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Hepatic encephalopathy (HE) encompasses a variety of neuropsychiatric symptoms, including anxiety and psychomotor dysfunction. Although HE is a frequent complication of liver cirrhosis, the neurobiological substrates responsible for its clinical manifestations are largely unclear. In the present study, male Wistar rats were bile duct-ligated (BDL), a procedure which induces liver cirrhosis, and on the 21st day after surgery tested in the elevated plus-maze (EPM) and in an open field for anxiety and locomotor activity measurements. Analysis of Fos protein immunoreactivity (Fos-ir) was used to better understand the neurobiological alterations present in BDL animals. Plasma levels of ammonia were quantified and histopathological analysis of the livers was performed. BDL rats showed a significant decrease in the percentage of entries and time spent in the open arms of the EPM, an anxiogenic effect. These animals also presented significant decreases in Fos-ir in the lateral septal nucleus and medial amygdalar nucleus. Their ammonia plasma levels were significantly higher when compared to the sham group and the diagnosis of cirrhosis was confirmed by histopathological analysis. These results indicate that the BDL model induces anxiogenic results, possibly related to changes in the activation of anxiety-mediating circuitries and to increases in ammonia plasma levels. A Encefalopatia hepática (HE) engloba uma variedade de sintomas neuropsiquiátricos, incluindo ansiedade e disfunção psicomotora. Embora seja uma complicação frequente da cirrose hepática, os substratos neurobiológicos responsáveis por suas manifestações clínicas são em grande parte desconhecidos. No presente estudo, ratos Wistar machos foram submetidos ao procedimento cirúrgico de ligação e secção do ducto biliar (BDL; bile-duct ligation), para indução da cirrose hepática e, no 21º dia após a cirurgia, submetidos aos testes comportamentais no labirinto em cruz elevado (LCE) e campo aberto para avaliação da ansiedade e atividade locomotora. A análise da imunorreatividade à proteína Fos (Fos-ir) foi utilizada para melhor compreender as alterações neurobiológicas presentes nos animais do grupo BDL. Foi realizada a quantificação da concentração de amônia plasmática e análise histopatológica dos fígados. Os ratos do grupo BDL mostraram diminuição significativa na porcentagem de entradas e tempo gasto nos braços abertos do LCE, caracterizando efeito ansiogênico. Estes animais também apresentaram redução significativa na Fos-ir no núcleo septal lateral e núcleo medial da amígdala. A concentração plasmática de amônia foi significativamente mais elevada que a do grupo sham e o diagnóstico de cirrose foi confirmado por análise histopatológica. Estes resultados indicam que o modelo de HE induzido por BDL induz efeito ansiogênico possivelmente relacionado à ativação de circuitos mediadores da ansiedade e à hiperamonemia.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Condroitim sulfato (CS) é um glicosaminoglicano (GAG), presente na matriz extracelular (MEC) de vários tecidos de mamíferos, utilizado para o tratamento da osteoartrite e, recentemente, tem despertado grande interesse devido ao seu potencial anti-inflamatório. Vários modelos experimentais in vivo de inflamação são empregados para o estudo da atividade anti-inflamatória, entre eles o modelo de fibrose induzida por colestase extra-hepática. A colestase produz lesão hepatocelular com edema do trato portal, infiltrado leucocitário, proliferação de células epiteliais biliares e fibrose do trato portal. O objetivo deste trabalho foi analisar os efeitos do CS no modelo de colestase extra-hepática emperimental induzido por laqueadura do ducto biliar (BDL) em ratos Wistar. Para isso foram utilizados animais (n = 82) de 6 a 8 semanas de idade eutanasiados 2, 7 ou 14 dias após o procedimento cirúrgico divididos nos grupos: BDL, BDL tratado com CS, Sham e Sham tratado com CS. Foram avaliados peso corporal e do fígado dos animais, concentrações séricas de bilirrubina direta (BD), globulinas, atividades de gama glutamil transpeptidase (Gama GT), fosfatase alcalina (FA), alanina transaminase (ALT) e aspartato transaminase (AST), alterações morfológicas no tecido, atividade de mieloperoxidase (MPO), atividade de metaloproteases (MMP-9, MMP-2 e pró MMP-2) e conteúdo de GAGs no fígado dos animais, além da análise histopatológica do tecido hepático. O CS obtido para a realização do trabalho apresentou teores superiores a 92%, com peso molecular de aproximadamente 40 kDa e um conteúdo dissacarídico com predominância de Δdi4S (65%). BDL gerou vários sintomas relacionados à lesão celular e ao processo inflamatório como aumento dos níveis séricos de BD e globulinas, aumento das atividades de Gama GT, FA, ALT e AST, infiltrado inflamatório e modificação morfométrica, com proliferação ductular, e na MEC do fígado dos animais induzidos. CS levou a redução do aumento inicial das transaminases indicando proteção dos tecidos lesados no procedimento cirúrgico. O tratamento levou à redução do infiltrado inflamatório no tecido, expresso pela diminuição significativa da atividade de MPO no homogenato. A remodelação tecidual também foi reduzida, havendo diminuição da atividade de MMP-9, pró MMP-2 e MMP-2 e ainda dos níveis dos GAGs dermatam sulfato e heparam sulfato presentes, produzidos por células estreladas em resposta ao dano no tecido. Estes resultados mostram que o CS reduziu os efeitos da lesão hepática do modelo e foi capaz de retardar a fibrogênese hepática. Chondroitin sulfate (CS) is a glycosaminoglycan (GAG) present in the extracellular matrix (ECM) of many mammalian tissue, used for osteoarthritis treatment and, recently, has aroused great interest due to its anti-inflammatory potential. Several in vivo inflammation experimental models are employed to study anti-inflammatory activity, including extra-hepatic cholestasis induced fibrosis. Cholestasis produces hepatocellular injury with portal tract edema, leukocyte infiltration, biliary epithelial cells proliferation and portal tract fibrosis. The aim of this work was to analyze CS effects on an extra-hepatic cholestasis experimental model induced by bile duct ligation (BDL) on Wistar rats. For this purpose 6 to 8 weeks old animals (n = 82) were euthanized 2, 7 or 14 days after surgical procedure, previously divided into groups: BDL, CS treated BDL, Sham, CS treated Sham. To analyze disease evolution body and liver weight, serum concentrations of direct bilirubin (BD), globulins, activities of gamma glutamyl transferase (Gama GT), alkaline phosphatase (FA), alanine and aspartate aminotransferases (ALT and AST), morphological changes on tissue, mieloperoxidase (MPO) activity, matrix metalloproteinases (MMP-9, pró MMP-2 and MMP-2) activities and liver GAGs content, besides histopathological analysis of the tissue. CS acquired presented over 92% tenor, molecular weight of approximately 40 kDa and disaccharide content of Δdi4S predominantly (65%).BDL caused many symptoms related to cellular damage and inflammatory process such as increasing BD and globulins, elevation of Gama GT, FA, ALT and AST activities, inflammatory infiltrate and changes on liver morphometry, with ductular proliferation, and on the ECM. CS reduced initial burst on aminotransferases, indicating protection of tissues injured on surgery procedure. Treatment led to reduction of inflammatory infiltrate, showed by significant decreasing on MPO activity. Tissue remodeling was also reduced, with decrease of MMP-9, pro MMP-2 and MMP-2 activities and also of GAGs dermatam sulfate and heparam sulfate levels, produced by hepatic stellate cells in response of tissue damage. These results show that CS reduced cholestasis hepatic injury effects, being capable to slow down liver fibrogenesis.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais A descoberta de protótipos naturais associada às metodologias de isolamento e identificação química de constituintes a partir de novas fontes botânicas, bem como da avaliação das atividades farmacológicas e toxicológicas dessas moléculas demonstram grandes perspectivas para o desenvolvimento racional de novos fármacos. Tendo em vista a alta incidência de doenças do fígado, no Brasil e no mundo, e que existem poucos medicamentos eficazes e capazes de reverter ou reduzir a progressão destas, o isolamento e a identificação de substâncias com potencial hepatoprotetor é, hoje, uma área promissora na busca de novas substâncias bioativas. Tradicionalmente, as raízes de Glycyrrhiza sp., conhecidas como licorice, são usadas na medicina alternativa com inúmeras finalidades, dentre elas hepatoprotetora. Entretanto, até o momento, não existem relatos desta atividade vinculada à licochalcona A, uma das substâncias majoritárias nas raízes de Glycyrrhiza inflata. No presente trabalho avaliaram-se as atividades da licochalcona A em ensaios de viabilidade celular das linhagens de fibroblásto (NIH/3T3) e carcinoma hepatocelular humano (HepG-2), adesão celular de HepG-2 e em modelo de lesão hepática induzida por ligação do ducto biliar (BDL) em ratos Wistar. Além disso, desenvolveu-se uma metodologia para determinação da licochalcona A em CLAE-UV, utilizando coluna C18, fase móvel em gradiente de água acidificada (0,1% H3PO4) e metanol (50:50 – 20:80 v/v), fluxo de 1,1 mL/min e comprimento de onda para detecção em 372 nm. A licochalcona A isolada a partir do extrato seco das raízes de G. inflata foi identificada por RMN 1H e 13C. O isolamento apresentou-se satisfatório, bem como a metodologia proposta para quantificação desta substância por CLAE-UV, que apresentou excelente linearidade, precisão e exatidão. Nos experimentos in vitro, a licochalcona A não demonstrou redução significativa na viabilidade das células da linhagem HepG-2 (IC50 > 200 μM) e da NIH/3T3 (IC50 > 100 μM), bem como no experimento de adesão das células HepG-2 (IC50 > 200 μM) (p>0,05). Estes dados corroboram com aqueles encontrados no experimento in vivo, no qual a licochalcona A (50 mg/Kg) também não apresentou toxicidade ao fígado, já que os resultados encontrados não foram significativamente diferentes aos do grupo controle (p>0,05). Contudo, ela também não demonstrou capacidade de promover ou reduzir os danos hepáticos causado pelo BDL, no tempo de tratamento do estudo realizado (48 h). The natural prototypes discovery associated with methods of chemical constituents isolation and identification from new botanical sources, as well as the evaluation of pharmacological and toxicological activities of these molecules show great prospects for the new drugs rational development. In view of the high incidence of liver disease in Brazil and the world, and there are few effective drugs and able to reverse or slow the progression of these disease, the substances isolation and identification with potential hepatoprotective today is a promising area in search for new bioactive substances. Traditionally, the roots of Glycyrrhiza sp., known as licorice, are used in alternative medicine with numerous purposes, among them hepatoprotective. However, to date, there are no reports of this activity linked to licochalcona A, one majority of the substances in the roots of Glycyrrhiza inflata. In the present study evaluated the activities of licochalcone A in cell viability assays of strains fibroblast (NIH/3T3) and human hepatocellular carcinoma (HepG-2), cell adhesion HepG-2 and model of liver injury induced by bile duct ligation (BDL) in Wistar rats. In addition, we developed a methodology for determining the licochalcone A quantitative HPLC-UV, using C18 column and a mobile phase gradient of acidified water (0.1% H3PO4) and methanol (50:50 - 20:80 v/v), flow rate of 1.1 mL/min and detection wavelength at 372 nm. The licochalcone A isolated from the dried extract of the roots of G. inflata was identified by 1H and 13C NMR. The isolation had to be satisfactory, as well as the proposed methodology for quantification of this substance by HPLC-UV, which showed excellent linearity, reproducibility and accuracy. In in vitro experiments, licochalcone A showed no significant reduction in the viability of the cell line HepG-2 (IC50 > 200 μM) and NIH/3T3 (IC50 > 100 μM), as well as in cell adhesion HepG-2 experiments (IC50 > 200 μM) (p> 0.05). These data corroborate those found in the in vivo experiment, in which the licochalcone A (50 mg/kg) also showed no toxicity to the liver, since the results were not significantly different to the control group (p>0.05). Nevertheless, it has not shown the ability to promote or reduce liver damage caused by BDL, at the treatment time of the study (48 h).