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Background The upper‐airway microbiota may be associated with the pathogenesis of asthma and useful for predicting acute exacerbation. However, the relationship between the lower‐airway microbiota and acute exacerbation in children with asthma is not well understood. We evaluated the characteristics of the airway microbiome using induced sputum from children with asthma exacerbation and compared the microbiota‐related differences of inflammatory cytokines with those in children with asthma. Methods We analysed the microbiome using induced sputum during acute exacerbation of asthma in children. We identified microbial candidates that were prominent in children with asthma exacerbation and compared them with those in children with stable asthma using various analytical methods. The microbial candidates were analysed to determine their association with inflammatory cytokines. We also developed a predictive functional profile using PICRUSt. Results A total of 95 children with allergic sensitisation including 22 with asthma exacerbation, 67 with stable asthma, and 6 controls were evaluated. We selected 26 microbial candidates whose abundances were significantly increased, decreased, or correlated during acute exacerbation in children with asthma. Among the microbial candidates, Campylobacter, Capnocytophaga, Haemophilus, and Porphyromonas were associated with inflammatory cytokines including macrophage inflammatory protein (MIP)‐1β, programmed death‐ligand 1, and granzyme B. Both Campylobacter and MIP‐1β levels were correlated with sputum eosinophils. Increased lipopolysaccharide biosynthesis and decreased glycan degradation were observed in children with asthma exacerbation. Conclusion Gram‐negative microbes in the lower airway were related to acute exacerbation in children with asthma. These microbes and associated cytokines may play a role in exacerbating asthma in children.

Lymphoid-tissue–resident commensal bacteria (LRCs), including Alcaligenes faecalis, are present in intestinal lymphoid tissue including the Peyer’s patches (PPs) of mammals and modulate the host immune system. Although LRCs can colonize within dendritic cells (DCs), the mechanisms through which LRCs persist in DCs and the symbiotic relationships between LRCs and DCs remain to be investigated. Here, we show an intracellular symbiotic system in which the LRC Alcaligenes creates a unique energy shift in DCs. Whereas DCs showed low mitochondrial respiration when they were co-cultured with Escherichia coli, DCs carrying A. faecalis maintained increased mitochondrial respiration. Furthermore, E. coli induced apoptosis of DCs but A. faecalis did not. Regarding an underlying mechanism, A. faecalis—unlike E. coli—did not induce intracellular nitric oxide (NO) production in DCs due to the low activity of its lipopolysaccharide (LPS). Therefore, A. faecalis, an example of LRCs, may persist within intestinal lymphoid tissue because they elicit little NO production in DCs. In addition, the symbiotic DCs exhibit characteristic physiologic changes, including a low rate of apoptosis and increased mitochondrial respiration.

Im Gegensatz zur bakteriellen Cystitis, die mit Antibiotika in der Regel effektiv behandelt werden kann, ist die Interstitielle Cystitis (IC) aufgrund bislang unzulänglich charakterisierter Pathogenese nur unzureichend therapierbar. Man geht davon aus, dass circa 5-6 Prozenz der weiblichen Bevölkerung von IC betroffen sind. Unzureichende Kenntnisse der Pathophysiologie gestalten die Suche nach neuen Therapeutika schwierig, allerdings zeigt die hohe Prävalenz, dass diese dringend benötigt werden. Ausgehend von einer inflammatorischen Genese der IC, untersuchte unsere Arbeitsgruppe die Effektivität einer enteralen antiinflammatorischen Therapie mittels des CB2R-Agonisten beta-Caryophyllen (BCP) im kontrollierten Tierexperiment an weiblichen BALB/c-Mäusen. Die Mäuse wurden in vier verschiedene Gruppen zu je fünf Tieren eingeteilt: 1. Kontrollgruppe, 2. IC-Gruppe, 3. IC+BCP-Gruppe und 4. BCP-Gruppe. Um den therapeutischen Effekt von BCP zu validieren, wurden die Leukozytenadhäsion, das Rolling und die FCD mittels Intravitalmikroskopie (IVM) untersucht. Außerdem wurden elf inflammatorische Mediatoren mittels Multiplextechnologie quantifiziert.Es konnte in diesem Tiermodell gezeigt werden, dass enteral appliziertes BCP die Leukozytenadhäsion als Marker für das Vorliegen einer Inflammationsreaktion signifikant reduziert. Weiterhin führt BCP zu einem signifikanten Anstieg der FCD in der BCP-Gruppe. Die Mediatorenanalyse im systemischen Plasma ergab keine signifikanten Änderungen. Dies ist auf die zu geringe zeitliche Latenz zwischen Induktion der IC und der Plasmaanalyse zurückzuführen., In contrast to bacterial cystitis, which can be effectively treated with antibiotics, interstitial cystitis (IC) is difficult to treat because of it´s unknown pathogenesis.It is estimated that about 5-6% of the female population is affected by IC. Inadequate knowledge of pathophysiology makes the search for new therapeutics difficult, but the high prevalence indicates that there is an unmet need for new treatments. Assuming an inflammatory etiology of IC, our group studied, whether an enteral anti-inflammatory therapy by the CB2R agonist, beta-Caryophyllen (BCP), is able to achieve therapeutic effects in experimental IC.The mice were divided into four different groups of five animals each: 1. Control group,2. IC-group, 3. IC+BCP group, 4. BCP group. To quantify the therapeutic effect of BCP, leukocyte rolling and adhesion, and FCD were studied using intravital microscopy (IVM). Furthermore, plasma levels of eleven inflammatory mediators were analyzed by multiplex assay.We showed that enterally administered BCP is able to significantly reduce leukocyte adhesion as marker of local bladder wall inflammation. The treatment with BCP also led to a significant increase in FCD in the BCP group. No significant changes could be observed regarding leukocyte rolling and the production of inflammatory mediators most likely due to the limited observation.

Adipositas, ein Vitamin D3 Mangel sowie fettreiche Mahlzeiten erhöhen die Durchlässigkeit der Darmschleimhaut und verursachen eine Dysbalance des Darmmikrobioms, was dazu führt, dass vermehrt Endotoxine (Lipopolysaccaride, LPS) von gramnegativen Bakterien in die Blutbahn gerät und eine metabolische Endotoxinämie (ME) verursacht. Durch Aktivierung des angeborenen Immunsystems trägt die ME zur Entstehung einer geringgradigen systemischen Entzündung (silent inflammation, meta-inflammation), in der das viszerale Fettgewebe eine zentrale Rolle spielt und die ihrerseits die Entwicklung von Adipositas, Insulinresistenz und Atherosklerose antreibt. Wenn eine One Anastomosis Gastric Bypass (OAGB) Operation den Zucker- und Fettstoffwechsel morbid Adipöser verbessert, eine längerfristige Gewichtsreduktion erwirkt und in Kombination mit einer hochdosierten Vitamin D3 Aufsättigung eine erhöhte Darmpermeabilität normalisiert, wäre eine Reduktion des LPS Übertrittes ins Blut, also der ME zu erwarten. Es gibt jedoch wenig klinische Studien über den Outcome der LPS-Konzentration im Plasma nach einer OAGB Operation und nach einer hochdosierten Vitamin D Supplementierung. Deshalb beschäftigt sich diese Abschlussarbeit mit der Frage, welchen Einfluss eine OAGB- Operation mit oder ohne hochdosierte Vitamin D3 Aufsättigung auf die ME von morbid adipösen PatientInnen hat. Es handelt sich um eine post-hoc Analyse von Biobank- gelagerten Serum- und Plasma-Proben aus der prospektiven, randomisiert kontrollierten LOAD-Studie (The Link between Obesity And vitamin D in bariatric patients with omega- loop gastric bypass surgery). Ziel der Studie war es zu untersuchen, ob bis zu drei orale Vitamin D3 Aufsättigungsdosen von 100 000 IU im ersten Monat postoperativ, gefolgt von einer oralen Erhaltungsdosis von 3420 IU pro Tag, die 25- Hydroxy-Vitamin D3 Konzentration (Calcidiol, die Speicherform von Vitamin D3) im Blut bis zu 24 Wochen nach der Operation normalisieren können. Die Kontroll-Gruppe erhielt die gleiche Standard Erhaltungsdosis von 3420 IU Vitamin D3 pro Tag, jedoch Plazebo statt der Aufsättigungsdosen. Für die vorliegende Analyse stehen Proben von insgesamt 43 StudienteilnehmerInnen (22 Verum und 21 Plazebo) zu jeweils 5 Zeitpunkten (vor und 1-3-6-12 Monate nach der OAGB OP) zur Verfügung. Als zusätzliche Referenz werden noch Proben von 30 Alters- und Geschlechts-gematchten normalgewichtigen Gesunden analysiert. Aus diesen insgesamt 245 Blutabnahmen werden nachträglich Endotoxinämie-Parameter wie LPS, LBP, SAA und Cathelicidin bestimmt und mit Entzündungsmarkern, Fett- und Zuckerstoffwechsel- Parametern sowie Parametern des Vitamin D Stoffwechsels in Relation gesetzt. Das zu erwartende Ergebnis ist eine postoperativ über die Monate hinweg abnehmende Endotoxinämie, sowie verbesserte Parameter des Fett- und Zuckerstoffwechsels als Indizien für eine Verbesserung des metabolischen Syndroms. Weiters erwarten wir signifikante Assoziationen dieser Outcomes mit dem Vitamin D Status und dem Erhalt der Vitamin D3 Aufsättigungsdosen. Obesity, vitamin D deficiency and fatty meals increase intestinal permeability and disturb the composition of gut microbiota leading to an increased transfer of endotoxins (lipopolysaccharides, LPS) from Gram-negative bacteria into the bloodstream and causing a so called metabolic endotoxemia (ME). Through activation of the innate immune system ME contributes to the pathogenesis of a low-level systemic inflammation (silent inflammation, meta-inflammation), in which visceral adipose tissue plays a key role. This low-level systemic inflammation for its part is a potent driver of obesity, insulin resistance and atherosclerosis. If One Anastomosis Gastric Bypass (OAGB) bariatric surgery results in improved sugar and fat metabolism, long-term weight reduction and, together with a high dose vitamin D3 loading, correction of an impaired intestinal barrier, then a reduced ME would be expected. However, there are few clinical studies on the effect of OAGB bariatric surgery and high dose vitamin D loading on ME in bariatric patients. This is the topic of the present thesis. It is a post-hoc analysis of biobanked serum and plasma samples from the prospective, randomized-controlled LOAD trial (The Link between Obesity And vitamin D in bariatric patients with omega-loop gastric bypass surgery). The trial aimed to assess the efficacy of up to 3 oral vitamin D3 loading doses of 100 000 IU each in the first post-operative month, followed by an oral maintenance dose of 3420 IU/d in normalizing 25-hydroxy-vitamin D (calcidiol, the main storage form of vitamin D in the body) serum concentrations up to the 24th post-operative week. The control group received the same standard maintenance dose of 3420 IU/d but placebo instead of the loading doses. Samples from a total of 43 study participants (22 verum and 21 placebo), 5 timepoints for each participant (pre-, 1, 3, 6 and 12 months post-operatively) are available for the present analysis. For additional reference, samples from 30 age- and sex-matched normal-weight healthy persons will be analysed. These 245 blood draws in total will be used to measure biomarkers related to endotoxemia (LPS, LBP, SAA and cathelicidin), which will then be related to inflammatory and metabolic parameters. Expected results would be a stepwise post-operative reduction of endotoxemia as well as improved parameters concerning comorbidities such as steatosis hepatis, metabolic syndrome and atherosclerosis. Further, we expect significant associations of these outcomes with the vitamin D status and the receipt of vitamin D loading doses.

Im Gegensatz zur bakteriellen Cystitis, die mit Antibiotika in der Regel effektiv behandelt werden kann, ist die Interstitielle Cystitis (IC) aufgrund bislang unzulänglich charakterisierter Pathogenese nur unzureichend therapierbar. Man geht davon aus, dass circa 5-6 Prozenz der weiblichen Bevölkerung von IC betroffen sind. Unzureichende Kenntnisse der Pathophysiologie gestalten die Suche nach neuen Therapeutika schwierig, allerdings zeigt die hohe Prävalenz, dass diese dringend benötigt werden. Ausgehend von einer inflammatorischen Genese der IC, untersuchte unsere Arbeitsgruppe die Effektivität einer enteralen antiinflammatorischen Therapie mittels des CB2R-Agonisten beta-Caryophyllen (BCP) im kontrollierten Tierexperiment an weiblichen BALB/c-Mäusen. Die Mäuse wurden in vier verschiedene Gruppen zu je fünf Tieren eingeteilt: 1. Kontrollgruppe, 2. IC-Gruppe, 3. IC+BCP-Gruppe und 4. BCP-Gruppe. Um den therapeutischen Effekt von BCP zu validieren, wurden die Leukozytenadhäsion, das Rolling und die FCD mittels Intravitalmikroskopie (IVM) untersucht. Außerdem wurden elf inflammatorische Mediatoren mittels Multiplextechnologie quantifiziert. Es konnte in diesem Tiermodell gezeigt werden, dass enteral appliziertes BCP die Leukozytenadhäsion als Marker für das Vorliegen einer Inflammationsreaktion signifikant reduziert. Weiterhin führt BCP zu einem signifikanten Anstieg der FCD in der BCP-Gruppe. Die Mediatorenanalyse im systemischen Plasma ergab keine signifikanten Änderungen. Dies ist auf die zu geringe zeitliche Latenz zwischen Induktion der IC und der Plasmaanalyse zurückzuführen. In contrast to bacterial cystitis, which can be effectively treated with antibiotics, interstitial cystitis (IC) is difficult to treat because of it´s unknown pathogenesis. It is estimated that about 5-6% of the female population is affected by IC. Inadequate knowledge of pathophysiology makes the search for new therapeutics difficult, but the high prevalence indicates that there is an unmet need for new treatments. Assuming an inflammatory etiology of IC, our group studied, whether an enteral anti-inflammatory therapy by the CB2R agonist, beta-Caryophyllen (BCP), is able to achieve therapeutic effects in experimental IC. The mice were divided into four different groups of five animals each: 1. Control group, 2. IC-group, 3. IC+BCP group, 4. BCP group. To quantify the therapeutic effect of BCP, leukocyte rolling and adhesion, and FCD were studied using intravital microscopy (IVM). Furthermore, plasma levels of eleven inflammatory mediators were analyzed by multiplex assay. We showed that enterally administered BCP is able to significantly reduce leukocyte adhesion as marker of local bladder wall inflammation. The treatment with BCP also led to a significant increase in FCD in the BCP group. No significant changes could be observed regarding leukocyte rolling and the production of inflammatory mediators – most likely due to the limited observation.

Dissertation, Universität Duisburg-Essen, 2017 Die viszerale Hyperalgesie ist Kernsymptom gastrointestinaler Erkrankungen, insbesondere der funktionellen Syndrome, wie dem Reizdarmsyndrom, deren Pathophysiologie noch nicht umfassend geklärt ist. Klinische sowie tier- und human-experimentelle Befunde deuten auf eine ätiologische Relevanz immunologischer Prozesse, etwa im Rahmen einer niedrigschwelligen, systemischen Immunaktivierung hin. In dieser Studie wurde die Hypothese untersucht, dass eine experimentell induzierte systemische Immunaktivierung zu einer viszeralen Hyperalgesie sowie einer veränderten neuralen Verarbeitung viszeraler Reize führt, insbesondere im Bereich des präfrontalen, des primär- und sekundär-sensorischen und des anterioren cingulären Kortex, der anterioren und posterioren Inselrinde und in Kerngebieten des Thalamus. In einem randomisierten, doppelblinden und Placebo-kontrollierten Studiendesign wurden N=26 männliche, gesunde Probanden mittels funktioneller Magnetresonanztomografie untersucht, wobei N=14 Probanden intravenös eine niedrige Dosis Lipopolysaccharid (LPS, 0,4 ng/kg) zur Induktion einer systemischen Immunaktivierung und N=12 Probanden Placebo erhielten. Mittels druckgesteuerter rektaler Distensionen wurden viszerale Schmerzreize appliziert. Die viszeralen Schmerz-schwellen sowie die blood-oxygen level dependent (BOLD)-Antwort auf viszerale Distensionen wurden vor (Baseline) und zwei Stunden nach der LPS- bzw. Placeboapplikation gemessen. Während der Studie erfolgten wiederholte Blutabnahmen zur Bestimmung der Plasmakonzentrationen von proinflammatorischen Zytokinen (TNF-alpha, Interleukin-6) und Cortisol. Den Erwartungen entsprechend ließ sich eine viszerale Hypersensitivität im Sinne reduzierter Schmerzschwellen bei Probanden der LPS-Gruppe nachweisen. In der Analyse der BOLD-Daten ergaben sich signifikant stärkere Aktivierungen der posterioren Inselrinde, des dorsolateralen präfrontalen Cortex (DLPFC), des anterioren midcingulären Cortex (aMCC) und des sekundär-somatosensorischen Cortex bei Probanden der LPS-Gruppe. Es fanden sich zudem signifikante Korrelationen zwischen der Interleukin-6-Konzentration im Plasma und einem stärkeren BOLD-Signal im Bereich des DLPFC sowie zwischen TNF-alpha-Konzentrationen im Plasma und stärkerem BOLD-Signal in den Regionen des DLPFC und des aMCC. Diese Ergebnisse deuten auf eine veränderte zentralnervöse Schmerzverarbeitung während einer experimentell induzierten systemischen Immunaktivierung hin. Insbesondere scheinen sensorisch-diskriminative sowie die Homöostase aufrecht erhaltende Zentren vermehrt involviert zu sein. Diese Ergebnisse können zu einem weiteren Verständnis der zentralnervösen Mechanismen der Schmerzverarbeitung während einer systemischen Immunaktivierung und potentiell der pathophysiologischen Mechanismen gastrointestinaler Schmerzen beitragen.

Kaliumkanäle spielen in der Pathophysiologie des septischen Schocks eine wichtige Rolle, da sie eine systemische Vasodilatation, sowie eine verminderte Ansprechbarkeit auf Katecholamine bewirken. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die hämodynamischen und metabolischen Effekte des Kaliumkanalblockers Tetraethylammoniumchlorid im etablierten Schafmodell des endotoxämischen Schocks mit einer unbehandelten Kontrollgruppe verglichen. Die Infusion von Tetraethylammoniumchlorid führte zu keiner Verbesserung der hämodynamischen Situation. Stattdessen kam es zu einer Beeinträchtigung der Myokardfunktion und konsekutiv zu einer eingeschränkten Kreislauffunktion, die in einer erhöhten Letalitätsrate in der Therapiegruppe resultierte. Diese Daten legen nahe, dass Tetraethylammoniumchlorid keine Therapieoption darstellt.

Zinc signals are induced in cells of the immune system following the activation of several receptors. One of these receptors is the toll-like receptor (TLR)4. Subsequently to TLR4 activation, an increase in free Zn2+ is required for the MyD88-dependent expression of proinflammatory cytokines. The aim of this study was to compare the effect of Zn2+ on the MyD88 and TRIF-dependent signaling pathways in the murine macrophage cell line RAW 264.7. A reduction of the intracellular available Zn2+ with the chelator N,N,N´,N´-tetrakis-(2-pyridyl-methyl)ethylenediamine (TPEN) reduces the mainly MyD88-dependent transcription of the cytokines interleukin (IL)-1beta, IL-6 and IL-10. Concomitantly, there is an increase in TRIF-dependent transcription of interferon (IFN)-beta and the IFN-beta-dependent inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression and nitric oxide (NO) release. This effect is independent of the TLR4-induced zinc signal and is also observed after stimulation of TLR3, the only TLR that does not induce a zinc signal and signals solely via TRIF. Following the stimulation of TLR4, basal Zn2+, instead of the zinc signal, is a negative regulator of the TRIF-dependent signaling pathway by inhibiting interferon regulatory factor (IRF)3-dependent transcription. Furthermore, the expression of the transcription factor signal transducer and activator of transcription (STAT)1 in the IFN-beta-induced JAK-STAT signaling pathway is decreased by TPEN indicating a possible feedback mechanism on elevated iNOS expression. The cytokine IFN-gamma also induces the expression of iNOS. IFN-gamma does not induce a zinc signal and the NO release is independent of incubation with TPEN. Hence, the impact of the basal Zn2+-concentration is specific for TLR signaling pathways. Here, zinc signals regulate the MyD88-dependent pathway and basal Zn2+ levels alter the TRIF-dependent pathway. Altogether, Zn2+ influences the balance of the two main TLR signaling pathways that are important for an adequate activation of innate immunity.

[no abstract]

Unter Verwendung der Oberflächenplasmonresonanz (SPR) wurden unterschiedliche Modellapplikationen etabliert. Es wurden verschiedene Zuckeroberflächen erzeugt und durch ein Lektin-Screening charakterisiert. Das Bindungsverhalten derartiger Oberflächen wurde daraufhin an NCI-H125- sowie an Lewis Lung-Zellen untersucht. Im Hinblick auf eine Mistellektinbestimmung in Fertigarzneimitteln zur Krebstherapie wurde ein Mistellektin-Assay entwickelt. Die Detektion des rekombinanten Mistellektin I (MLI) erfolgte durch zwei unterschiedliche monoklonale Anti-MLI-Antikörper. Eine weitere Modellapplikation war die Visualisierung des nicht enzymatischen Schichtdickenabbaus des Polyethylencarbonats durch Superoxidradikalanionen unter Verwendung von murinen Makrophagen der Zelllinie J774A.1. Die Abbaugeschwindigkeit konnte mit den Triggerfaktoren Concanavalin A, LPS aus Escherichia coli und Salmonella typhimurium beeinflusst werden. Gram negative Bakterien als Trigger für Makrophagen wurden über ein Bakterienmembranmodell nachgeahmt. Hierfür wurden Liposomen mit Lipopolysaccharid aus Legionella pneumophila und Salmonella typhimurium funktionalisiert und mittels spezifischer Antikörper detektiert. Eine weitere Form des Triggerns der murinen Makrophagen der Zelllinie J774A.1 wurde mit LPS-gekoppelten Magnetic Beads auf der LAPS (lichtadressierbarer potentiometrischer Sensor) Messplattform umgesetzt. Unter Zuhilfenahme eines Permanentmagneten wurde ein Konzentrationsgradient in der Messlösung erzeugt. Die metabolische Aktivität der Makrophagen konnte so in Form der Änderung des pH-Wertes gezeigt werden., Using surface plasmon resonance (SPR) different model applications were established. Different sugar surfaces were prepared and characterised by a lectin screening. The binding behaviour of such surfaces was examined by NCI-H125 and Lewis Lung cells. In order to determine mistletoe lectin in drugs for cancer therapy a mistletoe lectin assay was developed. The detection of recombinant mistletoe lectin I (MLI) was performed by two different monoclonal anti-MLI-antibodies. Another model application was the visualisation of the non-enzymatic degradation of layer thickness of polyethylene carbonate by superoxide radical anions using murine macrophages of cell line J774A.1. The rate of degradation could be influenced by the trigger factors Concanavalin A, LPS from Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Gram negative bacteria as a trigger for macrophages were imitated by a bacterial membrane model. For this purpose liposomes were functionalised with lipopolysaccharide from Legionella pneumophila and Salmonella typhimurium and detected using specific antibodies. Another mode of triggering murine macrophages from cell line J774A.1 was performed by the use of LPS-coupled magnetic beads implemented on the LAPS (light-addressable potentiometric sensor) measurement platform. By utilisation of a permanent magnet a concentration gradient was produced in the test solution. The metabolic activity of macrophages could be measured as a change in pH-value.

The contribution of airway epithelial cells to the innate immune response in the lung has been a focus of recent interest. A human mixed co-culture system of lung epithelial cell line A549 and primary peripheral blood mononuclear cells (PBMC) allowed us to study modulation of IL-1b, TNF-a, IL-6 and IL-8 expression triggered by lipopolysaccharide (LPS), staphylococcal enterotoxin B (SEB) and peptidoglycan (PGN) in comparison to respective monocultures. All immune stimuli induced significantly less TNF-a and much higher IL-6 release in co-cultures compared to PBMC alone. IL-1b release was stimulus-dependent: down-regulated upon LPS, up-regulated upon PGN and not affected upon SEB stimulation. IL-8 amounts were significantly increased in LPS and PGN-stimulated co-cultures and slightly increased upon SEB stimulation. Transwell experiments showed that LPS-induced cytokine modulation in co-culture is triggered by soluble factors. Using neutralizing IL-1b antibody we demonstrated that PBMC-derived IL-1b mediates augmented IL-6 and IL-8 production in LPS-stimulated co-cultures. A still unknown soluble factor in conditioned supernatant of resting A549 cells was shown to down-regulate TNF-a release by PBMC on mRNA level. Characterization of this anti-inflammatory compound suggests a peptide nature and opens an interesting area of future research. Here we could show that lung epithelial cells modulate the inflammatory response by down-regulating TNF-a and increasing IL-6 and IL-8 in co-cultures and must therefore be considered actors in shaping lung inflammation.Recent investigations postulate that lung inflammation due to environmental pollutants, including lipopolysaccharide (LPS) plays an important role in the development and progression of different chronic lung diseases, including idiopathic pulmonary fibrosis. Advances in understanding the molecular mechanisms of this disease point to epithelial to mesenchymal transition (EMT) as a link between inflammation and fibrosis, but so far the role of LPS in the process of EMT has not been investigated. Therefore, we hypothesized that conditioned supernatant from LPS stimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMC) induces an inflammatory cascade and subsequent EMT in lung epithelial type II A549 cell line. EMT in epithelial cells was evidenced after 3 days by alteration in cell morphology assessed by phase contrast microscopy and analysis of Western blot marker expression. A549 cells alone stimulated with LPS did not undergo EMT. Conditioned supernatant from LPS stimulated PBMC activated A549 cells to undergo EMT, evidenced by acquisition of mesenchymal morphology, down-regulation of epithelial cytokeratin and up-regulation of mesenchymal vimentin expression. Direct stimulation with IL-1b and TNF-a, but not IL-6, IL-8, MCP-1, MIP-1a and IL-10, shown to be produced from PBMC upon LPS-stimulation, induced fibroblast-like morphology, decreased cytokeratin and increased vimentin expression in A549 cells. Using neutralizing antibodies for IL-1b and TNF-a added to conditioned supernatants from LPS-stimulated PBMC we showed that IL-1b and TNF-a cytokines are responsible for the observed EMT effect. Thus, our findings indicate a central role of IL-1b and TNF-a in the in vitro LPS-driven EMT process in A549 cells.

Biophysikalische Untersuchungen zur Struktur-Wirkungsbeziehung von membranaktiven Peptiden und Lipopolysacchariden

Die chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen Morbus Crohn und Colitis ulzerosa sind wiederkehrende, nicht heilbare, immunvermittelte Krankheiten unklarer Ursache. Genetische Prädisposition und Umweltfaktoren können die Barrierefunktion der Darmmukosa stören, so dass eine überschiessende Entzündungsreaktion folgt, die durch kommensale Bakterien der normalen Darmflora verstärkt wird. Die Infektion mit H. pylori im Magen kann zu Gastritis, Ulkuskrankheit und der Entstehung von MALT-Lymphomen und Magenkarzinomen führen. An der Erkennung von bakteriellen Bestandteilen im Gastrointestinaltrakt sind Toll-like-Rezeptoren (TLR), als Komponenten des angeborenen Immunsystems maßgeblich beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurden Veränderungen der Bakterienflora bei Ileitis, Colitis und bei Vorliegen einer H. pylori-Infektion im Mausmodell untersucht. Durch eine globale Florenanalyse mit klassischen mikrobiologischen und molekularbiologischen Techniken konnte gezeigt werden, dass die Konzentrationen an Gram-negativen Stäbchenbakterien während der Entzündung in Ileum und Colon anstiegen. Die bakteriellen Faktoren, die eine Ileitis induzierten, wurden durch den Einsatz von gnotobiotischen TLR-defizienten Mäusen mit definierter bakterieller Rekolonisierung ermittelt. Hierbei zeigte sich, dass eine Ileitis durch das LPS von akkumulierenden E. coli über die TLR4-vermittelte Signaltransduktion verstärkt wurde. Die Entzündungsreaktionen konnten durch Behandlung mit Antibiotika oder dem LPS-Antagonisten Polymyxin B gebessert werden. In Folge einer H. pylori-Infektion kam es im Mausmagen zu einer erhöhten Diversität der Bakterienflora durch die Besiedelung mit Bakterienarten, die normalerweise das Colon kolonisieren. Eine derartige Florenverschiebung konnte durch eine Vakzinierung gegen H. pylori verhindert werden. Die Tiermodelle zur T. gondii-induzierten Ileitis und DSS-Colitis erlauben eine reproduzierbare Analyse entzündungsrelevanter Komponenten und damit die Möglichkeit, therapeutische Ansatzpunkte, wie z.B. den Einsatz von Lipopolysaccharid-Inhibitoren, die Blockade von TLR4 oder dem LPS-Bindeprotein oder den Einsatz von Probiotika, unter definierten Bedingungen zu analysieren. Inflammatory bowel diseases like Crohn´s disease and ulcerative colitis are chronic, relapsing, immunologically mediated disorders with uncertain etiology. Genetic abnormalities and environmental factors may have negative influences on the physiologic barrier function of the intestinal mucosa with inflamamtion coming up after immune response which is aggravated by commensal intestinal bacteria. The infection of H. pylori can cause gastritis and ulcus disease and contribute to the occurence of MALT lymphoma and gastric cancer. Bacterial ligands in the intestine are recognized by toll-like receptors (TLR) which are one component of the innate immune system. This study observed variations of the bacterial flora in mice with ileitis, colitis or H. pylori-infection. Performing a global survey of the intestinal flora combining culture based techniques with molecular methods, it was observed, that the concentration of gram-negative rods is elevated during ileitis or colitis. The bacterial factors, which are capable of inducing ileitis, could be confirmed using gnotobiotic TLR-deficient mice with a defined bacterial recolonization. It was clearly shown that ileitis was aggravated by LPS of accumulating E. coli through a TLR4-mediated signal transduction. The inflammation was ameliorated through antibiotic treatment or after application of the LPS-scavenger polymyxin B. H. pylori infection of mice leads to an increase of bacterial diversity in the stomach and bacterial species which are normally colonize the colon were detected after infection. Vaccination against H. pylori could prevent this diversity shift. The animal models for the T. gondii-induced ileitis and DSS-colitis used in this study offering the reproducible analysis of inflammation relevant components so that new approaches of treatment like inhibition of lipopolysaccharide, blockage of TLR4 or LPS binding protein or application of probiotics could be studied under well defined conditions.

Die durch Lipopolysaccharid (LPS) induzierte frühe Immunantwort ist ein wesentlicher Mechanismus der Infektabwehr durch die angeborene Immunität. Bei starker LPS-Exposition kann es andererseits zur Ausbildung eines septischen Syndroms kommen. Der endothelialen Sekretion von Interleukin-8 (IL-8/CXCL8), das als Chemokin die Migration neutrophiler Granulozyten vermittelt, kommt dabei herausragende Bedeutung zu. Zielsetzung dieser Arbeit war es, die Relevanz der Rho-Proteine RhoA, Rac1 und Cdc42 für die LPS-induzierte intrazelluläre Signaltransduktion mittels Überexpression inaktiver Mutanten dieser Proteine zu untersuchen. Diese Untersuchung wurde erschwert durch die schlechte Transfizierbarkeit der Endothelzelllinie HPMEC-ST1.6R, die nahezu alle Charakteristika primärer Endothelzellen aufweist. Deshalb wurde eine Methode etabliert, die durch Kotransfektion des Grünen Fluoreszenzproteins (GFP) die flusszytometrische Selektion der transfizierten Zellen anhand ihrer GFP-bedingten Fluoreszenz und die Messung der Expression von CXCL8 allein in dieser Population ermöglicht. Damit wurde nachgewiesen, dass die inaktiven Mutanten RhoAN19, Rac1N17 und Cdc42N17 jeweils die LPS-induzierte Expression von CXCL8 vermindern. Die größte Reduktion der CXCL8-Expression um 38 % der Positivkontrolle zeigte sich nach Transfektion der Mutante Rac1N17. Die Zelllinie CHO-3E10 exprimiert einen artifiziellen Reporter unter der Kontrolle eines Fragments aus der Verstärkerregion des Gens für das Endotheliale Leukozyten-Adhäsionsmolekül ELAM-1 (CD62E). Die Transfektion jeder einzelnen der inaktiven Varianten der drei GTP-bindenden Proteine in Zellen der Linie CHO-3E10 reduzierte die Expression des Reporterproteins nach Stimulation mit LPS signifikant. Die stärkste Reduktion der Reporterexpression um 51 % der Positivkontrolle ergab sich unter Rac1N17. Zusammengefasst zeigt die Studie, dass die Überexpression der inaktiven Mutanten RhoAN19, Rac1N17 und Cdc42N17 zu einer Abnahme der endothelialen Expression von CXCL8 führt. Darüberhinaus ergab sich im Vergleich zu den Mutanten RhoAN19 und Cdc42N17 die stärkste Reduktion der CXCL8-Expression in Endothelzellen nach Transfektion der Mutante Rac1N17. The early immune response induced by Lipopolysaccaride (LPS) is a crucial mechanism in fighting off infections by the innate immunity. On the other side high amounts of LPS can lead to the development of a sepsis. In this process the endothelial secretion of interleukin-8 (IL-8/CXCL8), which causes the migration of neutrophilic granulocytes to the site of infection is highly important. The aim of this study was to analyze the relevance of each of the three Rho-proteins RhoA, Rac1 and Cdc42 for the intracellular signal transduction resulting in CXCL8-expression by means of overexpressing inactive mutants of these proteins. Cells of the human microvascular endothelial cell line HPMEC-ST1.6R show most characteristics of primary endothelial cells and are extremely difficult to transfect. Therefore a method was established, which allowed sorting of successfully transfected cells by cotransfecting a gene encoding for green fluorescence protein (GFP). This method permitted measuring intracellular expression of CXCL8 in the population successfully transfected with plasmids encoding for RhoAN19, Rac1N17 or Cdc42N17 mutants. This experiments demonstrated that the inactive mutants RhoAN19 Rac1N17 or Cdc42N17 each decreased the LPS-induced expression of CXCL8. Quantitative comparision showed the greatest reduction of 38 % in CXCL8-expression due to transfection of the Rac1N17 mutant. The LPS-inducible reporter cell line CHO-3E10 used in this study expresses the human CD25-antigene as an artificial reporter protein under the control of a fragment from the enhancer region of the gene for the human endothelial leukocytic adhesionmolecule ELAM-1 (CD62E). Transfecting each of the inactive mutants RhoAN19, Rac1N17 or Cdc42N17 in CHO-3E10 cells significantly reduced the LPS-induced expression of the reporter protein. The greatest reduction in reporter expression of 51 % resulted from transfection with the Rac1N17 mutant. In conclusion, this study demonstrates that overexpression of nonfunctional GTP-binding proteins RhoAN19, Rac1N17 or Cdc42N17 leads to a decrease in endothelial CXCL8-expression. Moreover, CXCL8-expression in endothelial cells transfected with the Rac1N17 mutant was most efficiently reduced when compared to the other mutants.

keine dt.-spr. Zusammenfassung vh. The lipid matrix of the outer membrane of Gram-negative bacteria is an asymmetric bilayer composed of a phospholipid inner leaflet and a lipopolysaccharide (LPS) outer leaflet. In the present study, electrical and optical measurements on a planar reconstitution system of these membranes were performed to show the influence of the composition of the lipidmatrix on properties and functions of the membrane – on the one hand as a matrix, in which bacterial membrane proteins are embedded, and on the other hand as a barrier for antimicrobial peptides of the immune system of the host. The focus was mainly directed on the role of LPS, in particular the structure of its sugar moiety and its net negative charge. It could be shown exemplarily for the phosphoporin from Echerichia coli that LPS – in particular the structure of the sugar moiety – has a strong influence on the pore formation by porins. In general, the pore formation rate increased with increasing length of the sugar moiety of LPS. Furthermore, it could be shown for a cationic antimicrobial peptide of the cathelicidin family that a reduction of the net negative charge of LPS by positively charged sugar groups leads to a decrease of the electrostatic interaction between the peptide and LPS and, thus, causing a reduction of the accumulation and/or intercalation of the peptide. A very remarkable result was obtained from first fluorescence microscopic experiments on the reconstitution system of the outer membrane: domains, which were clearly visible in the LPS-monolayer, disappear after adding the opposing phospholipid-monolayer, indicating a strong interaction between both side of the lipid bilayer.

Die hier vorliegende Arbeit basiert auf Untersuchungen, in denen gezeigt wurde, dass es bei Patienten mit schweren Traumata zu einer allgemeinen Immunsuppression kommt. Diese zeigte sich unter anderem auch in einer verminderten Stimulierbarkeit der T-Lymphozyten durch Lipopolysaccharid, welche mit einem erhöhten Risiko einer Sepsis assoziiert wird. Deshalb wurden bei verschiedenen Unfallchirurgischen Patienten mit mittelschwerem Trauma untersucht, ob sich auch hier die T-Lymphozytenproliferation verändert. Dazu wurden 20 Patienten in die Studie eingeschlossen und die Werte mit denen einer vergleichbaren Kontrollgruppe verglichen. Es wurden mononukleäre Zellen für 7 Tage mit Lipopolysaccharid, Tetanus Toxoid und purified protein derivates of Mycobacterium tuberculosi (PPD) stimuliert. Die Desoxyribonukleinsäure (DNS)-Synthese wurde durch den Einbau von radioaktiv markiertem Thymidin ([3H]TdR) bestimmt. Zur Phänotypisierung der mononukleären Zellen wurden diese mit monoklonalen Antikörpern markiert und in einem FACStar Flow Cytometer analysiert. Die relative Monozytenanzahl wurde bestimmt und der prozentuale Anteil der durch die Antikörper markierten Zellen ermittelt. Es zeigte sich, dass die Spontanproliferation der Patienten im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht war. Dagegen war die Lipopolysaccharid-induzierte T-Lymphozytenproliferation bereits am präoperativen Tag reduziert. Diese verringerte sich hochsignifikant am ersten postoperativen Tag und war noch am zweiten Tag signifikant verringert. Die Untersuchungen mit Tetanus Toxoid und PPD ergaben, dass auch hier bereits präoperativ eine hochsignifikant verringerte Stimulationsfähigkeit vorlag, die im Verlauf des Beobachtungszeitraums noch weiter abnahm. Im Vergleich der CD14-positiven Monozyten fand sich ein am ersten postoperativen Tag verminderter Anteil, währenddessen es bei den HLA-DR positiven Monozyten zu keinem Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe kam. Die hier vorliegende Arbeit zeigt, dass auch schon bei einem mittelschweren Trauma die T-Lymphozyten-vermittelte Immunantwort signifikant reduziert ist. Die Gefahr septischer Komplikationen ist also auch bei dieser Patientengruppe nicht auszuschließen und im klinischen Alltag werden die Patienten auch entsprechend beobachtet.

Bdellovibrionaceae sind außergewöhnliche Bakterien, da sie als die kleinsten bekannten räuberischen Organismen gelten. Seit ihrer Entdeckung in Bodenproben im Jahr 1962 durch Stolp und Starr konnte eine weite Verbreitung in der Natur nachgewiesen werden. Besonderes Interesse erlangten Bdellovibrionaceae durch ihre Fähigkeit bakterielle Erreger wie Escherichia coli, Salmonella und Yersinia zu attackieren. Der bestuntersuchte Vertreter der Familie Bdellovibrionaceae ist Bdellovibrio bacteriovorus. Er durchläuft einen komplexen Lebenszyklus, der nur partiell verstanden ist. In der Attack-Phase werden durch einen noch nicht aufgeklärten Mechanismus potentielle Beutebakterien erkannt und der interzelluläre Kontakt hergestellt. Nachdem eine Pore in der Zellwand der ausschließlich Gram-negativen Beutebakterien erzeugt wurde, dringt B. bacteriovorus in den periplasmatischen Raum ein. Nach etwa 30 Minuten ist der Invasionsprozess abgeschlossen und man kann die Ausbildung sphärischer Bdelloblasten beobachten. Im Beutebakterium verdaut B. bacteriovorus makromolekulare Bestandteile des Wirtes und wächst zu einem langen spiralförmigen Stäbchen aus. Es setzt schließlich die Zellteilung ein bei der 5 bis 30 Tochterzellen in Abhängigkeit zur Größe des Beutebakteriums freiwerden. Mit der Reproduktion ist der parasitäre Lebenszyklus nach etwa 3 Stunden beendet. Die komplexe Regulation der Expression von Proteinen konnte für die einzelnen Wachstumsphasen durch ein- sowie zweidimensionale Gelelektrophorese nachgewiesen werden. In der Vergangenheit haben verschiedene Studien die Komplexität der Wechselwirkung mit den Beutebakterien belegt. Hierbei wurde, neben dem offensichtlichen Abbau makromolekularer Bestandteile der Beutebakterien, ein Recycling und Einbau von Membranbestandteilen wie Lipopolysacchariden (LPS) und Outer Membrane Proteine (OmP) in das Membransystem von B. bacteriovorus diskutiert. Die biologische Interpretation dieses Phänomens ist eine erhöhte Effizienz in der Reproduktion von B. bacteriovorus wenn es Bestandteile des Wirtsbakteriums wiederverwertet im Gegensatz zur Eigensynthese. Trotz der morphologischen Ähnlichkeit und des ungewöhnlichen Lebensstils wurde festgestellt, dass die Familie der Bdellovibrionaceae phylogenetisch sehr heterogen ist. Es werden zur Zeit zwei Gattungen unterschieden Bdellovibrio und Bacteriovorax. Aufgrund von 16S rRNA Untersuchungen konnten auch innerhalb der Gattungen eine Vielzahl von phylogenetisch distinkten Arten nachgewiesen werden. In der Literatur wird eine regulierende Wirkung auf pathogene Gram-negative Bakterien für aquatische Systeme durch Bdellovibrionaceae beschrieben. Weiterhin konnten sie bei verschiedenen Nutztieren im Verdauungstrakt mikrobiologisch nachgewiesen werden. Ein positiver Einfluss auf die Gesundheit der Tiere wurde bei Vorkommen von B. bacteriovorus festgestellt. Für eine Charakterisierung von Umweltisolaten werden in der vorliegenden Arbeit genetische Methoden vorgestellt. Hierfür wurden Hybridisierungsmethoden und PCR-methoden entwickelt, die es ermöglichen aus der Umwelt isolierte Bdellovibrionaceae phylogenetisch einzuordnen. Es konnte gezeigt werden, das sowohl B. bacteriovorus als auch Bacteriovorax stolpii im Verdauungstrakt von Nutztieren vorkommen. Es ist weiterhin gelungen eine PCR-methode für Kotproben zu entwickeln, die einen direkten Nachweis ermöglicht ohne mikrobiologische Anzucht. B. bacteriovorus ist ein Gram-negatives Bakterium, allein dieser Sachverhalt spiegelt die Schwierigkeit wider, wenn der enzymattische Abbau von Zellwandbestandteilen der Beutebakterien Ziel der Untersuchung ist, da auch die Beutebakterien Gram-negativ sind. Es ergibt sich aufgrund eines ähnlichen Zellwandaufbaus ein immenses analytisches Problem die makromolekularen Bestandteile von Wirtsbakterium und Jäger zu trennen. Um dem Lebensstil angepasst Modifikationen von B. bacteriovorus zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit LPS, charakteristischer Bestandteil der Äußeren Membran, von Wildtypstamm B. bacteriovorus HD100 und seiner wirtsunabhängigen Mutante HI100 isoliert und das Lipid A strukturell aufgeklärt. Die Isolation gelang durch die Ausnutzung unterschiedlicher Fällungseigenschaften des LPS von B. bacteriovorus HD100 gegenüber des E. coli K-12 LPS aus dem Extraktionsmittel. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, das B. bacteriovorus S-Form LPS besitzt. Die außergewöhnliche Struktur des Lipid A von B. bacteriovorus wurde im Detail mit massenspektrometrischen Methoden, ein- und zweidimensionalen NMR Methoden sowie mikrochemischer Methoden in Kombination mit der GC/MS charakterisiert. Der Fettsäureanker besteht aus a-D-ManpII-(1(R)4)-ß-D-GlcpN3NII-(1(R)6)-ß-D-GlcpN3NI-(1(R)1)-a-D-ManpI. Dies stellt eine neuartige Struktur dar, da an allen bisher bekannten Lipid A´s sich Brönstedtsäuren am hydrophilen Fettsäureanker befinden, die in physiologischer Lösung durch Protonenabgabe negative Ladungen tragen. Im Lipid A von B. bacteriovorus sind diese Substituenten durch den Neutralzucker Mannose ersetzt. Weiterhin wurden als Fettsäuren nur 3-Hydroxyfettsäuren nachgewiesen, wobei sich auf die 6 gebunden Fettsäuren etwa 1,5 Doppelbindungen verteilen. Dieses Lipid A zeigt eine wesentlich reduzierte endotoxische Aktivität im Vergleich zu E. coli Lipid A und weist als biophysikalische Besonderheit eine erhöhte Fluidität über einen weiten Temperaturbereich auf. Die vorgestellte 16S rRNA Analyse und die Strukturanalyse des Lipid A von B. bacteriovorus belegen seine besondere Stellung in der Welt der Bakterien., Bdellovibrionaceae are extraordinary bacteria known as the smallest predatory organism so far. Since their discovery in soil samples by Stolp and Starr 1963 they have been detected in a wide range of other natural habitats. Bdellovibrionaceae became the focus of attention concerning their ability to attack pathogens like Escherichia coli, Salmonella and Yersinia. For Bdellovibrio bacteriovorus the most detailed studies are available. The up to now only partially understood lifecycle consists of several complex phases. In the attack phase B. bacteriovorus is motile possessing flagella and the preys are recognized by an unknown mechanism. After attachment on the cell wall within 15 to 30 minutes a pore is formed which is used as entrance to the periplasmatic space of the Gram-negative prey bacteria. The completion of the invasion process can be observed by the change of the prey s shape to spherical bdelloblasts. Inside of the prey B. bacteriovorus degrades macromolecular compounds and transforms into a long spirally shaped rod. At the end of the lifecycle the rod divides yielding 5 up to 30 daughter cells depending on the size of the prey bacteria. This reproduction phase is completed within 3 hours. The complex regulation of expression of a certain number of proteins was observed by one and two dimensional gelelectrophoresis. The complexity of the interaction between predator and prey were examined in several studies. Besides the obvious degradation of macromolecular compounds of the prey, reutilising of lipopolysaccharides (LPS) and Outer Membrane Proteins (OmP) into the membrane system of B. bacteriovorus was discussed. The biological interpretation of such behaviour was that it is more efficient for reproduction to recycle components of the prey than to perform de novo synthesis. Unexpectedly, despite the unique predatory lifecycle and common morphological features, Bdellovibrionaceae show a great phylogenetical diversity based on 16S rRNA analyses. Bdellovibrionaceae are divided into the three species Bdellovibrio bacteriovorus, Bacteriovorax stolpii, Bacteriovorax starrii and some strains yet to be assigned. In two studies Bdellovibrionaceae were found as part of regulation processes for decreasing the number of pathogenic Gram-negative bacteria in aquatic systems. Furthermore, B. bacteriovorus were found in the intestinal tract of several domestic animals showing a positive influence on the state of health. For the phylogenetic characterization of environmental isolates techniques were developed based on hybridisation methods and the PCR. In this work we detected B. bacteriovorus and B. stolpii strains in the gut of animals. Furthermore, a PCR method for direct detection of Bdellovibrionaceae in fecal samples was developed. B. bacteriovorus are Gram-negative bacteria. This fact complicates the study of the degradation of the prey s cell wall as it possesses the architecture of Gram-negative bacteria also. Furthermore, the search for important modifications of the cell wall of B. bacteriovorus concerning the predatory lifestyle becomes an analytical problem. In this study we isolated LPS of the wild type strain B. bacteriovorus HD100 and its host independent mutant strain HI100. For the isolation of pure B. bacteriovorus HD100 S-form LPS we took advantage of different precipitation properties in the extraction solvent of E. coli K-12 LPS and the predator s LPS. The structure of the lipid A was examined in detail by mass spectrometric methods, one- and two-dimensional NMR and chemical analytical techniques. The novel structure consists of backbone built of a-D-ManpII-(1(R)4)-ß-D-GlcpN3NII-(1(R)6)-ß-D-GlcpN3NI-(1(R)1)-a-D-ManpI. This is the first known natural lipid A without negatively charged substituents in physiological solution. The lipid A of B. bacteriovorus carries the neutral sugar mannose instead of Brönstedt acids. Furthermore, the lipid A exclusively consists of 3-hydroxy fatty acids with approximately 1.5 double bounds distributed on six bounded fatty acids. This lipid A shows a significant decreased endotoxic activity in comparison to E. coli lipid A and revealed increased fluidity over broad temperature range as further remarkable biophysical property. The 16S rRNA analysis and the structural analysis of the lipid A of B. bacteriovorus document the unique position in the world of bacteria.

Lipopolysaccharide (LPS) is a potent immune stimulator which induces many of the pathological sequelae observed during systemic Gram-negative infection. The term endotoxin tolerance describes the phenomenon that the toxicity of LPS is attenuated upon repeated LPS-stimulation. Selective downregulation of certain macrophage activities is considered one of the mechanisms underlying LPS tolerance. In the present thesis it was investigated whether lipoteichoic acid, a component of Gram-positive bacteria, induced similar tolerance in vivo and macrophage refractoriness in vitro. In the second part of the thesis the effect of acquired LPS tolerance on host defense against virulent bacteria was studied.1. TNF release by murine macrophages in response to lipoteichoic acid (LTA) is independent of Toll like receptor (TLR) 4 but requires functional TLR2.2. LTA induced macrophage refractoriness similar to LPS in vitro and in vivo.3. LTA and LPS induced cross-desensitization of macrophages in vitro and cross-tolerance in galactosamine-sensitized mice in vivo.4. Paracrine mediators did not suffice to induce cross-desensitization of macrophages in vitro.5. Cytokine production in response to viable Salmonella typhimurium was attenuated in LPS-tolerant mice.6. Induction of LPS tolerance prior to Salmonella typhimurium infection was associated with decreased bacterial load and a prolongal of survival.7. Early but not late phase reduction of bacteria in LPS-tolerant mice depended on the accumulation of PMN in the peritoneal cavity in response to intraperitoneal LPS injections.8. LPS-tolerance was associated with increased PMN counts in blood and tissues and enhanced oxidative burst capacity of the individual PMN. Depletion of PMN prior to infection partially abrogated the survival benefit associated with LPS-tolerance.9. LPS-tolerant mice displayed improved clearance of systemically injected Salmonella typhimurium and enhanced phagocytic activity of the liver.

LPS wird von Gram-negativen Bakterien freigesetzt und führt mit Hilfe von LBP zur Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine aus Monozyten und Makrophagen. Diese von LPS ausgelöste Kaskade, ist entscheidend an der Entstehung der Sepsis beteiligt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die LPS-induzierte Stimulation von Makrophagen durch murines Serum gehemmt werden kann. Außerdem konnte im Rahmen dieser Arbeit im Mausmodell verdeutlicht werden, welche Rolle Lipoproteine und LBP bei dem protektiven Serumeffekt spielen. Von den in Mausseren verschiedener Mausstämme bestimmten Parametern korrelierte der Phospholipidgehalt relativ gut mit dem inhibitorischen Serumeffekt. Eine Depletion von Lipoproteinen aus den Seren führte zu einer starken Reduktion des inhibitorischen Serumpotentials, während die Verwendung von LBP-defizienten Seren keinen Einfluß auf den Serumhemmeffekt hatte. Lipoproteine sehr geringer, geringer und hoher Dichte verursachten in Gegenwart von LBP eine deutliche Reduktion der LPS-Effekte, die gut mit ihrem Phospholipidgehalt korrelierte. In Abwesenheit von Serum und LBP konnten Lipoproteine LPS-Effekte auch bei hohen Phospholipidkonzentrationen kaum noch inhibieren. In nativen murinen Lipoproteinen hoher Dichte und lipoproteindefizientem Serum ließ sich LBP nachweisen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß native Lipoproteine sehr geringer, geringer und hoher Dichten als Akzeptoren für LPS dienen können. Ihr inhibitorisches Potential korreliert am besten mit ihrem Phospholipidgehalt. Der Transport von LPS in diese Lipoproteine wird durch LBP katalysiert, was den protektiven Effekt hoher LBP-Konzentrationen erklärt. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß LBP nicht der einzige Bestandteil von murinem Serum ist, der LPS in Lipoproteine transferiert. Vermutlich ist bei den, in dieser Arbeit verwendeten Serumkonzentrationen der PLTP-Gehalt ausreichend, diesen LPS-Transfer in Abwesenheit von LBP zu vollziehen. Bei der Interaktion zwischen Lipoproteinen und LPS handelt es sich um einen physiologischen Weg des Organismus, um auf bakterielle Endotoxine zu reagieren und so der Sepsis entgegenzuwirken. Mit genaueren Kenntnissen über diese Interaktion, bei der Lipidtransferproteine wie LBP und PLTP eine entscheidende Rolle spielen, können eventuell in Zukunft Methoden gefunden werden, diese physiologischen Vorgänge des Körpers zu unterstützen, um so eine Sepsis zu therapieren. LPS released by gram-negative bacteria is bound by LBP and initiates the release of proinflammatory cytokines in makrophages and monocytes. These cytokines are thought to play a central role in the pathophysiology of sepsis. In these studies I was able to show an inhibitory effect of murine serum on the LPS-induced stimulation of macrophages. Furthermore the role of lipoproteins and LBP in this protective effect of serum was investigated. The inhibitory effect of serum from different mouse strains was best correlated to its phospholipid content. Depletion of serum from lipoproteins strongly reduced its LPS-inhibitory potential while depletion of serum from LBP had no effect. Murine VLDL, LDL and HDL were found to be potent inhibitors of LPS-effects in presence of LBP. In abscence of LBP the inhibitory effect was much weaker. LBP could be detected in murine HDL and murine lipoproteindeficient serum. My data shows that HDL, LDL and VLDL can act as acceptors of LPS. Their inhibitory potential is best correlated to their phospholipid content. LBP catalyses transport of LPS into lipoproteins. This could be an explanation for its protective effect in high doses. Furthermore it could be shown that LBP is not the only serum component that transfers LPS into Lipoproteins. Possibly the used serum contained enough PLTP to perform this transfer in absence of LBP. The interaction between Lipoproteins and LPS is a physiological way of the organism to react on endotoxines and inhibit the development of sepsis. PLTP and LBP play major roles in this interaction. Understanding the pathways of LPS-detoxification may help to support the organism s physiological answer and establish new methods to treat sepsis.

Unter dem Begriff der Sialinsäuren faßt man die mehr als 40 verschiedenen Derivate der Neuraminsäsure zusammen. Diese sauren Aminozucker kommen bei Bakterien in Oberflächenstrukturen wie z.B. im Lipopolysaccharid (LPS) vor. Dieser Bestandteil der äußeren Membran GRAM-negativer Bakterien setzt sich aus dem Lipid A, einem Kernbereich (Core) und einer strukturell ungeheuer variablen O-spezifischen Seitenkette (O-Antigen) zusammen. Bei dem O-Antigen des Escherichia coli Stammes 21701 handelt es sich um ein Tetrasaccharid bestehend aus N-Acetylgalactosamin, 2 Galaktosen und einer an C-7 und C-9 di-O-acetylierten Sialinsäure. Über die Funktion dieser Modifikation weis man bei Bakterien noch sehr wenig. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die O-Acetylierung einerseits zu einer erhöhten Immunogenität führt, andererseits die Bakterien aber besser vor Angriffen von Bakteriophagen schützt. Es ist gelungen, Antikörper herzustellen, die spezifisch an O-acetyliertes LPS binden konnten. Weiterhin wurde ein bisher unbekanntes Gen der O-Antigen-Biosynthese kloniert. Auch war es möglich, mehr über den Mechanismus der O-Acetylierung, die Lokalisation des Enzyms und dessen Spezifität in Erfahrung zu bringen.

Background Xiaochaihu Decoction (XCHD) prevents hepatocarcinogenesis in association with inhibition of oxidative stress. However, alkaline phosphatase (ALP) activity, lipopolysaccharides (LPS)-catecholamines (CA) interactions in gut, liver and brain may play an important role in the status of oxidative stress. This study was to assess whether XCHD attenuates the vicious circle between oxidative stress and ALP inactivation through LPS-CA interactions. Methods Hepatocellular carcinoma group (HCC) were induced by CCI4 + ethanol; HCC with Liver Depression and Spleen Deficiency (HCC + LDSD) were induced by squeezing tails (30 min/day), solitary breeding and intermittent fasting on the basis of HCC; XCHD was administered after 4 weeks of the HCC + LDSD. The degree of tissue injury were studied using a scoring system, and brain weights were measured. Peroxynitrite (ONOO−), malondialdehyde (MDA), 4-hydroxy-3-methoxymandelic acid (VMA, CA metabolites), lipopolysaccharide-phosphate (LPS-P), ALP activity (ALP-A) and Concanavalin A (ConA)-binding rate of ALP (ALP-C) were determined by colorimetric method and lectin (ConA) affinity precipitation method. Results More injuries and ONOO−, MDA, VMA, LPS-P, ALP-C were increased, ALP-A were decreased in the gut, liver and brain of HCC group, the most in HCC + LDSD group, after treatment with XCHD, all of which were improved. A positive association found between gut-liver-brain injury and ONOO−, MDA, VMA, LPS-P, ALP-C, between ONOO−, MDA, VMA, LPS-P and ALP-C in the gut, liver and brain, and a negative association found between gut-liver-brain injury and ALP-A, between ALP-A and ONOO−, MDA, VMA, LPS-P, ALP-C in the gut, liver and brain. Conclusions XCHD can attenuates the vicious circle between the oxidative stress, nitrosative stress, N-glycan deficiency and inactivation of ALP through LPS-CA interactions in gut, liver and brain.