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Bacteriophages or phages are viruses that infect bacteria. They are the most abundant biological entity on the earth and are present in all biotopes. Phage T5 is a strictly lytic phage that belongs to the family Siphoviridae and infects E. coli. Infection by the T5 phage is triggered by host recognition through the receptor binding protein (RBP) pb5, which binds to the E. coli outer membrane transporter FhuA. This interaction triggers the perforation of the bacterial wall and the injection of viral DNA into the host cytoplasm. This first stage of infection is followed by viral replication and the release of new virions. During this vulnerable period, T5 protects the new viral factory from superinfection by producing a periplasmic lipoprotein, Llp, which targets the inner leaflet of the outer membrane, binds to and inactivates FhuA. The main biological function of Llp is probably to prevent the inactivation of virions by FhuA present in the debris of lysed cells, thus increasing their chances of infecting a new host. During my thesis, we solved the structure of the FhuA-pb5 complex by electron microscopy at a resolution of 2.4 Å. The structure of pb5 shares homologies with other phage proteins only in its proximal part. The structure of the FhuA-pb5 complex shows that the interaction between FhuA and pb5 is mainly due to a network of hydrophobic bonds. We also solved the structure of Llp by NMR for the soluble form (Sol-Llp), revealing a predominantly beta-sheet folding with a flexible loop. This structure is a novel phage protein structure. In addition, I studied the FhuA-Llp complex with various biochemical and biophysical methods to define a KD of 1.5 mM for Sol-Llp and an estimated KD for the acylated protein of 20 µM, which implies that acylation plays an important role in the formation of the complex. NMR titration of Sol-Llp by FhuA shows intensity and chemical shift perturbations for residues 12-24, and 51-54. Mutants of these residues as well as residues 39-45 - not accessible by NMR - confirm the importance of these residues in the interaction with FhuA, with the mutant proteins being unable to protect the cell from T5 infection in contrast to the wild type.; Les bactériophages ou phages sont des virus qui infectent les bactéries. Ils représentent l’entité biologiques les plus abondantes de la planète et sont présents dans tous les biotopes. Le phage T5 est un phage strictement lytique qui appartient à la famille des Siphoviridae et qui infecte E. coli. L'infection par le phage T5 est déclenchée par la reconnaissance de l'hôte grâce à pb5, la protéine de liaison au récepteur (RBP), qui se lie à FhuA, transporteur de la membrane externe de E. coli. Cette interaction déclenche la perforation de la paroi bactérienne et l’injection de l'ADN viral dans le cytoplasme de l'hôte. Cette première étape de l'infection est suivie par la réplication virale puis la libération des nouveaux virions. Pendant cette période de vulnérabilité, T5 protège la nouvelle usine virale d'une surinfection par la production d’une lipoprotéine périplasmique, Llp, qui cible le feuillet interne de la membrane externe, se lie à FhuA et l'inactive. La principale fonction biologique de Llp est probablement d'empêcher l'inactivation des virions par les FhuA présente dans les débris des cellules lysées, augmentant ainsi leurs chances d'infecter un nouvel hôte. Pendant ma thèse, nous avons résolu la structure du complexe FhuA-pb5 par microscopie électronique à une résolution de 2,4 Å. La structure de pb5 partage des homologies avec d’autres protéines de phage dans sa partie proximale seulement. La structure du complexe FhuA-pb5 montre que l’interaction entre FhuA et pb5 est principalement due à un réseau de liaisons hydrophobes. Nous avons également résolu la structure de Llp par RMN pour la forme soluble (Sol-Llp), révélant un repliement principalement en feuillet bêta avec une boucle flexible. Cette structure est une nouvelle structure de protéine de phage. De plus, j’ai étudié le complexe FhuA-Llp avec diverses méthodes biochimiques et biophysiques permettant de définir un KD de 1,5 mM pour Sol-Llp et une estimation de KD pour la protéine acylé de 20 µM, ce qui implique de l’acylation joue un rôle important dans la formation du complexe. La titration de Sol-Llp par FhuA en RMN montre des perturbations d’intensité et de déplacement chimique pour les résidus 12 à 24, et 51 à 54. Des mutants de ces résidus ainsi que des résidus 39 à 45 - non accessibles en RMN - confirment l’importance de ces résidus dans l’interaction avec FhuA, les protéines mutantes étant incapables de protéger la cellule d’une infection à T5 contrairement à la protéine sauvage.

In recent decades, foldamers have emerged as a promising tool for developing bioactive molecules that mimic the secondary structures of proteins. These foldamers are mainly used to modulate protein-protein interactions involved in many diseases, including amyloidoses such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease and type II diabetes (T2D). Amyloidosis is a disease characterized by the presence of insoluble protein deposits in tissues. Islet amyloid polypeptide (hIAPP) aggregation is linked to beta-cell degeneration and to the pathogenesis of type 2 diabetes. hIAPP is a 37-residue polypeptide secreted by pancreatic beta cells. Amyloid deposits of hIAPP are found in the pancreas of many patients with T2D. hIAPP is one of the most amyloidogenic polypeptides known, and aggregates of hIAPP are toxic for pancreatic beta cells. Worldwide, approximately 483 million people currently have type 2 diabetes (T2D), a prevalence that is predicted to reach 579 million by 2030. The increasing prevalence of type 2 diabetes, and the associated adverse cardiovascular risks, is now considered a major public health challenge. Currently, the treatments available for diabetes are symptomatic and have many side effects. Targeting hIAPP has become a promising strategy to find an etiological treatment for T2D. In this context, we have designed foldamers based on fluorinated 1,2,3-triazoles that can modulate the aggregation process of hIAPP. The 1,2,3-triazoles were used for their properties as peptide bond isosteres with improved metabolic stability. The fluorine atom, by its properties, allows to induce conformations and constitutes a ¹⁹F NMR probe, useful for studying ligand-protein interactions, metabolic stability, membrane crossing or even the in vivo distribution of compounds. Firstly, we carried out the synthesis of homo- and heterotriazolamers based on N-difluoromethylated 1,2,3-triazoles. Secondly, we have carried out preliminary works on 5-fluoro-1,2,3-triazoles as a new architecture to design fluorinated foldamers. Conformational studies were carried out by NMR, and molecular dynamics for the triazolamers of N-difluoromethylated 1,2,3-triazoles. The conformational study of 5-fluoro-1,2,3-triazoles was performed by X-ray diffraction. In addition, preliminary studies were performed by thioflavin-T fluorescence spectrometry to assess the modulation of hIAPP aggregation by these foldamers. The thesis work aims to develop the knowledge around fluorinated foldamers to design bioactive molecules. To our knowledge, none of the fluorinated foldamers described in the literature has been used for medicinal applications., Ces dernières décennies, les foldamères ont émergé comme un outil prometteur pour développer des molécules bioactives mimant les structures secondaires des protéines. Ces foldamères sont principalement utilisés pour moduler les interactions protéine-protéine impliquées dans de nombreuses maladies, notamment les amyloïdoses telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson et le diabète de type II (DT2). Les amyloïdoses sont des maladies qui se caractérisent par la présence de dépôts de protéines insolubles dans les tissus. L'agrégation du polypeptide amyloïde des îlots (hIAPP) est liée à la dégénérescence des cellules bêta et à la pathogenèse du diabète de type 2. hIAPP est un polypeptide de 37 résidus sécrété par les cellules bêta du pancréas. On trouve des dépôts amyloïdes de hIAPP dans le pancréas de nombreux patients atteints de DT2. hIAPP est l'un des polypeptides les plus amyloïdogènes connus, et les agrégats de hIAPP sont toxiques pour les cellules bêta du pancréas. Dans le monde, environ 483 millions de personnes sont actuellement atteintes de diabète de type II (DT2), une prévalence qui, selon les prévisions, devrait atteindre 579 millions d'ici 2030. La prévalence croissante du diabète de type II, et les risques cardiovasculaires indésirables qui lui sont associés, sont désormais considérés comme un défi majeur de santé publique. Actuellement, les traitements disponibles pour le traitement du diabète sont symptomatiques et induisent de nombreux effets secondaires. Le ciblage de hIAPP est devenu une stratégie prometteuse pour trouver un traitement étiologique contre le DT2. Dans ce contexte, nous avons conçu des foldamères basés sur les 1,2,3-triazoles fluorés pouvant moduler le processus d’agrégation de hIAPP. Les 1,2,3-triazoles ont été utilisés pour leurs propriétés d’isostères de liaison peptidique avec une meilleure stabilité métabolique. L’atome de fluor, par ses propriétés particulières, permet d’induire des conformations et constitue une sonde en RMN du ¹⁹F, utile pour étudier les interactions ligand-protéine, la stabilité métabolique, le passage de membranes ou même la distribution d’un composé in vivo. D’une part, nous avons réalisé la synthèse d’homo- et d’hétérotriazolamères se basant sur les 1,2,3-triazoles N-difluorométhylés. D’autre part, nous avons effectué des travaux préliminaires sur les 5-fluoro-1,2,3-triazoles comme nouvelle architecture pour concevoir des foldamères fluorés. Les études conformationnelles ont été réalisées par RMN et dynamique moléculaire pour les triazolamères des 1,2,3-triazoles N-difluorométhylés. L’étude conformationnelle des 5-fluoro-1,2,3-triazoles a été réalisée par diffraction aux rayons X. De plus, des études préliminaires ont été réalisées par spectrométrie de fluorescence à la thioflavine-T pour évaluer la modulation de l’agrégation de hIAPP par ces foldamères. L’ensemble de ces travaux de thèse a pour objectif de développer le savoir autour des foldamères fluorés pour concevoir des molécules bioactives. À notre connaissance, aucun des foldamères fluorés décrit dans la littérature n’a d’application médicinale.

Protein-protein interactions are at the centre of cell signalling. The MAPKs (Mitogen-Activated Protein Kinases) are a family of intracellular protein kinases that form signalling cascades that control fundamental cell mechanisms such as proliferation, differentiation, inflammation and cell death. Signals progress through kinases (MAP4K to MAP3K to MAP2K) which eventually activate a MAPK. MAPK activation is achieved through the double phosphorylation of a TxY motif in its activation loop, and modulates the expression of genes through transcription factors or other protein kinases. The docking specificity of MAP2Ks towards MAPKs is mediated by Kinase Interacting Motifs (KIMs). Many X-ray structures exist of the individual kinases and complexes with isolated KIMs. However, due to the transient nature of the interaction between kinases, the molecular details of selectivity and activation of a MAPK by its upstream component are unknown.Two important members of the MAPK family involved in the inflammatory response are p38α, a MAPK, and its activating MAP2K, MKK6. Through them, we present the first model of the interaction between a MAPK and its upstream activating MAP2K trapped in transition state. The model reveals a face-to-face heterokinase dimer, allowing the activation loop of p38α to access the active site of MKK6. Most interactions are distal from the phosphorylation sites, including the well-characterised MAP2K KIM – MAPK docking site interaction and a novel interaction interface between the C-lobes of the two kinases. This previously unobserved configuration is favourable for catalysis, and, despite its limited resolution, the cryoEM structure of MKK6 and p38α paves the way for hypotheses on MAPK activation.We also discovered a novel non-canonical phosphorylation mechanism of p38α by MKK6 using ADP as a source of phosphate. We show that MKK6 is able to phosphorylate p38α using the β-phosphate of ADP and ATP in vitro, with lower efficiency than with the canonical hydrolysis of γ-phosphate of ATP. This alternative route of phosphorylation could confer an adaptive advantage to stress in case of ATP deprivation to maintain the signalling pathway.Some pathogens hijack host signalling pathways, such as the MAPK pathway, to remodel the cellular response to their advantage. The intracellular parasite Toxoplasma gondii secretes effector proteins that mimic motifs present in some host proteins to directly act on their targets. We characterized how two of T. gondii effectors, GRA24 and GRA16, interact with their target protein.GRA24 binds the host MAPKs p38α and ERK1/2 through a KIM motif; and GRA16 interacts with the host USP7 deubiquitinase through a MATH binding motif. Both motifs have high affinity for their targets and bind to known docking sites in competition with host interactors. We present the molecular details of the interaction between these pathogen motifs, and their host target, and propose some potential mechanism of action., Les interactions protéine-protéine sont au centre de la signalisation cellulaire. Les MAPKs (Mitogen-Activated Protein Kinases) sont une famille de protéines kinases intracellulaires qui forment des cascades de signalisation contrôlant des mécanismes cellulaires fondamentaux tels que la prolifération, la différenciation, l'inflammation et la mort cellulaire. Les signaux progressent à travers différentes kinases (MAP4K, MAP3K et MAP2K) qui finissent par activer une MAPK. L'activation des MAPKs se fait par la double phosphorylation d'un motif TxY situé dans sa boucle d'activation, et module l'expression de gènes par l'intermédiaire de facteurs de transcription ou d'autres protéines kinases. La spécificité de liaison des MAP2Ks aux MAPKs est médiée par des motifs nommés KIM (pour Kinase Interacting Motif). Il existe de nombreuses structures aux rayons X des kinases individuelles et en complexe avec des KIMs isolés. Cependant, en raison de la nature transitoire de l'interaction entre les kinases, les détails moléculaires de la sélectivité et de l'activation d'une MAPK par sa MAP2K sont inconnus.Deux membres importants de la famille MAPK impliqués dans la réponse inflammatoire sont p38α, une MAPK, et sa MAP2K activatrice, MKK6. A travers eux, nous présentons le premier modèle de l'interaction entre une MAPK et sa MAP2K activatrice amont piégée à l'état de transition. Le modèle révèle un dimère de kinases face à face permettant à la boucle d'activation de p38α d'accéder au site actif de MKK6. La plupart des interactions sont éloignées par rapport aux sites de phosphorylation. En plus de l'interaction bien caractérisée entre le KIM de la MAPK2K et le "docking site" de la MAPK, une nouvelle interface d'interaction entre les lobes C des deux kinases a été indentifiée. Cette configuration jusqu'alors inobservée est favorable à la catalyse et, malgré sa résolution limitée, le modèle cryoEM de MKK6 et p38α ouvre la voie à des hypothèses sur l'activation des MAPK.Nous avons également découvert un nouveau mécanisme de phosphorylation non canonique de p38α par MKK6 utilisant l'ADP comme source de phosphate. Nous montrons que MKK6 est capable de phosphoryler p38α en utilisant le β-phosphate de l'ADP et de l'ATP in vitro, avec une efficacité moindre qu'avec l'hydrolyse canonique du γ-phosphate de l'ATP. Cette voie alternative de phosphorylation pourrait conférer un avantage adaptatif au stress en cas de privation d'ATP pour maintenir la voie de signalisation.Certains pathogènes détournent les voies de signalisation de leur hôte pour remodeler la réponse cellulaire à leur avantage. Le parasite intracellulaire Toxoplasma gondii sécrète des protéines effectrices qui imitent des motifs présents dans certaines protéines de l'hôte pour agir directement sur leurs cibles. Nous avons caractérisé comment deux effecteurs de T. gondii, GRA24 et GRA16, interagissent avec leur protéine cible.GRA24 se lie aux MAPKs de l’hôte p38α et ERK1/2 par le biais d'un motif KIM ; et GRA16 interagit avec la déubiquitinase hôte USP7 par le biais d'un motif de liaison MATH. Les deux motifs ont une haute affinité pour leur cible et se lient à des sites d’interaction connus en compétition avec les interacteurs de l'hôte. Nous présentons les détails moléculaires de l'interaction entre ces motifs pathogènes et leur cible et proposons un mécanisme d'action potentiel.

BRCA2 is an oncoprotein frequently mutated in hereditary breast cancers. To improve the diagnosis of these cancers, several molecular studies have identified BRCA2 key positions and characterized mutations in these regions causing a BRCA2 loss of function. However, these studies mainly focused on the C-terminal globular domain of BRCA2. Here, we characterized the N-terminal region of BRCA2 from aa 48 to aa 284 (BRCA2₄₈₋₂₈₄). This well-conserved region is disordered, i.e. it lacks stable secondary structure (Julien et al. 2020 Biomol. NMR Assign). It is also highly phosphorylated by the kinase Plk1 at the entry into mitosis. However, previous studies using mass spectrometry didn’t allow to precisely identify all the phosphorylation sites, limiting their characterization. To circumvent this problem, we used real-time NMR to monitor phosphorylations of the N-terminal region of BRCA2, at the residue level. We developed 2 protocols for disordered regions allowing phosphorylation in a large range of temperatures and pHs (Julien et al. 2020 Methods Mol. Biol; Alik et al. 2020 An- gew. Chem.). Then, we identified that Plk1 phosphorylates BRCA2 at 2 conserved positions: pS193 and pT207. We further searched for the function of these phosphoresidues. First, we identified by biophysical methods that BRCA2pT207 creates a docking site for the regulatory domain of Plk1. In collaboration with the group of Dr. Aura Carreira, we showed that this interaction contributes to the assembly of a quaternary complex involving BRCA2, Plk1, BubR1 and PP2A that regulates chromosome alignment in mitosis (Ehlen et al. 2020. Nat Commun.). We also demonstrated that breast cancer variants impact the phosphorylation of BRCA2 and the formation of the complex in vitro and in cell. Then, we per- formed proteomics experiments to identify new mitotic partners specific to phospho-BRCA2, and found Plk1 as well as other proteins involved in mitosis. I started the characterization of two new BRCA2 partners: Ki2C and Chk2. We also explored the role of Cdk1 phosphorylation of BRCA2T77 on further Plk1 phosphorylation. We found that early BRCA2T77 phosphorylation increases the phosphoryla- tion rate of BRCA2S193 by Plk1. Finally, we initiated a project about the Plk1 kinase, an interesting cancer-target as it is often overexpressed in several cancers, including breast cancers. Here, I produced several constructs of the kinase for further structural characterization., BRCA2 est une oncoprotéine fréquemment mutée dans les cancers du sein héréditaires. Pour améliorer le diagnostic de ces cancers, plusieurs études moléculaires ont localisées des régions clés de BRCA2 et ont caractérisées l’impact de mutations sur les fonctions portées par ces régions. Ici, je m’intéresse à la région aa 48 à aa 284 (BRCA2₄₈₋₂₈₄) de la protéine. Cette région conservée est désordonnée (Julien et al. 2020 Biomol. NMR Assign), c.à.d. qu’elle ne contient pas de structure secondaire stable. Cette région est également phosphorylée par la kinase Plk1 à l’entrée en mitose. Cependant, des études précédentes utilisant la spectrométrie de masse n’ont pas permis d’identifier précisément les sites phosphorylés, limitant ainsi leur caractérisation fonctionnelle. Pour contourner ce problème, nous avons utilisé la RMN en temps réel pour identifier et caractériser les phosphorylations de BRCA2₄₈₋₂₈₄, à l’échelle du résidu. Nous avons développé deux protocoles permettant d’étudier la phosphorylation de régions désordonnées pour une grande gamme de pH et températures (Julien et al. 2020 Methods Mol. Biol; Alik et al. 2020 Angew. Chem.). Ainsi, nous avons identifié que Plk1 phosphoryle BRCA2₄₈₋₂₈₄ sur deux sites conservés : pS193 et pT207. Ceci. Nous a servi de base pour la caractérisation de ces sites. D’abord, nous avons identifié grâce à des méthodes biophysiques que BRCA2pT207 est un site d’interaction pour le domaine régulateur de Plk1. En collaboration avec l’équipe de Dr. Aura Carreira, nous avons montré que cette interaction est à la base d’un complexe quaternaire (BRCA2, Plk1, BubR1 et PP2A) qui régule l’alignement des chromosomes en métaphase (Ehlen et al. 2020. Nat Commun.). Nous avons aussi démontré que des mutations de BRCA2 issues de patientes ont un impact sur la phosphorylation de BRCA2 et la formation du complexe. Puis, nous avons réalisé des expériences de protéomique pour identifier de nouveau partenaires mitotiques reconnaissant pBRCA2₄₈₋₂₈₄. Nous avons identifié Plk1 et d’autres protéines impliquées dans la mitose. J’ai débuté l’analyse structurale de deux nouveaux partenaires prometteurs: Kif2C et Chk2. Nous avons aussi étudié le rôle de la préphosphorylation de BRCA2T77 par Cdk sur la phosphorylation par Plk1. Nous avons trouvé que BRCA2pT77 favorisait la phosphorylation de BRCA2S193 par Plk1. Enfin, nous avons initié une étude structurale sur la kinase Plk1, surexprimée dans de nombreux cancers dont le cancer du sein. Ici, j’ai produit plusieurs constructions de la kinase qui serviront à sa caractérisation structurale.

Protein complexes are of fundamental importance in most biological processes and mainly carry out their function in networks. The structure of their interface can give us crucial information to understand the mechanisms behind these processes. This thesis focuses on the improvement of the performance of structural prediction methods, in particular by exploiting co-evolutionary information. As part of my PhD project, I participated in major developments in our docking server, InterEvDock2, which suggests 10 interface models for a pair of input proteins using a mix of different scoring properties. InterEvDock2 now also accepts oligomeric structure inputs or sequence inputs, for which it can model monomeric structures, as well as user constraints taken from prior knowledge of the interaction. I validated the performance of InterEvDock2 on a large benchmark of 812 docking cases and found that InterEvDock2 was capable of finding a correct complex structure in as much as 32 % of these cases. My work then focused on finding a more efficient and explicit way of integrating implicitly defined evolutionary information into scoring. I made this information directly compatible with atomic-scale scoring thanks to homologous interface modelling. This strongly increases predictive power, from 32% to 40% on our large benchmark. Moreover, throughout my PhD, I was able to participate in 10 blind-test docking challenges through CAPRI (Critical Assessment of Predicted Interactions). The strategies applied by our team, which enabled us to rank first in the latest CAPRI round for 2016-2019, are described in the last chapter of this manuscript. This work aims at helping biologists study their proteins or biological pathways of interest using well performing prediction methods. It constitutes a step towards the final goal of interactome prediction., Les protéines sont des acteurs centraux du vivant et agissent rarement seules. La structure 3D de leurs interactions aide à mieux comprendre les mécanismes des processus biologiques dans lesquels elles sont impliquées. L’objectif de cette thèse était d’améliorer la performance des méthodes de prédiction structurale, notamment en utilisant l’information de (co-)évolution. J'ai participé à des évolutions majeures de notre serveur de docking, InterEvDock2, qui, à partir de deux protéines, propose 10 modèles d'interface en croisant des scores aux propriétés différentes. Le serveur accepte désormais aussi en entrée des structures oligomériques ou des séquences protéiques, pour lesquelles il modélise la structure monomérique, ainsi que des contraintes connues a priori sur l’interaction. Sur un large ensemble de 812 cas test, InterEvDock2 prédit une structure de complexe correcte dans 32 % des cas. J’ai ensuite recherché un moyen plus explicite d'intégrer dans les fonctions de score l’information évolutive contenue dans les alignements de séquences. J’ai rendu cette information compatible avec l’utilisation de scores atomiques par la modélisation 3D des interfaces homologues. Ceci améliore la performance prédictive de 32 à 40% sur notre large base de test. De plus, durant ma thèse, j'ai pu participer à 10 tests de docking à l’aveugle via CAPRI (Critical Assessment of Predicted Interactions). Les stratégies qui ont permis à notre équipe d’être classée première sur la période 2016-2019 sont décrites dans le dernier chapitre de ce manuscrit. Ce travail vise à aider les biologistes à étudier les protéines ou voies biologiques d'intérêt en utilisant des méthodes de prédiction performantes et constitue un pas en avant dans l'objectif final de la prédiction des interactomes.

Increasing evidence support the idea that proteins involved in RNA metabolism such as RNA binding proteins (RBPs) and RNA helicases are directly implicated in the DNA damage response (DDR). This activity is generally achieved through their interaction with DNA repair factors.BRCA2 is a tumor suppressor protein that plays an important role in the repair of DNA double-strand breaks (DSBs) by homologous recombination (HR) as well as protecting stalled replication forks from unscheduled degradation; therefore, it is essential to maintain genome integrity. Interestingly, BRCA2 deficient cells accumulate DNA-RNA hybrids or R-loops, a known source of DNA damage and genome instability, providing evidence for its role in either R-loop prevention or processing. However, the specific role of BRCA2 on these structures remains poorly understood.A mass spectrometry screen to identify partners of BRCA2 performed in our laboratory revealed an enrichment of proteins involved in RNA metabolism such as RNA helicases. These findings led us to investigate whether BRCA2 could cooperate with these candidate interacting RNA helicases in processing DNA-RNA structures. First, we confirmed the interaction of BRCA2 and the DEAD-box RNA helicase DDX5, which we found is enhanced in cells exposed to -irradiation. Then, we narrowed down the interaction to the first 250 aa of BRCA2 (BRCA2T1) and found that it is direct using purified proteins. In collaboration with A. Aguilera lab (Cabimer, SP), we could show that depletion of DDX5 leads to a genome-wide accumulation of DNA-RNA hybrids that is particularly enriched at DNA damage sites. DDX5 associates with DNA-RNA hybrids that form in the vicinity of DSBs. Interestingly, we found that BRCA2 is important for the retention of DDX5 at laser irradiation-induced DNA damage. Notably, in vitro R-loop unwinding assays using purified DDX5 and BRCA2 proteins revealed that BRCA2 stimulates the R-loop helicase activity of DDX5.A breast cancer variant of unknown clinical significance (VUS) located in BRCA2T1 (T207A) reduced the interaction between BRCA2 and DDX5 and led to the accumulation of DNA-RNA hybrids. Cells stably expressing BRCA2-T207A also showed a decreased association of DDX5 with DNA-RNA hybrids, especially upon irradiation. Notably, monitoring RAD51 foci to evaluate HR-mediated DSBs repair efficiency in either DDX5-depleted cells or in BRCA2-T207A cells resulted in a delayed kinetics of appearance of RAD51 foci upon irradiation suggesting an active role of BRCA2-DDX5 interaction in ensuring timely HR repair. In agreement with this, overexpression of the RNAseH1 ribonuclease, that specifically degrades the RNA moiety in DNA-RNA structures, partially restored RAD51 kinetics phenotype of BRCA2-T207A cells. Moreover, cells bearing BRCA2-T207A variant also showed a reduced number of RPA foci compared to BRCA2 WT expressing cells, a step that precedes RAD51 loading at DSBs.Taken together, our results are consistent with DNA-RNA hybrids being an impediment for the repair of DSBs by HR and reveal BRCA2 and DDX5 as active players in their removal., Un nombre croissant d’études soutiennent le fait que les protéines majeures du métabolisme des ARN, telles que les hélicases ARN, sont impliquées dans la réponse aux dommages à l’ADN. Cette activité est généralement accomplie par leur interaction avec des facteurs de réparation de l’ADN. BRCA2, une protéine suppressive de tumeurs, joue un rôle crucial dans la réparation des cassures double-brin (CDB) de l'ADN par recombinaison homologue (RH) et donc, est un facteur essentiel pour l’intégrité du génome. Les cellules déficientes pour BRCA2 accumulent des hybrides ADN-ARN ou R-loops, une source de dommage à l'ADN, suggérant ainsi l’importance de cette protéine dans la prévention ou la suppression de ces structures. Toutefois, le rôle spécifique de BRCA2 dans la résolution des hybrides ADN-ARN reste inconnu.Afin de connaître des potentiels partenaires de BRCA2, une analyse par spectrométrie de masse réalisée dans notre laboratoire a révélé un enrichissement en protéines impliquées dans le métabolisme de l'ARN, comme les hélicases ARN. Ces résultats nous ont menés à examiner la coopération entre BRCA2 et les hélicases ARN dans la séparation des structures ADN-ARN. Nous avons d’abord confirmé l'interaction entre l'hélicase ARN DDX5 et BRCA2, qui est améliorée dans les cellules exposées à γ-irradiation. Ensuite, nous avons réduit l’interaction aux premiers 250 aa de BRCA2 (BRCA2T1) et avons constaté que celle-ci est directe en utilisant des protéines purifiées. En collaboration avec le laboratoire du docteur A. Aguilera (Cabimer, SP), nous avons montré que la déplétion de DDX5 conduit à une accumulation des hybrides ADN-ARN dans l’entièreté du génome, particulièrement aux sites de dommages à l’ADN. De plus, nos résultats indiquent que DDX5 localise aussi aux hybrides ARN-ADN qui se forment à proximité de CDB.De manière intéressante, nous avons constaté que BRCA2 est important pour la rétention de DDX5 aux sites de dommage à l’ADN induit par l’irradiation laser. Notamment, des tests de déroulement de brins in vitro en utilisant les protéines purifiées DDX5 et BRCA2 ont révélé que BRCA2 stimule l’activité de déroulement des R-loops de DDX5.Un variant de signification inconnue (VSI) trouvé dans de patients atteints de cancer du sein situé dans la région BRCA2T1 (T207A) réduit l’interaction de BRCA2 avec DDX5 et conduit à l’accumulation des hybrides ADN-ARN. Les cellules exprimant stablement BRCA2-T207A montrent également une diminution de l’association de DDX5 avec les hybrides ARN-ADN, en particulier lors d’une exposition de cellules à l’irradiation. L’analyse de l’efficacité de la réparation des CDB par RH dans les cellules déficientes en DDX5 ou exprimant BRCA2-T207A, montre une cinétique retardée de l’apparition des foyers de réparation RAD51 lors de l’irradiation, ce qui suggère un rôle actif de l’interaction BRCA2-DDX5 pour assurer la réparation par RH efficacement. En accord avec cette hypothèse, la ribonucléase RNAseH1, qui dégrade spécifiquement la fraction d’ARN dans les structures d’ADN-ARN, restaure partiellement le phénotype de cinétique des foyers RAD51 dans les cellules BRCA2 T207A. De plus, les cellules portant le variant BRCA2-T207A ont également montré un nombre réduit de foyers RPA par rapport aux cellules qui expriment BRCA2 sauvage, témoins d’un défaut dans l’étape qui précède le chargement de RAD51 aux CDB.Ensemble, nos résultats suggèrent que les hybrides ADN-ARN représentent un obstacle à la réparation des CDB par RH et révèlent BRCA2 et DDX5 en tant que facteurs actifs dans leur suppression.

Protein-protein interactions (PPI) have a key role in physiological processes. The inhibition of these PPI may lead to new therapeutic strategies. Secondary structures in α-helix are frequently involved in protein interactions where they may contribute significantly to binding. Designing molecules which mimic the helical motif for protein surface recognition and inhibition of the natural partner represents an innovative path to discover new drug candidates. Aliphatic urea oligomers, a class of foldamers that adopt a well-defined H-bonded helical secondary structure with good similarity to the α-helix have been proposed as possible α-helix mimics to inhibit protein-protein interactions. The first part of this PhD project was dedicated to the design and synthesis of oligoureas and oligourea/α-peptide chimeras for specific protein surface recognition. We have selected the vitamin D receptor as a potential target, mainly because (i) it is therapeutically relevant; (ii) its protein partner (coactivators) interact through a short region which adopts an α-helical structure upon binding and (iii) structures at atomic resolution were available to enable the design of effective mimetics. In the second part, we investigated methods to generate foldamer covalent dimers that could potentially be used to cover larger interaction surfaces. The rationale is that the binding interface is often more complex than a single helix and may involve tertiary and quaternary structures such as coiled coils which in turns may also serve as a basis for the design of new classes of inhibitors.; Les interactions protéine–protéine (IPP) jouent un rôle primordial dans les processus physiologiques. L’inhibition de ces interactions ouvre la voie à la conception de nouvelles molécules à visée thérapeutique. Les structures secondaires en hélice α sont fréquemment impliquées dans les interactions entre protéines auxquelles elles peuvent contribuer de manière significative. La conception de molécules, mimant ce motif de reconnaissance et pouvant interagir avec la protéine cible tout en inhibant la reconnaissance avec le partenaire naturel, représente une voie innovante pour trouver de nouveaux candidats médicaments. Les oligomères d’urée aliphatique, une classe de foldamères qui adoptent une structure secondaire en hélice bien définie et proche de l’hélice α, ont été proposés comme mimes d’hélice α pour inhiber les IPP. Au cours de cette thèse, nous nous sommes d’abord intéressés à la conception de foldamères d’oligourée et de chimères oligoamide/oligourée pour cibler des surfaces de protéine. Nous avons sélectionné le récepteur nucléaire de la vitamine D (VDR) comme modèle d’étude en raison de son intérêt thérapeutique, et des connaissances structurales disponibles. Les protéines partenaires de VDR (coactivateurs) interagissant via une courte région structurée en hélice α, nos recherches ont portés sur des mimes d’hélices inspirés des séquences de coactivateurs. Dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés à la génération et à l’étude de dimères covalents de foldamères, qui pourraient être utilisés pour couvrir des surfaces d’interaction plus larges. En effet, les interactions protéine-protéine montrent souvent un mode d’interaction plus complexe qu’une simple hélice, faisant intervenir des structures tertiaires et quaternaires de type coiled coils, qui peuvent aussi servir de point de départ pour la conception de nouvelles classes d’inhibiteurs.

In the crowded cell, proteins interact with their functional partners, but also with a large number of non-functional partners that compete with the functional ones. The goal of this thesis is to characterize the physical properties and the evolution of protein surfaces in order to understand how selection pressure exerts on proteins, shaping their interactions and regulating this severe competition.To do this I developed a framework based on docking calculations to characterize the propensity of protein surfaces to interact with other proteins. Molecular cartography enables the visualization and the comparison of surface properties of proteins. I implemented a new theoretical framework based on the representation of interaction energy landscapes by 2-D energy maps. These maps reflect in a synthetic manner the propensity of the surface of proteins to interact with other proteins. These maps are useful from a practical point view for determining the regions of protein’s surface that are more prone to interact with other proteins. Our new theoretical framework enabled to show that the surface of proteins harbor regions with different levels of propensity to interact with other proteins (hot regions, intermediate and cold regions to favorable, intermediate and unfavorable regions respectively).A large part of this thesis work consisted in characterizing the physico-chemical properties and the evolution of these regions. The other part of this thesis work consisted in applying this methodology on several study systems: homomeric complexes, cytosolic proteins from S. cerevisiae, families of interologs. This work opens the way to numerous practical applications in structural bioinformatics, such as binding site prediction, functional annotation and the design of new interactions.To conclude, the strategy implemented in this work enable the exploration of the propensity of a protein to interact with hundred of protein partners. It thus enables the investigation of the behavior of a protein in a crowded environment. This application goes beyond the classical use of protein docking as a, because our strategy provides a systemic point of view of protein interactions at an atomic resolution.; Dans la cellule, les protéines évoluent dans un environnement très dense et interagissent ainsi avec un grand nombre de partenaires spécifiques et non-spécifiques qui entrent en compétition. L’objectif de ma thèse est de caractériser les propriétés physiques et évolutives des surfaces protéiques pour comprendre comment la pression de sélection s’exerce sur les protéines, façonnant leurs interactions et régulant ainsi cette sévère compétition.Pour cela, j’ai développé une méthodologie permettant de caractériser la propension des protéines à interagir avec les protéines de leur environnement, par des approches de docking. La cartographie moléculaire permettant la visualisation et la comparaison des propriétés de la surface des protéines, j’ai donc mis en place un nouveau cadre théorique basé sur une représentation des paysages énergétiques d'interaction par des cartes d'énergies. Ces cartes (en deux dimensions) reflètent de manière synthétique la propension des surfaces protéiques à engager des interactions avec d’autres protéines. Elles sont donc d’un grand intérêt pratique pour déterminer les régions des surfaces protéiques les plus enclines à engager des interactions avec d’autres molécules.Ce nouveau cadre théorique a permis de montrer que les surfaces des protéines comprennent des régions de différents niveaux d'énergies de liaison (régions chaudes, intermédiaires et froides pour les régions d'interaction favorables, intermédiaires et défavorables respectivement).Une partie importante de la thèse a consisté à caractériser les propriétés physico-chimiques et évolutives de ces différentes régions. L'autre partie a consisté à appliquer cette méthode sur plusieurs systèmes : complexes homomériques, protéines du cytosol de S. cerevisiae, familles d'interologues. Ce travail ouvre la voie à un grand nombre d'applications en bioinformatique structurale, telles que la prédiction de sites de liaison, l’annotation fonctionnelle ou encore le design de nouvelles interactions.En conclusion, la stratégie mise en place lors de ma thèse permet d’explorer la propension d’une protéine à interagir avec des centaines de partenaires d'intérêts, et donc d'investiguer le comportement d’une protéine dans un environnement cellulaire spécifique. Cela va donc au-delà de l'utilisation classique du docking "binaire" puisque notre stratégie fournit une vision systémique des interactions protéiques à l’échelle des "résidus".

UHRF1 is a nuclear protein maintaining and regulating the epigenome of cells. Its promotes proliferation and is found upregulated in most of cancers. TIP60 is one of the important interacting partner of UHRF1 and is involved in chromatin remodeling and transcriptional regulation through its acetyltransferase activity. Together they regulate the stability and activity of other proteins such as DNMT1 and p53. The aim of this thesis was to explore the mechanism of interaction between UHRF1 and TIP60 by visualizing this interaction in cells. Fluorescent lifetime imaging microscopy and other molecular biology techniques were employed for this purpose. Results of this study showed that UHRF1 interacts directly to the MYST domain of TIP60 and this interaction prevails in the S-phase of cell cycle. Both proteins also showed a similar response to DNA damage predicting a coherence in their function in DNA repair mechanism. Overexpression of TIP60 also downregulated UHRF1 and DNMT1 and induced apoptosis in cells suggesting a role of TIP60 in regulation of oncogenic functions of UHRF1.; UHRF1 est une protéine nucléaire responsable du maintien et de la régulation de l'épigénome des cellules. Elle favorise la prolifération cellulaire et est surexprimée dans la plupart des cancers. TIP60, l'un des partenaires le plus important d’UHRF1, est impliqué dans le remodelage de la chromatine et la régulation transcriptionnelle grâce à son activité acétyltransférase. Ensemble, les deux protéines régulent la stabilité et l'activité d'autres protéines telles que la DNMT1 et la p53. Le but de cette étude était d'explorer le mécanisme d'interaction entre UHRF1 et TIP60 en visualisant cette interaction dans les cellules. La microscopie par imagerie à temps de vie de fluorescence et d'autres techniques de biologie moléculaire ont été utilisées. Les résultats ont montré que UHRF1 interagit directement avec le domaine MYST de TIP60 et cette interaction se produit dans la phase S du cycle cellulaire. Les deux protéines ont également montré une réponse similaire aux dommages à l'ADN, ce qui prédit une cohérence dans leur fonction dans le mécanisme de réparation de l'ADN. La surexpression de TIP60 a également induit la baisse du niveau d’UHRF1 et de DNMT1 ainsi qu’une induction d'apoptose dans les cellules ce qui suggère un rôle de TIP60 dans la régulation des fonctions oncogéniques d’UHRF1.

The nucleus is an organelle characteristic of eukaryotic cells and its mechanical properties play an essential role in the behavior of the cell, in particular its motility, polarity and survival. It is surrounded by an envelope comprising an inner membrane and an outer membrane, as well as a large number of proteins. These proteins are either anchored at the nuclear membrane, as emerin, or form a filament meshwork lining the inner nuclear membrane, as lamins. My thesis objectives were to understand molecular mechanisms deficient in two types of genetic diseases caused by mutations in inner nuclear envelope proteins: Emery-Dreifuss muscular dystrophy, associated to mutations in emerin and A-type lamins, and progeroid syndromes caused by mutations in A-type lamins. First, we showed that the emerin protein self- assembles in vitro and in cells (Herrada, Samson et al., ACS Chem. Biol., 2015). I then studied the structure of emerin oligomers, determined the minimal protein fragment necessary for the formation of these oligomers, identify residues forming the structural core of these oligomers by solid- state NMR in collaboration with the group of Prof A. Lange (FMP Berlin). And described the impact of emerin mutations causing Emery-Dreifuss muscular dystrophy on emerin self-assembly (Samson et al., Biomol. NMR Assign. 2016, Samson et al., FEBS J. 2017). Then, I observed, mainly using solution-state NMR, that only the self-assembled form of emerin is able to interact with A-type lamin tail, and that mutants causing Emery-Dreifuss muscular dystrophy and unable to self-assemble are also defective in A-type lamin binding. I also obtained preliminary data showing that phosphorylation of emerin by the Src kinase, observed after a mechanical stress in purified nuclei, regulates the interaction between self-assembled emerin and A-type lamins. Finally, I showed that the monomeric form of emerin is able to form a ternary complex with A-type lamin tail through the chromatin-associated protein Barrier-to- Autointegration Factor (BAF). After having measured the protein-protein affinities within this complex, identified the minimal protein fragments involved in the complex and developed a robust protocol for purification of this complex, I was able to obtain crystals under several conditions. Subsequently, I solved the 3D structure of this complex by molecular replacement at a resolution of 2 Å. Finally, I showed that mutations in A-type lamins causing autosomal recessive progeroid syndromes impair interaction with BAF in vitro, and our collaborators at Univ. Paris Diderot, the team of Dr B. Buendia, showed that these same mutations induce a significant decrease in the proximity between lamin A and BAF in HeLa cells. An article with me as a first author is in preparation that reports all these new data., Der Zellkern ist eine charakteristische Organelle einer eukaryotischen Zelle. Seine mechanischen Eigenschaften spielen eine wesentliche Rolle für das Verhalten der Zelle, insbesondere für deren Beweglichkeit, Polarität und Überleben. Es ist von einer Hülle umgeben, die eine innere Membran und eine äußere Membran sowie eine große Anzahl von Proteinen umfasst. Diese Proteine sind entweder an der Kernmembran verankert, als Emerin, oder bilden ein Filamentnetz, das die innere Kernmembran auskleidet, als Lamine. Ziel meiner Doktorarbeit war, molekulare Mechanismen zu verstehen, die bei zwei Arten genetischer Erkrankungen, die durch Mutationen in inneren Kernhüllproteinen verursacht werden, fehlen: Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie, assoziiert mit Mutationen in Emerin- und A-Laminen, und Progeroid-Syndrome durch Mutationen in A- Laminen ein. Zunächst zeigten wir, dass das Emerin-Protein in vitro und in Zellen selbstorganisiert ist (Herada, Samson et al., ACS Chem. Biol., 2015). Ich untersuchte dann die Struktur von Emerin-Oligomeren, bestimmte das minimale Proteinfragment, das für die Bildung dieser Oligomere notwendig ist, identifiziere Reste, die den strukturellen Kern dieser Oligomere bilden, durch Festkörper-NMR in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Prof. A. Lange (FMP Berlin) und beschrieb den Einfluss von Emerin-Mutationen, die Emery-Dreifuss- Muskeldystrophie auf die emerierende Selbstorganisation verursachen (Samson et al., Biomol. NMR Assign. 2016, Samson et al., FEBS J. 2017). Dann beobachtete ich, hauptsächlich unter Verwendung von Lösungs-NMR, dass nur die selbstorganisierte Form von Emerin in der Lage ist, mit dem A-Typ-Lamin- Schwanz zu interagieren, und dass Mutanten, die Emery-Dreifuss- Muskeldystrophie verursachen und nicht in der Lage sind, sich selbst zu assemblieren in A-Laminen. Ich erhielt auch vorläufige Daten, die zeigen, dass die Phosphorylierung von Emerin durch die Src-Kinase, die nach einer mechanischen Belastung in gereinigten Kernen beobachtet wird, die Wechselwirkung zwischen selbstorganisierten Emerin- und A-Typ-Laminen reguliert. Schließlich zeigte ich, dass die monomere Form von Emerin einen ternären Komplex mit dem A-Typ-Lamin-Tail durch das Chromatin-assoziierte Protein Barrier-to-Autointegration Factor (BAF) bilden kann. Nachdem ich die Protein-Protein-Affinitäten in diesem Komplex gemessen, die minimalen Proteinfragmente identifiziert und ein robustes Protokoll für die Reinigung dieses Komplexes entwickelt hatte, konnte ich Kristalle unter verschiedenen Bedingungen erhalten. Anschließend löste ich die 3D-Struktur dieses Komplexes durch molekularen Ersatz mit einer Auflösung von 2 Å. Schließlich zeigte ich, dass Mutationen in A-Laminen, die autosomal-rezessive Progeroid-Syndrome verursachen, die Interaktion mit BAF in vitro beeinträchtigen, und unsere Mitarbeiter von Univ. Paris Diderot, das Team von Dr. B. Buendia, zeigte, dass diese gleichen Mutationen eine signifikante Abnahme der Nähe zwischen Lamin A und BAF in HeLa-Zellen induzieren. Ein Artikel mit mir als Erstautor ist in Vorbereitung, der all diese neuen Daten berichtet.

UHRF1 is a nuclear protein maintaining and regulating the epigenome of cells. Its promotes proliferation and is found upregulated in most of cancers. TIP60 is one of the important interacting partner of UHRF1 and is involved in chromatin remodeling and transcriptional regulation through its acetyltransferase activity. Together they regulate the stability and activity of other proteins such as DNMT1 and p53. The aim of this thesis was to explore the mechanism of interaction between UHRF1 and TIP60 by visualizing this interaction in cells. Fluorescent lifetime imaging microscopy and other molecular biology techniques were employed for this purpose. Results of this study showed that UHRF1 interacts directly to the MYST domain of TIP60 and this interaction prevails in the S-phase of cell cycle. Both proteins also showed a similar response to DNA damage predicting a coherence in their function in DNA repair mechanism. Overexpression of TIP60 also downregulated UHRF1 and DNMT1 and induced apoptosis in cells suggesting a role of TIP60 in regulation of oncogenic functions of UHRF1., UHRF1 est une protéine nucléaire responsable du maintien et de la régulation de l'épigénome des cellules. Elle favorise la prolifération cellulaire et est surexprimée dans la plupart des cancers. TIP60, l'un des partenaires le plus important d’UHRF1, est impliqué dans le remodelage de la chromatine et la régulation transcriptionnelle grâce à son activité acétyltransférase. Ensemble, les deux protéines régulent la stabilité et l'activité d'autres protéines telles que la DNMT1 et la p53. Le but de cette étude était d'explorer le mécanisme d'interaction entre UHRF1 et TIP60 en visualisant cette interaction dans les cellules. La microscopie par imagerie à temps de vie de fluorescence et d'autres techniques de biologie moléculaire ont été utilisées. Les résultats ont montré que UHRF1 interagit directement avec le domaine MYST de TIP60 et cette interaction se produit dans la phase S du cycle cellulaire. Les deux protéines ont également montré une réponse similaire aux dommages à l'ADN, ce qui prédit une cohérence dans leur fonction dans le mécanisme de réparation de l'ADN. La surexpression de TIP60 a également induit la baisse du niveau d’UHRF1 et de DNMT1 ainsi qu’une induction d'apoptose dans les cellules ce qui suggère un rôle de TIP60 dans la régulation des fonctions oncogéniques d’UHRF1.

Complex and dynamic protein-protein interactions are the core of protein-based networks in cells. At excitatory synapses, the postsynaptic density (PSD) is a typical example of protein-based network whose nanoscale structure and composition determines the cellular function. For instance, the dynamic regulation of PSD composition and glutamate receptors movements into or out of the PSD are the base of current molecular theories of learning and memory. In this context, during my PhD, I focused on a class of protein-protein interactions mediated by PDZ domains. Indeed, over the last decade, numerous studies have shown the critical implication of PDZ domain-mediated interactions from the PSD95 scaffolding protein family in the synaptic targeting and anchoring of glutamate receptors. However, in part due to the lack of adapted tools, the molecular mechanisms that dynamically govern their respective synaptic retention remain poorly understood. In order to investigate these PDZ domain-mediated interactions, I developed several selection strategies by phage-display based on the fibronectin type III (FN3) scaffold in order to either target the PDZ domain-binding motifs of the receptors complexes (e.g., stargazin for AMPARs and GluN2A for NMDARs) or the PDZ domains themselves. Using a multidisciplinary approach, my main objectives were to engineer small synthetic antibodies that will allow us to acutely and specifically disrupt or stabilize these protein complexes, as well as monitor endogenous interactions.; Les interactions protéine-protéine (IPPs), complexes et dynamiques, sont le cœur des réseaux protéiques cellulaires. Au niveau des synapses excitatrices, la densité post-synaptique (PSD) est un exemple typique de réseau protéique dont la structure et la composition à l’échelle nanoscopique détermine la fonction cellulaire. Ainsi, la régulation dynamique de la composition de la PSD et des mouvements des récepteurs au glutamate dans ou hors de la PSD constitue la base des théories moléculaires actuelles sur l’apprentissage et la mémoire. Dans ce contexte, durant ma thèse, j’ai étudié une classe d’IPPs faisant intervenir les domaines PDZ. En effet, durant ces dernières années, de nombreuses études ont démontré l’implication de ces interactions impliquant les domaines PDZ de la famille de PSD95 dans le ciblage synaptique et l’ancrage des récepteurs au glutamate. Cependant, en partie dû au manque d’outils adaptés, les mécanismes moléculaires sous-jacents qui contrôlent de façon dynamique leur rétention à la synapse restent mal compris. Dans le but d’étudier ces interactions impliquant des domaines PDZ, j’ai développé plusieurs stratégies de sélection par phage display basées sur l’utilisation du dixième domaine de type III de la fibronectine humaine (10Fn3) dans le but de cibler les motifs d’interaction aux domaines PDZ des récepteurs (Stargazin pour les rAMPA et GluN2A pour les rNMDA) ou les domaines PDZ eux-mêmes. En utilisant une approche multidisciplinaire, mes objectifs principaux ont été de concevoir de petits anticorps synthétiques qui nous permettront de rompre ou de stabiliser spécifiquement ces complexes protéiques, ainsi que d’observer les interactions endogènes.

The development of new therapeutics against bacterial infections has aroused great interest over the last years in the context of drug resistance. The starting-point in the pursuit of new antibiotics for which bacterial resistance mechanisms do not exist is the identification of novel cellular targets. Genetics studies in the early 2000s have identified engA as a conserved bacterial gene whose product is a GTPase that could represent a potential drug target: it is conserved among bacteria, essential for cell survival, and absent in humans.Since EngA acts as an assembly factor for the bacterial ribosome, one of our aims was to develop an assay to screen inhibitors of the EngA-ribosome interactions. These interactions are modulated by EngA conformational changes that are in turn triggered by the binding of different nucleotides to the catalytic G-domain. As the interplay between all these events in bacteria is still not resolved, we have used a multi-technique approach to explore these questions in order to obtain useful information for the setting up of a robust screening assay.SAXS and limited proteolysis showed a conformational change occurring in solution upon addition of either di- or tri-phosphate nucleotides. While model validation analysis confirmed the GDP-bound conformation, the GTP-bound state does not match any known EngA structure. Binding studies have revealed modulation of interactions by different nucleotide-bound states. Furthermore, response to nucleotides occurs at high concentrations, suggesting that the role of EngA in promoting ribosome assembly could be monitored by the intracellular nucleotide concentration. Efforts on identifying the GTP-bound state 3D structure by crystallography have resulted in EngA structures in different crystal forms. Although all the obtained structures represent the GDP-bound state, packing analysis has revealed conserved crystal contacts that can potentially stabilise this conformation during nucleation. Specific mutations aiming at disrupting these contacts may help to promote crystallisation of alternative conformations. Cryo-EM investigation has been initiated in order to obtain the structure of the B. subtilis EngA:50S complex. So far, an electron density map at 6.4 Å resolution has been obtained and its interpretation is underway., Au cours des dernières années, le développement de nouvelles thérapies contre les infections bactériennes a suscité un grand intérêt face à l’émergence des nombreuses souches résistantes aux antibiotiques. Le point de départ de cette recherche de nouveaux antibiotiques, pour lesquels les bactéries n’ont pas encore acquis de mécanismes de résistance, est l’identification de nouvelles cibles cellulaires. En 2000, des études génétiques ont identifié engA, un gène bactérien dont le produit est une GTPase, comme une cible pharmacologique pertinente: elle est essentielle à la survie cellulaire, conservée au sein des bactéries et absente chez les eucaryotes.Puisque EngA agit comme un facteur d’assemblage pour le ribosome bactérien, un de nos objectifs a été de développer un test de criblage pour identifier des inhibiteurs des interactions EngA-ribosome. Ces interactions sont modulées par des changements conformationnels d'EngA, qui sont eux-mêmes déclenchés par la fixation de différents nucléotides dans le domaine catalytique. Cependant, les liens entre ces différents changements restent encore méconnus. Nous avons utilisé une approche multi-technique pour étudier ces questions et obtenir des informations utiles pour l’optimisation de notre test de criblage.Des analyses de SAXS et protéolyse limitée ont démontré un changement conformationnel en solution après adition de nucléotides di- ou tri-phosphate. La comparaison des données avec des modèles cristallographiques d'EngA a confirmé la conformation de la protéine liée au GDP. Cependant, la conformation de la protéine liée au GTP ne correspond à aucune structure connue. Des essais d’interaction ont démontré que la fixation de différents nucléotides au niveau des domaines catalytiques régule l’interaction d'EngA avec le ribosome. En outre, les effets des nucléotides se produisent en utilisant des fortes concentrations, ce qui suggère que le rôle d'EngA dans la biogenèse du ribosome peut être contrôlé par la concentration intracellulaire de nucléotides. Les travaux visant la détermination de la structure d'EngA dans sa conformation liée au GTP par cristallographie nous ont permis d’obtenir la structure d’EngA dans différentes formes cristallines. Cependant, ces structures représentent la conformation liée au GDP. L’analyse de l’empilement des cristaux a montré des contacts intermoléculaires conservés qui peuvent stabiliser cette conformation pendant la nucléation. Des mutations spécifiques permettant la rupture de ces contacts peuvent éventuellement aider à promouvoir la cristallisation de conformations alternatives. Des analyses de cryo-microscopie électronique ont débuté afin d’obtenir la structure du complexe EngA:50S de chez B. subtilis. Des résultats préliminaires montrent une carte de densité électronique à 6.4 Å de résolution. L’interprétation de ces résultats est en cours.

Les systèmes bactériens de sécrétion de type IV (T4SS) sont constitués d’un ensemble de 8 à 12 protéines conservées. Ces dernières sont utilisées lors de la translocation de protéines, la translocation de complexes ADN-protéines mais aussi pour le transport de ces derniers au travers de la membrane cellulaire. Les T4SS, en tant que facteurs de virulence pour beaucoup de pathogènes comme Brucella suis, sont donc d’excellents modèles cibles pour le développement de médicaments d’antivirulence. Ces médicaments, en privant le pathogène de son facteur essentiel de virulence : le T4SS, constituent une alternative ou encore une amélioration des traitements antibiotiques utilisés actuellement. VirB8, un facteur d’assemblage conservé dans le T4SS, forme des dimères qui sont importants pour la fonction des T4SS dans ces pathogènes. De par ses interactions multiples, VirB8 est un excellent modèle pour l’analyse des facteurs d’assemblage mais aussi en tant que cible de médicaments qui empêcheraient son interaction avec d’autres protéines et qui, in fine, désarmeraient les bactéries en les privant de leur fonctions essentielles de virulence. À ce jour, nous savons qu’il existe un équilibre monomère-dimère et un processus d’homodimerization de VirB8 dont l’importance est vitale pour la fonctionnement biologique des T4SSs. En se basant sur des essais quantitatifs d’interaction, nous avons identifié (i) des sites potentiels d’interaction avec d’autres protéines VirB du T4SS mais aussi (ii) isolé des petites molécules inhibitrices afin de tester la fonction protéique de VirB8. Afin de déterminer les acides aminés importants pour l’hétérodimérization de VirB8 avec VirB10, nous avons effectué des expériences de mutagenèse aléatoire, de phage display et d’arrimage moléculaire in silico. Ces expériences ont démontré l’importance de trois acides aminés localisés sur le feuillet β : R160, S162, T164 et I165. Ces derniers seraient importants pour l’association de VirB8 avec VirB10 étant donné que leur mutagenèse entraine une diminution de la formation du complexe VirB8-VirB10. L’objectif actuel de notre projet de recherche est de pouvoir mieux comprendre mais aussi d’évaluer le rôle de VirB8 dans l’assemblage du T4SS. Grace à un méthode de criblage adaptée à partir de la structure de VirB8, nous avons pu identifié une petite molécule inhibitrice BAR-068, qui aurait un rôle prometteur dans l’inhibition du T4SS. Nous avons utilisé la spectroscopie par fluorescence, l’essai à deux hybrides, le cross-linking et la cristallographie afin de déterminer le mécanisme d'interaction existant entre VirB8 et BAR-068. Ces travaux pourraient permettre de nombreuses avancées, notamment en termes de compréhension des mécanismes d’inhibition du T4SS. Notre objectif ultime est de pouvoir caractériser la séquence d’évènements essentiels à l’assemblage et au fonctionnement du T4SS. De manière globale, notre projet de recherche permettrait de révéler les grands principes d’assemblage des protéines membranaires, les processus de sécrétion de protéines chez les bactéries mais aussi de proposer une nouvelle stratégie lors du développement de drogues antimicrobiennes., Bacterial Type IV secretion systems (T4SSs) are complexes that are constituted of 8 to 12 conserved proteins and used by many Gram-negative bacteria for the translocation of proteins and DNA-protein complexes as well as for the transport of DNA-protein complexes across their cell envelope. T4SS are excellent model targets for the development of antivirulence drugs as they are essential virulence factor for many bacterial pathogens, such as Brucella suis. Antivirulence drugs that deprive the pathogen of its essential virulence factor, the T4SS, would constitute alternatives to or enhancements of current antibiotic treatment. VirB8, a conserved core assembly factor in T4SS, forms homo- and heterodimers that are very important for T4SS function in these pathogens. Due to its multiple interactions, we hypothesized that VirB8 is an excellent model for the analysis of assembly factors but also a potential target for drugs that could target its protein–protein interactions, which would disarm bacteria by depriving them of their essential virulence functions. The existence of a monomer-dimer equilibrium and self-association of VirB8 were previously demonstrated as being essential for T4SS biological activity. Guided by quantitative interaction assays, we here identified (i) potential interaction sites with other T4SS components and (ii) isolated small molecules inhibitors as probes for protein function. To further determine the residues important for heterodimerization of VirB8 with VirB10, we conducted alanine-scanning mutagenesis, phage display and in silico docking. These experiments demonstrated that residues located on the β sheet R160, S162, T164 and I165. are involved in the association of VirB8 and VirB10 and mutagenesis of these residues led to a decrease in the heterodimer formation. The general objective of our research is to gain quantitative insights into the role VirB8 plays in T4SS assembly. Based on a structure-inspired high-throughput screening approach, we identified a promising compound BAR-068 that inhibits VirB8 interactions in the nM range. We used spectroscopy by fluorescence, a bacterial two-hybrid assay, chemical cross-linking and crystallography in order to decipher the mechanism of interactions of this inhibitor with VirB8. Ultimately, this may lead to advance the understanding of T4SS inhibition. Our ultimate objective is to characterize the sequence of events between VirB8 and other VirB factors that guides T4SS complex assembly and function. Our research will reveal general principles of membrane protein complex assembly that will enhance our knowledge of a number of different areas including bacterial protein secretion. In addition, this research will inform an innovative strategy for the development of novel antimicrobial drugs.

The phagocyte NADPH oxidase (NOX2) is a key enzyme of the immune system generating superoxide anions, which are precursors for other reactive oxygen species. Any dysfunctions of NOX2 are associated with a plethora of diseases and thus detailed knowledge about its regulation is needed. This oxidase is composed of five subunits, the membrane-bound gp91phox and p22phox and the cytosolic p47phox, p67phox, and p40phox. The latter are assumed to be in a ternary complex that translocates together with the small GTPase Rac to the membranous subunits during activation.Our aim was to discover and to characterize specific interactions of the cytosolic subunits of NOX2 in live cells using a Förster Resonance Energy Transfer (FRET) based approach: Since FRET depends on the distance between two fluorophores, it can be used to reveal protein-protein interactions non-invasively by studying fluorescent protein tagged subunits. To have a rapid method on hand to reveal specific interactions, a flow cytometer based FRET approach was developed. For more detailed studies, FRET was measured by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), because it allows a direct determination of the apparent and molecular FRET efficiency, which contains both qualitative and quantitative information about the interaction and the structure of the interacting proteins. Furthermore, the FRET-FLIM approach enables an estimation of the fraction of bound donor. This information itself is important for a better understanding of the organisation and regulation of the NOX2, but it is also necessary for the calculation of the dissociation constant Kd from the FRET-FLIM data. To confirm the findings obtained by FRET-FLIM fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) experiments were performed. This completely independent method is not based on distances like FRET but on the observation of the co diffusion of the fluorescently labelled samples when they move across a small observation volume inside the cells.The FRET-FLIM approach allowed us in a first step to discover heterodimeric interactions between all cytosolic subunits in live cells. Due to the good precision of the results, we were able to extract structural information about the interactions and to compare them with available structural data obtained from in vitro studies. The information from FRET-FLIM was coherent with in vitro data. We then aligned the available structures leading to the first 3D model of the cytosolic complex of the NADPH oxidase in the resting state in live cells.Additionally, the bound fraction for all heterodimeric interactions derived by FRET-FLIM is around 20 %, which is in contrast to the general belief that all cytosolic subunits are bound in complex. The first FCCS results support our findings. Therefore, we believe that the complexation of the cytosolic subunits could be involved in the regulation of the NADPH oxidase and should be investigated further. The estimated Kd derived from the FRET-FLIM approach is in the low micomolar range, which is an order of a magnitude higher than the nanomolar range of in vitro studies.In conclusion, we showed that our quantitative FRET-FLIM approach is not only able to distinguish between specific and unspecific protein-protein interactions, but gives also information about the structural organisation of the interacting proteins. The high precision of the FRET-FLIM data allow the determination of the bound fraction and an estimation of the Kd in live cells. FCCS is a complementary method, which can verify these quantitative findings. However, it cannot replace FRET-FLIM completely as it does not give any structural information.With respect to the biological outcome of this project, we can propose for the first time a 3D-model of the cytosolic complex of the NADPH oxidase covering the in vitro as well as the live cell situation. Additionally, the small bound fraction found here may raise new ideas on the regulation of this vital enzyme.; La NADPH oxydase des phagocytes (NOX2) est responsable de la production d’anions superoxydes qui sont les précurseurs des autres formes réactives de l’oxygène. NOX2 est une enzyme majeure de la réponse immunitaire. Les dysfonctionnements de NOX2 sont associés à de nombreuses pathologies et donc il convient d’en comprendre les détails de la régulation. Cette oxydase est composée de cinq sous-unités : deux protéines membranaires, gp91phox et p22phox et 3 protéines cytosoliques p47phox, p67phox et p40phox. D’après les études in vitro avec des protéines purifiées, les protéines cytosoliques sont supposées former un complexe ternaire qui se déplace à la membrane avec une petite protéine G, Rac, au moment l’activation.L’objectif de ce projet est de caractériser les interactions spécifiques entre les sous-unités cytosoliques de NOX2 en cellules vivantes en utilisant le phénomène de transfert résonant d’énergie de type Förster (FRET) entre deux fluorophores, un donneur et un accepteur. Ici les fluorophores seront des protéines fluorescentes de la famille de la GFP. Elles sont fusionnées à deux sous-unités. L’efficacité du FRET dépend de la distance entre les fluorophores et permet ainsi de caractériser les interactions entre les protéines d’intérêt. Une méthode rapide d’identification des situations où le FRET est positif a été mise au point par cytométrie en flux. Des études détaillées et quantitatives ont ensuite été réalisées en utilisant l’imagerie de durée de fluorescence (FLIM) du donneur. Le FLIM, combiné à l’utilisation de donneurs présentant une durée de vie mono-exponentielle, permet de déterminer directement des efficacités de FRET apparentes et moléculaires, qui contiennent, toutes les deux, des informations qualitatives et quantitatives sur l’interaction et la structure des protéines impliquées. De ces données, il est possible d’extraire la fraction des donneurs interagissant avec un accepteur. Les informations obtenues à partir des données de FRET-FLIM permettent une meilleure compréhension de l’organisation et de la régulation de NOX2 tout en permettant une estimation des constantes de dissociation (Kd). Afin de confirmer ces résultats, des expériences de spectroscopie de corrélation de fluorescence à deux couleurs (FCCS) ont été réalisées. Cette méthode complétement indépendante n’est pas basée sur la distance entre fluorophores comme le FRET mais sur leur co-diffusion à travers un petit volume d’observation dans le cytoplasme cellulaire.L’approche FRET-FLIM nous a tout d’abord permis d’observer les interactions entre hétéro-dimères formés de deux sous-unites différentes en cellules vivantes et d’exclure la formation d’homo-dimères entre deux sous-unités identiques. Etant donné la bonne précision des mesures de FLIM, nous avons pu comparer les informations structurales obtenues en cellules avec les données structurales issues d’études sur les protéines purifiées in vitro et nous avons constaté qu’elles sont en bon accord. Nous avons ensuite aligné les structures disponibles pour proposer un premier modèle 3D du complexe cytosolique de la NADPH oxydase au repos dans le cytosol cellulaire.Les fractions de protéines en interaction sont pour tous les hétéro-dimères autour de 20% ce qui n’est pas en accord avec l’hypothèse courante qui propose que toutes les sous-unités cytosoliques soient sous forme de complexe. Toutefois nos premiers résultats de FCCS confirment ce résultat extrait des données de FRET-FLIM. Nous proposons donc que la complexation des sous-unités cytosolique pourrait être impliquée dans la régulation de la NADPH oxydase. Des études complémentaires seront nécessaires pour valider cette nouvelle hypothèse. Les constantes de dissociation Kd estimées à partir de nos résultats sont micromolaires et donc un ordre de grandeur plus élevé que les valeurs nanomolaires déterminées in vitro. Des mesures plus détaillées de FCCS pourront compléter et valider ces résultats.

Complex and dynamic protein-protein interactions are the core of protein-based networks in cells. At excitatory synapses, the postsynaptic density (PSD) is a typical example of protein-based network whose nanoscale structure and composition determines the cellular function. For instance, the dynamic regulation of PSD composition and glutamate receptors movements into or out of the PSD are the base of current molecular theories of learning and memory. In this context, during my PhD, I focused on a class of protein-protein interactions mediated by PDZ domains. Indeed, over the last decade, numerous studies have shown the critical implication of PDZ domain-mediated interactions from the PSD95 scaffolding protein family in the synaptic targeting and anchoring of glutamate receptors. However, in part due to the lack of adapted tools, the molecular mechanisms that dynamically govern their respective synaptic retention remain poorly understood. In order to investigate these PDZ domain-mediated interactions, I developed several selection strategies by phage-display based on the fibronectin type III (FN3) scaffold in order to either target the PDZ domain-binding motifs of the receptors complexes (e.g., stargazin for AMPARs and GluN2A for NMDARs) or the PDZ domains themselves. Using a multidisciplinary approach, my main objectives were to engineer small synthetic antibodies that will allow us to acutely and specifically disrupt or stabilize these protein complexes, as well as monitor endogenous interactions., Les interactions protéine-protéine (IPPs), complexes et dynamiques, sont le cœur des réseaux protéiques cellulaires. Au niveau des synapses excitatrices, la densité post-synaptique (PSD) est un exemple typique de réseau protéique dont la structure et la composition à l’échelle nanoscopique détermine la fonction cellulaire. Ainsi, la régulation dynamique de la composition de la PSD et des mouvements des récepteurs au glutamate dans ou hors de la PSD constitue la base des théories moléculaires actuelles sur l’apprentissage et la mémoire. Dans ce contexte, durant ma thèse, j’ai étudié une classe d’IPPs faisant intervenir les domaines PDZ. En effet, durant ces dernières années, de nombreuses études ont démontré l’implication de ces interactions impliquant les domaines PDZ de la famille de PSD95 dans le ciblage synaptique et l’ancrage des récepteurs au glutamate. Cependant, en partie dû au manque d’outils adaptés, les mécanismes moléculaires sous-jacents qui contrôlent de façon dynamique leur rétention à la synapse restent mal compris. Dans le but d’étudier ces interactions impliquant des domaines PDZ, j’ai développé plusieurs stratégies de sélection par phage display basées sur l’utilisation du dixième domaine de type III de la fibronectine humaine (10Fn3) dans le but de cibler les motifs d’interaction aux domaines PDZ des récepteurs (Stargazin pour les rAMPA et GluN2A pour les rNMDA) ou les domaines PDZ eux-mêmes. En utilisant une approche multidisciplinaire, mes objectifs principaux ont été de concevoir de petits anticorps synthétiques qui nous permettront de rompre ou de stabiliser spécifiquement ces complexes protéiques, ainsi que d’observer les interactions endogènes.

Kinetic monitoring of protein-protein interactions offers fundamental insights of their cellular functions and is a vital key for the improvement of diagnostic tests as well as the discovery of novel therapeutic drugs. Surface plasmon resonance (SPR) is an established biosensor technology routinely used for kinetic studies of biomolecular interactions. While SPR offers the benefits of real-time and label-free detection, it requires expensive and sophisticated optical apparatus and highly trained personnel, thus limiting the accessibility of standard laboratories. In this PhD project, we have developed an alternative and cost-effective biosensor platform exploiting biofunctionalized nanofluidic slits, or nanoslits, combined with a bench-top fluorescence microscope. Our approach enables the visualization of protein interactions in real-time with the possibility to determine associated kinetic parameters along with optimized response times and enhanced binding efficiency. We have demonstrated the effectiveness of our devices through kinetic studies of two representative protein-receptor pairs with different binding affinities: streptavidin-biotin and mouse IgG/anti-mouse IgG interactions. Good agreement of extracted kinetic parameters between our device, SPR measurements and literature values indicated that this approach could be readily applicable to study kinetics of protein interactions with sensitivity down to 1 pM on a large scale of dissociation constants. In addition, we have incorporated a microfluidic gradient generator to our validated nanoslit device, which has allowed one-shot parallel kinetic measurements to be realized in a single-experiment. This integrated system provides advantages of diminished material consumption and analysis time over the conventional kinetic assays. We believe that this innovative technology will drive future advancements not only in the discipline of biomedical and personalized medicine, but also in basic chemical/biological research.; L'analyse cinétique d'interactions de protéines offre une multitude d'informations sur les fonctions physiologiques de ces molécules au sein de l'activité cellulaire, et peut donc contribuer à l'amélioration des diagnostics médicaux ainsi qu'à la découverte de nouveaux traitements thérapeutiques. La résonance plasmonique de surface (SPR) est la technique de biodétection optique de référence pour les études cinétiques d'interaction de molécules biologiques. Si la SPR offre une détection en temps réel et sans marquage, elle nécessite en revanche des équipements coûteux et sophistiqués ainsi que du personnel qualifié, limitant ainsi son utilisation au sein de laboratoires de recherche académiques. Dans ces travaux de thèse, nous avons développé une plateforme de biodétection basée sur l'utilisation de nanofentes biofonctionnalisées combinées avec une détection par microscopie à fluorescence. Ce système permet l'observation en temps réel d'interactions protéines-protéines et la détermination des constantes cinétiques associées, avec des temps de réponse optimisés et une excellente efficacité de capture. La fonctionnalité du système a été démontrée par l'étude des cinétiques d'interaction de deux couples modèles de différentes affinités : le couple streptavidine/biotine et le couple IgG de souris/anti-IgG de souris. Une très bonne cohérence entre les constantes cinétiques extraites, celles obtenues par des expériences similaires réalisées en SPR et les valeurs rapportées dans la littérature montre que notre approche pourrait être facilement applicable pour l'étude cinétique d'interactions de protéines avec une sensibilité allant jusqu'au pM, sur une large gamme de constantes de dissociation. De plus, nous avons intégré un générateur de gradient de concentrations microfluidique en amont de nos nanofentes, permettant ainsi des mesures simultanées de cinétiques d'interactions à différentes concentrations d'analyte en une seule expérience. Ce système intégré offre de nombreux avantages, tels qu'une réduction de la consommation des réactifs et des temps d'analyse par rapport aux approches séquentielles classiques. Cette technologie innovante pourrait ainsi être un outil précieux non seulement pour les domaines du biomédical et de la médecine personnalisée mais aussi pour la recherche fondamentale en chimie et biologie.

Molecular docking is a method that predicts orientation of one molecule with respect to another one when forming a complex. The first computational method of molecular docking was applied to find new candidates against HIV-1 protease in 1990. Since then, using of docking pipelines has become a standard practice in drug discovery. Typically, a docking protocol comprises different phases. The exhaustive sampling of the binding site upon rigid-body approximation of the docking subunits is required. Clustering algorithms are used to group similar binding candidates. Refinement methods are applied to take into account flexibility of the molecular complex and to eliminate possible docking artefacts. Finally, scoring algorithms are employed to select the best binding candidates. The current thesis presents novel algorithms of docking protocols that facilitate structure prediction of protein complexes, which belong to one of the most important target classes in the structure-based drug design. First, DockTrina - a new algorithm to predict conformations of triangular protein trimers (i.e. trimers with pair-wise contacts between all three pairs of proteins) is presented. The method takes as input pair-wise contact predictions from a rigid-body docking program. It then scans and scores all possible combinations of pairs of monomers using a very fast root mean square deviation (RMSD) test. Being fast and efficient, DockTrina outperforms state-of-the-art computational methods dedicated to predict structure of protein oligomers on the collected benchmark of protein trimers. Second, RigidRMSD - a C++ library that in constant time computes RMSDs between molecular poses corresponding to rigid-body transformations is presented. The library is practically useful for clustering docking poses, resulting in ten times speed up compared to standard RMSD-based clustering algorithms. Third, KSENIA - a novel knowledge-based scoring function for protein-protein interactions is developed. The problem of scoring function reconstruction is formulated and solved as a convex optimization problem. As a result, KSENIA is a smooth function and, thus, is suitable for the gradient-base refinement of molecular structures. Remarkably, it is shown that native interfaces of protein complexes provide sufficient information to reconstruct a well-discriminative scoring function. Fourth, CARBON - a new algorithm for the rigid-body refinement of docking candidates is proposed. The rigid-body optimization problem is viewed as the calculation of quasi-static trajectories of rigid bodies influenced by the energy function. To circumvent the typical problem of incorrect stepsizes for rotation and translation movements of molecular complexes, the concept of controlled advancement is introduced. CARBON works well both in combination with a classical force-field and a knowledge-based scoring function. CARBON is also suitable for refinement of molecular complexes with moderate and large steric clashes between its subunits. Finally, a novel method to evaluate prediction capability of scoring functions is introduced. It allows to rigorously assess the performance of the scoring function of interest on benchmarks of molecular complexes. The method manipulates with the score distributions rather than with scores of particular conformations, which makes it advantageous compared to the standard hit-rate criteria. The methods described in the thesis are tested and validated on various protein-protein benchmarks. The implemented algorithms are successfully used in the CAPRI contest for structure prediction of protein-protein complexes. The developed methodology can be easily adapted to the recognition of other types of molecular interactions, involving ligands, polysaccharides, RNAs, etc. The C++ versions of the presented algorithms will be made available as SAMSON Elements for the SAMSON software platform at http://www.samson-connect.net or at http://nano-d.inrialpes.fr/software.; Le docking moléculaire est une méthode permettant de prédire l'orientation d'une molécule donnée relativement à une autre lorsque celles-ci forment un complexe. Le premier algorithme de docking moléculaire a vu jour en 1990 afin de trouver de nouveaux candidats face à la protéase du VIH-1. Depuis, l'utilisation de protocoles de docking est devenue une pratique standard dans le domaine de la conception de nouveaux médicaments. Typiquement, un protocole de docking comporte plusieurs phases. Il requiert l'échantillonnage exhaustif du site d'interaction où les éléments impliqués sont considérées rigides. Des algorithmes de clustering sont utilisés afin de regrouper les candidats à l'appariement similaires. Des méthodes d'affinage sont appliquées pour prendre en compte la flexibilité au sein complexe moléculaire et afin d'éliminer de possibles artefacts de docking. Enfin, des algorithmes d'évaluation sont utilisés pour sélectionner les meilleurs candidats pour le docking. Cette thèse présente de nouveaux algorithmes de protocoles de docking qui facilitent la prédiction des structures de complexes protéinaires, une des cibles les plus importantes parmi les cibles visées par les méthodes de conception de médicaments. Une première contribution concerne l‘algorithme Docktrina qui permet de prédire les conformations de trimères protéinaires triangulaires. Celui-ci prend en entrée des prédictions de contacts paire-à-paire à partir d'hypothèse de corps rigides. Ensuite toutes les combinaisons possibles de paires de monomères sont évalués à l'aide d'un test de distance RMSD efficace. Cette méthode à la fois rapide et efficace améliore l'état de l'art sur les protéines trimères. Deuxièmement, nous présentons RigidRMSD une librairie C++ qui évalue en temps constant les distances RMSD entre conformations moléculaires correspondant à des transformations rigides. Cette librairie est en pratique utile lors du clustering de positions de docking, conduisant à des temps de calcul améliorés d'un facteur dix, comparé aux temps de calcul des algorithmes standards. Une troisième contribution concerne KSENIA, une fonction d'évaluation à base de connaissance pour l'étude des interactions protéine-protéine. Le problème de la reconstruction de fonction d'évaluation est alors formulé et résolu comme un problème d'optimisation convexe. Quatrièmement, CARBON, un nouvel algorithme pour l'affinage des candidats au docking basés sur des modèles corps-rigides est proposé. Le problème d'optimisation de corps-rigides est vu comme le calcul de trajectoires quasi-statiques de corps rigides influencés par la fonction énergie. CARBON fonctionne aussi bien avec un champ de force classique qu'avec une fonction d'évaluation à base de connaissance. CARBON est aussi utile pour l'affinage de complexes moléculaires qui comportent des clashes stériques modérés à importants. Finalement, une nouvelle méthode permet d'estimer les capacités de prédiction des fonctions d'évaluation. Celle-ci permet d‘évaluer de façon rigoureuse la performance de la fonction d'évaluation concernée sur des benchmarks de complexes moléculaires. La méthode manipule la distribution des scores attribués et non pas directement les scores de conformations particulières, ce qui la rend avantageuse au regard des critères standard basés sur le score le plus élevé. Les méthodes décrites au sein de la thèse sont testées et validées sur différents benchmarks protéines-protéines. Les algorithmes implémentés ont été utilisés avec succès pour la compétition CAPRI concernant la prédiction de complexes protéine-protéine. La méthodologie développée peut facilement être adaptée pour de la reconnaissance d'autres types d'interactions moléculaires impliquant par exemple des ligands, de l'ARN… Les implémentations en C++ des différents algorithmes présentés seront mises à disposition comme SAMSON Elements de la plateforme logicielle SAMSON sur http://www.samson-connect.net ou sur http://nano-d.inrialpes.fr/software.

Molecular docking is a method that predicts orientation of one molecule with respect to another one when forming a complex. The first computational method of molecular docking was applied to find new candidates against HIV-1 protease in 1990. Since then, using of docking pipelines has become a standard practice in drug discovery. Typically, a docking protocol comprises different phases. The exhaustive sampling of the binding site upon rigid-body approximation of the docking subunits is required. Clustering algorithms are used to group similar binding candidates. Refinement methods are applied to take into account flexibility of the molecular complex and to eliminate possible docking artefacts. Finally, scoring algorithms are employed to select the best binding candidates. The current thesis presents novel algorithms of docking protocols that facilitate structure prediction of protein complexes, which belong to one of the most important target classes in the structure-based drug design. First, DockTrina - a new algorithm to predict conformations of triangular protein trimers (i.e. trimers with pair-wise contacts between all three pairs of proteins) is presented. The method takes as input pair-wise contact predictions from a rigid-body docking program. It then scans and scores all possible combinations of pairs of monomers using a very fast root mean square deviation (RMSD) test. Being fast and efficient, DockTrina outperforms state-of-the-art computational methods dedicated to predict structure of protein oligomers on the collected benchmark of protein trimers. Second, RigidRMSD - a C++ library that in constant time computes RMSDs between molecular poses corresponding to rigid-body transformations is presented. The library is practically useful for clustering docking poses, resulting in ten times speed up compared to standard RMSD-based clustering algorithms. Third, KSENIA - a novel knowledge-based scoring function for protein-protein interactions is developed. The problem of scoring function reconstruction is formulated and solved as a convex optimization problem. As a result, KSENIA is a smooth function and, thus, is suitable for the gradient-base refinement of molecular structures. Remarkably, it is shown that native interfaces of protein complexes provide sufficient information to reconstruct a well-discriminative scoring function. Fourth, CARBON - a new algorithm for the rigid-body refinement of docking candidates is proposed. The rigid-body optimization problem is viewed as the calculation of quasi-static trajectories of rigid bodies influenced by the energy function. To circumvent the typical problem of incorrect stepsizes for rotation and translation movements of molecular complexes, the concept of controlled advancement is introduced. CARBON works well both in combination with a classical force-field and a knowledge-based scoring function. CARBON is also suitable for refinement of molecular complexes with moderate and large steric clashes between its subunits. Finally, a novel method to evaluate prediction capability of scoring functions is introduced. It allows to rigorously assess the performance of the scoring function of interest on benchmarks of molecular complexes. The method manipulates with the score distributions rather than with scores of particular conformations, which makes it advantageous compared to the standard hit-rate criteria. The methods described in the thesis are tested and validated on various protein-protein benchmarks. The implemented algorithms are successfully used in the CAPRI contest for structure prediction of protein-protein complexes. The developed methodology can be easily adapted to the recognition of other types of molecular interactions, involving ligands, polysaccharides, RNAs, etc. The C++ versions of the presented algorithms will be made available as SAMSON Elements for the SAMSON software platform at http://www.samson-connect.net or at http://nano-d.inrialpes.fr/software.; Le docking moléculaire est une méthode permettant de prédire l'orientation d'une molécule donnée relativement à une autre lorsque celles-ci forment un complexe. Le premier algorithme de docking moléculaire a vu jour en 1990 afin de trouver de nouveaux candidats face à la protéase du VIH-1. Depuis, l'utilisation de protocoles de docking est devenue une pratique standard dans le domaine de la conception de nouveaux médicaments. Typiquement, un protocole de docking comporte plusieurs phases. Il requiert l'échantillonnage exhaustif du site d'interaction où les éléments impliqués sont considérées rigides. Des algorithmes de clustering sont utilisés afin de regrouper les candidats à l'appariement similaires. Des méthodes d'affinage sont appliquées pour prendre en compte la flexibilité au sein complexe moléculaire et afin d'éliminer de possibles artefacts de docking. Enfin, des algorithmes d'évaluation sont utilisés pour sélectionner les meilleurs candidats pour le docking. Cette thèse présente de nouveaux algorithmes de protocoles de docking qui facilitent la prédiction des structures de complexes protéinaires, une des cibles les plus importantes parmi les cibles visées par les méthodes de conception de médicaments. Une première contribution concerne l‘algorithme Docktrina qui permet de prédire les conformations de trimères protéinaires triangulaires. Celui-ci prend en entrée des prédictions de contacts paire-à-paire à partir d'hypothèse de corps rigides. Ensuite toutes les combinaisons possibles de paires de monomères sont évalués à l'aide d'un test de distance RMSD efficace. Cette méthode à la fois rapide et efficace améliore l'état de l'art sur les protéines trimères. Deuxièmement, nous présentons RigidRMSD une librairie C++ qui évalue en temps constant les distances RMSD entre conformations moléculaires correspondant à des transformations rigides. Cette librairie est en pratique utile lors du clustering de positions de docking, conduisant à des temps de calcul améliorés d'un facteur dix, comparé aux temps de calcul des algorithmes standards. Une troisième contribution concerne KSENIA, une fonction d'évaluation à base de connaissance pour l'étude des interactions protéine-protéine. Le problème de la reconstruction de fonction d'évaluation est alors formulé et résolu comme un problème d'optimisation convexe. Quatrièmement, CARBON, un nouvel algorithme pour l'affinage des candidats au docking basés sur des modèles corps-rigides est proposé. Le problème d'optimisation de corps-rigides est vu comme le calcul de trajectoires quasi-statiques de corps rigides influencés par la fonction énergie. CARBON fonctionne aussi bien avec un champ de force classique qu'avec une fonction d'évaluation à base de connaissance. CARBON est aussi utile pour l'affinage de complexes moléculaires qui comportent des clashes stériques modérés à importants. Finalement, une nouvelle méthode permet d'estimer les capacités de prédiction des fonctions d'évaluation. Celle-ci permet d‘évaluer de façon rigoureuse la performance de la fonction d'évaluation concernée sur des benchmarks de complexes moléculaires. La méthode manipule la distribution des scores attribués et non pas directement les scores de conformations particulières, ce qui la rend avantageuse au regard des critères standard basés sur le score le plus élevé. Les méthodes décrites au sein de la thèse sont testées et validées sur différents benchmarks protéines-protéines. Les algorithmes implémentés ont été utilisés avec succès pour la compétition CAPRI concernant la prédiction de complexes protéine-protéine. La méthodologie développée peut facilement être adaptée pour de la reconnaissance d'autres types d'interactions moléculaires impliquant par exemple des ligands, de l'ARN… Les implémentations en C++ des différents algorithmes présentés seront mises à disposition comme SAMSON Elements de la plateforme logicielle SAMSON sur http://www.samson-connect.net ou sur http://nano-d.inrialpes.fr/software.

Nuclear receptors are members of ligand-inducible factors that regulate the transcription of many genes. Nuclear receptor RevErbα constitutively inhibits the transcription of target genes via the recruitment of the corepressor complex NCor-HDAC3 (Nuclear CoRepressor and Histone DeAcetylase 3). This complex plays an important role in controlling the circadian clock and glucogenesis via regulation of the transcription of the G6Pase (Glucose-6-Phosphatase) and PEPCK (PhosphoEnol Pyruvate Carboxy Kinase) genes, both coding for proteins involved in glucogenesis, which is central to type 2 diabetes. Here we have investigated the interaction of the nuclear receptor RevErbα with two corepressors: its establish partner, NCor and SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid Receptors). Despite literature reports that SMRT and RevErbα do not interact functionally in vivo, we choose to study this interaction because of sequence similarity between the two corepressors, because peptides of both corepressors were reported to interact with other nuclear receptors. To investigate these interactions, we used two complementary fluorescence techniques: In vitro assays based on fluorescence anisotropy and an in cellulo fluorescence microscopy technique called Number & Brightness. In addition to the interactions between the CoRs and the RN, we were interested in determining the effects of several ligands on these interaction. Three ligands were tested: heme, which is reported to be the natural ligand of RevErbα and two synthetic and non-naturals ligands of RevErbα (SGN and SD7). By fluorescence anisotropy (in vitro) we confirmed and quantitated the interaction between purified RevErbα Ligand Binding Domain (LBD) and an NCoR peptide containing the major interaction domains (ID1) for RevErbα and revealed the effect of the three ligands on this interaction. We quantitated as well, the interaction between RevErbα and other peptides from NCor corresponding to the other interaction domains (ID2 and ID3) for it binding to RevErbα. We found a destabilizing effect of heme and SD7 binding to RevErbα on it interaction with NCor in vitro, whereas the ligand SGN enhanced the complex stability. We also confirmed an interaction between RevErbα and a SMRT peptide corepressor in vitro. In order to examine these interactions in a more functionally relevant context using full length proteins, we used 2 photon 2 colors Cross Number and Brightness (N&B), an fluorescence microscopy technique based on fluorescence intensity fluctuations to study specific interactions of full length RevErbα with NCor and SMRT in cellulo as well as the effect of several ligands above mentioned. Under the conditions of our studies, we find that RevErbα and NCor interact strongly in cellulo, and we observed a slight enhancement of this interaction by the SGN ligand. No effect of heme or SD7 was observed on the complex. We show as well for the first time that RevErbα forms complexes with the full length SMRT corepressor in cellulo. Future extensions of these studies could be aimed at identifying ligands that enhance the recruitment of the corepressor complex NCor/HDAC3 by RevErbα, thus leading to a decrease expression of the target genes. Ultimately such a ligand could be of interest in the quest to decrease blood glucose levels in type 2 diabetes.; Les récepteurs nucléaires sont membres d'une famille de protéines activées par des ligands et qui régulent la transcription de nombreux gènes. Le récepteur nucléaire RevErbα est constitutivement inhibiteur de la transcription de gènes cibles via le recrutement du complexe corépresseur NCor-HDAC3 (Nuclear CoRepressor et Histone DeAcetylase 3). Ce complexe joue un rôle important dans le contrôle de l'horloge circadienne et de la glucogenèse via la régulation de la transcription des gènes codant pour les enzymes G6Pase (Glucose-6-Phosphatase) et PEPCK (PhosphoEnol Pyruvate Carboxy Kinase). Ces deux enzymes sont impliquées dans la glucogénèse qui est dérégulée en cas de diabète de type 2. Ce travail est basé sur l'investigation de l'interaction du récepteur nucléaire RevErbα avec deux corépresseurs: son partenaire établit NCor et SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid Receptors). Malgré ce qui est rapporté dans la littérature, c'est à dire que SMRT et RevErbα n'interagissent pas fonctionnellement in vivo, nous avons choisis d'étudier cette interaction à cause de la similarité de séquence entre les deux corépresseurs, mais également parce que les peptides des deux corépresseurs ont été rapportés comme interagissant avec d'autre récepteurs nucléaire. Afin d'étudier ces interactions, nous avons utilisé deux techniques complémentaires basées sur l'émission de fluorescence: Une technique in vitro qui est l'anisotropie de fluorescence et une technique de microscopie de fluorescence in cellulo appelée Number & Brightness. En plus de cette étude de l'interaction entre le récepteur nucléaire et les corépresseurs, nous nous sommes intéressé à déterminer l'effet de plusieurs ligands sur cette interaction. Trois ligands ont été testés: l'hème qui est rapporté comme étant le ligand naturel de RevErbα et deux ligands synthétiques et non naturels de RevErbα (SGN et SD7). Grâce à l'anisotropie de fluorescence (in vitro), nous avons confirmé et quantifié l'interaction entre le domaine de liaison au ligand (LBD) de RevErbα et un peptide NCor contenant le domaine d'interaction majeur (ID1 pour RevErbα et nous avons déterminé l'effet des trois ligands sur cette interaction. Nous avons également quantifié l'interaction entre RevErbα et d'autres peptides provenant de NCor et correspondant aux autres domaines d'interaction (ID2 et ID3) pour sa liaison à RevErbα. Nous avons déterminé que l'hème et le SD7 ont un effet déstabilisateur de la liaison de RevErbα à NCor in vitro, alors que le ligand SGN améliore la stabilité de complexe. Nous avons également confirmé une interaction entre RevErbα et un peptide corépresseur issu de SMRT. Afin d'étudier l'interactions des protéines pleine taille dans un contexte plus fonctionnel, nous avons utilisé le 2 photons-2 couleurs Number & Brightness. C'est une technique de microscopie à fluorescence basée sur la fluctuation de l'intensité de fluorescence pour étudier les interactions spécifiques de RevErbα avec NCor et SMRT pleine taille in cellulo ainsi que l'effet des ligands, précédemment mentionné, sur ces interactions. Dans les conditions choisies pour notre étude, nous avons déterminé que RevErbα interagit fortement avec NCor in cellulo et que cette interaction est améliorée par le ligand SGN. En revanche, l'hème et le SD7 n'ont pas d'effet observable sur ce complexe. Nous avons également montré pour la première fois que RevErbα forme des complexes avec le corépresseur SMRT pleine taille in cellulo. La continuité de ce travail pourrait être ciblée sur l'identification de ligands qui augmenterait le recrutement du complexe corépresseur NCor-HDAC3 sur RevErbα, menant ainsi à la diminution de l'expression des gènes cibles. En définitive, un ligand tel que celui-ci pourrait être d'un grand intérêt dans la recherche de la diminution de glucose dans le sang dans les cas de diabètes de type 2.

Ilf3 and NF90, two double stranded RNA-binding proteins, are generated by exclusive splicing from the ILF3 gene. For each one, a 5? alternative splicing leads to the synthesis of a long and a short isoforms that differ by the presence or not of 13 amino acid sequence at their N-terminus corresponding to a nucleolar localization signal. The characteristic of these two proteins is to exhibit a high degree of heterogeneity with at least 20 isoforms produced from the same gene, 12 for Ilf3 and 8 for NF90. It is generated by two complementary mechanisms, alternative splicing and posttranslational modifications which two have been identified in the laboratory, the arginine 609/622 asymmetric dimethylation present in a RGG consensus sequence and catalyzed by PRMT1 ("protein arginine N-methyltransferase 1") and the serine 190/203 phosphorylation. This polymorphism could explain the various cellular functions described for both proteins and could regulate their subcellular localization and the interaction with protein or nucleic partners. By immunofluorescence and GST pull-down experiments, it was shown that these two posttranslational modifications of Ilf3 and NF90 neither seem involved in their subcellular localization, nor in the regulation of interactions with their protein partners. Because of the many functions associated with Ilf3 and NF90 proteins in the literature, the identified modifications may be implicated in regulating the interactions with their nucleic partners, DNA or RNA., Ilf3 et NF90, deux protéines de liaison aux ARN localement structurés en double-brin, sont générées par épissage mutuellement exclusif à partir du gène ILF3. Pour chacune d’entre-elles, un épissage alternatif permet la synthèse de deux isoformes, une longue et une courte, qui diffèrent par la présence ou non d’une séquence de 13 acides aminés localisée à leur extrémité N-terminale et qui correspond à un signal de localisation nucléolaire. La particularité de ces deux protéines est de présenter une forte hétérogénéité avec au moins 20 isoformes produites à partir du même gène, 12 pour Ilf3 et 8 pour NF90. Elle est générée par deux mécanismes complémentaires, l’épissage alternatif et les modifications post-traductionnelles dont deux ont été mises en évidence au laboratoire, la diméthylation asymétrique de l’arginine 609/622 présente dans une séquence consensus de type RGG et catalysée par PRMT1 (« protein arginine N-methyltransferase 1 ») ainsi qu’une phosphorylation sur la sérine 190/203. Ce polymorphisme pourrait être à l’origine des différences de localisation subcellulaire observées selon l’isoforme considérée et/ou aurait comme fonction de réguler soit leurs interactions avec leurs partenaires protéiques ou nucléiques, soit leur activité biologique. Par des expériences d’immunofluorescence et de « GST pull-down », il a été montré que ces deux modifications post-traductionnelles d’Ilf3 et de NF90 ne semblent impliquées ni dans leur localisation subcellulaire, ni dans la régulation de leurs interactions avec leurs partenaires protéiques. Du fait des nombreuses fonctions associées aux protéines Ilf3 et NF90 dans la littérature, les modifications identifiées pourraient être impliquées dans la régulation de leurs interactions avec leurs partenaires nucléiques, ADN ou ARN.

La réplication et l’assemblage du virus de l’hépatite C (VHC) sont régulés finement dans le temps et l’espace par les interactions protéiques entre le virus avec l’hôte. La compréhension de la biologie du virus ainsi que sa pathogénicité passe par les connaissances relatives aux interactions virus/hôte. Afin d’identifier ces interactions, nous avons exploité une approche d’immunoprécipitation (IP) couplée à une détection par spectrométrie de masse (MS), pour ensuite évaluer le rôle des protéines identifiées dans le cycle viral par une technique de silençage génique. Les protéines virales Core, NS2, NS3/4A, NS4B, NS5A et NS5B ont été exprimées individuellement dans les cellules humaines 293T et immunoprécipitées afin d’isoler des complexes protéiques qui ont été soumis à l’analyse MS. Ainsi, 98 protéines de l’hôte ont été identifiées avec un enrichissement significatif et illustrant une spécificité d’interaction. L’enrichissement de protéines connues dans la littérature a démontré la force de l’approche, ainsi que la validation de 6 nouvelles interactions virus/hôte. Enfin, le rôle de ces interactants sur la réplication virale a été évalué dans un criblage génomique par ARN interférant (ARNi). Deux systèmes rapporteurs de la réplication virale ont été utilisés : le système de réplicon sous-génomique (Huh7-Con1-Fluc) et le système infectieux (J6/JFH-1/p7Rluc2a), ainsi qu’un essai de toxicité cellulaire (Alamar Blue). Parmi les protéines de l’hôte interagissant avec le VHC, 28 protéines ont démontré un effet significatif sans effet de toxicité cellulaire, suggérant fortement un rôle dans la réplication du VHC. Globalement, l’étude a mené à l’identification de nouvelles interactions virus/hôte et l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles., Hepatitis C virus (HCV) replication and assembly are tightly regulated in time and space within the cell, most likely due to protein interactions between virus and host. In order to better understand HCV biology and its pathogenesis, there is a need to unravel virus/host interaction network. We extended our knowledge of virus/host interactions by the identification of cellular proteins associated to HCV proteins using an immunoprecipitation (IP) technique coupled to mass spectrometry (MS), and further evaluate the role of retrieved interactors using gene knockdown. FLAG-tagged viral proteins Core, NS2, NS3/4A, NS4B, NS5A and NS5B have been expressed individually in 293T human cells, and immunoprecipitated protein complexes have been submitted to MS analysis for identification of host proteins. In this study, 98 proteins were significantly enriched and showed specific interaction to a viral protein. Retrieval of previously characterized interacting proteins proved the strength of the method. Six newly identified interactors by MS were individually confirmed using IP of viral proteins. We evaluated the role of identified interactors in HCV replication by performing a functional lentivirus-based RNA interference (RNAi) screen. Two reporter systems were used: the sub- genomic replicon (Huh7-Con1-Fluc) and a full length infectious clone (J6/JFH-1/p7Rluc2a), as well as the cellular toxicity assay Alamar blue. Of the identified host interactors, 28 proteins showed a significant effect on HCV replication upon gene knockdown and without cellular toxicity. Overall, the study led to the identification of novel virus/host interactions essential in HCV life cycle and provides novel potential drug targets.

The aim of this thesis is to develop tools for predicting interactions between proteins that can be applied to the human proteins forming a network with the CFTR protein. This protein, when defective, is involved in cystic fibrosis. The development of in silico prediction methods can be useful for biologists to suggest new interaction targets and to better explain the proteins' functions in the network. We propose a new method to solve the link prediction problem. To benefit from the information of unlabeled data, we place ourselves in the semi-supervised learning framework. Link prediction is addressed as an output kernel learning task, referred as Output Kernel Regression. An output kernel is assumed to encode the proximities of nodes in the target graph and the goal is to approximate this kernel by using appropriate input features. Using the kernel trick in the output space allows one to reduce the problem of learning from pairs to learning a single variable function with output values in a Hilbert space. By choosing candidates for regression functions in a reproducing kernel Hilbert space with operator valued kernels, we develop tools for regularization as for scalar-valued functions. We establish representer theorems in the supervised and semi-supervised cases and use them to define new regression models for different cost functions, called IOKR-ridge and IOKR-margin. We first tested the developed approach on transductive link prediction using artificial data, benchmark data as well as a protein-protein interaction network of the yeast S. Cerevisiae and we obtained very good results. Then we applied it to the prediction of protein interactions in a network built around the CFTR protein.; L'objectif de cette thèse est de développer des outils de prédiction d'interactions entre protéines qui puissent être appliqués en particulier chez l'homme, sur les protéines qui constituent un réseau avec la protéine CFTR. Cette protéine, lorsqu'elle est défectueuse, est impliquée dans la mucoviscidose. Le développement de méthodes de prédiction in silico peut s'avérer utile pour suggérer aux biologistes de nouvelles cibles d'interaction et pour mieux expliquer les fonctions des protéines présentes dans ce réseau. Nous proposons une nouvelle méthode pour le problème de la prédiction de liens dans un réseau. Afin de bénéficier de l'information des données non étiquetées, nous nous plaçons dans le cadre de l'apprentissage semi-supervisé. Nous abordons ce problème de prédiction comme une tâche d'apprentissage d'un noyau de sortie, appelée régression à noyau de sortie. Un noyau de sortie est supposé coder les proximités existantes entre les noeuds du graphe et l'objectif est d'approcher ce noyau à partir de descriptions appropriées en entrée. L'utilisation de l'astuce du noyau dans l'ensemble de sortie permet de réduire le problème d'apprentissage à partir de paires à un problème d'apprentissage d'une fonction d'une seule variable à valeurs dans un espace de Hilbert. En choisissant les fonctions candidates pour la régression dans un espace de Hilbert à noyau reproduisant à valeur opérateur, nous développons, comme dans le cas de fonctions à valeurs scalaires, des outils de régularisation. Nous établissons en particulier des théorèmes de représentation dans le cas supervisé et dans le cas semi-supervisé, que nous utilisons ensuite pour définir de nouveaux modèles de régression pour différentes fonctions de coût, appelés IOKR-ridge et IOKR-margin. Nous avons d'abord testé l'approche développée sur des données artificielles, des problèmes test ainsi que sur un réseau d'interaction protéine-protéine chez la levure S. Cerevisiae et obtenu de très bons résultats. Puis nous l'avons appliquée à la prédiction d'interactions entre protéines dans le cas d'un réseau construit autour de la protéine CFTR.

Artificial mini-proteins able to target catalytic sites of matrix metalloproteinases (MMPs) were designed using a functional motif grafting approach. The motif corresponded to the 4 N-terminal residues of TIMP-2, a broad-spectrum natural protein inhibitor of MMPs. Scaffolds able to reproduce the functional topology of this motif as described in the TIMP-2/MMP-14 complex were obtained by exhaustive screening of the Protein Data Bank (PDB) using the STAMPS software (Search for Three-dimensional Atom Motif in Protein Structure). Ten artificial protein binders satisfying all topologic, steric and electrostatic criteria applied for selection were produced for experimental evaluation. These binders targeted catalytic sites of MMPs with affinities ranging from 450 nM and 590 μM prior to optimization. The crystal structures of two artificial binders in complex with the catalytic domain of MMP-12 showed that the intermolecular interactions established by the functional motif in these artificial binders corresponded to those found in the TIMP-2/MMP-14 complex, albeit with some differences in their geometry. Molecular dynamics simulations of the 10 binders in complex with MMP-14 suggested that these scaffolds could allow reproducing in part the native intermolecular interactions, but some differences in geometry and stability could contribute to the lower affinity of the artificial protein binders as compared to the natural one. Nevertheless, these results show that the in silico design method used can provide sets of starting protein binders targeting a specific binding site with a good rate of success. This approach could constitute the first step of an efficient hybrid computational-experimental protein binder design approach.; Les travaux réalisés portent sur la conception de ligands protéiques capables de cibler le site catalytique des métalloprotéases matricielles (MMPs) grâce à une méthode d’ingénierie développée au laboratoire qui repose sur le greffage de motifs fonctionnels. Le motif fonctionnel choisi correspond aux 4 résidus N-terminaux du TIMP-2, un inhibiteur naturel des MMPs. Des plates-formes protéiques possédant des motifs d’acides aminés dans une topologie similaire à celle du motif de référence dans le complexe TIMP-2/MMP-14 ont été identifiées par criblage systématique de la PDB à l’aide du logiciel STAMPS (Search for Three-dimensional Atom Motif in Protein Structure). Dix candidats ligands satisfaisant les contraintes topologiques, stériques et de similarité électrostatique avec le ligand naturel TIMP-2 ont été sélectionnés. Ces ligands ont été produits par synthèse chimique ou par voie recombinante puis leur capacité à inhiber une série de 6 MMPs a été évaluée. Les résultats indiquent que tous les ligands protéiques conçus in silico sont capables de lier les sites catalytiques des MMPs avec des constantes d’association allant de 450 nM à 590 mM, sans optimisation supplémentaire. La caractérisation structurale par diffraction X de 2 variants d’un de ces ligands protéiques a permis de montrer que les interactions établies par le motif 1-4 dans ces ligands étaient similaires à celles observées dans le complexe TIMP-2/MMP-14, avec cependant des différences dans la géométrie de certaines d’entre elles. Des études de simulation par dynamique moléculaire ont également permis de mettre en évidence de possibles différences dans la géométrie et la stabilité de certaines des interactions reproduites dans les 10 plates-formes, pouvant contribuer aux affinités modestes observées pour ces ligands. Cependant, les résultats obtenus montrent que la méthode de conception in silico utilisée est capable de fournir une série de ligands protéiques de 1ère génération ciblant de manière spécifique un site catalytique d’intérêt avec un bon rendement. Cette méthode pourrait constituer la 1ère étape d’une approche hybride de conception in silico de ligands combinée à des techniques de sélection expérimentales.

Artificial mini-proteins able to target catalytic sites of matrix metalloproteinases (MMPs) were designed using a functional motif grafting approach. The motif corresponded to the 4 N-terminal residues of TIMP-2, a broad-spectrum natural protein inhibitor of MMPs. Scaffolds able to reproduce the functional topology of this motif as described in the TIMP-2/MMP-14 complex were obtained by exhaustive screening of the Protein Data Bank (PDB) using the STAMPS software (Search for Three-dimensional Atom Motif in Protein Structure). Ten artificial protein binders satisfying all topologic, steric and electrostatic criteria applied for selection were produced for experimental evaluation. These binders targeted catalytic sites of MMPs with affinities ranging from 450 nM and 590 μM prior to optimization. The crystal structures of two artificial binders in complex with the catalytic domain of MMP-12 showed that the intermolecular interactions established by the functional motif in these artificial binders corresponded to those found in the TIMP-2/MMP-14 complex, albeit with some differences in their geometry. Molecular dynamics simulations of the 10 binders in complex with MMP-14 suggested that these scaffolds could allow reproducing in part the native intermolecular interactions, but some differences in geometry and stability could contribute to the lower affinity of the artificial protein binders as compared to the natural one. Nevertheless, these results show that the in silico design method used can provide sets of starting protein binders targeting a specific binding site with a good rate of success. This approach could constitute the first step of an efficient hybrid computational-experimental protein binder design approach.; Les travaux réalisés portent sur la conception de ligands protéiques capables de cibler le site catalytique des métalloprotéases matricielles (MMPs) grâce à une méthode d’ingénierie développée au laboratoire qui repose sur le greffage de motifs fonctionnels. Le motif fonctionnel choisi correspond aux 4 résidus N-terminaux du TIMP-2, un inhibiteur naturel des MMPs. Des plates-formes protéiques possédant des motifs d’acides aminés dans une topologie similaire à celle du motif de référence dans le complexe TIMP-2/MMP-14 ont été identifiées par criblage systématique de la PDB à l’aide du logiciel STAMPS (Search for Three-dimensional Atom Motif in Protein Structure). Dix candidats ligands satisfaisant les contraintes topologiques, stériques et de similarité électrostatique avec le ligand naturel TIMP-2 ont été sélectionnés. Ces ligands ont été produits par synthèse chimique ou par voie recombinante puis leur capacité à inhiber une série de 6 MMPs a été évaluée. Les résultats indiquent que tous les ligands protéiques conçus in silico sont capables de lier les sites catalytiques des MMPs avec des constantes d’association allant de 450 nM à 590 mM, sans optimisation supplémentaire. La caractérisation structurale par diffraction X de 2 variants d’un de ces ligands protéiques a permis de montrer que les interactions établies par le motif 1-4 dans ces ligands étaient similaires à celles observées dans le complexe TIMP-2/MMP-14, avec cependant des différences dans la géométrie de certaines d’entre elles. Des études de simulation par dynamique moléculaire ont également permis de mettre en évidence de possibles différences dans la géométrie et la stabilité de certaines des interactions reproduites dans les 10 plates-formes, pouvant contribuer aux affinités modestes observées pour ces ligands. Cependant, les résultats obtenus montrent que la méthode de conception in silico utilisée est capable de fournir une série de ligands protéiques de 1ère génération ciblant de manière spécifique un site catalytique d’intérêt avec un bon rendement. Cette méthode pourrait constituer la 1ère étape d’une approche hybride de conception in silico de ligands combinée à des techniques de sélection expérimentales.

Protein-protein interactions play a central role in the regulation of biological processes and represent a promissing class of therapeutic targets. It has been recently reported that disrupting the interaction between the PDZ protein PSD-95 and the serotonin receptor 5-HT2A induced an antihyperalgesic effect in diabetic rats. In this context, the development of original ligands capable to inhibit specifically this interaction could lead to a new class of analgesic compounds.We carried out the synthesis of three generations of ligands possessing an indole moiety in order to interact with the highly conserved carboxylate-binding loop (GLGF loop) of PSD-95. Two generations of compounds were developed to find out the position and the nature of the substituents furnishing the best interactions. One generation consists of a family of 15 biligands possessing a substituted indole moiety, coupled with a linker (having from 2 to 6 carbon atoms) via an amid function, ended with various amino acids to interact with the S1 site of the protein, in order to obtain specific ligands.By various biological evaluations, NMR HSQC 1H/15N, chromatography affinity assays and in vivo experiments, we identified two promising inhibitors of the interaction PSD-95/5-HT2A with strong interactions with S0 site of PSD-95. For these compounds, we determined the structure of the complex protein/ligand by NMR NOESY experiments. The orientation of one of these molecules in the S0 site allows us to envisage a new generation of ligands capable to interact with the S1 site of the protein., Les protéines à domaine PDZ, en très grand nombre dans le génome humain, sont impliquées dans des interactions protéine-protéine. Elles participent ainsi à véhiculer des signaux à l’origine de différentes pathologies (cancer, douleur….). L’interruption de l’interaction entre la protéine à domaine PDZ, PSD-95, et le récepteur de la sérotonine, 5-HT2A, entraîne une réduction de l’hyperalgie chez le rat neuropathique. Le développement de molécules capables d’inhiber cette interaction pourrait donc conduire à une nouvelle classe d’antalgiques.Nous avons réalisé, au cours de ces travaux, la synthèse de trois générations de ligands, comportant un noyau indolique, capables d’interagir avec le site S0, site très conservé des protéines à domaines PDZ. Dans un premier temps, nous avons préparé 15 biligands possédant un noyau indolique polysubstitué lié, via un espaceur de longueur variable (2 à 6 atomes de carbone), à différents acides aminés, dans le but d’interagir avec le site S1, montrant beaucoup de diversité en fonction du domaine. Nous avons ensuite, après une étude de relation structure/activité, développé deux autres générations d’indoles polysubstitués présentant notamment des substituants hydrophobes en position 5.Nous avons montré, par RMN HSQC 1H/15N et chromatographie d’affinité, que deux de ces composés sont des inhibiteurs de l’interaction PSD-95/5-HT2A et présentent de fortes interactions avec le site S0 de PSD-95. Ces molécules présentent également des propriétés antalgiques particulièrement intéressantes in vivo. Nous avons également déterminé, par RMN NOESY, la structure du complexe protéine/ligand pour ces deux composés. L’orientation d’une de ces molécules dans le site de la protéine nous permet d’envisager le développement d’une nouvelle génération d’indoles polysubstitués, pouvant interagir avec le site S1 de la protéine et permettant ainsi d’obtenir des inhibiteurs sélectifs de l’interaction PSD-95/5-HT2A.

Les protéines intrinsèquement désordonnées (PID) sont dépourvues de structures secondaire et tertiaire en conditions physiologiques. La plupart des PID sont impliquées dans des fonctions cellulaires intervenant dans des étapes clés de la vie cellulaire, telles que la régulation du cycle cellulaire, la transduction d’un signal et la transcription. Une caractéristique notable des PID est leur capacité à interagir avec de multiples partenaires tout en étant spécifiques. Bien que cette propriété semble liée à leur flexibilité structurale, aucune étude n’a été entreprise jusqu’à présent qui permettrait de comprendre les déterminants moléculaires de la reconnaisance de partenaire.Le but de ce projet est de tenter de comprendre et de préciser les bases moléculaires déterminant l’affinité et la spécificité des PID lors de la reconnaissance de leur(s) partenaire(s). Pour cela, l’approche in vitro utilisée a consisté en la génération de mutants aléatoires au sein de la partie C-terminale de la nucléoprotéine NTAIL (domaine désordonné) du virus de la rougeole. Le domaine NTAIL subit un repliement induit en _-hélice au niveau de la région d’interaction Box2 (aa 489-506), lors de sa liaison avec son partenaire naturel et structuré PXD (partie C-terminale de la Phosphoprotéine). Le système de criblage utilisé est fondé sur le réassemblage de la Green Fluorescent Protein (GFP), où NTAIL et PXD sont chacun fusionnés à une moitié de la GFP. Ainsi, l’affinité de l’interaction des variants de NTAIL pour PXD, guide la reconstitution de la GFP.La mesure de la fluorescence des variants de NTAIL, corrélée à l’analyse de leur séquence peptidique, a permis de confirmer l’implication de certains résidus de la Box2 dans la liaison avec le partenaire. De plus, cette étude met en évidence que la pré-configuration en hélice de la région Box2 facilite l’interaction. Enfin, grâce à cette approche d’évolution descriptive, nous avons identifié des sites de contact primaire, en dehors de la Box2, capables de favoriser l’interaction entre NTAIL et son partenaire PXD.

A lot of essential cellular functions like translation, splicing, ribosome biogenesis and telomere replication need the activity of non coding RNPs. The biogenesis of non coding RNPs in eukaryotes is a complex pathway involving numerous cellular factors. For instance, ribosome biogenesis requires more than 150 factors. They are important to facilitate and to control the biogenesis of this essential cellular machinery. These factors include the C/D box snoRNPs. These RNPs are involved in pre-rRNA maturation (post-transcriptional ribose methylation and endo-nucleolytic cleavages). Recently, our laboratory participated to the discovery of snoRNP assembly factors: the Rsa1p protein, R2TP complex (Rvb1p, Rvb2p, Tah1p and Pih1p) and Hit1p in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Using a high throughput co-expression approach, we deciphered a network of interactions between RNP core proteins and the assembly factors. Coupled with a limited proteolysis strategy, the co-expression method allowed us to obtain proteins sub-complexes Snu13p/Rsa1p and Rsa1p/Hit1p which are currently studied by NMR. In collaboration with the F. Allain team (ETH Zurich), we also determined the tridimensional structure of protein Tah1p and its complex with the chaperon Hsp90 C-terminal peptide at high resolution. The data obtained reveal a particular mode of association of the Tah1p TPR domain with the Hsp90 peptide, De nombreuses fonctions cellulaires essentielles telles que la traduction, l'épissage, la biogenèse des ribosomes et la réplication des télomères font appels aux particules RNP non codantes. La biogenèse de ces dernières chez les eucaryotes est un processus très complexes qui fait intervenir de nombreux facteurs cellulaires. La biogenèse du ribosome nécessite au moins 150 facteurs. Ceux-ci sont importants pour faciliter mais également contrôler la biogenèse de cette machinerie cellulaire essentielle qu'est le ribosome. Parmi ces facteurs, nous avons les snoRNP à boîtes C/D. Ces RNP sont impliqués dans la maturation des pré-ARNr (méthylation post-transcriptionnelle des riboses et clivages endonucléolytiques). Récemment notre laboratoire a participé à la découverte de facteurs d'assemblage de ces RNP. Il s'agit entre autre des protéines Rsa1p, du complexe R2TP (Rvb1p, Rvb2p, Tah1p et Pih1p) et de Hit1p chez la levure Saccharomyces cerevisiae. En utilisant une approche de co-expression à haut débit, nos travaux ont révélé un réseau complexe d'interactions entre les protéines constitutives des snoRNP et leurs facteurs d'assemblage. Couplé à une stratégie de protéolyse ménagée, la co-expression nous a permis d'obtenir des sous-complexes protéiques Snu13p/Rsa1p et Rsa1p/Hit1p qui font actuellement l'objet d'une étude structurale par RMN. En collaboration avec l'équipe de F. Allain (ETH Zurich), nous avons également déterminé la structure tridimensionnelle de la protéine Tah1p, ainsi que de son complexe avec le peptide C-terminale de la protéine chaperonne Hsp90 à haute résolution. Ces travaux ont révélé un mode d'association particulier entre le domaine TPR de la protéine et le peptide

The overall objective of this work was to investigate the mechanisms of protein-salt interactions and linkage between milk proteins powders and milk proteins dispersions (5% w/v) mainly NMC and WPI under various ranges of ionic environments (distilled water, NaCl solution and CaCl2 solution. In the first phase, we investigated the influence of the ionic environments on milk proteins powders rehydration profiles. The second phase of this study includes the characterization of milk proteins dispersions in an aqueous ionic environment regarding changes in the protein: secondary structure (ß-sheet, alpha-helix, ß-turns and unordered structures), size, morphological features and surface hydrophobicity by using FTIR, TEM, and DLS with other complimentary techniques. In the last part, the functionality of whey proteins was studied by the combined effect of heat and different ratios of salts. For this purpose, the study was exclusively focalized in an aqueous ionic medium composed of NaCl (0.75-3%) at different temperatures (30-90°C). The results obtained from the first part showed two distinct rehydration behaviors depending on the salts type and concentration. For the NMC dispersions under salt increase, spherical micelles with an average size around 150 nm disintegrated in sub-micelles around 20-30 nm and more or less aggregated were observed by DLS and TEM. WPI dispersions in water were composed of well separated proteins by a spherical shape with two populations around 6 and 70 nm. Salt increase resulted in an aggregation of the proteins and the formation of denser aggregates. Moreover, a combined salt/heat resulted showed a stabilizing effect on the secondary structural elements of both Amide I and III bands and higher denaturation temperatures observed by FTIR and µDSC respectively. A size and morphological investigation showed a transition from spherical/compact protein aggregates to linear ones. Finally, this work demonstrated that whey protein functional properties depend on both salt and how heat treatment is applied, Le but de cette thèse était d'étudier et de mieux comprendre les mécanismes d'interaction entre protéines laitières (caséines micellaires natives NMC et protéines de lactosérum natives WPI) sous forme de poudres dispersées (5% p/v) dans des milieux fortement ionisés par des sels (NaCl, CaCl2). D'une manière générale notre étude a été organisée en trois parties. Premièrement, nous avons étudié l'influence des milieux ioniques (eau distillé, solution de NaCl, solution de CaCl2) sur la réhydratation de protéines laitières. Dans une seconde partie nous avons caractérisé les dispersions en milieux ionisés par les études respectives de la structure secondaire des protéines, de la taille et de la morphologie des particules en cours de dispersion et de l'hydrophobicité des protéines. Dans la troisième et dernière partie nous nous sommes intéressés aux propriétés fonctionnelles des protéines du lactosérum par l'effet combiné de la température (30 - 90°C) et de la concentration en NaCl (0,75 - 3%). La réhydratation des protéines du lait a montré deux comportements distincts en fonction du type de sel d'une part (NaCl, CaCl2) et de la concentration d'autre part (0 - 12%). Dans les dispersions de NMC, avec l'ajout et l'augmentation de la concentration de NaCl on observe (DLS, TEM), une désintégration des micelles de taille 150 nm en petites micelles de 20-30 nm qui sont plus ou moins agrégées. En définitive, les propriétés fonctionnelles des protéines du WPI dépendent en même temps de la concentration en sel et de la température appliquée

Box C/D and H/ACA ribonucleoparticles (RNPs) are required for UsnRNA and ribosomal RNA maturation. Their assembly in cells is a complex process, which implicates numerous cellular factors, such as NUFIP, a common assembly factor, and NAF1, which is a specific factor for H/ACA box RNP assembly. The Survival of Motoneurons (SMN) complex is essential for cell survival and is required for the assembly of another class of RNPs, the UsnRNPs, which are essential components of the splicing machinery. Decreased levels of the SMN protein lead to a severe disease, the spinal muscular atrophy. Several studies led to the proposal that the SMN complex also plays a role in the assembly of box C/D and H/ACA RNPs. In order to obtain more information, we analyzed whether some interactions may exist between components of the SMN complex and i) core proteins of mature RNPs, or ii) factors already known to be involved in the assembly. Using a yeast two-hybrid approach, we observed strong interactions between NAF1 and the SMN complex components, Gemin3 and Gemin8. Since the core H/ACA protein GAR1 interacts with the SMN protein, our data suggest that the SMN complex participates to the exchange of NAF1 by GAR1, which is a crucial step of H/ACA box RNP biogenesis. Furthermore, we discovered strong interactions between Gemin3/NUFIP, Gemin4/NUFIP and Gemin6/NUFIP. Concerning the Gemin6/NUFIP interaction, we showed that is direct, that it exists in both compartments in mammalian cells and we defined domains of both proteins necessary for the interaction in collaboration with the E. Bertrand team (IGM Montpellier). These results open new perspectives concerning functional links between the SMN complex and NUFIP in box H/ACA and C/D RNP assembly, but also in U4 snRNP assembly and in the mechanism of localized translation, Les particules ribonucléoprotéiques (RNP) à boîtes C/D et H/ACA sont impliquées dans la maturation des UsnRNA et des précurseurs des ARNr. L'assemblage de ces RNP dans les cellules est un processus complexe faisant intervenir de nombreux facteurs cellulaires dont NUFIP, commun aux deux RNP, et NAF1, spécifique aux RNP à boîtes H/ACA. Le complexe de Survie des Motoneurones (SMN) est essentiel à la survie cellulaire et est nécessaire à l'assemblage d'une autre RNP, les UsnRNP, composants des spliceosomes. Un déficit en protéine SMN conduit à une pathologie grave, l'amyotrophie spinale. Plusieurs études suggèrent que le complexe SMN puisse également jouer un rôle dans l'assemblage des RNP à boîtes C/D et H/ACA. Dans le but d'obtenir de plus amples informations, nous avons testé si des interactions existent entre les constituants du complexe SMN et i) les protéines associées aux RNP matures, ainsi que ii) les autres facteurs d'assemblage déjà connus. Ainsi, par une approche de double hybride chez la levure, nous avons observé des interactions fortes entre NAF1 et les protéines Gemin3 et Gemin8 du complexe SMN. Comme la protéine coeur GAR1 des RNP à boîte H/ACA interagit avec la protéine SMN, ces données suggèrent que le complexe SMN participe à l'échange de NAF1 par GAR1, qui est une étape clé de la biogenèse des RNP à boîtes H/ACA. De plus, nous avons mis en évidence des interactions entre Gemin3/NUFIP, Gemin4/NUFIP et Gemin6/NUFIP. L'étude de cette dernière interaction a été approfondie. Nous avons montré que l'interaction est directe, qu'elle existe dans les cellules de mammifères à la fois dans le cytoplasme et le noyau, et nous avons défini les domaines de chaque protéine nécessaires à l'interaction, en collaboration avec l'équipe d'E. Bertrand (IGM Montpellier). Ces résultats ouvrent de larges perspectives quant à un lien fonctionnel entre le complexe SMN et NUFIP dans l'assemblage des RNP à boîtes C/D et H/ACA, mais aussi dans l'assemblage de la snRNP U4 et dans le mécanisme de traduction localisée dans les cellules

A critical step for retroviral replication is the stable integration of the provirus genome into the genome of its host; this integration is realized by a viral enzyme, the integrase. The aim of this work was to better understand the functioning of the integrase, particularly, by identifying host factors that might interact with it, and which could be factors favoring the integration process or, restrictive factors. Therefore, we used two models of retroviral integrases: The integrase of RAV1, an alpharetrovirus belonging to the subgroup A of the family of ALSV. Although this viral enzyme is widely studied, still not enough data are available about its cellular cofactors. The second enzyme studied here is the integrase of PERV, a gammaretrovirus. No studies of either PERV integrase activities in vitro or of proteins interacting with this viral enzyme have been available until now. In the present study, we have expressed the PERV and ALSV integrases as fusion proteins with a 6xHistidine Tag in both Escherichia coli and insect SF9 cells. After that, we analysed their ability to mediate catalytic activities (3’-end processing, strand transfer and disintegration) in vitro. We also investigated the interaction of these two viral enzymes with the cellular protein Brd2, using the Far western blot method. Our results validate Brd2 as a cofactor of PERV integrase and point to the important role of particular domains of the PERV integrase and Brd2 in mediating the interaction. Finally, this study contibute to a better understanding of the precise interaction between cellular proteins and integrase, and may lead in the future to the development of protein-protein interaction inhibitors, Les rétrovirus sont des virus à ARN, enveloppés présents dans de nombreuses espèces animales de rente, chez les animaux de compagnie et chez l’homme. Une des particularités des rétrovirus concerne l’intégration du génome viral au sein du génome de la cellule infectée; cette intégration est réalisée par une enzyme virale, l’intégrase. Le projet de cette thèse vise à mieux comprendre le fonctionnement de cette enzyme notamment en identifiant des facteurs cellulaires interagissant avec celle-ci, facteurs qui pourraient être des agents favorisant le processus intégratif ou, au contraire, des agents restrictifs. Les intégrases de deux modèles de rétrovirus ont été utilisées dans cette étude : L’intégrase de RAV1, un rétrovirus exogène aviaire du genre des alpharétrovirus appartenant au sous-groupe A de la famille des ASLV. Cette enzyme virale est largement étudiée soit au niveau structural ou fonctionnel, mais les données concernant ses partenaires cellulaires sont rares et insuffisantes. La seconde intégrase est celle du PERV A/C, un rétrovirus endogène porcin du genre gammarétrovirus. Aucune information sur cette enzyme n’a été décrite jusqu’à présent. Ces deux enzymes, en fusion avec une étiquette 6xHistidine, ont été donc produites en bactérie, et en cellules d’insecte puis purifiées sur colonne d’affinité en FPLC. Leurs activités catalytiques ont été testées in vitro. Ces tests permettent de valoriser la capacité de l’intégrase à exercer principalement les 2 fonctions dont elle est responsable in vivo, le clivage en 3’ et le transfert de brins, et une activité qu’elle exerce exclusivement in vitro, la désintégration. Les protéines pures et actives ont ensuite servies à la vérification de leur interaction avec une protéine cellulaire, Brd2. La technique ‘Far western blot’ a ainsi permis de valider l’interaction entre l’intégrase de PERV et la protéine cellulaire, puis d’identifier les domaines de l’intégrase et de Brd2 impliqués dans cette interaction. A terme, l’identification de ce facteur cellulaire et la validation de son rôle dans le processus intégratif permettront de mieux comprendre ce processus particulier développé par les rétrovirus et pourront conduire au développement d’inhibiteurs dirigés contre cette interaction

In skeletal muscle, the action potential triggers muscle contraction through a massive calcium release from the sarcoplasmic reticulum (SR). This process, called excitation-contraction coupling (ECC), requires physical interactions between two calcium channels: (1) the dihydropyridine receptor (DHPR), a voltage-dependent channel composed of four subunits among which the 1S subunit, that forms both the pore and the voltage-sensor, and the 1a subunit fully cytoplasmic, and (2) the ryanodine receptor (RyR1) which is responsible of calcium release from SR. 1a subunit interacts with both RyR1 and the 1S subunit. The mechanism whereby the DHPR is functionally coupled to RyR1 is still not clearly understood. During my thesis, I identified new molecular and structural determinants of the interaction between RyR and DHPR. I demonstrated the existence of intramolecular interactions between the cytoplasmic loops of the 1S subunit centered on a domain called domain A. I also localized the site of interaction of the caveoline-3 on the I-II loop of 1S. The study of the interaction of the β1a subunit with RyR1 showed (1) that the C-terminal region of β1a controls this interaction, (2) that the affinity of this interaction is strongly increased by the interaction of β1a with 1S, and 3) that the interaction β1a/RyR1 regulates the closure of RyR1. The use of a toxin, the maurocalcine (MCa) which behaves as an analogue of the domain A allowed me to identify a minimal domain of RyR1 responsible for the binding of the MCa and the domain A. A structural study by NMR of this domain has been realized. Finally, I studied the effect of the MCa on myotubes not expressing the 1S sub-unit. I showed that the MCa is capable of restoring in absence of DHPR, an increase of the cytoplasmic Ca2+ concentration triggered by the depolarization of the plasma membrane.; L'excitation nerveuse d'une cellule musculaire produit une libération massive dans le cytoplasme du Ca2+ stocké dans le réticulum sarcoplasmique (RS). L'augmentation de la concentration cytoplasmique de Ca2+ déclenche la contraction. Ce processus, appelé couplage excitation contraction (CEC), requiert des interactions physiques entre deux canaux calciques : (1) le récepteur des dihydropyridines (DHPR), un canal calcique activé par le voltage ; le DHPR est composé de plusieurs sous-unités, dont la sous-unité α1S, qui forme le canal et le détecteur de potentiel, et la sous-unité β1a, entièrement cytoplasmique; (2) le récepteur à la ryanodine (RyR1) responsable de la libération de Ca2+ hors du RS. La sous unité β1a interagit avec la sous-unité α1S et RyR1. Au cours de ma thèse, j'ai identifié de nouveaux déterminants moléculaires et structuraux de l'interaction DHPR/RyR1. J'ai ainsi démontré l'existence d'interactions intramoléculaires entre les différentes boucles cytoplasmiques de la sous-unité α1S du DHPR, centrées autour d'un domaine appelé domaine A. J'ai également localisé le site d'interaction de la cavéoline-3 sur une boucle cytoplasmique de la sous-unité α1S. L'étude de l'interaction de la sous-unité β1a avec RyR1 a montré (1) que la région C-terminale de β1a contrôle cette interaction, (2) que l'affinité apparente de β1a pour RyR1 est fortement augmentée par l'interaction de β1a avec α1S et (3) que l'interaction β1a/RyR1 régule la fermeture du RyR. L'utilisation d'une toxine, la maurocalcine (MCa) qui se comporte comme un analogue du domaine A m'a permis d'identifier un domaine minimal de RyR1 responsable de la fixation de la MCa et du domaine A. Une étude structurale par RMN de ce site a été réalisée. Enfin, j'ai étudié l'effet de la MCa sur des myotubes n'exprimant pas la sous-unité α1S. J'ai montré que la MCa est capable de restaurer, en absence de DHPR, une augmentation de la concentration de Ca2+ cytoplasmique induite par la dépolarisation de la membrane plasmique.

Membrane protein dynamics is of great importance for living organisms. The precise localization of proteins composing a synapse on the membrane facing a nerve terminus is essential for proper functioning of the nervous system. In muscle fibers, the nicotinic acetylcholine is densely packed under the motor nerve termini. A receptor associated protein, rapsyn, acts as a linker between the receptor and the other components of the synaptic suramolecular assembly. Advances in fluorescence microscopy have allowed to measure the behavior of a single receptor in the cell membrane. In this work single-molecule microscopy was used to track the motion of ionotropic acetylcholine (nAChR) and serotonin (5HT3R) receptors in the plasma membrane of cells. We present methods for measuring single-molecule diffusion and their analysis. Single molecule tracking has shown a high dependence of acetylcholine receptors diffusion on its associated protein rapsyn. Comparing muscle cells that either express rapsyn or are devoid of it, we found that rapsyn plays an important role on receptor immobilization. A three-fold increase of receptor mobility was observed in muscle cells devoid of rapsyn. However, in these cells, a certain fraction of immobilized receptors was also found immobile. Furthermore, nAChR were strongly confined in membrane domains of few tens of nanometers. This showed that membrane composition and membrane associated proteins influence on receptor localization. During muscle cell differentiation, the fraction of immobile nAChR diminished along with the decreasing nAChR and stable rapsyn expression levels. The importance of rapsyn in nAChR immobilization has been further confirmed by measurements in HEK 293 cells, where co-expression of rapsyn increased immobilization of the receptor. nAChR is a ligand-gated ion-channel of the Cys-loop family. In mammals, members of this receptor family share general structural and functional features. They are homo- or hetero-pentamers and form a membrane-spanning ion channel. Subunits have three major regions, an extracellular ligand binding domain, a transmembrane channel and a large intracellular loop. 5HT3R was used as a model to study the effect of this loop on receptor mobility. Single-molecule tracking experiments on receptors with progressively larger deletions in the intracellular loop did not show a dependence of the size of the loop on the diffusion coefficient of mobile receptors. However, two regions were identified to play a role in receptor mobility by changing the fractions of immobile and directed receptors. Interestingly, a prokaryotic homologue of cys-loop receptors, ELIC, devoid of a large cytoplasmic loop was found to be immobile or to show directed diffusion similar as the wild-type 5HT3R. The scaffolding protein rapsyn stabilizes nAChR clusters in a concentration dependent manner. We have measured the density and self-interactions of rapsyn using FRET microscopy. Point-mutations of rapsyn, known to provoke myopathies, destabilized rapsyn self-interactions. Rapsyn-N88K, and R91L were found at high concentration in the cytoplasm suggesting that this modification disturbs membrane association of rapsyn. A25V was found to accumulate in the endoplasmic reticulum. Fluorescent tools to measure intracellular concentration of calcium ions are of great value to study the function of neurons. Rapsyn is highly abundant at the neuromuscular junction and thus is a genuine synaptic marker. A fusion protein of rapsyn with a genetically encoded ratiometric calcium sensor has been made to probe synapse activity. This thesis has shown that the combined use of biologically relevant system and modern fluorescence microscopy techniques deliver important information on pLGIC behaviour in the cell membrane. QC 20151217