La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad crónica del sistema nervioso central (SNC) en el que episodios repetidos de inflamación (bortes), dan lugar a inflamación que conduce a la interrupción de la vaina de mielina por daños producidos en la misma. Junto a este fenómeno de inflación focal, existe una inflamación difusa en el SNC, que unida a la anterior, dará lugar a que aparezca un proceso de neurodegeneración, que será el responsable último de la afectación axonal y neuronal difusa que es la que va a condicionar la discapacidad en los pacientes afectos de EM. La enfermedad es una causa importante de discapacidad neurológica y de disfunción neurológica en adultos jóvenes que afecta a más de dos millones de personas en todo el mundo. En España, la prevalencia de la enfermedad es de aproximadamente 70-80 casos por cada 100.000 habitantes según las estimaciones actuales. La enfermedad se manifiesta típicamente hacia los 20 a 40 años de edad, cuando las personas están en su plena capacidad profesional y, a veces se convierte en un proceso agresivo que altera la vida de los pacientes y sus familias. La EM es una enfermedad heterogénea, tanto en su forma de presentación, el curso evolutivo, la anatomía patológica (donde se han descrito hasta 4 patrones distintos de afectación patológica) y la respuesta a los tratamientos. Estas diferencias llevaron a la clasificación de los tipos de EM en remitente-recurrente (EMRR), EM secundaria progresiva (EMSP) o EM primaria progresiva (EMPP). La mayoría de los pacientes comienzan con un curso de la enfermedad del tipo EMRR que se caracteriza por ataques periódicos (brotes), seguidos de su recuperación parcial o completa (remisiones). A pesar de recibir medicamentos para prevenir la recaída de los pacientes, que tienen un efecto antiinflamatorio pero sobre todo inmunomodulador, los pacientes entran finalmente en la fase secundaria progresiva (EMSP) con un empeoramiento neurológico irreversible. Los pacientes que cursan con una enfermedad progresiva primaria (PPMS) sufren un deterioro continuo de los síntomas neurológicos, lo que sugieren que la fisiopatología de la progresión no es únicamente de naturaleza inflamatoria. El desarrollo de tratamientos eficaces se ha visto obstaculizado por nuestro aún limitado entendimiento de la patogénesis de la EM. Es evidente que una comprensión más profunda de los mecanismos que sustentan la progresión de la enfermedad pueden ayudar en el desarrollo de estrategias terapéuticas para el tratamiento de esta patología. Aunque todas las células del SNC, incluyendo oligodendrocitos y astrocitos, pueden considerarse como "víctimas" celulares en la EM, se acepta ampliamente que es el daño neuronal la causa principal de la discapacidad funcional persistente en estos pacientes, aunque su origen no está aún del todo aclarado. Una de las hipótesis generales es que el daño axonal en los axones desmielinizados es el resultado del aumento de la demanda energética consecuente con la redistribución de la bomba Na+/K+ ATPasa anterior al aumento de los niveles intracelulares de Ca2+. El daño axonal también se ha atribuido a defectos metabólicos defectuosa o a un soporte trófico deteriorado a causa de daños en los oligodendrocitos. Sin embargo, también se cree que ciertos factores difusibles presentes en el líquido cefalorraquídeo (LCR) podrían también afectar a la capacidad de las neuronas para responder al daño axonal con una producción de energía adecuada, especialmente en la patogénesis de las lesiones corticales. La disminución de la capacidad para satisfacer la demanda energética se ha observado durante el deterioro mitocondrial en estudios con neuronas cultivadas, modelos preclínicos de EM en animales, y en muestras de EM humana. El LCR se encuentra en contacto con el parénquima y los ventrículos del cerebro y puede ser un sitio para la deposición de los productos del daño celular que pueden influir en la fisiología celular de las neuronas, las células progenitoras de los oligodendrocitos (OPCs) y los propios oligodendrocitos mielinizantes. El LCR es por tanto un biofluido prometedor para la búsqueda de biomarcadores y de proteínas asociadas al desarrollo de la EM, tanto con respecto al proceso inflamatorio como al neurodegenerativo. Los factores liberados en el LCR de pacientes con EM incluyen factores apoptóticos, citoquinas, enzimas proteolíticas, productos oxidativos y radicales libres que son producidos por las células gliales y las células inmunes activadas. Estos compuestos serían probablemente los más propensos a causar el daño axonal durante el desarrollo de la enfermedad. La hipótesis de trabajo sobre la que se articula el trabajo desarrollado es que la identificación del efecto a nivel transcripcional de células neuronales incubadas con LCR, obtenido de distintos tipos clínicos de pacientes con EM, puedan tal vez explicar ese daño neuronal. Por otra parte, el estudio de los posibles patrones genéticos diferenciales sobre las OPCs incubados con el LCR, el cual podría contener factores que dañan éstas células durante los intentos de reparación de las neuronas, podría facilitar la progresión de la EM. La identificación de los mecanismos implicados en la degeneración-reparación del daño axonal puede arrojar luz en la comprensión de la progresión de la enfermedad y/o su pronóstico dependiente del tipo clínico de la EM. 2. OBJETIVOS En base a esta hipótesis, el objetivo principal fue intentar determinar los mecanismos que están implicados en la degeneración axonal-regeneración en la EM. Para ello se centró el estudio en el daño neuronal primario, independiente del daño secundario como resultado de la desmielinización, utilizando cultivos primarios de neuronas granulares del cerebelo (CGCs) como modelo celular. Es verosímil que factores hasta ahora desconocidos presentes en el LCR de pacientes con EM son capaces de regular la destrucción a la reparación axonal, y hacer una remielinización estable o no y que la recuperación funcional pueda ser posible o permanecer en el curso de la enfermedad. Además, durante las fases de la enfermedad remitente-recurrente el cerebro del paciente por sí solo es capaz de reparar el daño, remielinizar el axón y recuperar la función neurológica. Por lo tanto, decidimos tratar a las CGC y OPCs con LCR derivado de diferentes formas clínicas de la EM y llevar a cabo estudios de expresión génica global. Por otro lado nos planteamos también como objetivo identificar los genes de referencia más estables expresadas en CGC y OPCs tratados para poder normalizar con precisión las niveles de mRNA en los perfiles de expresión. Por último, nos planteamos intentar identificar posibles biomarcadores que ayuden a distinguir las diferentes formas clínicas de la EM y permitan explorar las diferencias y similitudes con la neuromielitis óptica (NMO). Por todo ello, los objetivos concretos que se proponen en esta tesis son los siguientes: 1. Establecer una clasificación de pacientes con EM y NMO en base a criterios clínicos y la presencia de bandas oligoclonales de IgG e IgM en el LCR y aquaporina en suero. 2. Determinar el efecto de la LCR en la viabilidad y el daño celular de las neuronas granulares del cerebelo y en oligodendrocitos. 3. Establecer una relación entre la afectación neuronal y la agresividad en diferentes formas clínicas de EM y NMO. 4. Identificar genes constitutivos durante la maduración de CGCs y en neuronas y OPC expuestos a la LCR de pacientes con EM y NMO. 5. Analizar mediante ensayos con micromatrices de DNA la afectación en la expresión génica del tratamiento con el LCR de los cultivos primarios de CGCs y en OPC. 6. Analizar las variaciones en los genes implicados en el metabolismo de los hidratos de carbono y en la producción de energía y correlacionarlos con el deterioro neuronal y la prognosis en los diversos tipos de EM y NMO. 7. Buscar potenciales biomarcadores para diferenciar los diversos tipos de EM y NMO y en su prognosis. 3. MATERIALES Y METODOS 3.1. Clasificación de pacientes Se han estudiado un total de 59 pacientes en los diferentes experimentos usando las muestras de LCR obtenidas en el Departamento de Neurología del Hospital La Fe y en el Hospital Clínico (Universidad de Valencia). Estos pacientes fueron analizados mediante electroforesis para determinar la presencia en el LCR de bandas oligoclonales de IgG e IgM, en pacientes con EM, y de aquaporina en el suero de pacientes con NMO. Los pacientes con EM se definieron y se agrupan en diferentes cursos clínicos, de acuerdo con los criterios de Lublin. Adicionalmente, los pacientes con EMRR fueron reclasificamos en función de la presencia de bandas oligoclonales de tipo IgM, manteniendo un subgrupo con predominio de afectación medular, que se clasificó como tal. Los pacientes con EM incluidos en este estudio fueron diagnosticados según los criterios de McDonald 2010, y todos ellos cumplen las siguientes características: bandas IgG oligoclonales presentes, habiéndose realizado la punción lumbar fuera de un brote y que hayan pasado al menos un mes después de la última dosis de corticoides. Se utilizaron los criterios Wingerchuk para diagnosticar pacientes con enfermedad NMO. Los pacientes sufrieron recaídas de neuritis óptica y mielitis, y 2 de los tres criterios, la RM normal o que no cumplen los criterios de Patty para MRI de diagnóstico de la EM. Se realizaron todos los estudios durante el procedimiento de diagnóstico, para lo cual el paciente firmó un consentimiento informado. En base a estos criterios clínicos y bioquímicos se pudo establecer que de los 59 pacientes, 21 tenían EM de tipo inflamatoria (11 EMRR subtipo IgM +/+ y 10 EMRR subtipo IgM +/-), 8 tenían EM de subtipo medular (EMMed), 11 tenían EM primaria progresiva (EMPP), 9 tenían neuromielitis óptica (NMO), y 10 eran controles (pacientes NIMD). La tabla 3 muestra la clasificación final y las características clínicas de los pacientes usados en este estudio. Estos pacientes fueron analizados mediante electroforesis para determinar la presencia en el LCR de bandas oligoclonales de IgG e IgM, en pacientes con sospecha de EM, y de aquaporina en el suero de pacientes con sospecha de NMO. 3.2. Análisis de LCR y suero en pacientes con EM y NMO Para determinar los subtipos de EM y NMO señalados arriba, se analizaron muestras de LCR y suero pareadas para detectar las bandas oligoclonales de IgG y IgM mediante isoelectroenfoque (IEF) e inmunodetección. La técnica consiste, usando un kit comercial (Helena BioScience IgG-IEF) y el método descrito por Villar et al. (2001), consiste en la dilución de las de las muestras de LCR hasta concentraciones similares de proteínas, y la incubación con ditiotreitol para reducir IgM. El electroenfoque enfoque se realizó en un sistema de electroforesis Multiphor II (GE Healthcare) a un pH entre de 5 a 8. Las proteínas se transfirien a una membrana de PVDF y se analizan mediante Western blot usando en la inmunodetección anticuerpo anti-IgM humano conjugado con biotina y estreptavidina-fosfatasa alcalina para la detección. En los estudios con suero de pacientes con NMO se usó el anticuerpo anti-AQP4 para la inmunodetección. Se usó además la para detectar la presense de NMO anticuerpos IgG específicos. La inmunofluorescencia indirecta (IFI) se realizó además en las células transfectadas por acuaporina 4 usando el mismo anticuerpo (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG). 3.3. Material biológico 3.3.1. Animales Para los diversos experimentos con cultivos celulares primarios se utilizaron ratas Wistar (Harlan Iberica) con peso entre 200-250 g. El mantenimiento de los animales se realizó en las instalaciones de los animales inferiores del Príncipe Centro de Investigación, Felipe, Valencia, España. 3.3.2. Cultivos primarios de neuronas granulares de cerebelo (CGCs) Los cultivos primarios de neuronas granulares del cerebelo (CGCs) se obtuvieron de acuerdo con el protocolo modificado descrito previamente [Minana et al., 1998]. Los extrajeron los cerebelos de ratas Wistar de 8 días y, tras eliminar las meninges, se disgregaron con pipeta Pasteur, se trataron con 3 mg/ml de dispasa (grado II) durante 30 min a 37ºC en atmósfera humidificada de CO2 5% y se inactivó la enzima con 1 mM EDTA. Las células granulares se resuspendieron en medio basal de Eagle (BME, Gibco) con 40μg/ml de DNAasa I. La suspensión celular se filtró a través de una malla con un tamaño de poro de 90μm, se centrifugó a 1.500 rpm durante 5 min y se lavó la suspensión de células con BME. Finalmente, las células se resuspendieron en medio completo BME con sales de Earle con 10% de suero bovino fetal, glutamina 2 mM, 0.1 mg/ml de gentamicina y 25 mM KCl. Se contaron las células neuronales, se sembró la suspensión en placas de cultivo revestidas de poli-L-lisina a una densidad de 3x105 células/pocillo y se incubaron a 37º C. Para la obtención de cultivos enriquecidos en neuronas, se incubaron las células con arabinósido de citosina 1 mM entre de 18 a 24 horas, lo que inhibe la replicación de células no neuronales. 3.3.3. Cultivos primarios de células precursoras de oligodendrocitos (OPCs) Las OPCs se aislaron a partir de la corteza de ratas postnatales el día 1 y se cultivaron de acuerdo con un procedimiento de McCarthy y De Vellis modificado [McCarthy y De Vellis 1.980]. Las células fueron cultivadas en medio NM10 (DMEM de alta glucosa suplementado con SBF al 10%), y se cultivaron durante una semana a 37 ºC en 5% CO2. Después de una semana, las células de microglía poco adheridas se eliminaron mediante una agitación de baja velocidad (210 rpm) durante 20 min en un agitador de plataforma rotatoria. El medio se retira y se desecha y se reemplaza con medio fresco NM10. Los matraces se agitaron durante la noche durante 18-20 horas a 220 rpm y las células se inmunoseleccionaron en una columna de purificación magnética Miltenyi MACS usando anticuerpo de ratón anti-A2B5. Las OPCs primarias se sembraron en placas revestidas de poli-lysine a una densidad de 2.000 células por cm2 y se cultivaron en medio de definición química de oligodendrocitos (ODM) que contiene 100 mg/ml de transferrina bovina, 5.0 g/ml de insulina recombinante de levadura, 100 g/ml de BSA, 1 mg/ml de biotina, 0.628 mg/ml de progesterona, 0,38 mg/ml de selenito de sodio, 16.1 g/ml de putrescina. Para la expansión de los OPCs, el medio ODM se suplementó con 20 ng/ml del factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF) y 10 ng/ml del factor de crecimiento AA derivado de plaquetas (PDGF-AA), y las células se dejaron proliferar durante 48 horas antes del tratamiento con los LCR . Los cultivos de OPCs, tal como se detectó por inmunocitoquímica, eran 99%+ cultivos OPCs puros, con