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[ES] El sustrato del receptor de la insulina 2 (IRS2) es una proteína adaptadora citoplasmática esencial en las vías de señalización celular reguladas por el receptor de la insulina, el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina y sus ligandos. Los ratones con deficiencia de IRS2 muestran un crecimiento cerebral alterado, subfertilidad y desarrollan progresivamente diabetes debido a una reducción de la masa de las células beta pancreáticas y al desarrollo de resistencia periférica a la insulina. Sin embargo, pese a ser esencial para el crecimiento y la función de los islotes, los niveles de expresión de IRS2 en el páncreas endocrino son relativamente bajos. Ello, sumado a la falta de herramientas adecuadas, ha dificultado históricamente el estudio de IRS2 en el páncreas endocrino en diferentes etapas del desarrollo o en condiciones patológicas. En este contexto, el grupo de la Dra. Burks ha generado un nuevo modelo murino reportero que permite monitorizar la expresión génica endógena in vivo e in vitro. El objetivo general del presente TFG era explorar varias técnicas para caracterizar la expresión de IRS2 en dicho modelo reportero de ratón. Empleando western blot se evaluó la expresión de IRS2 en los islotes pancreáticos y en el bazo mediante la detección de las proteínas reporteras GFP (Green Fluorescent Protein) y luciferasa. La expresión de IRS2 aumenta con la edad tanto en los islotes como en el bazo en el modelo reportero. Mediante citometría de flujo se observó que las células del páncreas que no expresan GFP/IRS2 son más proliferativas que las que sí expresan GFP/IRS2. Además, se han comenzado a establecer las condiciones técnicas óptimas para separar las células de los islotes GFP+ y GFP- del modelo reportero mediante citometría de tipo FACS, a la espera de confirmar si la estrategia de sorting utilizada es adecuada o no., [EN] Insulin Receptor Substrate 2 (IRS2) is a cytoplasmic adaptor protein essential in cell signalling pathways governed by the insulin receptor, insulin-like growth factor receptor and their ligands. IRS2-deficient mice show impaired brain growth, subfertility, and progressively develop diabetes due to a reduction in pancreatic beta-cell mass and the development of peripheral insulin resistance. However, despite being essential for islet growth and function, IRS2 expression levels in the endocrine pancreas are relatively low and the lack of appropriate tools has historically hindered the study of IRS2 in the endocrine pancreas at different developmental stages or in pathological conditions. In this context, the group of Dr. Burks has generated a new murine reporter model allowing endogenous gene expression to be monitored in vivo and in vitro. The overall objective of the current TFG was to explore various techniques to characterize IRS2 expression in this mouse reporter model. Using western blot, IRS2 expression in pancreatic islets and spleen was assessed by detecting the GFP (Green Fluorescent Protein) and luciferase reporter proteins. IRS2 expression increases with age in both islets and spleen in the reporter model. Using flow cytometry, we observed that pancreas cells that do not express GFP/IRS2 are more proliferative than those that do express GFP/IRS2. We have also begun to establish the optimal technical conditions for separating GFP+ and GFP- islet cells from the reporter model by FACS-type cytometry, pending confirmation of whether the sorting strategy used is appropriate or not.

[ES] Los organismos eucariotas, desde hongos hasta humanos, poseen sistemas de transducción de señales para responder y adaptarse a una gran variedad de moléculas xenobióticas. La activación de estos sistemas multidrug es una causa importante de la resistencia pleiotrópica a los compuestos antifúngicos en hongos patógenos, así como a los tratamientos contra el cáncer en las células humanas. Aquí investigamos la diversidad natural de la respuesta multidrug , que se produce en aislados naturales evolucionados de manera diferente de la levadura Saccharomyces cerevisiae. En este organismo, Pdr1 es el principal activador transcripcional, que reconoce directamente los xenobióticos y, posteriormente, activa la expresión de genes que codifican los transportadores de eflujo de fármacos, lo que genera resistencia al xenobiótico. En este trabajo, diferentes variantes de Pdr1 de diversas cepas naturales de S. cerevisae y de la levadura patógena Candida glabrata se fusionarán con el dominio de unión al ADN de Gal4. La capacidad de activación de estas proteínas de fusión Pdr1 se analizará en células de levadura mediante ensayos de luciferasa de células vivas en respuesta a concentraciones crecientes de xenobióticos (por ejemplo, menadiona). Esto permitirá comparar las sensibilidades de las diferentes variantes de Pdr1. Los datos obtenidos se compararán con las sensibilidades relativas de las diferentes cepas de levadura a las concentraciones de menadiona y otros xenobióticos que inhiben el crecimiento. En ensayos complementarios, los aislamientos naturales de S. cerevisiae, que han evolucionado en diferentes hábitats, se transformarán con reporteros de células vivas específicos para la respuesta PDR. Las diferentes cepas se examinarán para determinar su activación dependiente de la dosis de la respuesta multidrug mediante ensayos de luciferasa y para determinar su resistencia a xenobióticos mediante ensayos de crecimiento continuo. Tomados en conjunto, los resultados permitirán cuantificar la diversidad natural de los sistemas multidrug de levadura y específicamente de Pdr1, y comparar estos comportamientos con la resistencia xenobiótica de las cepas respectivas., [EN] Eukaryotic organisms, from fungi to humans, possess signal transduction systems to respond and adapt to a great variety of xenobiotic molecules. Activation of these multidrug systems is a major cause of pleiotropic resistance to antifungal compounds in pathogenic fungi as well as to anticancer treatments in human cells. Here we investigate the natural diversity of a multidrug response, which occurs in differentially evolved natural isolates of the yeast Saccharomyces cerevisiae. In this organism, Pdr1 is the main transcriptional activator, which directly recognizes xenobiotics and subsequently activates the expression of genes encoding drug efflux transporters, thus leading to resistance to the xenobiotic. In this work, different Pdr1 variants from diverse natural S. cerevisae strains and from the pathogenic yeast Candida glabrata will be fused to the Gal4 DNA-binding domain. The activation capacity of these Pdr1 fusion proteins will be assayed in yeast cells by live cell luciferase assays in response to increasing concentrations of xenobiotics (for example menadione). This will allow to compare the sensitivities of the different Pdr1 variants. The obtained data will be compared with the relative sensitivities of the different yeast strains to growth inhibiting concentrations of menadione and other xenobiotics. In complementary assays, natural S. cerevisiae isolates, which have evolved in different habitats, will be transformed with live cell reporters specific for the PDR response. The different strains will be examined for their dose-dependent activation of the multidrug response by luciferase assays and for their xenobiotic resistance by continuous growth assays. Taken together, the results will allow to quantify natural diversity of yeast multidrug systems and specifically of Pdr1, and to compare these behaviors with the xenobiotic resistance of the respective strains.

Se sabe que la luz irradiada por el Sol es de vital importancia para el desarrollo de la vida en la Tierra, y que sin ella definitivamente no estaríamos aquí. Sin embargo, cuando la oscuridad de la noche llega a nuestro planeta, es posible observar que la luz no solamente puede ser producida por el Sol. Muchas especies de organismos, tanto terrestres como marinos, tienen la sorprendente capacidad de generar su propia luz. Quizá los primeros organismos que llegan a nuestra mente en este contexto sean las luciérnagas, que emiten luz en la búsqueda de sus parejas; pero, también hay otros organismos como larvas de escarabajos, caracoles y hongos que sorprenden con esta capacidad. En los océanos, un sinfín de especies —incluidos los ctenóforos, cefalópodos, bacterias, crustáceos, fitoplancton y algunos peces— también tienen esta magia, convirtiéndose en un verdadero espectáculo.--LEER MÁS-- Se sabe que la luz irradiada por el Sol es de vital importancia para el desarrollo de la vida en la Tierra, y que sin ella definitivamente no estaríamos aquí. Sin embargo, cuando la oscuridad de la noche llega a nuestro planeta, es posible observar que la luz no solamente puede ser producida por el Sol. Muchas especies de organismos, tanto terrestres como marinos, tienen la sorprendente capacidad de generar su propia luz. Quizá los primeros organismos que llegan a nuestra mente en este contexto sean las luciérnagas, que emiten luz en la búsqueda de sus parejas; pero, también hay otros organismos como larvas de escarabajos, caracoles y hongos que sorprenden con esta capacidad. En los océanos, un sinfín de especies —incluidos los ctenóforos, cefalópodos, bacterias, crustáceos, fitoplancton y algunos peces— también tienen esta magia, convirtiéndose en un verdadero espectáculo.--LEER MÁS

Resumen Objetivos: En las últimas décadas se han identificado genes asociados a la masa ósea y al riesgo de fractura osteoporótica, varios de los cuales pertenecen a la vía de Wnt. En este proyecto se estudió la funcionalidad de 7 mutaciones de cambio de sentido del gen DKK1 –un inhibidor de la vía de Wnt– presentes en la población general. Material y métodos: Se realizaron estudios in vitro del gen reportero luciferasa para medir la actividad de la vía de Wnt en presencia o ausencia de DKK1 silvestre o mutada, y estudios de western blot, para evaluar si las distintas mutaciones afectan a su síntesis y/o a su estabilidad. Resultados: La proteína DKK1 con la variante p.Ala41Thr presenta menor actividad inhibidora de la vía en comparación con la proteína silvestre. También se observaron diferencias significativas entre los experimentos realizados en ausencia de DKK1 y los que incluyen DKK1 con la mutación p.Ala41Thr. Los western blots mostraron que la cantidad de proteína era similar para todas las variantes, tanto las mutadas como la silvestre, por lo que la pérdida de actividad de p.Ala41Thr no parecía deberse a falta de proteína. El resto de las mutaciones no presentaron un comportamiento diferente al de la proteína DKK1 silvestre. Conclusiones: La variante de cambio de sentido p.Ala41Thr de la proteína DKK1, con una frecuencia poblacional de 0,013%, presenta una pérdida parcial de su función inhibidora, que no es debida a la falta de expresión de ésta. Esta variante génica podría conllevar un aumento de la densidad mineral ósea en las personas de la población general portadoras de esta mutación. Abstract Objectives: In recent decades, genes associated with bone mass and osteoporotic fracture risk have been identified, several of which belong to the Wnt pathway. In this project, the functionality of 7 missense mutations of the gene DKK1 –an inhibitor of the Wnt pathway– present in the general population was studied. Materials and methods: In vitro studies of the luciferase reporter gene were carried out to measure Wnt pathway activity in the presence or absence of wild-type or mutated DKK1, and western blot studies, to evaluate if the different mutations affect its synthesis and/or stability. Results: The DKK1 protein with the p.Ala41Thr variant shows lower pathway inhibitory activity compared to the wild-type protein. Significant differences were also observed between the experiments performed in the absence of DKK1 and those that include DKK1 with the p.Ala41Thr mutation. Western blots showed that the amount of protein was similar for all variants, both mutated and "wild-type, so the loss of p.Ala41Thr activity did not seem to be due to a lack of protein. The rest of the mutations did not show different behavior from that of the wild DKK1 protein. Conclusions: The missense variant p.Ala41Thr of the DKK1 protein, with a population frequency of 0.013%, shows a partial loss of its inhibitory function, which is not due to the lack of expression. This gene variant could lead to an increase in bone mineral density in those people in the general population who carry this mutation.

La falla ovárica prematura (FOP) afecta al 1%-2% de las mujeres menores de 40 años. Se caracteriza por presencia de amenorrea y niveles elevados de gonadotropinas. En un estudio reciente, mediante un experimento de secuenciación de NGS de 70 genes candidatos, se encontraron las variantes heterocigotas c.296A>G (p.Asn99Ser) y c.526T>C (p.Ser176Pro) en el gen LHCGR. Variantes en este gen han sido previamente relacionadas con la FOP. El objetivo de la presente tesis fue evaluar el potencial impacto funcional de las variantes identificadas mediante ensayos in vitro. Inicialmente, se determinó si las variantes encontradas afectaban la localización subcelular. Posteriormente, se evaluó si estas variantes tenían un efecto deletéreo en la producción de cAMP y por lo tanto, en la transducción de la señal corriente abajo. Para esto se cotransfectaron la condición WT o las condiciones mutantes (LHCGR-N99S o LHCGR-S176P) con un plásmido reportero de cAMP. La medición del cAMP se realizó luego de la estimulación con hCG, mediante un ensayo reportero de luciferasa. Se encontró que la localización subcelularfue similar entre la condición WT y las condiciones mutantes. Sin embargo, en las condiciones mutantes se observó que hubo un incremento significativo en imágenes similares a agregados. También, se identificó que estas variantes no afectaron laseñalización mediada por la hCG. Con los ensayos funcionales realizados no se pudo determinar de manera directa que las variantes analizadas tuvieran un efecto deletéreo. No obstante, considerando que la FOP es una patología de origen poligénico, no se descarta la posibilidad que las variantes c.296A>G (p.Asn99Ser) y c.526T>C (p.Ser176Pro) tuvieran un efecto aditivo mínimo y estuvieran relacionadas con su etiología.

[EN] Cells respond to environmental stimuli by fine tuned regulation of gene expression. In this thesis we investigate the dose dependent modulation of the genetic response upon nutrient and stress signals in yeast. A destabilized version of firefly luciferase was used in living yeast cells as a real-time reporter for gene expression. This highly sensitive and non-invasive system can be simultaneously used upon many different experimental conditions in small culture aliquots. This allows the dose-response behaviour of gene expression driven by any yeast promoter to be reported and can be used to quantify important parameters, such as the threshold, sensitivity, response time, maximal activity and synthesis rate for a given stimulus. We applied the luciferase assay to the nutrient-regulated GAL1 promoter and the stress-responsive GRE2 promoter. We find that luciferase expression driven by the GAL1 promoter responds dynamically to growing galactose concentrations, with increasing synthesis rates determined by the light increment in the initial linear phase of activation. The GAL1 gene is activated with continuously increasing synthesis rates in a well defined range of galactose concentrations, correlating with a dynamic increase of histone remodeling and subsequent association of the RNAPII complex. Dose dependent chromatin remodeling appears to be the basis for the dynamic GAL1 expression since mutants with impaired histone dynamics show severely truncated dose response profiles. In the case of the GRE2 promoter, we demonstrate that the very short-lived version of luciferase used here is an excellent tool to quantitatively describe transient transcriptional activation. The luciferase expression controlled by the GRE2 promoter responds dynamically to a gradual increase of osmotic or oxidative stress stimuli, which is mainly based on the progressive increase of the time the promoter remains active. In contrast, the GRE2 promoter operates like an off/on switch in response to increasing osmotic stress with almost constant synthesis rates and exclusively temporal regulation of histone remodeling and RNAPII occupancy. The Gal3 inducer and the Hog1 MAP kinase seem to determine the different dose response strategies at the two promoters. Our analysis reveals important differences in the way dynamic signals create dose sensitive gene expression outputs. Taken together, the luciferase assay described here is an attractive tool to rapidly and precisely determine and compare kinetic parameters of gene expression. Additionally, the function of the specific transcriptor factor Smp1 involved in the yeast osmostress response was investigated. Location analyses upon osmotic stress reveal that Smp1 associates preferentially with the whole transcribed regions (ORFs) upon stress as opposed to other transcriptional activators involved in the osmostress response. However, Smp1 seems to be important for stress-activated gene expression only in the presence of the natural induced gene and not of artificial promoter fusions. This highlights the possible role of Smp1 in regulating gene expression from ORF sequences rather than promoter regions., [ES] Las células responden a los estímulos ambientales a través de una regulación precisa de la expresión génica. En este trabajo se investigó la modulación dosis dependiente de la expresión de genes activados en respuesta a estrés y por nutrientes. Se utilizó una versión desestabilizada de luciferasa de luciérnaga en células vivas de levadura como reportero para la detección de la expresión génica en tiempo real. Este sistema altamente sensible y no invasivo puede ser utilizado simultáneamente en diferentes condiciones experimentales a través de pequeñas alícuotas de cultivo. Esto permite la caracterización dosis-respuesta de la regulación de los promotores de levadura y puede ser utilizado para cuantificar parámetros importantes como el umbral, la sensibilidad, el tiempo de respuesta, la actividad máxima y el ratio de síntesis provocado por un determinado estímulo. Se aplicó el ensayo luciferasa al promotor GAL1 regulado por nutrientes y al promotor GRE2 activado en respuesta a estrés. Se observó que la expresión de la luciferasa activada por el promotor GAL1 responde de forma dinámica a las crecientes concentraciones de galactosa, con un incremento del ratio de síntesis determinado por el aumento de luz en la fase lineal inicial de la activación, en función de una gama de concentraciones de galactosa bien definidas. Este mecanismo de regulación depende de un aumento en la remodelación de las histonas y la consecuente asociación del complejo ARN pol II. La remodelación de la cromatina dosis dependiente parece ser la base de la expresión dinámica de GAL1, pues los mutantes relacionados con la dinámica de las histonas muestran perfiles dosis respuesta severamente afectados. En el caso del promotor GRE2, se demostró que una versión de una luciferasa desestabilizada es una herramienta excelente para describir de forma cuantitativa la activación transcipcional transitoria. La expresión de la luciferasa controlada por el promotor GRE2 responde de forma dinámica al aumento gradual de estímulo de estrés osmótico u oxidativo. La activación se observa principalmente en el incremento progresivo del tiempo en que el promotor permanece activo. Diferentemente de GAL1, el promotor GRE2 opera a través de un cambio apagado/encendido en respuesta a un aumento de estrés osmótico a través de ratios de síntesis prácticamente constantes y cuya regulación solamente depende de la remodelación de la cromatina y de la permanencia de la ARN pol II. Finalmente, se puede especular que el inductor Gal3 y la MAPK Hog1 son las moléculas determinantes para las diferentes estrategias de respuesta dinámica para los dos promotores. En este trabajo se identifican importantes diferencias en la señalización dinámica determinada por la dosis de estímulo en la expresión génica. En conjunto, el ensayo de luciferasa presentado en este trabajo puede ser una herramienta interesante para determinar y comparar de forma rápida y precisa los parámetros de la expresión génica. Adicionalmente se investigó la función del factor de transcripción Smp1 involucrado en la respuesta a osmoestrés en levadura. Un análisis de la asociación a la cromatina in vivo bajo estrés osmótico demostró que Smp1 se une preferentemente a regiones transcritas (ORFs) lo que refleja un comportamiento diferente comparando con otros activadores transcripcionales de la respuesta a estrés osmótico. Sin embargo, Smp1 parece ser importante para la expresión génica activada por estrés osmótico sólo en la presencia del gen natural inducido y no de fusiones artificiales del promotor. Esto evidencia el posible papel de Smp1 en la regulación de la expresión génica desde secuencias ORF y no en las regiones promotoras., [CAT] Les cèl¿lules responen als estímuls ambientals a través d'una regulació precisa de l'expressió gènica. A aquest treball es va investigar la modulació dosi dependent de l'expressió de gens activats en resposta a estrès i per nutrients. Es va utilitzar una versió desestabilitzada de luciferasa de cuca de llum en cèl¿lules vives de llevat com a reporter per a la detecció de l'expressió gènica a temps real. Aquest sistema altament sensible i no invasiu pot ser utilitzat simultàniament en diferents condicions experimentals a través de xicotetes alíquotes de cultiu. Això permet la caracterització dosi-resposta de la regulació dels promotors de llevat i pot ser utilitzat per a quantificar paràmetres importants com el llindar, la sensibilitat, el temps de resposta, l'activitat màxima i el rati de síntesi provocat per un determinat estímul. L'assaig luciferasa es va aplicar al promotor GAL1 regulat per nutrients i al promotor GRE2 activat en resposta a estrès. Es va observar que l'expressió de la luciferasa activada pel promotor GAL1 respon de forma dinàmica a les creixents concentracions de galactosa, amb un increment del rati de síntesi determinat per l'augment de llum en la fase lineal inicial de l'activació, en funció d'una gama de concentracions de galactosa ben definides. Aquest mecanisme de regulació depèn d'un augment en la remodelació de les histones i la conseqüent associació del complex ARN pol II. La remodelació de la cromatina dosi dependent sembla ser la base de l'expressió dinàmica de GAL1, ja què els mutants relacionats amb la dinàmica de les histones mostren perfils dosi-resposta severament afectats. En el cas del promotor GRE2, es va demostrar que una versió d'una luciferasa desestabilitzada és una eina excel¿lent per a descriure de forma quantitativa l'activació transcripcional transitòria. L'expressió de la luciferasa controlada pel promotor GRE2 respon de forma dinàmica a l'augment gradual d'estímul d'estrès osmòtic o oxidatiu. L'activació s'observa principalment a l'increment progressiu del temps al qual el promotor roman actiu. De forma diferent de GAL1, el promotor GRE2 opera a través d'un canvi apagat/encès en resposta a un augment d'estrès osmòtic a través de ratis de síntesi pràcticament constants i als quals la seua regulació només depèn de la remodelació de la cromatina i de la permanència de l'ARN pol II. Finalment, es pot especular que l'inductor Gal3 i la MAPK Hog1 són les molècules determinants per a les diferents estratègies de resposta dinàmica per als dos promotors. A aquest treball s'identifiquen importants diferències a la senyalització dinàmica determinada per la dosi d'estímul a l'expressió gènica. En conjunt, l'assaig luciferasa presentat a aquest treball pot ser una eina interesant per a determinar i comparar de forma ràpida i precisa els paràmetres de l'expressió gènica. Addicionalment, es va investigar la funció del factor de transcripció Smp1 involucrat en la resposta a osmoestrès en llevat. Una anàlisi de l'associació a la cromatina in vivo sota l'estrès osmòtic va demostrar que Smp1 s'uneix preferentment a regions transcrites (ORFs), el qual reflecteix un comportament diferent comparant amb altres activadors transcripcionals de la resposta a estrès osmòtic. Tot i així, Smp1 sembla ser important per a l'expressió gènica activada per estrès osmòtic només en la presència del gen natural induït i no de fusions artificials del promotor. Això evidencia el possible paper de Smp1 en la regulació de l'expressió gènica des de seqüències ORF i no a les regions promotores., Rienzo, A. (2016). Estudio de la regulación dinámica de la expresión génica en respuesta a estrés osmótico en levadura [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. doi:10.4995/Thesis/10251/62160., TESIS

[EN] Yeast (Saccharomyces cerevisiae) is an important model to understand the molecular mechanisms of the defense to different types of stress. Production of reactive oxygen species (ROS) is one of the fundamental stresses for all cells. The increase of ROS can be produced by external agents (like H2O2 and menadione) or by the cell itself (for example, during cellular respiration). In these situations of stress, yeast cells modify their transcriptional capacity to adapt to environmental conditions and survive. This adaptation occurs via stress-induced activation of transcription factors, which recognize and bind specific regulatory sites in cis and facilitate the access of the transcriptional pre-initiation complex to the promoters. To study how specific transcription factors contribute to the transcriptional response profile, a system is needed to quantify the modulation of gene expression by stress in real time and in living cells. Thus, in the present work a destabilized luciferase system (lucCP+) is used as a tool to detect and quantify oxidative damage produced by various treatments in yeast. Specifically we apply two types of reporters with the gene lucCP+ whose expression is regulated by the two key transcription factors that act in response to oxidative stress: Yap1 and Skn7. Subsequently, the dose dependent responses obtained for the two reporters are compared in a quantitative manner in various conditions of external stress (H2O2; menadione) and the sensitivity is determined for both reporters. On the other hand, the destabilized luciferase system is also used to study the dynamic transcriptional response to salt and osmotic stress of the GRE2 and SOD2 promoters in different culture media. Specifically, the way the fermentative or respiratory metabolism influence in the transcriptional response to diverse saline and oxidative stresses has been investigated. Therefore, growth media with glucose (fully fermentative medium) or galactose (partially respiratory medium) as an energy source were used to quantify the differences in the dynamic dose response to stress with various stress-responsive luciferase reporters. These assays have been supplemented with growth assays in liquid medium, which allows evaluating the sensitivity of yeast cells to salt stress comparing glucose and galactose medium. As a result it was confirmed that galactose growth renders the transcriptional response to salt stress more sensitive (faster saturation of the response at lower salt concentrations), and that yeast growth is more efficiently inhibited by salt stress in galactose medium. Finally, the glycerol production upon salt stress was compared in yeast cells grown in glucose or galactose. Glycerol is one of the most important osmolytes in the osmoadaptation process of yeast cells. It was confirmed that yeast cells grown on galactose medium produce significantly less amounts of glycerol as compared to glucose medium., [ES] La levadura Saccharomyces cerevisiae es un modelo muy importante para comprender los mecanismos moleculares de la defensa a diferentes tipos de estrés. La producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) es uno de los estreses fundamentales para todas las células. El aumento de ROS puede producirse por agentes externos (como H2O2, menadiona) o por la propia célula (por ejemplo, durante la respiración). Ante estas situaciones de estrés, las células de levadura modifican su capacidad transcripcional para adaptarse a las condiciones ambientales y sobrevivir. Esta adaptación, se produce gracias al reconocimiento del estrés por parte de los factores de transcripción, encargados de generar una respuesta transcripcional mediante el reconocimiento y la unión específica a sitios reguladores en cis y el favorecimiento del acceso del complejo de pre-iniciación de la transcripción a los promotores. Para poder estudiar como factores de transcripción específicos contribuyen al perfil de respuesta transcripcional es necesario un sistema que permita cuantificar la modulación de la expresión génica por estrés en tiempo real y en células vivas. Para ello, en el presente trabajo se emplea un sistema de luciferasa desestabilizada (lucCP+) como herramienta para detectar y cuantificar los daños oxidativos producidos por varios tratamientos en levadura. Para ello, se aplican dos tipos de reporteros con el gen lucCP+ cuya expresión está regulada por los dos principales factores de transcripción que actúan en respuesta a estrés oxidativo: Yap1 y Skn7. Posteriormente, se compara de forma cuantitativa las respuestas dependiendo de la dosis de los dos reporteros en varias condiciones de estrés oxidativo externo (H2O2; menadiona), así como también se determinan las sensibilidades de ambos reporteros a los distintos tipos de oxidación intracelular. Por otro lado, también se emplea el sistema luciferasa desestabilizada para estudiar la dinámica transcripcional en respuesta a estrés salino y osmótico de los promotores GRE2 y SOD2 en diferentes medios de cultivo. Es decir, se ha investigado sobre la manera en la que el metabolismo fermentativo y respiratorio influyen en la respuesta a nivel transcripcional a diversos estreses tanto salino como oxidativo. Para ello, se han empleado medios que emplean glucosa como fuente de energía (medio completamente fermentativo) y medios que emplean galactosa como fuente de energía (medio parcialmente respiratorio).Estos ensayos se han complementado con un ensayo de crecimiento en medio líquido, que permite evaluar la sensibilidad de las células de levadura a medio con glucosa y con galactosa. Como resultado de estos ensayos se confirmó que cuando las células crecen en medio con galactosa responden a estrés salino de forma mucho más sensible (la saturación de la respuesta es más rápida a bajas concentraciones de sal), también se pudo deducir que el crecimiento es inhibido de forma más eficiente cuando las células se someten a estrés en medio con galactosa. Por último, se midió la producción de glicerol, osmolito que juega un papel importante en la osmoadaptación, comparándose los resultados de la producción en medio con glucosa con la producción en medio con galactosa. Se confirmó que cuando las células de levadura crecen en medio con galactosa la cantidad de glicerol producida es significativamente menor en comparación con el medio de glucosa.

La medicina regenerativa és una disciplina que ha guanyat reconeixement en les últimes dècades pel fet que moltes malalties no són tractables amb fàrmacs convencionals. Molts grups de recerca i empreses inverteixen temps i diners en la producció de nous paradigmes per curar malalties com el Parkinson, l'artrosi o la regeneració de medul·la espinal. Aquestes propostes es basen en l'ús de teixits biomimètics per reparar òrgans danyats. En aquesta tesi es presenta un nou model experimental per estudiar la formació d'os i cartílag i eventualment la reparació d'aquests teixits. Hem utilitzat Fibroblasts Embriònics de Ratolí (MEFs) combinats amb diferents materials biomimètics per estudiar os i cartílag in vitro i in vivo. Aquests MEFs es van cultivar in vitro i in vivo en RAD16-I, un pèptid auto-ensamblable amb estructura similar a matrius extracel·lulars genèriques, amb l'objectiu d'estudiar l'evolució dels fibroblasts en aquestes dues condicions. També s'han recobert superficialment micropartícules de hidroxiapatita obtenint càrregues inorgàniques similars a l'os i biològicament actives per a utilitzar-les com a substituts d'os o cartílag. Amb la idea de millorar els recobriments superficials, hem desenvolupat una plataforma que permet dur a terme proves combinatòries amb factors de creixement i altres compostos biològicament actius. Cultius in vitro de MEFs han mostrat que quan fibroblasts embrionaris primaris de ratolí es cultiven en RAD16-I, estableixen una xarxa intercel·lular que causa una contracció cel·lular organitzada, proliferació i migració cel·lulars i culmina amb la formació d'una estructura bilateral i simètrica amb un eix central distingible. Durant aquest procés morfològic, augmenta l'expressió d'un grup de gens mesodèrmics (brachyury, Sox9, Sox5, Sox6, Runx2). L'expressió de brachyury està localitzada primer en l'eix de simetria central i després s'extén als dos costats de l'estructura. Per acabar, la formació espontània d'un teixit similar al del cartílag acompanya l'expressió de Sox9 i Runx2.L'estudi in vivo de MEFs es va fer gràcies a la tècnica de presa d'imatges no invasiva basada en bioluminiscència (BLI) que ha desenvolupat en el grup de recerca del dr. Jerónimo Blanco. Aquests experiments han mostrat que el RAD16-I és una matriu molt permissiva per a la supervivència i proliferació cel·lulars in vivo. A més, sembla que les pobres propietats mecàniques que té el RAD16-I no li suposen cap desavantatge en termes de creixement cel·lular in vivo. Finalment, hem desenvolupat diferents tipus de micropartícules de hidroxiapatita (HA) no recobertes, i recobertes mitjançant polimerització assistida per plasma. Els recobriments permeten afinar les propietats de la HA i produir partícules que satisfacin les necessitats de diferents aplicacions mèdiques en reparació d'os i cartílag. També hem desenvolupat un mètode per produir plataformes basades en plaques de 96 pous que permetin fer proves combinatòries amb compostos biològicament actius per vàries aplicacions en medicina regenerativa. En conclusió, hem aportat noves idees i eines que permetran trobar teixits regeneratius basats en l'ús de fibroblasts i materials biomimètics., La medicina regenerativa es una disciplina que ha ganado reconocimiento en las últimas décadas porque muchas enfermedades no son tratables con fármacos convencionales. Muchos grupos de investigación y empresas invierten tiempo y dinero en la producción de nuevos paradigmas para curar enfermedades como el Parkinson, la artrosis o la regeneración de médula espinal. Estas propuestas se basan en el uso de tejidos biomiméticos para reparar órganos dañados. En esta tesis se presenta un nuevo modelo experimental para estudiar la formación de hueso y cartílago y tal vez la reparación de estos tejidos. Hemos utilizado Fibroblastos Embrionarios de Ratón (MEFs) combinados con diferentes materiales biomiméticos para estudiar hueso y cartílago in vitro e in vivo. Estos MEFs se cultivaron in vitro e in vivo en RAD16-I, un péptido auto-ensamblable con estructura similar a matrices extracelulares genéricas, con el objetivo de estudiar la evolución de los fibroblastos en estas dos condiciones. También se han recubierto superficialmente micropartículas de hidroxiapatita obteniendo cargas inorgánicas similares al hueso y biológicamente activas para utilizarlas como sustitutos de hueso o cartílago. Con la idea de mejorar los recubrimientos superficiales, hemos desarrollado una plataforma que permite llevar a cabo pruebas combinatorias con factores de crecimiento y otros compuestos biológicamente activos. Cultivos in vitro de MEFs han mostrado que cuando fibroblastos embrionarios primarios de ratón se cultivan en RAD16-I, establecen una red intercelular que causa una contracción celular organizada, proliferación y migración celulares y culmina con la formación de una estructura bilateral y simétrica con un eje central distinguible. Durante este proceso morfológico, aumenta la expresión de un grupo de genes mesodérmicos (brachyury, Sox9, Sox5, Sox6, Runx2). La expresión de brachyury está localizada primero en el eje de simetría central y después se extiende a los dos lados de la estructura. Para terminar, la formación espontánea de un tejido similar al del cartílago acompaña a la expresión de Sox9 y Runx2.El estudio in vivo de MEFs se hizo gracias a la técnica de toma de imágenes no invasiva basada en bioluminiscencia (BLI) que han desarrollado en el grupo de investigación del dr. Jerónimo Blanco. Estos experimentos han mostrado que el RAD16-I es una matriz muy permisiva para a la supervivencia y proliferación celulares in vivo. Además, parece que las pobres propiedades mecánicas que tiene el RAD16-I no le suponen ninguna desventaja en términos de crecimiento celular in vivo. Finalmente, hemos desarrollado diferentes tipos de micropartículas de hidroxiapatita (HA) no recubiertas, y recubiertas mediante polimerización asistida por plasma. Los recubrimientos permiten afinar las propiedades de la HA y producir partículas que satisfagan las necesidades de diferentes aplicaciones médicas en reparación de hueso y cartílago. También hemos desarrollado un método para producir plataformas basadas en placas de 96 pozos que permitan hacer pruebas combinatorias con compuestos biológicamente activos para varias aplicaciones en medicina regenerativa. En conclusión, hemos aportado nuevas ideas y herramientas que permitirán hallar tejidos regenerativos basados en el uso de fibroblastos y materiales biomiméticos., Regenerative medicine is a discipline that has gained recognition in the last decades because many diseases are not treatable with traditional drugs. Many research groups and companies invest time and money in the production of new paradigms to cure conditions such as Parkinson's, arthrosis or spinal cord injuries. These approaches are based in the use of biomimetic tissues to replace damaged organs. In this work we present a new experimental model to study the formation of bone and cartilage and eventually to repair these tissues. We have used Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) combined with different biomimetic materials to study bone and cartilage formation in vitro and in vivo. MEFs have been cultured in vitro and in vivo in RAD16-I, a synthetic self-assembling peptide with structure similar to generic extracellular matrix milieu, to study the evolution of these fibroblasts in both conditions. Also, hydroxyapatite microparticles have been surface coated to produce biologically active bone-like inorganic charges for use in cartilage or bone substitutes. In order to improve the particles' coatings, we have developed a platform that allows us to perform combinatorial testing of growth factors and other biologically active compounds. In vitro cultures of MEFs has shown that when primary mouse embryonic fibroblasts are cultured in a soft nanofiber scaffold, they establish a cellular network that causes an organized cell contraction, proliferation, and migration that ends in the formation of a symmetrically bilateral structure with a distinct central axis. A subset of mesodermal genes (brachyury, Sox9, Sox5, Sox6, Runx2) is upregulated during this morphogenetic process. The expression of brachyury was localized first at the central axis, extending then to both sides of the structure. The spontaneous formation of cartilage-like tissue mainly at the paraxial zone followed the expression of Sox9 and Runx2.In vivo study of MEFs was facilitated by a non-invasive bioluminescence imaging (BLI) technique to detect luciferase-expressing cells, developed by Dr. Blanco's research group. These experiments showed that RAD16-I is a very permissive scaffold for cell survival and proliferation in vivo. Furthermore, it seems that the poor mechanical properties of RAD16-I are no disadvantage in terms of cell growth in vivo.Finally, we have developed different types of coated and uncoated hydroxyapatite (HA) microparticles by plasma polymerization. The coatings permit to tune the properties of HA and produce particles that suit the needs of different medical applications in bone and cartilage repair. Moreover, we have developed a method to produce platforms based on 96-well plates that allow the combinatorial testing of biologically active compounds for various applications in regenerative medicine. In conclusion, we have supplied new insights and tools that will enhance the finding of new regenerative tissues based on fibroblasts and biomimetic materials.