sustavom. Bolest se klinički očituje različitom težinom i pojavnošću, od blagih oblika do vrlo teških pneumonija. Etiološka dijagnoza legionarske bolesti može se postaviti samo specifičnim mikrobiološkim testovima: kultivacija, otkrivanje antigena u uzorcima dišnog sustava ili u mokraći, serološkim testovima i metodama molekularne dijagnostike, U liječenju legionarske bolesti najvažnije je što prije primijeniti odgovarajući antibiotik. zakašnjenje u primjeni učinkovitog antibiotika rezultira lošom prognozom. Lijekovi izbora su azitromicin ili fluorokinoloni. U blagim do umjereno teškim oblicima bolesti liječenje se provodi 10 - 14 dana. Ako se liječenje provodi azitromicinom, dovoljna je terapija tijekom pet, odnosno tri dana. U teškim oblicima bolesti ili u imunokompromitiranih bolesnika preporučuje se liječenje od tri tjedna. U slučaju neuspjeha mogu se kombinirati te dvije skupine antibiotika s rifampicinom.

U ovom radu prikazan je postupak optimizacije ekstrakcije farmaceutika miješalom iz vode. Ispitivani farmaceutici pripadaju skupini makrolida (roksitromicin, klaritromicin i tilozin) i tiamulin. Postupak ekstrakcije optimiran je s obzirom na trajanje i temperaturu ekstrakcije. Optimalni uvjeti postignuti su pri 75 &ordm ; C kroz 4 sata. Farmaceutici su desorbirani s miješala 2 sata s etanolom. Iskoristivosti ekstrakcije određene su kapilarnom elektroforezom.

Bakterija Streptococcus pneumoniae može biti dio normalne flore gornjeg respiratornog trakta, ali i glavni uzročnik bakterijske pneumonije i meningitisa, naročito kod djece i starijih osoba, upale srednjeg uha, bronhitisa, bakterijemije. Osim beta-laktama, u liječenju streptokoknih infekcija se vrlo često koriste i makrolidni antibiotici, no otpornost je u stalnom porastu. Geografska rasprostranjenost sojeva s određenim mehanizmom rezistencije nije ujednačena, pa se njenim epidemiološkim praćenjem stječe važan uvid u lokalnu situaciju. Ovim radom analizirana je otpornost i mehanizam otpornosti na makrolidne antibiotike te distribucija serotipova kod ukupno 261 izolata S. pneumoniae prikupljenih sa zagrebačkog područja. Otpornost je viša kod nazo-faringealnih nego kod invazivnih izolata, s dominacijom erm(B) tipa rezistencije i serotipova 19F i 6B, koja je posljedica klonalnog širenja pojedinih sojeva. Među efluks otpornim nazofaringealnim izolatima prevladava serotip 23F. Kod invazivnih izolata češći je efluks mehanizam otpornosti, a prevladavaju serotipovi 6A, 14, 23F i 4.

Narastajuća rezistencija na makrolide među najčešćim respiratornim patogenima, osobito u zemljama s dugotrajnom primjenom makrolida, izaziva bojazan od kliničkog neuspjeha u slučaju njihove primjene u empirijskom liječenju nekih čestih kliničkih sindroma akutnih respiratornih infekcija u djece kao što su akutna upala srednjega uha, streptokokni tonzilofaringitis ili upala pluća u dojenčadi i male djece. Ipak, narastajuća množina dokaza o važnoj ulozi atipičnih bakterija (Mycoplasma pneumoniae i Chlamydia pneumoniae) u etiologiji akutnoga tonzilofaringitisa, pneumonije, osobito u starije djece i adolescenata, astme, kao i kontinuirana prisutnost hripavca u populaciji, ističu jasne indikacije za primjenu makrolida/azalida u pedijatrijskoj medicini. Liječenje streptokoknog tonzilofaringitisa u Hrvatskoj, u kojoj rezistencija Streptococcus pyogenesa na makrolide iznosi oko 10%, također ostaje kao indikacija za primjenu makrolida/azalida, osobito u slučajevima kada je liječenje moguće otpočeti nakon prijma bakteriološkog nalaza obriska ždrijela. Osim etabliranog liječenja infekcija u djece peroralnim pripravcima azitromicina, recentne farmakološke studije podupiru i parenteralnu primjenu azitromicina u djece, osobito važnu za djecu koja povraćaju lijek ili boluju od težih oblika bolesti.

Streptococcus pneumoniae je najznačajniji bakterijski uzročnik pneumonije, bakterijemije i upale srednjeg uha u djece, te treći najčešći uzročnik meningitisa. Pojava rezistentnih sojeva pneumokoka posljednjih desetljeća otežava terapiju infekcija izazvanih ovom bakterijom, a pored rezistencije na penicilin zabrinjava i porast rezistencije na makrolide zabilježen posljednjih godina. Poznato je da promjene vrijednosti pH medija utječu na rezultate ispitivanja osjetljivosti bakterija na makrolidne antibiotike. Svrha ovog istraživanja bila je istražiti utjecaj pH, odnosno različitih uvjeta kultivacije, na rezultate ispitivanja osjetljivosti pneumokoka na eritromicin, azitromicin i klaritromicin. Upotrijebljene su tri standardne metode za ispitivanje osjetljivosti bakterija na antibiotike: kirby-Bauer didk difuzijska metoda, metoda mikrodilucije u bujonu i E-test. Na temelju rezultata istraživanja utvrđeno je da promjene pH medija imaju veliki utjecaj na ispitivanje osjetljivosti pneumokoka na azitromicin i klaritromicin, a posebice alkalizacija medija, kad i neznatne oscilacije u vrijednosti pH medija (7, 4-7, 6) mogu dovesti do pogrešne interpretacije testa i proglašenja rezistentnog soja osjetljivim ili intermedijarno osjetljivim na ove antibiotike.

Konformacijska analiza oleandomicina i njegovih derivata u otopini CDCl3 , DMSO-d6 , aceton-d3 i fosfatni/TRIS pufer određena je uz pomoć metoda i tehnika spektroskopije NMR. Analizirane su homonuklearne vicinalne konstante sprega H2, H3 i NOE/ROE kontakti, te su uspoređeni s literaturno dostupnim konformacijskim analizama strukturno sličnih makrolidnih spojeva. Makrociklički laktonski prsten može poprimiti dvije konformacije – „ folded-in“ i „ folded-out“ . Utvrđeno je da su konformacije svh istraživanih spojeva smjese „ folded-in“ i „ folded-out“ konformacijskih familija, sa većim udjelom „ folded-out“ konformera. Također ispitana je temperaturna ovisnost udjela konformacijskih familija, te ovisnost o dielektričnoj konstanti otapala. Konformacije makrociklikog laktonskog prstena potvrđene su i računima molekulskog modeliranja. Desozamin i oleandroza zaprimaju uobiajenu „ Everett-Tyler“ konformaciju stolice. Pokazano je da šećeri imaju više konformacijske slobode oko glikozidne veze od srodnih šećera u strukturno sličnim makrolidima. Istražena je i aktivna konformacija oleandomicinskih spojeva u kompleksu s ribosomom E.Coli pomoću trNOESY i STD NMR tehnika. Nađene su tri regije odgovorne za vezanje: desozamin, C3-C6 i C10-C14 regija.

Streptococcus pyogenes uzročnik je brojnih zaraznih bolesti, od grlobolje i impetiga do teških invazivnih infekcija. Sojevi S. pyogenesa rezistentni na makrolidne antibiotike susreću se sve češće diljem svijeta te se smatra da posjeduju veće invazivne sposobnosti. U Primorsko-goranskoj županiji streptokokne infekcije čine 14 % svih prijavljenih zaraznih bolesti u razdoblju od 2001. do 2006. godine. Godišnje se prijavljuje od 297 do 511 slučajeva streptokokne angine, od 132 do 178 slučajeva erizipela te od 222 do 404 slučaja skarlatine. Rezistencija S. pyogenes na makrolide kretala se u rasponu od 10 do 27 %, a na klindamicin od 3 do 21 %. U istom se razdoblju na području Republike Hrvatske rezistencija na makrolide kretala od 11 do 16 %, a na klindamicin od 3 do 9 %. Rastuća rezistencija S. pyogenes na makrolide sve više nameće potrebu za revizijom kliničkih smjernica za uporabu antimikrobnih sredstava u empirijskom zbrinjavanju zaraznih bolesti u pojedinim područjima Republike Hrvatske., Streptococcus pyogenes causes a wide range of human diseases, from sore throat and impetigo to severe invasive infections. Species of macrolide-resistant S. pyogenes have increasingly been encountered all over the world and it has been suggested they possess a more invasive potential. The infections caused by S. pyogenes represent 41 % of all reported infectious diseases in the Primorsko-Goranska County in the period between 2001 and 2006. Annually there were 297 to 511 cases of streptococcal pharyngitis, 132 to 178 cases of erysipelas and 222 to 404 cases of scarlatina. S. pyogenes resistance to macrolides was detected in the range of 10 to 27 % and to clindamycin from 3 to 21 % respectively. In the same period, the resistance to macrolides in Croatia ranged from 11 to 16 % and to clindamycin from 3 to 9 %. Increasing S. pyogenes resistance to macrolides poses a need for review of clinical guidelines for use of antimicrobial drugs in the empirical treatment of infectious diseases in certain areas of the Republic of Croatia.

Makrolidni antibiotici uključujući i azalide sve većom upotrebom uzrokuju rezistenciju kod mnogih patogenih mikroorganizama. U novije vrijeme je nađeno da neki 3-acil, 3-keto i 2, 3-anhidro derivati makrolida djeluju na rezistentne sojeve, od kojih najznačajniji sadrže i 11, 12-karbamoilni prsten. S namjerom da se priprave analogni azalidi s poboljšanom antibakterijskom aktivnošću sintetizirani su 9a, 11-ciklički karbamati 12-O-alkil derivata 9-dihidro-9a aza-9a-homoeritromicina A te njihovi 3-deskladinozil derivati.

Dijagnostika i posebno liječenje pneumonija, unatoč stalnomu napretku, i danas su praćeni brojnim kontroverzama. Algoritmi (hrvatski: postupnik, smjernice) daju sažete preporuke o brojnim praktičnim problemima pri dijagnosticiranju i liječenju pneumonija. Na izradu i provedbu smjernica utječu brojni i različiti čimbenici koji se bitno razlikuju u pojedinim sredinama. Moderni algoritmi za zbrinjavanje pneumonija, osim izbora antibiotika, propisuju i dijagnostičke postupke, kriterije za hospitalizaciju i duljinu liječenja, prijelaz s parenteralnog na peroralni način primjene antibiotika, preventivne mjere itd. Najpoznatiji algoritmi (nekoliko američkih, kanadski, britanski, Europskog udruženja za plućne bolesti) temelje se na empirijskom liječenju pneumonija. Danas je općeprihvaćen stav da u inicijalnom empirijskom liječenju treba primijeniti antibiotik koji dobro djeluje na Streptococcus pneumoniae i na atipične uzročnike. Za ambulantno liječenje ovi algoritmi preporučuju makrolide, doksiciklin ili nove (respiratorne) fl uorokinolone, a za hospitalizirane bolesnike betalaktamski antibiotik u kombinaciji s makrolidom ili fl uorokinolonski antibiotik s dobrim učinkom na pneumokoka. Danas je uobičajena preporuka da se liječenje težih pneumonija započinje u bolnici parenteralnom primjenom antibiotika, a nakon stabilizacije stanja bolesnika prelazi se na peroralnu primjenu (switch therapy). Respektirajući brojne čimbenike koji utječu na zbrinjavanje pneumonija u nas i polazeći od zatečenog stanja, uključujući već tradicionalno kliničko razvrstavanje pneumonija na bakterijske i atipične, za učinkovito i racionalno liječenje pneumonija valja izraditi i prihvatiti vlastite smjernice na nacionalnoj razini. U članku se daje prijedlog smjernica za liječenje pneumonija., Despite continuous progress, diagnostics and especially the treatment of pneumonias are accompanied with numerous controversies. Algorithms provide summary guidelines for numerous practical problems in diagnosis and treatment of pneumonias. Numerous factors, which differ to a signifi cant extent among certain countries, affect the development and implementation of algorithms. In addition to the choice of an antibiotic, modern algorithms for the management of pneumonias defi ne diagnostic procedures, criteria for hospitalisation and length of treatment, transfer from parenteral to oral administration of antibiotics, preventive measures, etc. The most known algorithms (several American, Canadian, British, that of the European Respiratory Society) are based on empirical treatment of pneumonias. Nowadays it is generally accepted that the antibiotic effi cient against Streptococcus pneumoniae and atypical pathogens should be administered in the initial empirical treatment. In outpatient treatment, these algorithms recommend macrolides, doxycycline or new (respiratory) fl uoroquinolones. In hospital treatment, they recommend a beta-lactam antibiotic in combination with a macrolide or a fl uoroquinolone antibiotic effi cient against pneumococcus. The recommend algorithm for the treatment of more severe pneumonias is the onset of hospital treatment with parenteral antibiotic administration, followed by oral administration once the patient’s status stabilises (switch therapy). Respecting numerous factors affecting the management of pneumonias in Croatia and starting from the current status, while including the already traditional clinical classifi cation of pneumonias into bacterial and atypical, national algorithms for effi cient and rational treatment of pneumonias should be developed. This article suggests various algorithms for treatment of pneumonias.

Legionele redovito koloniziraju različite vodoopskrbne sustave i uređaje, a čovjek se inficira inhalacijom kontaminiranog vodenog aerosola. Od legionarske bolesti obolijevaju sve dobne skupine, a češće stariji ljudi, poglavito oni s kroničnim bolestima srca, pluća i bubrega, no posebno su ugroženi bolesnici s oslabljenim imunosnim sustavom. Legionela je odgovorna za 2 do 15% pneumonija u općoj populaciji. Nema pouzdanih kliničkih, laboratorijskih ili radioloških pokazatelja kojima se sa sigurnošću može razlikovati legionarska bolest od drugih pneumonija, pa kliničku sumnju uvijek treba potvrditi specifičnim laboratorijskim testovima (kultura, otkrivanje antigena u respiratornom sekretu ili u mokraći, serološki testovi, molekularna dijagnostika). U kliničkom je radu osobito praktičan i pouzdan brzi test za otkrivanje antigena legionele u urinu. U liječenju legionarske bolesti najvažnije je što prije primijeniti odgovarajući antibiotik. Međutim, L. pneumophila, kao i drugi uzročnici pneumonija, u svakodnevnom se kliničkom radu malokad dijagnosticira na početku bolesti, kada se započinje antimikrobno liječenje. Budući da su legionele relativno česti uzročnici upale pluća, razumno je i racionalno pri empirijskom liječenju pneumonija, posebno atipičnih, upotrijebiti antibiotik koji je učinkovit i protiv legionela. Novi makrolidi, posebno azitromicin, in vitro i u eksperimentalnom modelu imaju bolju aktivnost od eritromicina koji se tradicionalno preporučuje u liječenju legionarske bolesti. U liječenju se uspješno upotrebljavaju i fluorokinoloni te doksiciklin i rifampicin. Zakašnjenje u primjeni učinkovitog antibiotika rezultira lošom prognozom. Zato svi bolesnici s težom kliničkom slikom pneumonije ili težim pratećim kroničnim bolestima i oslabljenim imunosnim sustavom u inicijalnom empirijskom liječenju zahtijevaju antibiotik s dobrim učinkom na legionelu. Naše kliničko iskustvo pokazuje da je pravodobno započeto liječenje legionarske bolesti azitromicinom klinički uspješno i ključno za ishod bolesti.

Glukokortikoidi su već više od pola stoljeća nezamjenjivi protuupalni lijekovi koji se koriste u bolestima kao što su astma, alergijski rinitis, upalne bolesti crijeva i kronična opstruktivna plućna bolest. No, budući da su glukokortikoidi i endogeni hormoni koji upravljaju metabolizmom i drugim važnim funkcijama organizma, cilj istraživanja mnogih grupa je nalaženje glukokortikoida sa što manje nuspojava i visokim omjerom topičkog u odnosu na sistemsko djelovanje. Makrolidi su poznati prije svega kao antibiotici, no s vrlo zanimljivim drugim farmakološkim svojstvima. To se pogotovo odnosi na azalidne makrolide koji pokazuju svojstvo nakupljanja u mnogim stanicama, osobito upalnim stanicama, a dokazano im je i protuupalno djelovanje kako in vitro tako i u kliničkim studijama. Povezivanjem tih dviju klasa lijekova u stabilni konjugat dobila su se nova svojstva. Premda su svi ispitivani konjugati slabije in vitro aktivnosti od standarda kao što je deksametazon, izdvojile su se ipak dvije klase konjugata: vezane na C18 kiselinu koje su slabije in vitro aktivnosti, i one vezane na C17 hidroksidnu skupinu, koje pokazuju bolju učinkovitost in vitro. Dva spoja, predstavnika tih skupina, ispitivani su na testovima izazivanja apoptoze T-staničnih hibridoma, kompetitivnom vezanju na glukokortikoidni receptor, inhibiciji produkcije proupalnih citokina u aktiviranih splenocita, u transaktivacijskom i transrepresijskom djelovanju glukokortikoida. Upotrebom glukokortikoidnog antagonista mifepristona te COS-1 stanične linije koja nema endogeni glukokortikoidni receptor, dokazano je da su te aktivnosti striktno ovisne o vezanju za glukokortikoidni receptor. Ti spojevi izazivaju i translokaciju kimere glukokortikoidnog receptora i zelenog fluorescnentnog proteina. In vitro slabije aktivna konjugat pokazao je izvrstan činak u inhibiciji nastanka edema uške u štakora, odličnu aktivnost u mišjem modelu astme kada je bio apliciran intranazalno, a isto tako se pokazao daleko sigurnijim od flutikazon propionata i budezonida, jer za razliku od njih nije izazvao smanjenje težine timusa i kortikosterona nakon aplikacije u štakora. Konjugati makrolida i glukokortikoida su nova klasa spojeva koji se mogu dalje razvijati kao lokalno aktivno glukokortikoidi.