Search

Huntington disease (HD) is an autosomal dominant inherited neurological disorder conducting to the appearance of motors, psychiatrics and cognitives symptoms during mid-adulthood. HD is characterised by a massive neurodegenerescence of both striatal and cortical neurons. HD is caused by a mutation in coding region of the protein Huntingtin (HTT) leading to the production of a mutated form (mHTT). mHTT gain new toxic function but also loss some of normal function of HTT. Therefore, studying both gain and loss of function is mandatory to better understand the physiopathological progression of HD.HTT and mHTT both contribute to development of cerebral structures. Our hypothesis is that developmental defects induced by mHTT could contribute at least in part to the physiological progression of HD. Our work focuses on cerebral cortex development a structure which is largely impacted in HD. Our previous studies demonstrated roles of HTT and the effect of mHTT in neuronal precursor proliferation during neurogenesis. However, roles and functions of HTT and mHTT during later step of cortical neurogenesis remain elusive.My PhD project has focused on two main aspects: (i) study the function of HTT in newborn post-mitotic neurons in cerebral cortex, notably during their migration and maturation, and (ii), characterising cortical neurogenesis in genetically integrated mouse model of HD: zQ175.; La maladie de Huntington (MH) est un trouble neurologique transmis selon un mode autosomique dominant qui conduit à l’apparition de symptômes moteurs, psychiatriques et cognitifs chez l’adulte. La MH est caractérisée par une neurodégénérescence massive des neurones striataux et corticaux. La MH est causée par une mutation de la séquence codante de la protéine Huntingtine (HTT) conduisant à la production d’une protéine mutée (mHTT). La mHTT gagne de nouvelles fonctions toxiques mais perd aussi certaines fonctions normales. L’étude de ces deux aspects (à la fois gain et perte de fonction) est donc indispensable à la compréhension du processus pathologique de la MH.La HTT et mHTT participent au développement des structures cérébrales. Notre hypothèse est donc que les défauts développementaux induits par la mHTT contribuent à la progression physiopathologique de la MH. Notre équipe s’intéresse tout particulièrement au développement du cortex cérébral, largement atteint dans la MH. Nos précédentes études ont démontré le rôle de la HTT et l’effet de sa mutation dans la prolifération des précurseurs neuronaux du cortex cérébral. Cependant, les fonctions de la HTT et de la mHTT lors des étapes plus avancées du développement cortical, restent à ce jour inconnues.Mon projet de thèse se décompose en deux axes principaux : (i) l’étude des fonctions de la HTT dans les neurones nouvellement produits dans le cortex en développement, notamment au cours de leur migration et de leur maturation dendritique et (ii), la caractérisation de la neurogenèse corticale dans un modèle génétique de la MH : zQ175.

Huntington disease (HD) is an autosomal dominant inherited neurological disorder conducting to the appearance of motors, psychiatrics and cognitives symptoms during mid-adulthood. HD is characterised by a massive neurodegenerescence of both striatal and cortical neurons. HD is caused by a mutation in coding region of the protein Huntingtin (HTT) leading to the production of a mutated form (mHTT). mHTT gain new toxic function but also loss some of normal function of HTT. Therefore, studying both gain and loss of function is mandatory to better understand the physiopathological progression of HD.HTT and mHTT both contribute to development of cerebral structures. Our hypothesis is that developmental defects induced by mHTT could contribute at least in part to the physiological progression of HD. Our work focuses on cerebral cortex development a structure which is largely impacted in HD. Our previous studies demonstrated roles of HTT and the effect of mHTT in neuronal precursor proliferation during neurogenesis. However, roles and functions of HTT and mHTT during later step of cortical neurogenesis remain elusive.My PhD project has focused on two main aspects: (i) study the function of HTT in newborn post-mitotic neurons in cerebral cortex, notably during their migration and maturation, and (ii), characterising cortical neurogenesis in genetically integrated mouse model of HD: zQ175., La maladie de Huntington (MH) est un trouble neurologique transmis selon un mode autosomique dominant qui conduit à l’apparition de symptômes moteurs, psychiatriques et cognitifs chez l’adulte. La MH est caractérisée par une neurodégénérescence massive des neurones striataux et corticaux. La MH est causée par une mutation de la séquence codante de la protéine Huntingtine (HTT) conduisant à la production d’une protéine mutée (mHTT). La mHTT gagne de nouvelles fonctions toxiques mais perd aussi certaines fonctions normales. L’étude de ces deux aspects (à la fois gain et perte de fonction) est donc indispensable à la compréhension du processus pathologique de la MH.La HTT et mHTT participent au développement des structures cérébrales. Notre hypothèse est donc que les défauts développementaux induits par la mHTT contribuent à la progression physiopathologique de la MH. Notre équipe s’intéresse tout particulièrement au développement du cortex cérébral, largement atteint dans la MH. Nos précédentes études ont démontré le rôle de la HTT et l’effet de sa mutation dans la prolifération des précurseurs neuronaux du cortex cérébral. Cependant, les fonctions de la HTT et de la mHTT lors des étapes plus avancées du développement cortical, restent à ce jour inconnues.Mon projet de thèse se décompose en deux axes principaux : (i) l’étude des fonctions de la HTT dans les neurones nouvellement produits dans le cortex en développement, notamment au cours de leur migration et de leur maturation dendritique et (ii), la caractérisation de la neurogenèse corticale dans un modèle génétique de la MH : zQ175.

Huntington’s disease (HD) is a rare genetic neurodegenerative disorder. Curative treatments are still actively sought. HD is induced by a mutation in the HTT gene inducing an abnormal expansion of the polyQ domain contained in the Huntingtin protein (Htt). Mechanisms and consequences of this mutation are now well described and allowed to identify an interaction of the Htt with the brain derived neurotrophic factor (BDNF) signaling pathway. BDNF is a neurotrophic factor, which plays important roles, through TrkB, one of its receptor, in neuronal development and plasticity. Mutant Htt (mHtt) down-regulates BDNF and TrkB transcription and transport along the axons.P42, a part of the Htt protein, is a 23aa peptide able to rescue HD pathological phenotypes, such as aggregation, axonal transport and neuronal viability.The aim of my PhD was to better understand the mechanisms of action of P42, in a purpose to optimize its therapeutic potential. To this end I developed different studies using different models.In a paper now accepted for publication in HMG, I first used a P42-based treatment on R6/2 HD mice, to analyze the effect of P42 on the BDNF/TrkB signaling pathway. To this end I analyzed pathologic phenotypes: behaviors or cell mechanisms developing in R6/2 mice and are related to the BDNF/TrkB pathway. I also measured BDNF and TrkB, mRNA or protein levels in both striatum and cortex. What I found is that P42 is acting on BDNF/TrkB pathway mainly by increasing the protein level of TrkB in the striatum.To observe the effect of P42 on vesicular transport, I rather used a Drosophila model, to perform live imaging based studies, in different transgenic conditions: with or without mHTT or P42.Also, in a way to better follow the progression of different pathological phenotypes and the effect of treatments on R6/2 mice, I benefited from a very recent and innovative tool, the HAMLET, which allows a multi-behavioral test.Finally, a bitherapy was used on R6/2 mice combining P42 and P3, a peptide raised against PolyQ mRNA that are also toxic.All those results contribute or will contribute to a better understanding of P42 mechanisms of action.; La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative progressive héréditaire. Aucun traitement curatif n’a encore été trouvé. La MH est provoquée par une mutation dans le gène HTT induisant l’augmentation anormale du domaine PolyQ (>36) contenue dans la Huntingtine (Htt), la protéine codée par le gène HTT. Les conséquences et les mécanismes de cette mutation sont maintenant bien décrits et ont permis d’identifier une interaction importante entre la Htt et la voie de signalisation du BDNF. Le BDNF est un facteur neurotrophique qui joue des rôles importants, à travers l’activation de son récepteur TrkB, dans le développement et le maintien des neurones et également dans la plasticité des réseaux synaptiques. La Htt mutante (mHtt) diminue l’expression et le transport du BDNF et de TrkB dans les neurones.P42, une partie de 23 acides aminés de la Htt, est capable de sauver de nombreux phénotypes pathologiques induits dans la MH.L’objectif de ma thèse était de mieux comprendre les mécanismes d’action de P42, dans le but d’optimiser son potentiel thérapeutique. Pour cela, j’ai développé plusieurs expériences sur plusieurs modèles. Dans un article, publié dans HMG, je montre les effets d’un traitement avec P42 sur la voie de signalisation BDNF/TrkB dans un modèle de MH : les souris R6/2. Pour cela, j’ai analysé plusieurs phénotypes pathologiques, comportements et mécanismes cellulaires développés par les souris R6/2 et connus pour être dépendants de la voie BDNF/TrkB. J’ai également mesuré les taux d’ARNm et de protéine, du BDNF et de TrkB, dans le cortex et le striatum. Ce que j’ai trouvé est que P42 agit sur la voie BNDF/TrkB principalement en augmentant l’expression de TrkB dans le striatum.Afin d’observer l’effet de P42 sur le transport vésiculaire, j’ai également utilisé la drosophile comme modèle. Grâce à ce modèle, j’ai pu observer in vivo le transport vésiculaire dans différentes conditions avec ou sans mHtt ou P42.Egalement, dans le but de mieux suivre l’évolution des différents phénotypes pathologiques induits par la MH et l’effet du traitement par P42, j’ai expérimenté le Hamlet test®, un test innovant multi-comportemental.Enfin, j’ai observé sur les souris R6/2, l’effet d’une bithérapie P42 avec P3, un peptide ciblant les effets toxiques induits par les ARN codants pour un PolyQ.Tous ces résultats permettent ou vont permettre de mieux comprendre les mécanismes d’action de P42.

Huntington Disease (HD) is a rare multisystemic neurodegenerative genetic disorder, which combines psychiatric, cognitive and motor alterations. It is caused by an increase in CAG repeats in the huntingtin gene, resulting in an expansion of polyglutamine stretch in the protein. This induced a loss of the huntingtin protein (HTT) normal function associated with production of a mutant protein. HTT is an ubiquitous microtubules associated protein, with numerous functions among which vesicles and organelles traffic along microtubules. Along this line, one of its functions could be the traffic of reticulum vesicles to form contact point with the plasma membrane in neurons. Moreover, a phenocopy named Huntington’s disease like 2 is due to junctophilin-3 loss of function. Junctophilin 3 is involved in contact points between endoplasmic reticulum and plasma membrane in neurons. These studies are dedicated to the validation of the hypothesis of the role of HTT in contact points between endoplasmic reticulum and plasma membrane in another model, in which contacts between reticulum and plasma membrane are of major importance: the skeletal muscle cell. Indeed, the contact points between sarcoplasmic reticulum and plasma membrane (T-Tubule), called the triads, are the basis of excitation-contraction coupling in muscle. In these studies, we develop cellular and animals models with a loss of expression of HTT in skeletal muscle specifically. Theses studies show that calcium release is altered at the cellular level and muscle force is altered at animal model level. Theses alterations are correlated with loss of expression of the main receptors of the triad. Finally, fragment of the normal protein can restore calcium defects. Theses studies put forward the role of huntingtine in skeletal muscle., La maladie de Huntington (HD) est une pathologie génétique multisystémique neurodégénérative rare caractérisée par des atteintes motrices, cognitives et psychiatriques. Elle est due à une augmentation de la répétition de triplet CAG dans l'exon 1 du gène HTT, dont la taille normale est de 6 à 35 répétitions. Cette expansion de triplets conduit à la présence d'une répétition de glutamine de taille anormale dans l'extrémité N-terminale de la protéine huntingtine (HTT). Les conséquences de la mutation sont d’une part la diminution de l’expression de la protéine non mutée et d’autre part l’expression d’une protéine mutée. L’une des fonctions de la HTT est le transport intracellulaire de vésicules le long des microtubules dans les neurones. Par ailleurs, une phénocopie : Huntington disease like 2 maladie ayant un phénotype similaire, est due à une perte de fonction de la junctophilin-3 ayant pour rôle l’établissement de points de contact entre la membrane plasmique et le reticulum endoplasmique au niveau neuronal. Les présents travaux visent à découvrir les mécanismes au sein desquels la HTT est impliquée dans un modèle différent de la cellule neuronale : la cellule musculaire. En effet, les points de contact nommées triades sont le cœur du couplage excitation-contraction. Les travaux ont permis de montrer, après avoir créé des modèles cellulaires et in vivo avec baisse d’expression de la protéine, un défaut de la fonction musculaire au niveau cellulaire comme au niveau physiologique. Les relâchements calciques sont altérés. La force est diminuée. De plus, ces altérations de fonctionnement sont corrélées à une baisse d’expression des principaux récepteurs de la triade. Enfin, une fraction exogène de la partie N-terminale de la protéine non mutée restaure les défauts calciques observés. La huntingtine a donc un rôle prépondérant dans la fonction princeps du muscle : la contraction.

Aux fondements de la vie, on retrouve les protéines qui agissent telles des nanomachines à l’échelle de la cellule. En effet, elles effectuent une immense diversité de tâches vitales à tout organisme vivant, allant de la transcription/traduction de l’ADN, au transport membranaire en passant par le métabolisme énergétique, etc. Les protéines sont des macromolécules composées de combinaisons des 20 acides aminés classiques. Sous l’effet des lois fondamentales de la physique, cette chaîne va se replier localement (structure secondaire) puis globalement (structure tertiaire). C’est cette dernière qui donne la fonction aux protéines et son étude se révèle donc primordiale. Les méthodes numériques offrent un complément indispensable à l’expérience pour la réalisation de cet immense défi. Ce mémoire s’articule autour de deux axes principaux. Le premier est l’étude du N-terminal de la protéine Huntingtine à l’aide de simulations numériques. Le second est l’optimisation et le développement de la famille de potentiel gros-grain OPEP. La protéine Huntingtine est à l’origine du développement de la maladie d’Huntington et son N-terminal est crucial pour son agrégation et son interaction avec la membrane. Suite à la proposition d’un premier modèle expérimental du N-terminal de Huntingtine, nous avons déterminé son ensemble structurel, en solution et en membrane, à l’aide de simulations tout-atome et de techniques d’échantillonnage avancées. Les motifs structurels et interactions dominantes observés sont mis en relation avec les modèles détaillés de son agrégation et de son ancrage dans la membrane. Finalement, les potentiels OPEP sont des potentiels gros-grain dont l’application s’est révélée un succès pour l’étude des protéines amyloïdes et pour la prédiction de structure tertiaire avec PEPFOLD. Le potentiel sOPEP fut optimisé sur de vastes ensembles de protéines avec comme résultat une amélioration de 25% au niveau des inégalités. La paramétrisation de sOPEP fut aussi testée à l’aide de simulation sur neuf protéines. En parallèle, nous développons le potentiel aaOPEP, qui portera la philosophie des potentiels OPEP en régime tout-atome. Ces potentiels sont intégrés à un code de dynamique moléculaire flexible qui permettra leur distribution., Proteins are the vital machinery of the cell and therefore are fundamental to life. They play a wide variety of roles from the transcription/translation of DNA to membrane transport to energy metabolism and many more. In terms of structure, proteins are macromolecules composed by the combination of 20 basic amino acids. Under the fundamental laws of physic, this chain will fold itself locally (secondary structure) and then globally (tertiary). This three dimensional structure gives rise to the protein’s function thus making the prediction of three dimensional structure a crucial aspect of protein study. Numerical techniques provide an essential tool to complement experiments in the study of proteins. The following thesis is divided into two main research axes. The first one is the study, via numerical techniques, of the N-terminal of the Huntingtin protein. The second one is the optimization and the development of the coarse grained forcefield family OPEP. First, we present our study of Huntingtin’s N-terminal. The Huntingtin protein is associated with the Huntington disease and its N-terminal is crucial for the protein aggregation and anchoring inside the membrane. Following the proposition of a first experimental model of the N-terminal, we determined its structural ensemble in aqueous solution and membrane environment. To do so, we used powerful sampling techniques in the all-atom regime. Our discoveries are linked to Huntingtin’s aggregation and membrane association models. Finally, the last chapter discusses the optimization of the sOPEP and aaOPEP forcefield. The coarse grained OPEP forcefields were successfully applied to multiple studies, most notably for the simulation of amyloid peptides and the tertiary structure prediction using the PEPFOLD methodology. Vast protein ensemble were generated and used in the optimization of sOPEP resulting in 25% of improvement compared to the previous version on our decoys set. The parametrization is also validated by short molecular dynamic simulations on nine proteins. In parallel, we develop the new aaOPEP, a forcefield that will use the OPEP philosophy but in the all-atom regime. Those potential are included in a flexible molecular dynamic code that will be available to everyone when completed.

Les protéines sont au coeur de la vie. Ce sont d'incroyables nanomachines moléculaires spécialisées et améliorées par des millions d'années d'évolution pour des fonctions bien définies dans la cellule. La structure des protéines, c'est-à-dire l'arrangement tridimensionnel de leurs atomes, est intimement liée à leurs fonctions. L'absence apparente de structure pour certaines protéines est aussi de plus en plus reconnue comme étant tout aussi cruciale. Les protéines amyloïdes en sont un exemple marquant : elles adoptent un ensemble de structures variées difficilement observables expérimentalement qui sont associées à des maladies neurodégénératives. Cette thèse, dans un premier temps, porte sur l'étude structurelle des protéines amyloïdes bêta-amyloïde (Alzheimer) et huntingtine (Huntington) lors de leur processus de repliement et d'auto-assemblage. Les résultats obtenus permettent de décrire avec une résolution atomique les interactions des ensembles structurels de ces deux protéines. Concernant la protéine bêta-amyloïde (AB), nos résultats identifient des différences structurelles significatives entre trois de ses formes physiologiques durant ses premières étapes d'auto-assemblage en environnement aqueux. Nous avons ensuite comparé ces résultats avec ceux obtenus au cours des dernières années par d'autres groupes de recherche avec des protocoles expérimentaux et de simulations variés. Des tendances claires émergent de notre comparaison quant à l'influence de la forme physiologique de AB sur son ensemble structurel durant ses premières étapes d'auto-assemblage. L'identification des propriétés structurelles différentes rationalise l'origine de leurs propriétés d'agrégation distinctes. Par ailleurs, l'identification des propriétés structurelles communes offrent des cibles potentielles pour des agents thérapeutiques empêchant la formation des oligomères responsables de la neurotoxicité. Concernant la protéine huntingtine, nous avons élucidé l'ensemble structurel de sa région fonctionnelle située à son N-terminal en environnement aqueux et membranaire. En accord avec les données expérimentales disponibles, nos résultats sur son repliement en environnement aqueux révèlent les interactions dominantes ainsi que l'influence sur celles-ci des régions adjacentes à la région fonctionnelle. Nous avons aussi caractérisé la stabilité et la croissance de structures nanotubulaires qui sont des candidats potentiels aux chemins d'auto-assemblage de la région amyloïde de huntingtine. Par ailleurs, nous avons également élaboré, avec un groupe d'expérimentateurs, un modèle détaillé illustrant les principales interactions responsables du rôle d'ancre membranaire de la région N-terminal, qui sert à contrôler la localisation de huntingtine dans la cellule. Dans un deuxième temps, cette thèse porte sur le raffinement d'un modèle gros-grain (sOPEP) et sur le développement d'un nouveau modèle tout-atome (aaOPEP) qui sont tous deux basés sur le champ de force gros-grain OPEP, couramment utilisé pour l'étude du repliement des protéines et de l'agrégation des protéines amyloïdes. L'optimisation de ces modèles a été effectuée dans le but d'améliorer les prédictions de novo de la structure de peptides par la méthode PEP-FOLD. Par ailleurs, les modèles OPEP, sOPEP et aaOPEP ont été inclus dans un nouveau code de dynamique moléculaire très flexible afin de grandement simplifier leurs développements futurs., Proteins are at the center of life. They are formidable molecular nanomachines specialized and optimized during million years of evolution for well-defined functions in the cell. The structure of proteins, meaning the tridimensional setting of their atoms, is closely related to their function. Absence of structure for a subset of proteins is also recognized to be as crucial. Amyloid proteins is a striking example : they fold into an ensemble of various structures hardly observable experimentally that are associated with neurodegenerative diseases. This thesis, firstly, is on the study of the structural ensemble of the amyloid proteins amyloid-beta (Alzheimer) and huntingtin (Huntington) during their folding and aggregation. Our results describe in details, with an atomic resolution, the characteristic interactions present in the structural ensemble of these two proteins. Concerning the amyloid-beta protein (AB), our results show the structural differences between three of its physiological forms during its first aggregation steps in an aqueous environment. We have then compared these results with those obtained during the past few years by several other research groups using various experimental and simulation protocols. Clear trends come out of this comparison regarding the influence of AB physiological form on its structural ensemble during its first aggregation steps. Their distinct aggregation pathways are rationalized by the identified differences. For their part, the identified similarities offer targets for therapeutical compounds disrupting the aggregation of the neurotoxic oligomers. Concerning the huntingtin protein, we identify the structural ensemble of its functional region at its N-terminal in an aqueous environment and in a phospholipid membrane. In agreement with the available experimental results on the global structure of this region in aqueous solution, our results reveal the dominant interactions, at an atomic precision, in its structural ensemble as well as the influence of its neighboring regions. We have also characterized the stability and the growth of nanotube-like structures that could occur during the aggregation of the amyloid region of huntingtin. Moreover, we have developed, in collaboration with a group of experimentalists, a precise model describing the main membrane interactions of huntingtin N-terminal, which serves as a membrane anchor that controls the localization of huntingtin in the cell. Secondly, this thesis is on the refinement of a coarse-grained model (sOPEP) and on the development of a new all-atom model (aaOPEP) that are both based on the coarse-grained OPEP force field, commonly used to study protein folding and amyloid protein aggregation. The goal behind the optimization of these models is to improve the de novo structure prediction of the PEP-FOLD method. These three models -- OPEP, sOPEP and aaOPEP -- are now also implemented in a new molecular dynamics software that we have developed specifically to greatly ease their future developments.

Growing evidence support the idea that impairments in Fast Axonal Transport (FAT) play a crucial role in Neurodegenerative Diseases (NDs). Huntington’s Disease is neurodegenerative disorder caused by an abnormal polyglutamine expansion in the N-Terminal part of huntingtin (HTT), a large scaffold protein implicated in transport regulation. Both the presence of the mutated HTT as the loss of HTT leads to transport defects in mammals. In the fruit fly overexpression of the mutant HTT recapitulates the phenotype observed in mammals. However, it is still unclear whether HTT’s function is conserved in D. melanogaster. Here, we show that D. melanogaster HTT (DmHTT) associates with vesicles, microtubules, and interacts with dynein. In rat cortical neurons, DmHTT partially replaces mammalian HTT in fast axonal transport, and DmHTT KO flies show axonal transport defects in vivo. These results suggest that HTT function in transport is conserved in D. melanogaster.FAT is a process that requires a constant supply of energy. Mitochondria are the main producers of ATP in the cell. However, we have demonstrated that FAT does not depend on this source of energy, as previously thought, but it depends on glycolytic ATP produced on vesicles. Perturbing GAPDH or PK, the two ATP generating glycolytic enzymes, slows down vesicular transport. However, knocking down GAPDH does not affect mitochondrial transport. Furthermore, all of the glycolytic enzymes are associated with dynamic vesicles, and are capable of producing their own ATP. Finally, we show that this ATP production is sufficient to sustain their own transport, demonstrating the energetical autonomy of vesicles for transport., De plus en plus de preuves montrent que le transport axonal rapide (FAT) joue un rôle crucial au cours des maladies neurodégénératives (NDs). La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative causée par une expansion anormale de polyglutamines dans la partie Nterminale de la protéine huntingtine (HTT) : une grande protéine d’échafaudage impliquée dans la régulation du transport. La présence de HTT mutante comme l’absence de la HTT induisent des défauts de transport chez les mammifères. Chez la Drosophile, la HTT mutante reproduit le phénotype observée chez les mammifères, cependant la fonction conservée de la HTT chez la Drosophile melanogaster (DmHTT) n’est pas encore clairement établie. Ici nous mettons en évidence que DmHTT s’associe aux vésicules, aux microtubules et intéragit avec la proteine dynéine. Dans les neurones corticaux de rat, DmHTT remplace partiellement la HTT de mammifère dans le transport axonal rapide, et les drosophiles invalidées pour la HTT montrent des défauts de transport axonal in vivo. Ces résultats suggèrent que la fonction de la HTT est conservée dans le modèle Drosophile.Le FAT est un processus qui requiert un apport constant d’énergie. Les mitochondries sont les principales sources de production d’ATP de la cellule. Cependant nous avons démontré que le FAT ne dépend non pas de cette source d’énergie là, contrairement à ce que l’on pensait, mais de l’ATP glycolytique produit par les vésicules. La dérégulation de GAPDH ou de PK, les deux enzymes glycolytiques productrices d’ATP, ralentit le transport vésiculaire. Néanmoins, l’invalidation de GAPDH n’affecte pas le transport mitochondrial. En outre, toutes les enzymes glycolytiques sont associées à des vésicules dynamiques et sont capables de produire leur propre ATP. Enfin nous montrons que l’ATP produit est suffisant pour assurer leur propre transport, prouvant l’autonomie énergétique des vésicules pour le transport.

Huntington disease (HD) is an autosomal dominant neurodegenerative disorder caused by an abnormal CAG expansion in the huntingtin (HTT) gene. The corresponding polyglutamine expansion in the HTT protein causes specific neuronal death, but the consequences of HTT mutation in other tissues are less well understood. Nevertheless, HD mutation causes peripheral symptoms as HTT is an ubiquitous protein. HD was associated to lower cancer incidence, however, the mechanisms behind this effect were not described. Here we have studied the role of wild-type and mutant HTT in breast cancer, where we found the protein to be highly expressed. We demonstrate that mouse breast cancer models (MMTV-PyVT and MMTV-ErbB2) expressing mutant HTT (knock-in mice carrying 111 CAGs) develop aggressive mammary tumors as compared to control mice. Epithelial-to-mesenchymal transition is enhanced with subsequent increased cell motility and metastasis. These tumors accumulate tyrosine-kinase receptor HER2 at the membrane, due to a dynamin-dependent endocytosis defect in the presence of mutant HTT. HER2 enhanced signaling is responsible for the aggressiveness of the mutant HTT expressing tumors, as demonstrated by Trastuzumab treatment, an antibody against HER2 that restores motility and invasion in tumor cells carrying HD mutation. The wild-type HTT has itself a protective role in cancer, inhibiting metastasis due to a possible role in cellular junction maintenance. Thus, our work unravels a key role of HTT in breast cancer progression, with the mutant HTT triggering the development of aggressive and metastatic tumors., La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative autosomale dominante causée par une expansion anormale de CAG dans le gène codant la huntingtine (HTT) qui se traduit dans la protéine HTT par une répétition de polyglutamine, entrainant la mort neuronale. Néanmoins, la MH entraine aussi le développement de symptômes périphériques comme la HTT est une protéine exprimée de façon ubiquitaire. Notamment, la MH a été associé à une plus faible incidence des cancers, mais les mécanismes sous-jacents ne sont pas décrits. Nous avons étudié le rôle de HTT mutée et sauvage dans le cancer du sein, où la protéine est fortement exprimée. Des modèles murins de cancer du sein (MMTV-PyVT et MMTV-ErbB2) exprimant la HTT mutée (souris knock-in transportant 111 GAC) développent des tumeurs mammaires agressives par rapport aux souris exprimant la HTT sauvage. La transition épithéliale-mésenchymateuse est accélérée avec une augmentation de la motilité cellulaire ainsi que de la formation de métastases. Ces tumeurs accumulent le récepteur tyrosine-kinase HER2 à la membrane, en raison d'un défaut d'endocytose dynamine-dépendante en présence de la HTT mutée. La signalisation accrue de HER2 est responsable de l'agressivité des tumeurs exprimant la HTT mutée, comme en témoigne le traitement trastuzumab, un anticorps dirigé contre HER2 qui restaure la motilité et l'invasion des cellules tumorales porteuses de la mutation responsable de la MH. La HTT sauvage a elle-même un rôle protecteur dans le cancer, retardant l’apparition des métastases en raison d'un potentiel rôle dans l’adhésion intercellulaire. Ainsi, notre travail met en évidence des rôles clés de la HTT mutée et sauvage au cours de la progression du cancer du sein.

Huntington’s disease (HD) is an autosomal dominant inherited neurodegenerative disorder caused by an abnormal polyglutamine (polyQ) expansion in the N-terminus of the protein huntingtin (HTT). A crucial step in HD pathogenesis is the cleavage of full-length HTT into smaller N-terminal (N-ter) fragments that contain the polyQ stretch and that are toxic to neurons. HTT cleavage generates short N-ter fragments whose amino-acid positions range from 1-105 to 1-586. These fragments are observed in HD post mortem brain samples and their participation in neuronal death in HD is well characterized. During my PhD research, I investigated the consequences of full-length mutant HTT proteolysis by developing a time and site-specific controlled system for HTT proteolysis. I have assessed HTT cleavage on two sites caspase-6 and cathepsin Z. My results show that HTT cleavage induces neurotoxicity in vitro as well as in vivo, toxicity which depends on HTT proteolysis pattern. Briefly, we described an intramolecular interaction within the HTT domains which is impaired upon successive proteolysis of HTT. We found that HTT intramolecular interaction buffer mutant N-ter HTT-induced toxicity. Moreover, specific cleavages of the mutant HTT generated toxic N-ter fragments as they translocate into the nucleus. To conclude, my PhD work has shown that additional cleavage of mutant HTT induces cytotoxicity by different mechanisms., La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative héréditaire autosomique dominante. Elle est due à l’expansion anormale de polyglutamine dans la partie N-terminal de la protéine huntingtine (HTT). Une des étapes clés de la pathologie est le clivage de la HTT pleine longueur en fragments N-terminaux plus petits, contenant l’expansion de polyglutamine, et qui sont toxiques pour les neurones. En effet, les clivages de la HTT mutée génère des fragments N-terminaux (N-ter) de tailles comprises entre les acides aminés 1-105 et 1-586 observés dans des extraits de cerveaux de patients MH post-mortem et dont l’implication dans la mort neuronal est bien caractérisée. Mes travaux de thèse ont visé à modéliser le clivage de la HTT et à évaluer les conséquences sur la survie neuronale.Au cours de ma thèse, j’ai développé un outil permettant de contrôler le clivage de la HTT dans le temps et à des sites spécifiques. J’ai étudié le clivage de la HTT à deux sites stratégiques : les positions clivées par la caspase-6 et par la bléomycine hydrolase/cathepsine Z. A l’aide de cet outil, j’ai montré que le clivage de la HTT confère une toxicité cellulaire qui dépend du profil du clivage. Plus précisément, J’ai décrit une interaction intramoléculaire au sein des domaines de la HTT. Mes résultats indiquent que cette interaction protège les cellules de la toxicité induite par le clivage de la HTT mutée. En effet, les clivages successifs de la HTT annulent cette interaction, ce qui induit la libération des fragments N-ter mutants et provoque la mort cellulaire à l’issue de leur translocation nucléaire. Pour conclure, au cours de ma thèse, j’ai montré que la protéolyse successive de la HTT induit des processus cytotoxiques différents.

Huntington disease (HD) is a genetic neurodegenerative disorder that affects about 6,000 people in France. Psychiatric manifestations are an important component of the early symptoms of the disease. Indeed, depressive episodes sometimes associated with generalized anxiety are commonly observed during the pre-symptomatic stages of disease. Few information is available about the reasons for this high prevalence.The allele responsible for the disease encodes a protein called huntingtin (HTT) whose polyglutamine expansion (polyQ) in the N-terminal region is longer than in the non-pathogenic HTT. Huntingtin is involved in various cellular functions including the transport and the expression of a neurotrophic factor, the Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF). This factor is also known for its role in the regulation of mood, adult hippocampal neurogenesis, and in the therapeutic response to antidepressants.We hypothesized that huntingtin, in addition to its known roles in the cortex and striatum, may play a role in the hippocampus. Thus, an impaired transport of BDNF in the hippocampus could partly explain the mood disorders observed in HD patients.By an in vivo approach using different mouse models, we demonstrated that huntingtin stimulates vesicular trafficking and secretion of BDNF in hippocampal neurons and that this action may be modulated by the polyQ mutation or by the phosphorylation status of the protein on serines 1181 and 1201. These lead to changes in signaling pathways (Akt, ERK, CREB) activated by BDNF.We also demonstrate that normal huntingtin is involved in the support provided by mature neurons to new neurons for their long-term survival and the formation of a complex dendritic arborization. BDNF is the ideal candidate to mediate these effects on hippocampal neurogenesis. Finally, normal huntingtin and its mutated forms (polyQ and phosphorylated on serines 1181 and 1201) are involved in anxiety and depressive-like phenotype in mice., La maladie de Huntington (HD) est une maladie génétique neurodégénérative qui touche environ 6000 personnes en France. Les manifestations psychiatriques sont une des composantes majeures des symptômes précoces de la pathologie. Ainsi, des épisodes dépressifs parfois associés à de l’anxiété généralisée sont communément observés au cours des stades pré-symptomatiques de la maladie. On connaît mal à l’heure actuelle les raisons de cette prévalence élevée. L'allèle responsable de la maladie code une protéine appelée huntingtine (HTT) dont l'expansion polyglutaminique (polyQ) en N-terminal est plus longue que dans la HTT non pathogénique. La huntingtine est impliquée dans diverses fonctions cellulaires et notamment dans le transport et l’expression d’un facteur neurotrophique, le Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF). Celui-ci est d’ailleurs connu pour son rôle dans la régulation des troubles de l’humeur, de la neurogénèse hippocampique chez l’adulte, ainsi que dans la réponse thérapeutique aux antidépresseurs. Nous avons émis l'hypothèse que la huntingtine, en plus de ses rôles connus dans le cortex et le striatum, puisse jouer également un rôle dans l'hippocampe. Ainsi, une altération du transport de BDNF dans l’hippocampe pourrait en partie expliquer les troubles de l’humeur observés chez les patients HD.Par une approche in vivo, en utilisant différents modèles de souris, nous avons ainsi démontré que la huntingtine stimule le trafic vésiculaire et la sécrétion de BDNF dans les neurones hippocampiques et que cette action peut être modulée par la mutation polyQ ou par le statut de phosphorylation de la protéine sur les sérines 1181 et 1201. Cela aboutit à des modifications des voies de signalisation (Akt, ERK, CREB) activées par le BDNF. Nous mettons également en évidence que la huntingtine sauvage est impliquée dans le soutien exercé par les neurones matures sur les nouveaux neurones, nécessaire à leur survie à long terme et à la formation d’une arborisation dendritique complexe. Le BDNF est l’intermédiaire idéal grâce à ses effets sur la neurogenèse hippocampique. Enfin, la huntingtine sauvage et ses formes mutées (polyQ et phosphorylation sur les sérines 1181 et 1201) sont impliquées dans le comportement anxio-dépressif des souris.

Huntington disease (HD) is an autosomal-dominant neurodegenerative disorder caused by the pathogenic expansion of the poly-glutamine (polyQ) N-terminal stretch in the huntingtin protein (HTT; encoded by HTT). HD is characterized by the dysfunction and death of neurons in the brain, leading to devastating cognitive, psychiatric, and motor symptoms in patients. Studies in multiple cell and animal model systems support the notion that polyQ expansion in mutant HTT leads to the gain of new toxic functions and loss of the neuroprotective functions of the wild-type HTT. During my thesis, I focused on the description and functional validation of a new tool to study HTT: pARIS-htt. pARIS-htt is a synthetic gene built to facilitate cloning and tagging of full-length HTT. Using different cellular approaches, we showed that pARIS-htt can replace endogenous HTT in the transport of Golgi and brain derived neurotrophic factor (BDNF) containing vesicles. pARIS-htt mutant version could not restore vesicular transport when endogenous HTT was knocked-down. Moreover, we generated pARIS-htt deletion mutants for HTT interaction domain with dynein, a minus-end directed motor protein, and huntingtin associated protein 1 (HAP1), a HTT interactor. Both deletion mutants failed to restore vesicular transport in gene replacement assays. Another aspect of my thesis was the study of HTT during mitosis. We showed that HTT monitors spindle orientation though its interaction with diverse proteins involved in cell division. This function is lost when HTT is mutated and can be reverted by Akt phosphorylation at serine 421. The control of spindle orientation is particularly important during neurogenesis since spindle orientation and the mode of division of apical progenitors are implicated in the determination of cell fate. This function of HTT is conserved in D. melanogaster. This study contributes to the understanding of HTT functions and suggests new therapeutical approaches to treat HD., La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative héréditaire autosomique dominante. Elle résulte d’une expansion anormale de glutamines (polyQ) dans la partie N-terminale de la protéine huntingtine (HTT ; codé par HTT). La MH est caractérisée par la dysfonction et la mort de cellules neuronales dans le cerveau, entraînant l’apparition de symptômes cognitifs, psychiatriques et moteurs, dévastateurs chez les patients. De nombreuses études sur des modèles animaux et cellulaires montrent que l’expansion polyQ dans la protéine mutante conduit à un gain de nouvelles fonctions toxiques, ainsi qu’à la perte de fonctions neuroprotectives de la protéine sauvage. Pendant ma thèse, je me suis intéressée à la description et à la validation fonctionnelle d’un nouvel outil pour étudier la HTT : pARIS-htt. pARIS-htt est un gène synthétique construit pour faciliter le clonage et le marquage de la protéine HTT totale. En utilisant différentes approches cellulaires, nous avons montré que pARIS-htt peut remplacer le rôle de la HTT endogène dans le transport de vésicules du Golgi ainsi que du brain derived neurotrophic factor (BDNF). La version mutante de pARIS-htt ne peut pas restaurer cette fonction. Parallèlement, nous avons généré deux variants de pARIS-htt avec soit une délétion dans la région d’interaction de la HTT avec la dynéine, moteur moléculaire se dirigeant vers l'extrémité négative des microtubules, soit avec la huntingtin associated protein 1 (HAP1), l’un de ses interacteurs. Dans les expériences de remplacement du gène, aucun des deux mutants n’a restauré le transport vésiculaire.Un autre aspect de ma thèse a été d’étudier le rôle de la HTT au cours de la mitose. Nous avons mis en évidence l’importance de la HTT dans le contrôle de l’orientation du fuseau. Cette fonction est perdue lorque la HTT est mutée, mais restaurée lorsque celle-ci est phosphorylée par Akt à la sérine 421. Le contrôle de l’orientation du fuseau est particulièrement important durant la neurogénèse puisque cette orientation ainsi que le mode de division sont impliqués dans la détermination des devenirs cellulaires. Cette fonction de la HTT est conservée chez la D. melanogaster.Cette étude a donc permis de mieux comprendre les fonctions de la HTT, et de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter la MH.

Huntington disease (HD) is a genetic neurodegenerative disorder that affects about 6,000 people in France. Psychiatric manifestations are an important component of the early symptoms of the disease. Indeed, depressive episodes sometimes associated with generalized anxiety are commonly observed during the pre-symptomatic stages of disease. Few information is available about the reasons for this high prevalence.The allele responsible for the disease encodes a protein called huntingtin (HTT) whose polyglutamine expansion (polyQ) in the N-terminal region is longer than in the non-pathogenic HTT. Huntingtin is involved in various cellular functions including the transport and the expression of a neurotrophic factor, the Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF). This factor is also known for its role in the regulation of mood, adult hippocampal neurogenesis, and in the therapeutic response to antidepressants.We hypothesized that huntingtin, in addition to its known roles in the cortex and striatum, may play a role in the hippocampus. Thus, an impaired transport of BDNF in the hippocampus could partly explain the mood disorders observed in HD patients.By an in vivo approach using different mouse models, we demonstrated that huntingtin stimulates vesicular trafficking and secretion of BDNF in hippocampal neurons and that this action may be modulated by the polyQ mutation or by the phosphorylation status of the protein on serines 1181 and 1201. These lead to changes in signaling pathways (Akt, ERK, CREB) activated by BDNF.We also demonstrate that normal huntingtin is involved in the support provided by mature neurons to new neurons for their long-term survival and the formation of a complex dendritic arborization. BDNF is the ideal candidate to mediate these effects on hippocampal neurogenesis. Finally, normal huntingtin and its mutated forms (polyQ and phosphorylated on serines 1181 and 1201) are involved in anxiety and depressive-like phenotype in mice., La maladie de Huntington (HD) est une maladie génétique neurodégénérative qui touche environ 6000 personnes en France. Les manifestations psychiatriques sont une des composantes majeures des symptômes précoces de la pathologie. Ainsi, des épisodes dépressifs parfois associés à de l’anxiété généralisée sont communément observés au cours des stades pré-symptomatiques de la maladie. On connaît mal à l’heure actuelle les raisons de cette prévalence élevée. L'allèle responsable de la maladie code une protéine appelée huntingtine (HTT) dont l'expansion polyglutaminique (polyQ) en N-terminal est plus longue que dans la HTT non pathogénique. La huntingtine est impliquée dans diverses fonctions cellulaires et notamment dans le transport et l’expression d’un facteur neurotrophique, le Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF). Celui-ci est d’ailleurs connu pour son rôle dans la régulation des troubles de l’humeur, de la neurogénèse hippocampique chez l’adulte, ainsi que dans la réponse thérapeutique aux antidépresseurs. Nous avons émis l'hypothèse que la huntingtine, en plus de ses rôles connus dans le cortex et le striatum, puisse jouer également un rôle dans l'hippocampe. Ainsi, une altération du transport de BDNF dans l’hippocampe pourrait en partie expliquer les troubles de l’humeur observés chez les patients HD.Par une approche in vivo, en utilisant différents modèles de souris, nous avons ainsi démontré que la huntingtine stimule le trafic vésiculaire et la sécrétion de BDNF dans les neurones hippocampiques et que cette action peut être modulée par la mutation polyQ ou par le statut de phosphorylation de la protéine sur les sérines 1181 et 1201. Cela aboutit à des modifications des voies de signalisation (Akt, ERK, CREB) activées par le BDNF. Nous mettons également en évidence que la huntingtine sauvage est impliquée dans le soutien exercé par les neurones matures sur les nouveaux neurones, nécessaire à leur survie à long terme et à la formation d’une arborisation dendritique complexe. Le BDNF est l’intermédiaire idéal grâce à ses effets sur la neurogenèse hippocampique. Enfin, la huntingtine sauvage et ses formes mutées (polyQ et phosphorylation sur les sérines 1181 et 1201) sont impliquées dans le comportement anxio-dépressif des souris.

Calcium regulates neuronal signaling and viability through a vast range of cellular and molecular mechanisms. However, many details of these mechanisms still remain to be elucidated. It is believed that calcium-related pathways may comprise promising therapeutic targets for the treatment of many human neurologic conditions, including those involving neurodegeneration. Therefore, achieving a better understanding of calcium-related signaling and survival pathways may lead to concrete advances in the development of new therapeutics for such conditions. In the present study we investigate the potential involvement of two such calcium-related mechanisms in the regulation of neuronal viability. In the first part of the project we assessed the potential role of the neuronal calcium sensor hippocalcin in mitigating striatal neuron death associated with Huntington's disease (HD). The rationale for these experiments comprised previous evidence for neuroprotective effects of hippocalcin in other neuronal cell types as well as data from our laboratory showing decreased hippocalcin expression in HD brain. In order to obtain basic information on hippocalcin's range of normal functions in striatal neurons, we assessed its protein-protein interactions and studied its compartmentalization and calcium-dependent trafficking in living striatal cells. Cellular trafficking experiments demonstrated the calcium-dependent translocation of hippocalcin from the nuclear and cytoplasmic compartments to the trans-Golgi network. Through protein-protein interaction studies, we identified three novel hippocalcin mitochondrial interactor proteins, thereby providing a novel potential link between hippocalcin and energy metabolism. Surprisingly, experiments designed to assess neuroprotective properties of hippocalcin revealed no effects of hippocalcin overexpression either alone or in combination with its potential effectors. These included its assessment in three models of HD-associated neurotoxicity comprised of striatal neurons exposed to mutant huntingtin, excitotoxic doses of glutamate, or mitochondrial succinate dehydrogenase inhibitors. While studying hippocalcin binding to one of the potential interactors, the β2-subunit of clathrin adaptor protein complex 2 (AP-2), we serendipitously discovered that AP-2 is hydrolyzed by the calcium-activated protease calpain. The second part of the thesis was subsequently devoted to the investigation of the role of calpain's proteolysis of AP-2 and other clathrin adaptors in regulating clathrin-mediated endocytosis (CME) and promoting neurodegeneration. Biochemical studies first confirmed that both the α- and β2-subunits of AP-2 (α- and β2-adaptins) were substrates for calpain both in vitro and in vivo. By immunopurification and amino acid sequencing of its C-terminal cleavage fragment, we subsequently defined the precise endogenous calpain cleavage site in β2-adaptin. We further demonstrated calpain cleavage of adaptins occurred in living neuronal cells exposed to glutamate. We then showed that adaptin hydrolysis was accompanied by a decrease in clathrin-mediated endocytosis of plasma membrane receptors. Truncated forms of β2-adaptin corresponding to the calpain cleavage products were demonstrated to mimic the inhibitory effects of calpain hydrolysis on CME of plasma membrane receptors, and moreover, neurons expressing these fragments showed increased sensitivity to glutamate receptor-mediated toxicity. Accessory clathrin adaptors epsin 1, adaptor protein 180 (AP180) and the clathrin assembly lymphoid myeloid leukemia protein (CALM) were also shown to be substrates of calpains in vitro. Finally, cleavage fragments of α- and β2-adaptin, epsin 1, AP180 and CALM were shown to be present in an animal model of focal brain ischemia and in postmortem samples of human Alzheimer's disease cortex. These findings show that calpain hydrolysis of clathrin adaptors comprises an important regulator of CME and suggest that excessive calpain activation may promote excitotoxic neurodegeneration through the decreased internalization of surface receptors.