Search

Directional cellular movement is required for various organismal processes, including immune defense and cancer metastasis. Proper navigation of migrating cells involves responding to a complex set of extracellular cues, including diffusible chemical signals and physical structural information. In tissues, conflicting gradients and signals may require cells to not only respond to the environment but also modulate it for efficient adhesion formation and directional cell motility. Recently, we found that cells endocytose fibronectin (FN) and resecrete it from a late endosomal/lysosomal (LE/Lys) compartment to provide an autocrine extracellular matrix (ECM) substrate for cell motility. Branched actin assembly regulated by cortactin was required for trafficking of FN-containing vesicles from LE/Lys to the cell surface. These findings suggest a model in which migrating cells use lysosomal secretion as a versatile mechanism to modulate the ECM environment, promote adhesion assembly and enhance directional migration.

One of the hallmarks of Alzheimer’s disease (AD) is the pathological accumulation of β-amyloid (Aβ) in the brains of AD patients. Oligomeric and fibrillar aggregates of Aβ have been shown to be neurotoxic to neurons and hippocampal slices. Therefore, limiting Aβ production is an important area of research in order to delay or stop AD progression. Aβ is produced by amyloidogenic cleavage of amyloid precursor protein (APP). Amyloidogenic cleavage requires ectodomain removal by β-secretase and intramembrane γ-cleavage by γ-secretase to release Aβ products ranging from 38-43 residues. Work from our lab has shown that APP and γ-secretase are resident proteins of the lysosome. Furthermore, the acidic environment of lysosomes that promotes the aggregation of Aβ. While many lines of evidence demonstrate that APP internalization is important to the Aβ production, the intracellular itinerary of APP, from production to cleavage, is unclear. In order to follow the intracellular trafficking of APP and Aβ, we have applied various microscopy techniques, in combination with fluorescently-tagged proteins. Using a photoactivatable mutant of GFP (paGFP), we accurately photoactivated nascent APP and followed its trafficking to lysosomes. To our surprise, we found that APP was delivered to lysosomes, where it is cleaved by γ-secretase, through an entirely intracellular pathway. This intracellular pathway was dependent upon an interaction between APP and adaptor protein 3. We found that the interaction between APP and AP-3 is dependent on the 709YTSI712 tyrosine motif. Furthermore, phosphorylation of the serine within this motif, by PKCε, can disrupt this interaction. By decreasing APP trafficking to lysosomes, through disrupting the APP/AP-3 interaction we decreased the production of Aβ. While lysosomes have traditionally been thought to be responsible for cellular waste disposal, they also have a secretory role in a number of cell types; including neurons. We demonstrate that lysosomes are not only responsible for the production of Aβ, but may also be responsible for the secretion of lysosomal Aβ into the extracellular space. This research may provide new therapeutic targets to limit the production and release of Aβ.

Macrophages mediate innate immunity through release of cytokines, eicosanoids, reactive oxygen species as well as through phagocytosis and secretion of lysosomal enzymes. Regulation of lysosomal secretion in macrophages differs in several respects from release of specialized granules in other leukocytes. Lysosomal secretion is not dependent upon cytosolic calcium but is instead triggered by lysosomal alkalinization and is modulated by cytosolic pH. Common to secretory responses in most leukocytes, on the other hand, is a regulation by protein kinase C. Immune complexes trigger a localized azurophilic degranulation in neutrophils which is dependent upon protein kinase C. An enrichement of conventional isoforms at the target area of the plasma membrane further implies a role for these kinases in the spatial regulation of degranulation. Lysosomal secretion in macrophages is likewise regulated by protein kinase C. This regulation is also exerted by conventional isoforms but involves both enhancing and repressing signaling pathways. Activation of protein kinase C reduces secretion through inhibition of lysosomal alkalinization while at the same time inducing a compensatory enhancement downstream of the lysosomal alkalinization. Both pathways are sensitive to depletion of cytosolic calcium and are blocked by down-regulation of conventional isoforms of protein kinase C. The pathway acting on lysosomal pH involves signaling through phosphoinositide 3-kinase. Inhibition of this kinase abrogates translocation of conventional isoforms of protein kinase C to lysosomes. Makrofager återfinns i stort sett överallt i kroppen. De bildas från stamceller i benmärgen och cirkulerar i blodomloppet tillsammans med andra vita blodkroppar i form av monocyter, som kan vandra igenom blodkärlens väggar och vidareutvecklas till makrofager ute i vävnaderna. Makrofagen spelar en viktig roll i kroppens totalförsvar genom att vägleda och orkestrera immunförsvarets övriga celler, t ex genom att producera prostaglandiner och utsöndra cytokiner. Cytokiner är immunförsvarets egna hormoner som verkar såväl lokalt på grannceller som systemiskt via blodbanan. Makrofager har i likhet med vissa andra blodkroppar förmåga att äta (fagocytera) och dricka (pinocytera) av sin omgivning. Därav kommer namnet makrofag som betyder stor ätarcell. En måltid kan bestå av t ex vävnadsvätska, infektiösa mikroorgansimer, tumörceller, döda celler och andra vävnadsmaterial. Bakterier kan bindas till makrofagen m h a olika cellytereceptorer. Dessa receptorer aktiverar olika signalsystem inuti cellen. Sådana signaler kan bestå av spridning av vissa joner såsom kalcium eller av en slags kedjereaktion där olika enzymer i tur och ordning påverkar varandra. En sådan påverkan kan bestå av att fosfat fästs vid ett enzym. Sammantaget kan dessa signalsystem, som för övrigt ofta interagerar inbördes på ett komplext sätt, ses som cellens sätt att tänka och är därmed avgörande för dess handling. Bakterier och svamporganismer som fastnar på makrofagens receptorer aktiverar signalsystem som leder till att de fagocyteras. Väl inne i cellen sammansmälter dessa fagosomer med lysosomer. Lysosomen är en membranomsluten behållare som kan ses som cellens soptipp eller snarare som cellens återvinningscentral. Här finns en stor uppsättning nedbrytande enzymer som fungerar bäst i en sur miljö. Till skillnad från den neutrala cellvätskan har lysosomerna ett pH-värde under 5, som bibehålles av speciella protonpumpar belägna i lysosommembranet. Tyvärr kan vissa bakteriefamiljer överleva inuti makrofager t ex genom att se till så att lysosomen blir mer basisk eller genom att helt enkelt undvika att hamna i lysosomen. Parallellt med bekämpning av t ex bakterier inuti cellen sker en utsöndring av lysosomala enzymer ut ur cellen. Syftet med detta tror man vara att åstadkomma bekämpning av bakterier i cellens omgivning samt att bryta ner vävnad för att underlätta upprensning och återuppbyggnad i inflammatorisk vävnad. Dessvärre kan sådan sekretion av lysosomala enzymer eventuellt bidra till bestående vävnadsskador vid långvariga inflammatoriska tillstånd som ses t ex vid autoimmuna sjukdomar. Syftet med denna avhandling är att belysa hur olika signalsystem inuti makrofagen påverkar utsöndringen av lysosomala enzymer. Till skillnad från i många andra celltyper, där en ökning av kalciumjoner i cellvätskan sätter igång sekretionen, så verkar aktivering av makrofager i stället leda till att dess lysosomer blir mer basiska, vilket i sin tur leder till att den lysosomala sekretionen sätts igång. Alkalinisering av lysosomer styrs bl a av de två olika enzymerna fosfatidylinositol 3-kinas och proteinkinas C. Kinas betecknar här att de vidarebefordrar signaler genom att koppla fosfatgrupper på lipider respektive proteiner. Proteinkinas C har utöver en reglerande funktion på lysosomalt pH även en pH-oberoende förstärkande effekt på den lysosomala sekretionen i makrofager.