Search

https://www.ester.ee/record=b5507225

A Thesis for applying for the degree of Doctor of Philosophy in Veterinary Science The roles of BMP and Pax in the embryonic development have been extensively studied in recent years and the formation of the neural tube is usually described as a self-evident process, but formation of nervous system in human embryos has actually not been examined in detail. In the present study 40 human embryos at Carnegie stages (CS) 10-20 were obtained, and the expression of BMP-2, BMP-4, Pax2, Pax6 and Pax7 proteins were examined in the developing brain. 22 rat embryos of CS 14, 18 and 20 were employed to compare the BMP-2, BMP-4 and Pax2 expression in the developing spinal cord of human and rat embryos throughout early stages of the nervous system development. To detect expression of proteins the method of immunohistochemistry was used. BMP-2 and BMP-4 are essential signalling molecules for the formation of the neural tube in human embryos as their expression was seen throughout all studied developmental stages 10-20. The expression of both proteins, BMP-2 and BMP-4, had a tendency to decline in the later stages of the development. In the developing CNS of rat embryos BMP-2 and BMP-4 have a similar spatial and temporal expression pattern compared to the corresponding stages of the human embryos. However, slight differences were noted as in the spinal cord of rat embryos BMP-2 and BMP-4 expression was weaker compared to human embryos. In the human embryos Pax2, Pax6 and Pax7 were identified as signalling molecules that are involved in the formation of the early spinal cord and brain. The expression of Pax2, Pax6 and Pax7 had a tendency to increase in the later stages of the development both in the spinal cord and the brain. Significantly weaker expression of the Pax proteins was observed at CS 10. The similar temporal expression pattern of Pax2 to human embryos was seen in the forming spinal cord of rat embryos, as the Pax2 expression was found to increase at the later stages of the development. Differently from human embryos, no clear regional differences in Pax2 expression in the developing spinal cord of the rat embryos were not seen. It can be said that in the human and rat embryos BMP-2, BMP-4, Pax2, Pax6 and Pax7 proteins are associated with the establishment of neuroepithelial cells within the developing neural tube and with the migration and the differentiation of specific neural cell populations. In particular, the studied signalling molecules play an essentially important role in the determining of the dorsal-ventral and rostral-caudal axis of the developing brain. BMP ja Pax valgud on ühed olulisemad signaalmolekulid imetajate neuraaltoru moodustumisel ja edasises kesknärvisüsteemi arengus. BMP ja Pax valkude osalusest inimembrüo närvisüsteemi varajases arengus on siiani ilmunud üksikud teadusartiklid. Käesoleva töö eesmärgiks oli uurida BMP-2, BMP-4, Pax2, Pax6 ja Pax7 ekspressiooni inimembrüo arenevas pea- ja seljaajus. Lisaks inimembrüotele analüüsiti BMP-2, BMP-4 ja Pax2 avaldumist rottide embrüote seljaajus. Uuringuteks kogutud embrüod jäid Carnegie arenguetappidesse 10–20, roti embrüod vastavalt 14, 18 ja 20 arenguetappi. BMP ja Pax valkude ekspressiooni hindamiseks kasutati immunohistokeemilist meetodit. BMP ja Pax signaalmolekulide ekspressioon avaldus kõigis uuritud etappides 10–20. Nii BMP-2 kui ka BMP-4 avaldumisel ilmnes hilisemates arenguetappides ekspressiooni nõrgenemise tendents. BMP-2 ja BMP-4 on olulised kasvufaktorid inimembrüo seljaaju dorsoventraalse telje väljakujunemisel, eriti etappides 16–18, kus antud töö tulemused näitasid BMP-de tugevamat ekspressiooni areneva seljaaju dorsaalosas võrreldes ventraalosaga. Roti arenevas seljaajus ilmnes võrreldes inimembrüote vastavate arenguetappidega ajalise ja ruumilise BMP-2 ja BMP-4 ekspressiooni sarnasus. Nii Pax2, Pax6 kui Pax7 avaldumise hindamisel selgus ekspressiooni tugevnemine hilisematel arenguetappidel. Pax valkude ekspressioon etappidel 10–14 näitab antud signaalmolekulide vajalikkust seljaaju dorsoventraalse telje ja ajuvatsakeste moodustumisel. Hilisemates etappides 16–20 on Pax2, Pax6 ja Pax7 kaasatud ees-, kesk- ja tagaaju mitmete erinevate piirkondade arengusse. Roti ja inimembrüo arenevas seljaajus avaldus sarnane Pax2 ajaline ekspressioon – Pax2 signaal tugevnes hilisematel arenguetappidel. Erinevalt inimembrüotest, ei ilmnenud rottide embrüotel arenevas seljaajus Pax2 avaldumises selgeid regionaalseid erinevusi dorsaalse ja ventraalse poole vahel. Kokkuvõtlikult võib öelda, et BMP-2, BMP-4, Pax2, Pax6 ja Pax7 on olulisel määral seotud neuroepiteeli rakkude formeerumise, migreerumise ja diferentseerumisega erinevateks närvirakkude populatsioonideks. Uuritud singnaalmolekulid on inimese ja roti embrüote varajases kesknärvisüsteemi arengus määrava tähtsusega dorsoventraalse ja kraniokaudaalse telje väljakujunemisel. Publication of this dissertation is granted by the Estonian University of Life Sciences

http://www.ester.ee/record=b4678844*est

Bakalaureusetöö eesmärgiks on tutvustada filosoofilist aspekti abordidebatis, abordiga seostuvaid moraalseid probleeme ning võimalikke vastuseid. Põhiliseks ülesandeks on vastata küsimusele, millal on moraalselt lubatud teha aborti. Sellega seoses tuleb ka põhjendada, milline moraalne staatus on sündimata lapsel ning milline on see võrreldes täiskasvanud inimese ja emaga. Sündimata lapse moraalne staatus omistab tema suhtes ka teatud õigusi ja kohustusi, mille rikkumine peab olema piisavalt põhjendatud. Abordi moraalsus või ebamoraalsus on teema, mis tekitab sageli tugevaid emotsioone. Ühe vaate eest seisavad elupooldajad (pro-life), kes püüavad iga hinna eest sündimata laste tapmist peatada, ning teise eest valikupooldajad (pro-choice), kes näevad abordi keelamises naiste inimõiguste rikkumist. Tegu on moraalse probleemiga, mis ikka ja jälle muutub aktuaalseks nii läänes kui mujal. Maailmas leidub piirkondi, kus abort on karistatav surmanuhtlusega. Samuti on riike, kus seda nähakse enesestmõistetava inimõigusena. Kuigi tegemist võib olla levinud praktikaga, on see siiski kohati tabuteema, millest osalejad ei taha avalikult rääkida. Säärane hoiak on mõistetav, sest kuigi paljud inimesed ei pühenda aega abordi filosoofilisele mõtestamisele, on suuremale osale arusaadav, et selle käigus surmatakse keegi või miski tahtlikult. Tegu ei ole ka niisama tapmisega, vaid inimese või kellegi, kes kunagi võiks inimeseks saada, kaotamisega. Seega on tüüpiline, et isegi ühiskondades, kus aborti seaduslikult tõlgendatakse naise inimõigusena, eksisteerib paralleelselt arvamus, et seda peaks siiski varjama ning vältima. Nii nähakse raseduses midagi iseenesest väärtuslikku ja kohati püha, mis peaks olema rõõmustav, mitte kurvastav. Töös püüan just seda tundlikku teemat mõlemast vaatekohast esitada ning näidata, kuidas elu- ja valikupooldajad võivad näha sama moraalset probleemi kardinaalselt erinevalt., http://www.ester.ee/record=b4501024*est

In recent decades technological developments have opened up new possibilities for genomic research. Mouse and bovine embryos are widely used as a tool for biomedical research. These embryos represent mammal eukaryotic cells, which have different mechanisms for gene expression control compared with prokaryotic cells. Recent research has focused on studies of pluripotency-associated genes and their expression levels in embryos. For mammal embryos, gene expression profiling might give us a better tool to evaluate developmental potential. So far, most of these studies have shown controversial results. A recent study conducted by Suzuki Jr et al. (2009) shows that pregnancy rates in day 40 differ depending on which method was used to produce embryos. Artificial insemination (AI) leads to 75 % pregnancy rate in day 40, whereas the same proportion for in vitro fertilization (IVF) is 50 % and for somatic cell nuclear transfer (SCNT) -- 30 %. Interestingly, blastocyst development rate in IVF embryos is 34 % and in SCNT embryos 28 %. During 33 days, the 6-unit difference in blastocyst formation rate increases up to a 20-unit difference in day 40 pregnancy rate between IVF and SCNT embryos. This indicates that reprogramming of SCNT embryos and in vitro conditions play a huge role in embryo survival rates. By comparing the gene expression profiles between in vivo, in vitro and SCNT we can observe how changes in in vitro conditions affect the developmental potential of embryos. In this study, we purified ribonucleic acid (RNA) from bovine embryo pools and analysed expression levels for gene insulin-like growth factor 1 (IGF1), insulin-like growth factor 2 (IGF2) and insulin-like growth factor binding protein 6 (IGFBP6). Embryos were either frozen or fresh, and produced by either IVF or SCNT. RNA was purified by using the Qiagen RNeasy Plus Micro kit (Qiagen Sciences, Maryland, USA). After purification the RNA was analysed using the Agilent 2100 Bioanalyzer with RNA 6000 Pico kit (Agilent Technologies Inc., California, USA). Complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) was synthesized from RNA by using the Quantitect Reverse Transcription kit (Qiagen Sciences, Maryland, USA). cDNA was used as a template for TaqMan quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis in the ABI Prism 7900HT sequence detection system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). 9 The results of RNA analysis showed that the quality of RNA was acceptable in all samples. Messenger RNA (mRNA) level for IGF1 was below the detection limit. IGF2 expression level was detected in three samples. IGFBP6 mRNA level was detectable in all samples. In addition to practical skills, the author's theoretical knowledge of modern reproductive technologies improved notably during the experiments. These were the first experiments conducted in our laboratory in which RNA was purified and gene expression profiles from bovine blastocyst stage embryos were analysed. This is important, because in the future it will be easier to undertake research in this area due to applying the methods which have proven to be successful. Viimaste aastate jooksul on loomade genoomiuuringud hoogustunud peamiselt geenitehnoloogia tehniliste võimaluste kiire arengu tõttu. Hiire ja veise embrüod on biomeditsiinilistes uuringutes laialdast kasutust leidnud, aidates selgitada embrüonaalse arengu geneetilisi kontrollmehhanisme. Imetajate rakkudel on võrreldes prokarüootse rakuga mitmeid erinevaid võimalusi geeniekspressiooni kontollimiseks. Viimaste aastate uuringud on keskendunud rakkude pluripotentsusega seotud geenide uurimisele. See on vajalik, kuna nimetatud geenidel on tähtis roll imetajate varajases arengus, samuti võivad nende uuringute tulemused oluliselt mõjutada embrüonaalsete tüvirakkude alaseid uuringuid. Hiljuti avaldatud uurimustöös (Suzuki Jr et al., 2009) selgus, et sõltuvalt veise embrüo tootmise tehnoloogiast, on loomade tiinestumine erinev. Leiti, et kunstliku seemenduse (artificial insemination, AI) puhul oli 40. päeval pärast seemendust 75% veistest tiined. Samas oli tiinestumine katseklaasi viljastamise (in vitro fertilization, IVF) puhul 50% ja somaatilise raku tuuma siirdamisel (somatic cell nucleus transfer, SCNT) ainult 30%. Eelnev viitab sellele, et embrüo varajases arengus on embrüote in vitro kasvutingimustel ja kloonitud embrüote reprogrammeerimise edukusel väga oluline roll. Võrreldes geeniekspressiooni profiile in vivo, in vitro ning SCNT embrüote vahel on näha, kuidas in vitro tingimuste muutmine mõjutab embrüo arengupotentsiaali. Käesoleva uuringu käigus eraldasime blastotsüsti arengujärgus veise embrüotest ribonukleiinhappe (RNA) ning uurisime insuliinilaadset kasvufaktorit 1 (IGF1), insuliinilaadset kasvufaktorit 2 (IGF2) ning insuliinilaadse kasvufaktori siduva proteiini 6 (IGFBP6) kodeerivate geenide ekspressiooni. Embrüod saadi kas IVF või SCNT teel ja analüüsiti kolmest kuni kolmeteistkümnest embrüost koosnevate rühmadena. RNA eraldati embrüotest kasutades Qiagen RNeasy Plus Micro kitti (Qiagen Sciences, Maryland, USA). Saadud RNA kvaliteeti analüüsiti kasutades Agilent 2100 Bioanalyzer’it ja RNA 6000 Pico kiipi (Agilent Technologies Inc., California, USA). Komplementaarne DNA (cDNA) sünteesiti kogu RNA-st kasutades Quantitect Reverse Transcription kitti (Qiagen Sciences, Maryland, USA). cDNA puhul kasutati geeniekspressiooni modelleerimiseks Taqman kvantitatiivse reaalaja polümeraasi ahelreaktsiooni (qRT-PCR) meetodil ABI Prism 7900 HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) abil. RNA kvaliteedi analüüsi tulemused näitasid, et kõikide proovide RNA kvaliteet oli rahuldav. IGF1 ekspressiooni tuvastada ei õnnestunud. IGF2 puhul oli ekspressiooni tase piiripealne ning seda õnnestus tuvastada neljas proovis seitsmest. IGFBP6 puhul oli mRNA tase tuvastatav kõikide proovide puhul. Tegemist oli embrüolabori esimeste katsetega, kus blastotsüsti arengujärgus veise embrüotest eraldati RNA ning analüüsiti geeniekspressiooni profiile. Käesolev uurimistöö aitas kaasa vastava metoodika väljatöötamisele. Lisaks praktilisele töö osale tuleb märkida autori teoreetiliste teadmiste kasvamist kaasaegsete sigimisbioloogia tehnoloogiate osas. Peale selle oli autoril unikaalne võimalus harjutada oma käega erinevaid võtteid antud valdkonnas. Taoline teoreetiline ning praktiline kogemus on tulevikus kasulik.

Käesoleva töö eesmärgiks oli kirjeldada ja analüüsida veise in vitro viljastatud embrüote mitteinvasiivseid määramismeetodeid ning viimastel aastakümnetel avaldatud teadustööde tulemusi. Kirjanduse ülevaate põhjal saadud olulisemad tulemused olid järgmised: Tänapäeval on kõige levinum meetod veise IVF embrüote määramiseks morfoloogiline hindamine, mida teostatakse tavalise valgusmikroskoobiga. Meetodi eeliseks on vähene ajakulu, suhteliselt lihtne väljaõpe ning odavus. Puuduseks on aga hindamise subjektiivsus ning hindamistulemusi mõjutavate tegurite rohkus. IVF embrüote hapnikutarbe määramine on täpsem elujõulisuse hindamise meetod võrreldes morfoloogilise hindamisega. Kasutatakse mitmeid erinevaid aparaate nagu skaneeriv elektronmikroskoop, spektrofotomeeter, mikroelektroodid ning nanorespiromeeter. Viimane on neist kõige täpsem ning võimaldab mõõta ka individuaalsete embrüote hapnikutarvet erinevates arengujärkudes. On leitud, et kõrgema hapnikutarbega embrüod on suurema elujõulisusega. IVF embrüote elujõulisuse hindamiseks saab kasutada ka glükoositarbe ja laktaadi eritumise määramist. Suure glükoositarbega embrüod on eluvõimelised, kuid kõrge laktaadi eritumisega embrüod seevastu aga kehva eluvõimega. Laktaadi eritumine on seotud embrüo stressiga. Kasvulahusesse vabanevate ensüümide määramise abil saab hinnata degenereeruvate ja surnud embrüorakkude osakaalu. Meetodi eeliseks on selle täpsus ning kiirus. Teadlased on avastanud, et defektiga embrüod eritavad normaalsete embrüotega võrreldeskasvulahusesse rohkem L-laktaat-dehüdrogenaasi. Bioaktiivsetest ühenditest on kasvulahuses määratud interferoon-τ ja plasminogeeni aktivaatoreid. Uurimustöödest selgus, et hea kvaliteediga embrüod eritavad rohkem interferoon-τ-d kui elujõuetud embrüod ning plasminogeeni aktivaatorite tootmine on positiivses korrelatsioonis embrüorakkude arvu ja embrüo diameetriga. Implantatsioonieelse faktori PIF määramine on kõige uuem embrüote hindamise viis. Võrreldes elujõuetute embrüotega on elujõuliste embrüote PIFi tase märgatavalt kõrgem ning eluvõimetutel embrüotel puudub peptiid täielikult. Tulemused näitavad, et PIF-ELISA on usaldusväärne, kiire ning embrüoid mittekahjustav meetod IVF embrüote varajaseks valikuks. Vedelikkromatograafia kasutamine võimaldab kasvulahusest määrata embrüote poolt eritatud ja tarvitatud aminohappeid, mis korreleeruvad blastotsüstide elujõulisusega Teadlased on leidnud, et glütsiini- ja leutsiinitaseme vähenemine ning asparagiinitaseme suurenemine kasvulahuses on seotud tiinestumise ja elussündide arvuga ning et madalama aminohapete metabolismi tasemega embrüod on elujõulisemad. Teaduskirjanduse analüüs võimaldas teha embrüote kvaliteedi mitteinvasiivse hindamise võimaluste kohta järgmised järeldused: 1. Täpsemateks meetoditeks on embrüote kasvulahuses erinevate metaboliitide, eeskätt aminohapete, glükoosi ja laktaadi dünaamika, ning bioaktiivsete peptiidide määramine. 2. Bioaktiivsetest peptiididest on perspektiivne implanteerumiseelse faktori määramine 3. Uued meetodid on seni veel kallid, keerulist väljaõpet nõudvad ja pole veelstandardiseeritud, mistõttu embrüote morfoloogiline hindamine on endiselt aktuaalne. 4. Tõhus embrüote selektsioonimeetod aitab tõsta veiste tiinestumist. Samuti aitab hea arengupotentsiaaliga embrüote valik vähendada aborte ning loote arenguhäireid. The aim of this Bachelor thesis was to describe different non-invasive viability assessment methods for bovine in vitro fertilized embryos and to describe their advantages and weaknesses. As the number of bovine embryo transfers is growing worldwide and the embryo transfer business is international, it is very important to evaluate the quality of embryos for achieving the best results. However, assessment of embryo viability is also the trickiest and most challenging part in IVF technologies. Sustainable evaluation method of bovine IVF embryos must be non-invasive, fast and accurate. Nowadays, due to a lack of alternative effective non-invasive methods, embryo quality estimation based on morphological parameters is still the most commonly used method. It is the simplest method but unfortunately, also the most subjective way to judge an embryo prior to transfer. Advantages of this method are the short time needed per embryo, the ease of learning it and cheapness. Disadvantage is the abundance of factors influencing the evaluation. Embryo viability judged according to the ability to initiate pregnancy, still varies within groups of embryos with the same grade. A combination of embryo morphology and other non-invasive methods e.g. measuring oxygen consumption, glucose uptake or metabolites would result in a better discrimination between viable and non-viable embryos. Recent research in non-invasive assessment of bovine embryo metabolomics seems to be very promising. Review of the scientific publications enabled following conclusions on non-invasive embryo assessment possibilities: 1. Most precise methods for embryo assessment are measurements of different metabolites, first of all amino acids, glucose, lactate and bioactive peptides. 2. From bioactive peptides, preimplantation factor is most perspective for the assessment of embryo. 3. For now, new methods are expensive, require difficult training and also, are not yet standardized. Therefore morphological evaluation of embryos is still a current trend. 4. Effective bovine embryo selection method helps to improve pregnancy rates. Likewise it helps to reduce abortions and fetal developmental disorders.

https://www.ester.ee/record=b5360916*est

http://tartu.ester.ee/record=b1898837~S1*est

http://tartu.ester.ee/record=b1918254~S1*est

http://tartu.ester.ee/record=b1901364~S1*est

http://tartu.ester.ee/record=b1972203~S6*est