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Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) assurent une production constante des cellules sanguines tout au long de la vie, mais sont vulnérables à l’acquisition de mutations pouvant mener à une transformation maligne. Les mutations qui confèrent un avantage de croissance entraîneront une prolifération clonale. L’étude de la clonalité est centrale à la compréhension de ces phénomènes. Historiquement, l’analyse de la clonalité a été possible grâce au principe de l’inactivation du chromosome X (ICX) chez les femmes qui entraîne la création de deux populations cellulaires, celle avec le X-paternel actif et celle avec le X-maternel actif. Une déviation (biais) de la proportion théorique de 1 :1 entre ces deux populations peut supposer une dominance clonale. Nous avons démontré un biais significatif de l’ICX chez les femmes avec l’âge. Ce phénomène peut être expliqué par plusieurs causes dont la sélection hémizygote (un des deux X possède des allèles plus forts que l’autre) et l’acquisition de mutations dans une CSH. Nous posons l’hypothèse que ces deux phénomènes coexistent et peuvent être distingués par une approche génomique. Nous avons recruté une cohorte de 2996 femmes canadiennes-françaises âgées entre 37 et 101 ans composée de 2172 individus issus de 321 familles et de 824 individus non apparentés. Deux tissus biologiques ont été recueillis : le sang périphérique (PMN, monocytes, lymphocytes T, lymphocytes B) et des cellules buccales. Le ratio de l’ICX a été déterminé par la méthode HUMARA, l’analyse de gènes associés à l’hématopoïèse clonale (19 gènes) a été faite par la méthode de séquençage NGS, et la cohorte a été génotypée à 700 625 loci polymorphiques de l’ADN (SNP). Des analyses bioinformatiques ont été - iv - appliquées pour étudier la contribution génétique au biais de l’ICX. Nous démontrons que : (i) le biais de l’ICX est plus prévalent dans les cellules sanguines par rapport aux cellules épithéliales et maximal dans les cellules myéloïdes; (ii) le biais augmente avec l’âge seulement dans les cellules sanguines et que cette influence est plus marquée pour les neutrophiles; (iii) la concordance du biais est très importante pour les différents types cellulaires sanguins, suggérant un mécanisme opérant au niveau de la CSH ; (iv) il y a une composante héréditaire liée au biais de l’ICX; (v) la présence de mutations acquises (TET2, DNMT3A, etc.) explique seulement une partie du biais ; (vi) à l’aide d’analyses par liaison génétique la présence d’une région sur le chromosome X à Xq21 (LOD score 4.9) qui est associée au biais des lymphocytes T et une autre sur le chromosome 1 à 1q21 (LOD score 6) qui est associée au biais des neutrophiles. Nous avons départagé la contribution liée à l’acquisition de mutations somatiques et identifié pour la première fois des régions liées à une prédisposition génétique. Nos travaux se poursuivront d’une part par l’analyse de gènes candidats dans les régions identifiées, et d’autre part nous tenterons d’identifier les cibles génétiques qui confèrent un potentiel de transformation maligne en utilisant une approche basée sur l’analyse du méthylome, de l’hydroxyméthylome et du transcriptome que nous venons de valider. Notre étude démontre la complexité de l’adaptation de l’hématopoïèse au vieillissement et ouvre des portes sur l’identification de facteurs prédisposant aux cancers hématologiques., Hematopoietic stem cells (HSC) ensure a constant lifelong production of blood cells, but are vulnerable to acquisition of mutations, which may lead to malignant transformation. Mutations that confer a growth advantage will lead to clonal derivation of cells. The study of clonality is central to the understanding of hematopoiesis adaptation to aging. Historically, the first clonality assays were based on the principle of X-chromosome inactivation (XCI) in women. Women are mosaics with half the cells with the paternal X active and the other half with the maternal one. A skewing from the theoretical 1:1 ratio between these two populations of cells could infer clonal derivation of cells. More than 20 years ago, our team demonstrated, through analysis of (XCI) in women, that skewing increases with age. This intriguing phenomenon can be explained by several etiology including hemizygous selection (one of the 2 Xs has stronger alleles) or the acquisition of mutations giving a growth advantage. The first etiology is genetically predetermined and the second, acquired in somatic cells of bone marrow. We hypothesize that these two phenomena coexist and can be distinguished with a genomic approach. To test our hypothesis, we investigated skewing in a cohort of 2996 French-Canadian women aged 37 to 101 comprised of 2172 related individuals from 321 families and 824 unrelated individuals. We analyzed XCI ratios at the HUMARA locus in epithelial cells, neutrophils, T-cells, monocytes, B-lymphocytes. We genotyped the cohort for clonal hematopoiesis and looked for germline heritable components by genome wide association studies and linkage analyses. We document that skewing was more prevalent in blood cells than in epithelial cells, and maximal in myeloid cells. Skewing increases with age only in blood cells. Intra- vi - individual correlation of skewing blood cell types was strongly correlated, suggesting selection influences operating at the HSC. Sibship analyses demonstrated heritability which was strongest when parental origin of skewing was taken into account. Clonal hematopoiesis accounted only for a small proportion of the skewing trait but its importance increased in the very old. Linkage analysis identified a region at Xq21 for skewing occurring in T-cells (LOD score 4.9) suggesting a hemizygous cell selection influence. We also identified a region at 1q21 for skewing in neutrophils (LOD score 6) suggesting a gene-gene interaction with Xlinked genes. We have demonstrated that age-associated skewing is a complex trait caused in part by acquired mutations and genetic predisposition variants. We will pursue our investigation using a candidate gene approach in the two identified regions and will try to identify genetic targets of oncogenic potential by a method based on analysis of the methylome, hydroxymethylome and transcriptome that was have validated in this cohort. This thesis demonstrates the complexity of the adaptation mechanisms of hematopoiesis to aging and set the stage to identification of factors predisposing to hematological cancers.

The objective of this PhD is the study of chronic myeloid leukemia (CML), chronic Lymphoid leukemia (CLL) and hematopoiesis with structured mathematical models. Firstly, we model CML with a system of PDEs and we identify three types of equilibrium points : the disease free, the remission and the high equilibrium points. We study the impact of the distribution of leukemic differentiated cells on the stability of the steady states and we show that there are distributions that can destabilize the remission equilibrium. Secondly, we propose and analyze four PDE models for CLL. The objective is to choose the most pertinent to describe the dynamics under treatment. We conclude that a model of competition could better explain certain clinical phenomena but at the same time a continuous model does not give more information than a discreet model of ODE. Finally, we model the hematopoiesis with a delay differential system and we conduct the stability analysis. We investigate the appearance of a Hopfbifurcation and the existence of periodic solutions, a situation that is related to hematological diseases.; L’objectif de cette thèse est d’étudier avec des modèles mathématiques structurés la leucémie myéloïde chronique (LMC), la leucémie lymphoïde chronique (LLC) et l’hématopoïèse. Dans un premier temps nous modélisons la LMC avec un système d’EDP et nous identifions trois types de points d’équilibre : l’équilibre de guérison, de rémission et les équilibres hauts. Nous étudions l’impact de la distribution des cellules leucémiques différentiées sur la stabilité des équilibres et nous montrons qu’il y a des distributions qui peuvent déstabiliser l’équilibre de rémission. Ensuite nous proposons et nous analysons quatre modèles d’EDP pour la LLC. L’objectif est de choisir le modèle le plus pertinent pour décrire sa dynamique sous traitement. Nous concluons qu’un modèle de compétition serait le meilleur choix pour expliquer certains phénomènes cliniques mais en même temps un modèle continue n’apporte pas plus d’information qu’un modèle discret d’EDO. Enfin nous modélisons l’hématopoïèse avec un modèle à retard. Nous cherchons l’apparition d’une bifurcation de Hopf et l’existence des solutions périodiques. Les oscillations des solutions du système de départ sont liées à des maladies hématologiques.

Durant l’hématopoïèse, les cellules souches hématopoïétiques peuvent soit s’autorenouveler soit se différencier dans les divers types de cellules matures constituant le système hématopoïétique. Un des modèles prédominants sur le développement du système hématopoïétique postule une différenciation par étape des différentes lignées le constituant. Ce modèle débute avec les cellules souches hématopoïétiques qui donnent naissance à des précurseurs multipotents qui peuvent à leur tour se différencier en précurseurs dédiées à la lignée lymphoïde ou myéloïde. Bien que la dernière décennie ait apporté de nombreuses connaissances sur les principales signalétiques transcriptionnelles impliquées dans le développement hématopoïétique, le détail des mécanismes moléculaires en jeu expliquant comment les cellules souches hématopoïétiques sont initialement amorcées puis complètement engagées vers une voie de différenciation reste toujours à élucider. Le travail de notre laboratoire indique que l’assemblage combinatoire du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF est un élément clé parmi les mécanismes épigénétiques qui gouvernent le destin cellulaire et notamment la famille de sous-unités Smarcd qui comporte 3 membre alternatifs Smarcd1/2/3. Des analyses du transcriptome par séquençage haut débit ont montré que l’expression de la sous-unité Smarcd1 du complexe est élevée dans le compartiment des cellules souches, les précurseurs multipotents et les progénitures lymphoïdes tandis que la sous-unité Smarcd2 est principalement exprimée dans les précurseurs myéloïdes. En utilisant des modèles de délétion conditionnelle dans des modèles murins, nous avons démontré que Smarcd1 et Smarcd2 jouent des rôles critiques et lignés spécifiques durant l’hématopoïèse. Dans un premier temps, nous avons pu montrer que Smarcd1 collabore avec le facteur de transcription de la famille bHLH E2A pour spécifier le destin lymphoïde des précurseurs multipotents et qu’elle est donc absolument essentielle pour la lymphopoïèse. Notre travail sur les mécanismes moléculaires en jeu a pu montrer que Smarcd1 interagit directement avec E2A et est nécessaire pour l’accessibilité de la chromatine sur un ensemble de régions enrichies avec les modifications d’histones H3K27ac/H3K3me1 qui marquent des régions activatrices (« enhancer ») impliquées dans l’activation d’une signature lymphoïde dans les précurseurs multipotents. Le blocage de l’interaction entre Smarcd1 et E2A inhibe l’amorce de cette signature lymphoïde et bloque l’émergence de précurseurs destinés à la voie lymphocytaire. Concernant la fonction de Smarcd2, nous avons pu montrer que cette sous-unité est absolument nécessaire pour la granulopoïèse. Les souris ayant subi une délétion génétique de Smarcd2 deviennent très rapidement neutropéniques. Ce phénotype découle d'un blocage au stade de différenciation myélocyte/métamyélocyte, tandis que les autres lignées hématopoïétiques restent non affectées par la délétion. Nous avons pu identifier le facteur de transcription C/ebpƐ comme un partenaire essentiel de Smarcd2 qui interagit avec le complexe SWI/SNF sur les promoteurs de gènes de granules secondaires afin d’en activer la transcription. Les analyses du transcriptome que nous avons effectué lorsque l’interaction de Smarcd2 et C/ebpƐ est interrompue dans des précurseurs de granulocytes ont montré une diminution de l’expression des gènes de granules secondaires liée à une maturation incomplète des granulocytes menant au développement d’un syndrome de myélodysplasie au court du temps., During hematopoiesis, hematopoietic stem cells (HSCs) either selfrenew or differentiate into all mature blood cell types through successive rounds of binary cell fate decisions. The prevailing model of hematopoiesis predicts a step-by-step model of lineage differentiation in which HSCs first give rise to multipotent progenitors that subsequently differentiate into myeloid and lymphoid restricted progenitors. Although key transcriptional pathways controlling hematopoietic development are beginning to be deciphered, detailed molecular mechanisms explaining how HSCs and progenitors are initially primed and then commit to the different hematopoietic cell lineages are lacking. Work from our laboratory indicates that combinatorial assembly of the mammalian SWI/SNF (mSWI/SNF) chromatin remodeling complex is a key epigenetic mechanism that governs cell fate decisions. Transcriptomics analyses revealed that expression of the Smarcd1 subunit is enriched in hematopoietic stem/progenitors and early lymphoid cells, while Smarcd2 is mainly expressed in myeloid progenitors. Using conditional knock-out mouse models, we demonstrated that Smarcd1 and Smarcd2 subunits perform critical and lineage-specific roles during hematopoiesis. First, we found that Smarcd1 collaborates with the bHLH transcription factor E2A to specify lymphoid cell fate during hematopoiesis and, therefore, is absolutely required for lymphopoiesis. Mechanistically, we showed that Smarcd1 physically interacts with E2A and is required for chromatin accessibility of a set of H3K27ac/H3K4me1-enriched enhancers that coordinate activation of the early lymphoid signature in hematopoietic stem cells. Impairing the interaction between Smarcd1 and E2A inhibits lymphoid lineage determination and the emergence of lymphoid-primed multipotent progenitors. Conversely, we showed that Smarcd2 is absolutely required for granulopoiesis. Smarcd2-deficient mice quickly become neutropenic due to a XIII block at the myelocyte/metamyelocyte stage of granulocyte maturation while other lineages remain unaffected. We discovered that Smarcd2 interacts with the transcription factor C/ebpε to recruit the mSWI/SNF complex on the promoter of secondary granule genes, thus inducing their transcriptional activation. As shown by transcriptomic analysis, impairing this interaction results in decreased expression of secondary granule genes, improper granulopoietic maturation, and development of a myelodysplastic-like syndrome over time. Altogether, this work identifies the Smarcd1 and Smarcd2 subunits of SWI/SNF complexes as master chromatin remodelers allowing the recruitment of lineage-specific transcription factors at key regulatory loci controlling lymphoid lineage priming and granulocyte development, respectively. More globally, these studies highlight that combinatorial assembly of alternative subunits of mSWI/SNF complexes is a key epigenetic mechanism controlling cell fate decisions during hematopoiesis.

Hematopoiesis is the production of all of the cellular components of blood. It occurs within the hematopoietic system, including organs and tissues such as the bone marrow, liver, and spleen. It begins early in the development of an embryo, well before birth, and continues all the life of an individual. During adult life, hematopoiesis occurs in the marrow of the long bones like femur and tibia, but mainly in the pelvis, cranium, vertebrae, and sternum. Hematopoiesis represents approximately 5% of total body mass in human healthy adult, 3% of total body mass in rat and 2% in dogs. In pathological conditions, the lymph nodes, liver, and spleen may regain their hematopoietic function that is called extramedullary hematopoiesis (EMH). Pathological hematopoiesis may show alterations in the number and morphology of different cell lineages in peripheral blood and mono- or multilineage cell changes in the bone marrow. Both normal and pathological hematopoiesis can be divided into two different systems, myeloid and lymphoid, according to the different lineages. Myeloid neoplasms include acute myeloid leukemia (AML) and related aggressive myeloid neoplasms, myeloproliferative neoplasms (MPN), mastocytosis, myelodysplastic syndromes (MDS), and MDS/MPN syndromes. JAK2V617F is one of the most common mutations expressed in myeloid neoplasms and more particularly in MPN where this mutation has been demonstrated as causative of the disorders. However, other genes can be abnormal in myeloid neoplasms. TP53 which encodes the tumor suppressor P53 is the most frequently mutated gene in cancers. Surprisingly, it is not one of the most mutated genes in myeloid neoplasms, however it has been suggested that TP53 could be associated to the evolution of MPN and MDS to acute leukemias. The aim of this work was first to better understand the clonal advantage of JAK2V617F mutated cells based on the hypothesis that instead of steady state JAK2V617F hematopoiesis the clonal advantage may be due to stressed JAK2V617F stem cells, and second to better delineate what is TP53 dependent or independent in MPN and verify if the TP53 inactivation can transform the MPN into AML., L'hématopoïèse est la production de tous les composants cellulaires du sang. Il se produit dans le système hématopoïétique, y compris les organes et les tissus tels que la moelle osseuse, le foie et la rate. Il commence tôt dans le développement d'un embryon, bien avant la naissance, et se poursuit toute la vie d'un individu. Au cours de la vie adulte, l'hématopoïèse se produit dans la moelle des os longs comme le fémur et le tibia, mais principalement dans le bassin, le crâne, les vertèbres et le sternum. L'hématopoïèse représente environ 5% de la masse corporelle totale chez l'homme adulte en bonne santé, 3% de la masse corporelle totale chez le rat et 2% chez le chien. Dans des conditions pathologiques, les ganglions lymphatiques, le foie et la rate peuvent retrouver leur fonction hématopoïétique appelée hématopoïèse extramédullaire (HEM). L'hématopoïèse pathologique peut montrer des altérations du nombre et de la morphologie des différentes lignées cellulaires dans le sang périphérique et des modifications cellulaires mono- ou multilignées dans la moelle osseuse. L'hématopoïèse normale et pathologique peut être divisée en deux systèmes différents, myéloïde et lymphoïde, selon les différentes lignées. Les néoplasmes myéloïdes comprennent la leucémie myéloïde aiguë (LMA) et les néoplasmes myéloïdes agressifs associés, les néoplasmes myéloprolifératifs (NPP), la mastocytose, les syndromes myélodysplasiques (SMD) et les syndromes MDS / MPN. JAK2V617F est l'une des mutations les plus courantes exprimées dans les néoplasmes myéloïdes et plus particulièrement dans le MPN où cette mutation a été démontrée comme causale des troubles. Cependant, d'autres gènes peuvent être anormaux dans les néoplasmes myéloïdes. TP53 qui code pour le suppresseur de tumeur P53 est le gène le plus fréquemment muté dans les cancers. Étonnamment, ce n'est pas l'un des gènes les plus mutés dans les néoplasmes myéloïdes, mais il a été suggéré que TP53 pourrait être associé à l'évolution du MPN et du SMD en leucémies aiguës. Le but de ce travail était d'abord de mieux comprendre l'avantage clonal des cellules mutées JAK2V617F en partant de l'hypothèse qu'au lieu de l'hématopoïèse de JAK2V617F à l'état d'équilibre, l'avantage clonal peut être dû à des cellules souches JAK2V617F stressées, et deuxièmement de mieux délimiter ce qui dépend de TP53 ou indépendant en MPN et vérifiez si l'inactivation du TP53 peut transformer le MPN en AML.

Cardiovascular diseases, particularly atherothrombosis, are the leading cause of death worldwide, but their mechanisms are not yet fully understood. Traditional cardiovascular risk factors have been known for many years, but are not enough to predict individual risk. Clonal haematopoiesis of indeterminate potential (CHIP) has been described recently; it corresponds to the clonal expansion of a population of haematopoietic cells in response to the acquisition of a somatic mutation, without any clinical or biological sign of haematological malignancy. The prevalence of this condition increases with age, reaching 10–20% of the general population aged > 70 years. Recent observational studies have shown a link between CHIP and cardiovascular diseases in humans, revealing that CHIP carriers have a higher risk of myocardial infarction, heart failure and severe aortic valve stenosis. The prognosis of these conditions also seems to be altered by the presence of CHIP. Experimental studies have identified that the immune system and inflammation – particularly interleukin-1-secreting macrophages – play a critical role in enhancing the cardiovascular consequences of CHIP, through their action on the atherosclerotic plaque and myocardial tissues. We aimed to write an extensive review of what is currently known about CHIP and its cardiovascular consequences, the pathophysiological mechanisms leading to the increased cardiovascular risk and, finally, the expected influence on our daily practice and how we care for patients with CHIP., Les maladies cardiovasculaires, en particulier l’athérosclérose, sont la principale cause de décès dans le monde, mais leur pathogénie n'est pas encore complètement élucidée. En effet, les facteurs de risque cardiovasculaires traditionnels sont bien connus depuis de nombreuses années mais ne suffisent pas à prédire le risque individuel. L'hématopoïèse clonale de potentiel indéterminé (CHIP) a été décrite récemment. Elle correspond à l'expansion clonale d'une population de cellules hématopoïétiques en réponse à l'acquisition d'une mutation somatique, sans aucun signe clinique ou biologique d’hémopathie maligne. La prévalence de cette affection augmente avec l'âge, pour atteindre 10–20 % de la population générale de plus de 70 ans. De récentes études observationnelles ont montré un lien entre la CHIP et les maladies cardiovasculaires chez l'homme, révélant que les porteurs de CHIP avaient plus de risque d'infarctus du myocarde, d'insuffisance cardiaque ou de rétrécissement aortique serré. Le pronostic de ces pathologies semble également être grevé par la présence d’une CHIP. Des études expérimentales ont par la suite mis en lumière le rôle crucial du système immunitaire et de l'inflammation, en particulier des macrophages produisant de l’interleukine-1, pour expliquer les conséquences cardiovasculaires de la CHIP, à travers leur action sur la plaque d’athérome et les tissus myocardiques. Notre objectif était d'écrire une revue approfondie de ce qui est connu actuellement sur la CHIP et ses conséquences cardiovasculaires, les mécanismes physiopathologiques conduisant au sur-risque cardiovasculaire, et enfin l'influence attendue sur notre pratique quotidienne et la façon dont nous prenons soin des patients porteurs de CHIP.

La santé cardiovasculaire, la fonction immunitaire, l'hémostase et la réponse à d'autres maladies dépendent de l'abondance et des caractéristiques spécifiques des cellules sanguines. Au fil des années, un effort considérable a été fait pour trouver les variants génétiques, les gènes et les mécanismes de régulation impliqués dans la création de ces cellules. L'inactivation d'un allèle, appelée "perte de fonction" (LoF), est un type de variant codant que nous aimerions associer aux phénotypes sanguins. Comme ces mutations ne peuvent pas être artificiellement induites chez l'humain, pour des raisons éthiques évidentes, nous observons les occurences naturelles de ces pertes de fonction et espérons que la taille des cohortes sera suffisante pour trouver des associations statistiquement significatives. L'inactivation des deux allèles, appelée "knockout" (KO), peut avoir des conséquences plus fortes qu'une simple perte de fonction. Nous espérons également trouver des KO d'origine naturelle grâce à la taille des cohortes. La combinaison de deux variants LoF différents sur les deux allèles est appelée knockout hétérozygote composé. Nous nous intéressons également aux variants non codants qui affectent l'expression des gènes impliqués dans l'hématopoïèse. Certains de ces variants créent ou perturbent des sites de liaison des facteurs de transcription (TF), ces protéines qui se lient à des séquences d'ADN spécifiques et régulent l'expression des gènes. Les sites de liaison (TFBS) des facteurs de transcription se trouvent dans les promoteurs des gènes et dans les amplificateurs spécifiques au type cellulaire. Alors que certaines de ces mutations peuvent être bénignes ou même bénéfiques, la présence d'un LoF ou d'un KO peut être trop nuisible à la survie de l'individu. Les résultats de cette étude sont limités par le biais de survie. Comparée à une étude d'association pangénomique, cette étude se concentre sur un plus petit nombre de variants génétiques pour augmenter la puissance statistique et offrir une interprétation pour les résultats statistiquement significatifs. Le programme Trans-Omics for Precision Medicine (TOPMed) recueille et garantit la qualité des 45 000 séquences du génome entier que nous avons utilisées dans cette étude, ainsi que les bilans sanguins correspondants. Grâce à ces données, nous avons pu trouver plusieurs associations connues et nouvelles entre des variants rares et des phénotypes sanguins., Cardiovascular health, immune function, hemostasis and the response to other illnesses depend on the abundance and specific features of blood cells. Over the years, a considerable effort has been made to find which genetic variants, genes and regulatory mechanisms are involved in the creation of these cells. The inactivation of an allele, called a loss-of-function (LoF), is a type of coding variant we would like to associate with blood phenotypes. For obvious ethical reasons, these mutations cannot be artificially induced in human, so we fall back on natural occurrences and hope that large cohorts will provide enough samples to find statistically significant associations. The inactivation of both alleles, called a knockout (KO), may have stronger consequences than a simple loss-of-function. We also hope to find naturally occurring knockouts thanks to the size of a large cohort. The combination of two different LoF variants is called a compound heterozygote knockout. We are also interested in non-coding variants that affect the expression of genes that are involved in hematopoiesis. Some of these variants create or disrupt the binding sites of transcription factors (TF), the proteins that bind to specific DNA sequences and regulate gene expression. Transcription factors binding sites (TFBS) are found in gene promoters and cell type specific enhancers. While some of these mutations can be benign or even beneficial, the presence of a LoF or KO may be too detrimental for the individual to survive. The results of this study are limited by survival bias. Compared to a genome-wide association study, this study focuses on a smaller number of genetic variants to increase statistical power and give an interpretation to the statistically significant findings. The Trans-Omics for Precision Medicine (TOPMed) program collects and ensures the quality of the 45,000 whole-genome sequences we used in this study, as well as the corresponding complete blood counts. Thanks to this raw data, we were able to find several known and novel associations between rare variants and blood phenotypes.

Fanconi anemia is a DNA repair deficiency syndrome associating developmental anomalies, bone marrow failure and leukemia predisposition. The principal function of the FANC/BRCA pathway is to maintain genomic stability dealing with DNA interstrand crosslinks repair and stalled replication forks. Despite the progress made in recent years, the exact mechanism by which the bone marrow failure arises is not completely understood. The objective of this project was to shed light on the cellular and molecular abnormalities characterizing the hematopoietic stem cells and their niche in Fanconi anemia. First, I demonstrated that Fanconi anemia cells are characterized by the constitutive expression of the Microphthalmia transcription factor (MiTF), which regulates hematopoietic stem cells quiescence. MiTF overexpression impacts hematopoietic stem cells self-renewal ability participating to their attrition. Hematopoietic stem cells reside in the hematopoietic niche, which comprises many different cell types contributing to their homeostasis. Among these are the osteoclasts, giant multinucleated cells of hematopoietic origin capable of bone-resorption. Since MiTF participate also to osteoclasts differentiation, we hypothesize that, following its dysregulation, osteoclasts and therefore the niche may be dysfunctional and have an impact on the bone marrow failure and the development of cancer. My data shows that indeed there are major cellular and molecular alterations in the differentiation of osteoclasts isolated from Fanca-/- mice, associated with an alteration with p53 activity. The identification of the origins and consequences on the hematopoietic stem cells of such anomalies may contribute to a better definition of the pathophysiology of Fanconi anemia and may open new therapeutic perspectives for the patients., L'anémie de Fanconi est une maladie héréditaire de la réparation de l'ADN associant anomalies du développement, aplasie médullaire et prédisposition aux leucémies. La fonction principale de la voie moléculaire FANC/BRCA est de maintenir la stabilité génomique en permettant la réparation de l’ADN endommagé et la sauvegarde des fourches de réplication bloquées. Dans un premier temps, j’ai démontré que les cellules d’anémie de Fanconi présentent une surexpression constitutive du facteur de transcription Microphtalmia (MiTF), régulateur de la quiescence des cellules souches hématopoïétiques. Cela impacte leur capacité d’auto-renouvellement et participe à leur épuisement. Les cellules souches hématopoïétiques résident dans la niche hématopoïétique, qui comprend plusieurs types cellulaires qui contribuent à leur homéostasie. Parmi ces types cellulaires se trouvent les ostéoclastes, cellules géantes multinucléées d'origine hématopoïétique et responsables de la résorption de l’os. MiTF participant également à la différenciation des ostéoclastes, j’ai émis l'hypothèse que, par suite de sa dérégulation, les ostéoclastes et la niche pouvaient être dysfonctionnels dans l'anémie de Fanconi et avoir un impact sur l'aplasie médullaire et le développement du cancer. Mes données montrent des altérations cellulaires et moléculaires majeures dans la différenciation des ostéoclastes isolés de souris modèles d’anémie de Fanconi, associé à une altération dans l’activité de p53. L’identification des origines et conséquences sur les cellules souches hématopoïétiques de telles anomalies contribuera à une meilleure définition de la pathophysiologie de l’anémie de Fanconi et pourrait ouvrir des nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), including the multipotent progenitors (MPPs), are responsible for replenishing immune cells. They reside in bone marrow (BM) endosteal and (peri)-vascular niches, which provide all cellular and molecular components required for their lifelong maintenance and fate. Among them, the CXCL12 chemokine and one of its receptor, CXCR4, exert a dominant role in promoting HSPC retention and quiescence. These processes are deregulated in the WHIM Syndrome (WS), a rare immunodeficiency caused by inherited heterozygous autosomal gain-of-function CXCR4 mutations that affect homologous desensitization of the receptor. Clinically, WS is notably characterized by severe, chronic circulating lymphopenia whose mechanisms remain to be elucidated. Using a mouse model carrying a naturally occurring WS-linked Cxcr4 mutation as well as human BM and blood samples, we explored the possibility that the lymphopenia in WS originates from defects at the HSPC level in BM. We reported that Cxcr4 desensitization is required for lymphoid differentiation of HSPCs and further identified the MPP stage as defective in mutant mice. The divergence between lymphoid and myeloid lineages occurs at the MPP stage, which is composed of distinct subpopulations, i.e., MPP2 and MPP3 are reported as distinct myeloid-biased MPP subsets that operate together with lymphoid-primed MPP4 to control blood leukocyte production. Our understanding of how cell-extrinsic niche-related and cell-intrinsic cues drive the lymphoid versus myeloid fate decision of MPPs is still fragmentary. Therefore, my PhD project aimed at determining whether and how CXCR4 signaling regulates bioenergetics demands of MPPs and at understanding how these metabolic pathways shape the lympho-myeloid fate of MPPs. We unraveled a myeloid skewing of the HSPC compartment in BM of WS mice and patients. In mutant mice, this partly relied on the contraction of the MPP4 pool and on cell-autonomous molecular and metabolic changes that reprogramed MPP4 away from lymphoid differentiation. Interestingly, chronic treatment with the CXCR4 antagonist AMD3100 normalized mitochondrial metabolism and fate of MPP4, while correcting circulating lymphopenia in WS mice. This study provides evidence that CXCR4 signaling acts as an essential gatekeeper for integrity of the mitochondrial machinery, which in turn controls lymphoid potential of MPP4.; Les cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques (CSPHs), incluant les progéniteurs multipotents (MPPs), sont responsables de la production des cellules immunes circulantes. Ils résident dans la moelle osseuse (MO) au sein de structures spécialisées, les niches endostéale et (péri)-vasculaire, qui régulent la spécification et l'engagement lymphoïde versus myéloïde des CSPHs. Dans la MO, le couple formé par la chimiokine CXCL12 et l’un de ses récepteurs, CXCR4, exerce un rôle clé dans la régulation de la rétention et la quiescence des CSPHs. Ces processus sont dérégulés dans le Syndrome WHIM (SW), une maladie immuno-hématologique rare liée à des mutations autosomiques dominantes du gène codant CXCR4, qui altèrent la désensibilisation du récepteur et conduisent à un gain de fonction en réponse à CXCL12. Cliniquement, le SW se caractérise notamment par une profonde leucopénie circulante qui affecte les lignages lymphoïde et myéloïde et dont les mécanismes restent à déterminer. Grâce à un modèle murin génétiquement modifié du SW et à l'accès à des prélèvements biologiques de patients atteints du SW, nous avons testé l'hypothèse que la lymphopénie circulante associée au SW résultait de défauts hématopoïétiques dans la MO. Nous avons révélé un rôle clé de la désensibilisation de CXCR4 dans la différenciation lymphoïde des CSPHs et identifié les MPPs comme étant le stade défectueux dans le SW. La divergence entre les lignages lymphoïde et myeloïde se produit précisément à ce stade au sein duquel règne une hétérogénéité : les MPP2/3 sont biaisés myéloïde et les MPP4 sont orientés lymphoïde. Notre compréhension de la façon dont les signaux extrinsèques (niches) et intrinsèques aux MPPs déterminent leur devenir lymphoïde versus myéloïde est encore parcellaire. Dans ce contexte, l’objectif de ma thèse a été de déterminer si et comment la signalisation de CXCR4 régule la dépendance énergétique des MPPs et à comprendre comment les voies métaboliques façonnent leur spécification lympho-myéloïde. Dans la MO des souris porteuses de la mutation gain de fonction de Cxcr4, nous avons observé une diminution du nombre de MPP4 qui contrastait avec l'augmentation des MPP2/3. L’analyse de prélèvements médullaires de patients a également permis de rapporter une diminution de la fréquence des progéniteurs lymphoïdes et une augmentation de celle des progéniteurs myéloïdes. Chez la souris mutantes, ce biais myéloïde du compartiment de MPPs s'avèrait associé à une expansion anormale et une reprogrammation moléculaire et métabolique des MPP4. Fait marquant, un traitement chronique par l’AMD3100, un antagoniste de CXCR4, permettait de normaliser le nombre de MPP4 dans la MO, de restaurer leurs propriétés métaboliques, et de corriger la lymphopénie des souris mutantes. Par conséquent, nos résultats suggèrent que l’axe CXCL12/CXCR4 est requis au maintien du potentiel lymphoïde des MPP4 au travers de la modulation de leur activité métabolique mitochondriale.

Erythro-myeloid progenitors (EMP) are developmentally restricted hematopoietic progenitors that produce the first definitive hematopoietic cells in the embryo. Importantly, it has been shown that they give rise to tissue-resident macrophages and mast cells that colonize organs during gestation and self-maintain during adult life without contribution from the bone marrow. These cells are specialized immune cells that contribute to the homeostasis of the tissues throughout steady state and tissue challenge (wounds or infections). This PhD project aimed to characterise the contribution of EMPs to the hematopoietic system of the embryo, with special focus to their niche of origin, the yolk sac. With the use of genetic mouse models, high parameter flow cytometry and single cell expression analysis, this project i) characterises the major definitive progenitor populations in the yolk sac, ii) identifies a novel pathway of direct megakaryopoiesis from EMPs and iii) uncovers two waves of EMP potential emerging at different stages. This work sheds light on the poorly characterised early definitive embryonic haematopoiesis and could have potential implications on macrophage ontogeny studies and early childhood myeloproliferative disorders.; Les progéniteurs érythro-myéloïdes (EMP) sont des progéniteurs hématopoïétiques restreints au développement qui produisent les premières cellules hématopoïétiques définitives de l'embryon. Surtout, ils donnent naissance aux mastocytes et macrophages résidents qui colonisent les différents organes pendant la gestation et s’auto-renouvellent pendant la vie adulte sans apport de la moelle osseuse. Ces cellules sont des cellules immunitaires spécialisées qui contribuent à l'homéostasie des tissus aussi bien dans les tissus sains que suite à des blessures ou des infections. Ce projet de doctorat visait à caractériser la contribution des EMP au système hématopoïétique de l'embryon, avec un accent particulier sur leur niche d'origine, le sac vitellin. En utilisant des modèles génétiques de souris, la cytométrie de flux à paramètres élevés et l'analyse de l'expression au niveau unicellulaire, ce projet i) caractérise les principales populations de progéniteurs définitifs dans le sac vitellin, ii) identifie une nouvelle voie de mégacaryopoïèse directe à partir des EMP et iii) découvre deux vagues de potentiel EMP émergeant à des stades différents du développement. Ce projet a pour but de mieux comprendre la complexité de l'hématopoïèse embryonnaire et pourrait avoir des implications sur les études d'ontogenèse des macrophages et les troubles myéloprolifératifs infantiles.

GATA transcription factors play crucial roles in various developmental processes throughout bilaterian animals. In mammals, six GATA factors are present and they play essential functions in different tissues such as the blood, the gut, the liver and the gonads. GATA proteins have two highly conserved domains, the N-terminal and the C-terminal zinc fingers. The C-terminal finger recognizes GATA DNA-binding consensus motif, while the N-terminal finger stabilizes fixation to DNA palindromic sequences and allows their interaction with cofactors of the Friend Of GATA (FOG) family. GATA zinc finger mutations are associated to a vast panel of human diseases whose severity depends on the affected GATA gene and on the position of the mutation in the zinc fingers. Numerous studies have demonstrated the high level of molecular and functional similarities existing between flies and humans. Drosophila melanogaster has five GATA factors containing either one or two zinc fingers, whose sequences are almost identical to those of the canonical zinc fingers of vertebrates. Among them, the Drosophila GATA factor Serpent (Srp) is required for the formation of blood cells, gut and fat body as well as during oogenesis. In all these tissues, two isoforms of Srp are generated through an alternative splicing event giving rise to proteins containing either both zinc fingers (N- and C-terminal, hence the name of this isoform: SrpNC) or only the C-terminal zinc finger (SrpC). In a previous work, our team has shown that SrpC and SrpNC activate some genes in a similar manner but also they regulate others differently. Moreover, interaction between SrpNC and its cofactor FOG, U-shaped, is responsible for some but not all aspects of the distinct activities of SrpC and SrpNC. The purpose of this study is to provide a deep genetic investigation of possible differential functional roles of Srp isoforms during Drosophila development. Using CRISPR/Cas9 technology, we generated two mutant fly lines deleted either of SrpC or of SrpNC. In addition, we produced a third mutant fly line in which we specifically introduced into the N-terminal zinc finger of Srp a single point mutation that alters its interaction with U-shaped. Analysis of these mutants revealed that both isoforms regulate redundantly the transcription of a common set of genes during gut development as well as few genes involved during early hematopoiesis. Surprisingly, flies devoid of SrpNC (isoform containing two-zinc fingers as the mammalian GATA factors) are viable, showing that this isoform is dispensable for most of the developmental processes controlled by Srp. [...]; Les facteurs de transcription GATA jouent un rôle crucial dans divers processus de développement chez les animaux bilatéraux. Chez les mammifères, six facteurs GATA sont présents et ils jouent des rôles essentiels dans différents tissus tels que le sang, l'intestin, le foie et les gonades. Les protéines GATA possèdent deux domaines hautement conservés, les doigts de zinc N-terminal et C-terminal. Le doigt C-terminal reconnaît le motif consensus de liaison à l'ADN GATA, tandis que le doigt N-terminal stabilise la fixation aux séquences palindromiques d'ADN et permet leur interaction avec les cofacteurs de la famille Friend Of GATA (FOG). Les mutations des doigts de zinc GATA sont associées à un vaste éventail de maladies humaines dont la gravité dépend du gène GATA affecté et de la position de la mutation dans les doigts de zinc. De nombreuses études ont démontré le haut niveau de similarités moléculaires et fonctionnelles existant entre les mouches et les humains. La drosophile possède cinq facteurs GATA contenant un ou deux doigts de zinc, dont les séquences sont presque identiques à celles des doigts de zinc canoniques des vertébrés. Parmi eux, le facteur GATA de la drosophile Serpent (Srp) est requis pour la formation des cellules sanguines, de l'intestin et du corps gras ainsi que pendant l'ovogenèse. Dans tous ces tissus, deux isoformes de Srp sont générées par un événement d'épissage alternatif donnant naissance à des protéines contenant soit les deux doigts de zinc (N- et C-terminal, d'où le nom de cette isoforme : SrpNC) ou uniquement le doigt de zinc C-terminal (SrpC). Dans un travail précédent, notre équipe a montré que SrpC et SrpNC activent certains gènes cibles de manière similaire mais aussi elles en régulent d'autres différemment. En plus, l'interaction entre SrpNC et son cofacteur FOG, U-shaped, est responsable de certaines mais pas de toutes les activités distinctes de SrpC et SrpNC. Le but de cette étude est de fournir une investigation génétique approfondie des rôles fonctionnels différentiels possibles des isoformes Srp au cours du développement de la drosophile. En utilisant la technologie CRISPR/Cas9, nous avons généré deux lignées de mouches mutantes invalidées soit pour SrpC ou pour SrpNC. En outre, nous avons produit une troisième lignée de mouche mutante dans laquelle nous avons spécifiquement introduit dans le doigt de zinc N-terminal de Srp une mutation ponctuelle qui modifie son interaction avec U-shaped. L'analyse de ces mutants a révélé que les deux isoformes régulent d'une manière redondante la transcription d'un ensemble commun de gènes au cours du développement intestinal ainsi que de quelques gènes impliqués dans l'hématopoïèse précoce.[...]

GATA transcription factors play crucial roles in various developmental processes throughout bilaterian animals. In mammals, six GATA factors are present and they play essential functions in different tissues such as the blood, the gut, the liver and the gonads. GATA proteins have two highly conserved domains, the N-terminal and the C-terminal zinc fingers. The C-terminal finger recognizes GATA DNA-binding consensus motif, while the N-terminal finger stabilizes fixation to DNA palindromic sequences and allows their interaction with cofactors of the Friend Of GATA (FOG) family. GATA zinc finger mutations are associated to a vast panel of human diseases whose severity depends on the affected GATA gene and on the position of the mutation in the zinc fingers. Numerous studies have demonstrated the high level of molecular and functional similarities existing between flies and humans. Drosophila melanogaster has five GATA factors containing either one or two zinc fingers, whose sequences are almost identical to those of the canonical zinc fingers of vertebrates. Among them, the Drosophila GATA factor Serpent (Srp) is required for the formation of blood cells, gut and fat body as well as during oogenesis. In all these tissues, two isoforms of Srp are generated through an alternative splicing event giving rise to proteins containing either both zinc fingers (N- and C-terminal, hence the name of this isoform: SrpNC) or only the C-terminal zinc finger (SrpC). In a previous work, our team has shown that SrpC and SrpNC activate some genes in a similar manner but also they regulate others differently. Moreover, interaction between SrpNC and its cofactor FOG, U-shaped, is responsible for some but not all aspects of the distinct activities of SrpC and SrpNC. The purpose of this study is to provide a deep genetic investigation of possible differential functional roles of Srp isoforms during Drosophila development. Using CRISPR/Cas9 technology, we generated two mutant fly lines deleted either of SrpC or of SrpNC. In addition, we produced a third mutant fly line in which we specifically introduced into the N-terminal zinc finger of Srp a single point mutation that alters its interaction with U-shaped. Analysis of these mutants revealed that both isoforms regulate redundantly the transcription of a common set of genes during gut development as well as few genes involved during early hematopoiesis. Surprisingly, flies devoid of SrpNC (isoform containing two-zinc fingers as the mammalian GATA factors) are viable, showing that this isoform is dispensable for most of the developmental processes controlled by Srp. [...]; Les facteurs de transcription GATA jouent un rôle crucial dans divers processus de développement chez les animaux bilatéraux. Chez les mammifères, six facteurs GATA sont présents et ils jouent des rôles essentiels dans différents tissus tels que le sang, l'intestin, le foie et les gonades. Les protéines GATA possèdent deux domaines hautement conservés, les doigts de zinc N-terminal et C-terminal. Le doigt C-terminal reconnaît le motif consensus de liaison à l'ADN GATA, tandis que le doigt N-terminal stabilise la fixation aux séquences palindromiques d'ADN et permet leur interaction avec les cofacteurs de la famille Friend Of GATA (FOG). Les mutations des doigts de zinc GATA sont associées à un vaste éventail de maladies humaines dont la gravité dépend du gène GATA affecté et de la position de la mutation dans les doigts de zinc. De nombreuses études ont démontré le haut niveau de similarités moléculaires et fonctionnelles existant entre les mouches et les humains. La drosophile possède cinq facteurs GATA contenant un ou deux doigts de zinc, dont les séquences sont presque identiques à celles des doigts de zinc canoniques des vertébrés. Parmi eux, le facteur GATA de la drosophile Serpent (Srp) est requis pour la formation des cellules sanguines, de l'intestin et du corps gras ainsi que pendant l'ovogenèse. Dans tous ces tissus, deux isoformes de Srp sont générées par un événement d'épissage alternatif donnant naissance à des protéines contenant soit les deux doigts de zinc (N- et C-terminal, d'où le nom de cette isoforme : SrpNC) ou uniquement le doigt de zinc C-terminal (SrpC). Dans un travail précédent, notre équipe a montré que SrpC et SrpNC activent certains gènes cibles de manière similaire mais aussi elles en régulent d'autres différemment. En plus, l'interaction entre SrpNC et son cofacteur FOG, U-shaped, est responsable de certaines mais pas de toutes les activités distinctes de SrpC et SrpNC. Le but de cette étude est de fournir une investigation génétique approfondie des rôles fonctionnels différentiels possibles des isoformes Srp au cours du développement de la drosophile. En utilisant la technologie CRISPR/Cas9, nous avons généré deux lignées de mouches mutantes invalidées soit pour SrpC ou pour SrpNC. En outre, nous avons produit une troisième lignée de mouche mutante dans laquelle nous avons spécifiquement introduit dans le doigt de zinc N-terminal de Srp une mutation ponctuelle qui modifie son interaction avec U-shaped. L'analyse de ces mutants a révélé que les deux isoformes régulent d'une manière redondante la transcription d'un ensemble commun de gènes au cours du développement intestinal ainsi que de quelques gènes impliqués dans l'hématopoïèse précoce.[...]

Hematopoiesis is a very tightly regulated process leading to the normal production of every blood cells in an organism. In mammals there is a lot of cell types that participate to the establishment of the defense mechanisms of the body. All those cells come from the terminal differentiation of a single cell called Hematopoietic Stem Cell (HSC) which will differentiate to give rise to committed progenitors that will eventually differentiate all blood cell types. HSCs are among the most controlled cells in the organism. Indeed, deregulation of their normal function (excessive proliferation, premature differentiation, ...) can be at the onset of severe blood pathologies called leukemias. Several molecular factors are involved in HSC regulation, and some of them, like RUNX1 and the Monocytic Leukemia Zinc-Finger protein (MOZ), are targets of mutations or chromosomal rearrangements that lead to a leukemic transformation. In Drosophila, blood cells share functional homology with the mammalian myeloid lineage, and the molecular actors controlling their formation are well conserved. Indeed, differentiation of crystal cells (CC), which have similar functions than megakaryocytes, occurs following the interaction of RUNX1 homolog, Lozenge (Lz) and GATA1 Serpent (Srp). With the aim at identifying regulators of Srp/Lz transcriptional activity, a genome-wide screen led by my team allowed the identification of enoki mushroom (enok) as a strong negative regulator of this activity. Enok is the homolog of MOZ in Drosophila, and a preliminary study in vivo showed that Enok is essential for CC development during the larval stage, as CC almost completely disappear in enok loss of function context. The objective of my PhD was to understand the mechanisms by which Enok regulates CC formation in the Drosophila larvae. During the larval stage, CC are generated by the transdifferentiation of macrophages, after their activation by the Notch signaling pathway and onset of Lz expression. In contrast to data published by another group, I demonstrated that Lz is required and sufficient to initiate the expression of the Hippo signaling pathway effector Yorkie, and not the contrary. Furthermore, using loss of function and rescue experiments, I showed that Enok is absolutely required cell autonomously in CC precursors for Lz expression but not for the proper Notch signaling which appears normal in an enok mutant context.[...]; L'hématopoïèse est un processus très finement régulé qui mène à la formation de chaque cellule sanguine d'un organisme. Chez les mammifères il existe un nombre important de types cellulaires qui participent à l'établissement des mécanismes de défense du corps. Toutes ces cellules proviennent de la différenciation terminale d'une cellule unique appelée Cellule Souche Hématopoïétique (CSH) qui, par le biais de différenciations successives donnant naissance à des progéniteurs de plus en plus spécifiés, va permettre l'établissement normal de tous les types de cellules sanguines. Les CSH sont parmi les cellules les plus finement contrôlées de l'organisme, car en effet une dérégulation de leur fonctionnement normal (prolifération excessive, différentiation prématurée...) peut entrainer de graves conséquences, à savoir des maladies du sang appelées leucémies. De nombreux facteurs moléculaires sont impliqués dans la régulation des CSH, et certains d'entre eux sont les cibles de mutations ou réarrangements chromosomiques à l'origine de leucémies, tels que le facteur de transcription RUNX1 et la Lysine Acétyl-Transférase (KAT) Monocytic Leukemia Zinc-Finger (MOZ). Chez la Drosophile, les cellules sanguines sont apparentées au lignage myéloïde des mammifères, et les acteurs moléculaires contrôlant leur formation sont très conservés. Ainsi, les cellules à cristaux (CC), qui sont les homologues fonctionnels des mégakaryocytes, sont formées suite à l'action conjointe de l'homologue de RUNX1, Lozenge (Lz) et de GATA1, Serpent (Srp). Un crible pan génomique mené par mon équipe d'accueil visant à trouver des modulateurs de l'activité transcriptionelle de Lz et Srp, a permis de d'identifier le gène enoki mushroom (enok) comme étant un régulateur négatif de cette activité. Enok est l'homologue chez la Drosophile de MOZ, et une étude préliminaire de son rôle in vivo a pu mettre en évidence une fonction essentielle dans le développement des CC, qui disparaissent quasiment en totalité dans un contexte mutant pour enok. L'objectif de ma thèse a été de comprendre les mécanismes par lesquels Enok régule la formation des CC chez la larve de Drosophile. Les CC sont générées au stade larvaire à partir de la transdifférenciation de macrophages après activation par la voie Notch, et l'initiation de Lz. Au contraire de données publiées récemment par un autre groupe, j'ai démontré que Lz est requis et suffisant pour induire l'expression de l'effecteur de la voie Hippo Yorkie, et non l'inverse. De plus, grâce à des expériences de perte de fonction et de sauvetage phénotypique, j'ai montré qu'Enok est requis pour l'expression de Lz de fac¸on autonome cellulaire dans les précurseurs de CC. [...]

Hematopoiesis is a very tightly regulated process leading to the normal production of every blood cells in an organism. In mammals there is a lot of cell types that participate to the establishment of the defense mechanisms of the body. All those cells come from the terminal differentiation of a single cell called Hematopoietic Stem Cell (HSC) which will differentiate to give rise to committed progenitors that will eventually differentiate all blood cell types. HSCs are among the most controlled cells in the organism. Indeed, deregulation of their normal function (excessive proliferation, premature differentiation, ...) can be at the onset of severe blood pathologies called leukemias. Several molecular factors are involved in HSC regulation, and some of them, like RUNX1 and the Monocytic Leukemia Zinc-Finger protein (MOZ), are targets of mutations or chromosomal rearrangements that lead to a leukemic transformation. In Drosophila, blood cells share functional homology with the mammalian myeloid lineage, and the molecular actors controlling their formation are well conserved. Indeed, differentiation of crystal cells (CC), which have similar functions than megakaryocytes, occurs following the interaction of RUNX1 homolog, Lozenge (Lz) and GATA1 Serpent (Srp). With the aim at identifying regulators of Srp/Lz transcriptional activity, a genome-wide screen led by my team allowed the identification of enoki mushroom (enok) as a strong negative regulator of this activity. Enok is the homolog of MOZ in Drosophila, and a preliminary study in vivo showed that Enok is essential for CC development during the larval stage, as CC almost completely disappear in enok loss of function context. The objective of my PhD was to understand the mechanisms by which Enok regulates CC formation in the Drosophila larvae. During the larval stage, CC are generated by the transdifferentiation of macrophages, after their activation by the Notch signaling pathway and onset of Lz expression. In contrast to data published by another group, I demonstrated that Lz is required and sufficient to initiate the expression of the Hippo signaling pathway effector Yorkie, and not the contrary. Furthermore, using loss of function and rescue experiments, I showed that Enok is absolutely required cell autonomously in CC precursors for Lz expression but not for the proper Notch signaling which appears normal in an enok mutant context.[...]; L'hématopoïèse est un processus très finement régulé qui mène à la formation de chaque cellule sanguine d'un organisme. Chez les mammifères il existe un nombre important de types cellulaires qui participent à l'établissement des mécanismes de défense du corps. Toutes ces cellules proviennent de la différenciation terminale d'une cellule unique appelée Cellule Souche Hématopoïétique (CSH) qui, par le biais de différenciations successives donnant naissance à des progéniteurs de plus en plus spécifiés, va permettre l'établissement normal de tous les types de cellules sanguines. Les CSH sont parmi les cellules les plus finement contrôlées de l'organisme, car en effet une dérégulation de leur fonctionnement normal (prolifération excessive, différentiation prématurée...) peut entrainer de graves conséquences, à savoir des maladies du sang appelées leucémies. De nombreux facteurs moléculaires sont impliqués dans la régulation des CSH, et certains d'entre eux sont les cibles de mutations ou réarrangements chromosomiques à l'origine de leucémies, tels que le facteur de transcription RUNX1 et la Lysine Acétyl-Transférase (KAT) Monocytic Leukemia Zinc-Finger (MOZ). Chez la Drosophile, les cellules sanguines sont apparentées au lignage myéloïde des mammifères, et les acteurs moléculaires contrôlant leur formation sont très conservés. Ainsi, les cellules à cristaux (CC), qui sont les homologues fonctionnels des mégakaryocytes, sont formées suite à l'action conjointe de l'homologue de RUNX1, Lozenge (Lz) et de GATA1, Serpent (Srp). Un crible pan génomique mené par mon équipe d'accueil visant à trouver des modulateurs de l'activité transcriptionelle de Lz et Srp, a permis de d'identifier le gène enoki mushroom (enok) comme étant un régulateur négatif de cette activité. Enok est l'homologue chez la Drosophile de MOZ, et une étude préliminaire de son rôle in vivo a pu mettre en évidence une fonction essentielle dans le développement des CC, qui disparaissent quasiment en totalité dans un contexte mutant pour enok. L'objectif de ma thèse a été de comprendre les mécanismes par lesquels Enok régule la formation des CC chez la larve de Drosophile. Les CC sont générées au stade larvaire à partir de la transdifférenciation de macrophages après activation par la voie Notch, et l'initiation de Lz. Au contraire de données publiées récemment par un autre groupe, j'ai démontré que Lz est requis et suffisant pour induire l'expression de l'effecteur de la voie Hippo Yorkie, et non l'inverse. De plus, grâce à des expériences de perte de fonction et de sauvetage phénotypique, j'ai montré qu'Enok est requis pour l'expression de Lz de fac¸on autonome cellulaire dans les précurseurs de CC. [...]

La Cardiotrophin-Like Cytokine (CLCF1) est une cytokine de la famille de l’IL-6 connue principalement pour ses fonctions neurotrophiques médiées par l’activation du récepteur au CNTF (CNTFR). Contrairement à son homologue le CNTF, CLCF1 est efficacement sécrété des cellules sous forme de cytokine composite avec le récepteur soluble CRLF1. Des mutations dans les gènes codants pour CLCF1 ou son partenaire de sécrétion le CRLF1 mènent au développement des syndromes CISS et Crisponi, deux syndromes sévères comprenant des phénotypes complexes similaires. L’étude des phénotypes des patients CISS et Crisponi a mené à l’hypothèse de l’existence d’importantes fonctions non redondantes de CLCF1 dans le développement et la régulation du système immunitaire. Afin de caractériser les activités immunomodulatrices de cette cytokine, nous avons initialement étudié les rôles de CLCF1 dans l’hématopoïèse. Nous avons observé que CLCF1 stimule la prolifération des cellules hématopoïétiques multipotentes et induit l’expansion de celles-ci en absence d’autres facteurs de croissance. In vivo, l’administration de la cytokine a fortement accéléré la reconstitution des cellules myéloïdes dans un modèle de transplantation congénique de moelle osseuse. Ces résultats suggèrent des rôles jusqu’alors non identifiés de CLCF1 dans la régulation de la myélopoïèse. Dans une étude subséquente, nous avons évalué la capacité de CLCF1 à moduler l’activation des cellules myéloïdes. Pour ce faire, nous avons étudié l’impact de CLCF1 sur la différenciation et la fonction des macrophages. Au cours de ce projet, nous avons déterminé que CLCF1 1) active les voies de signalisation JAK/STAT dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM), 2) induit l’augmentation de l’expression du récepteur éboueur SR-A1 et 3) favorise la formation des cellules spumeuses proathérogènes. Ensemble, ces résultats indiquent que CLCF1 pourrait être une nouvelle cible thérapeutique à étudier dans des modèles précliniques d’athérosclérose. Alors que CLCF1 a auparavant été présenté comme un facteur de stimulation des lymphocytes B, les résultats contenus dans les deux premiers articles de cette thèse suggèrent des fonctions biologiques dans la formation et la régulation des cellules myéloïdes. Parallèlement, nous avons défini de nouvelles interactions biochimiques entre CLCF1 et les lipoprotéines plasmatiques. Nous avons notamment démontré l’existence de complexes entre CLCF1 et l’apolipoprotéine E ainsi qu’avec les lipoprotéines de basse et de très basse densité. De manière intéressante, notre étude indique que les activités biologiques de CLCF1 sont modulées par des lipoprotéines de très basse densité. Ces résultats révèlent une interaction directe entre les lipoprotéines et les cytokines et suggèrent que certaines composantes métaboliques sont en mesure de moduler les fonctions immunes des cytokines. Les résultats présentés dans cette thèse ont ainsi mené à une meilleure compréhension des propriétés immunomodulatrices de la Cardiotrophin-Like cytokine et de son potentiel d’applications thérapeutiques., Cardiotrophin-Like Cytokine (CLCF1) is a cytokine of the IL-6 family recognized primarily for its neurotrophic functions mediated by CNTF receptor activation (CNTFR). In contrast to its counterpart CNTF, CLCF1 is efficiently secreted as a composite cytokine with the soluble receptor CRLF1. Mutations in the genes encoding for CLCF1 or its secretion partner CRLF1 lead to the development of CISS and Crisponi syndromes, two severe conditions associated with complex overlapping phenotypes. Studying patients’ phenotypes led us to hypothesize important, non-redundant CLCF1 functions in the development and regulation of the immune system. To characterize the immunomodulatory properties of this cytokine, we first studied the roles of CLCF1 in hematopoiesis. We observed that CLCF1 stimulates the proliferation of multipotent hematopoietic cells and induces their expansion in absence of other growth factors. In vivo, administration of the cytokine accelerated myeloid cell reconstitution in a model of congenic bone marrow transplantation. These results therefore suggest yet-unidentified roles for CLCF1 in myelopoiesis regulation. In a subsequent study, we assessed the ability of CLCF1 to modulate myeloid cell activation. Assessing the impact of CLCF1 on macrophages functions and differentiation, we determined that CLCF1 1) activates JAK/STAT signaling pathways in bone marrow-derived macrophages (BMDM), 2) induces the upregulation of scavenger receptor SR-A1 expression and 3) promotes the formation of pro-atherogenic foam cells. Altogether, these results indicate that CLCF1 may constitute a novel and attractive therapeutic target to be investigated in preclinical models of atherosclerosis. While CLCF1 has previously been recognized as a B-cell stimulating factor, the results presented in the first two articles of this thesis indicate biological functions for CLCF1 in the formation and regulation of myeloid cells. In parallel, we defined new biochemical interactions between CLCF1 and plasma lipoproteins. In particular, we have demonstrated the existence of complexes between CLCF1, apolipoprotein E, low- and very low-density lipoproteins. Furthermore, we observed that CLCF1 biological activities are modulated by very low-density lipoproteins. These results provide evidence of direct interactions between lipoproteins and cytokines and suggest that certain metabolic components modulate the immune functions of type I cytokines. In conclusion, the results summarized in this thesis have improved our understanding of CLCF1 immunomodulatory properties and of its potential therapeutic applications.

Since the new recommendations of the « Groupe Génétique et Cancer » (GGC) to perform a panel of 13 genes (including BRCA1, BRCA2 and TP53), for the diagnosis of breast and ovarian cancers predispositions, deleterious variants of low variant allele fraction (VAF) are regularly detected. It raises the question of the differential diagnoses of mosaic neomutation, clonal hematopoiesis (CH), and circulating tumor DNA (ctDNA). To answer this question, a search of patients with low VAF variants was performed on 2007 index cases analyzed by high throughput sequencing. The presence of these variants was verified by Sanger sequencing and/or SNaPshot on different available tissues such as blood, oral smear and tumor. Among the 20 patients with potentially pathogenic low VAF variants, it was possible to document a case of BRCA1 mosaic, to detect ctDNA in a patient carrying a TP53 and a PTEN variant with a VAF close to 30%, and 9 cases of CH. For the other patients, the preferred hypothesis was CH subject to accessibility to different tissues. More women were diagnosed with ovarian cancer in carriers of low VAF TP53 variants (11/18) relative to the control group (310/1388) (p < 0 .001) and they were older (67.6 vs 55.7 years, p < 0.001). This study highlights the complexity of interpreting these variants. Mosaic remains a rare event that should be explored before testing the offspring in order to avoid traumatic diagnostic errors that would result from the presence of HC or ctDNA, particularly in the cases of TP53 variants.; Depuis que le Groupe Génétique et Cancer (GGC) recommande d’effectuer le diagnostic des prédispositions aux cancers du sein et de l’ovaire par l'étude de 13 gènes par séquençage à haut débit (notamment BRCA1, BRCA2 et TP53), des variants ayant un ratio allélique (ou VAF pour "variant allele fraction") faible sont détectés régulièrement posant la question du diagnostic différentiel de néomutation en mosaïque, d'hématopoïèse clonale (HC) et d'ADN tumoral circulant (ADNtc). Pour y répondre, une recherche des patients porteurs de variants de VAF faibles a été effectuée sur 2007 cas index. La présence de ces variants a été vérifiée par Sanger et/ou SNaPshot sur différents tissus disponibles tels que le sang, les cellules jugales et la tumeur. Parmi 20 patients porteurs d’un variant potentiellement pathogène présentant une VAF faible, ont été prouvés un cas de mosaïque de BRCA1, la présence d'ADNtc chez une patiente porteuse d’un variant de TP53 et de PTEN avec une VAF proche de 30 %, et 9 cas d’HC. Pour les autres patients, l’hypothèse était l’HC sous réserve de l'accessibilité à des tissus différents. Plus de femmes étaient atteintes d'un cancer de l’ovaire chez les porteuses de variants de TP53 de faible VAF (11/18) par rapport au groupe contrôle (310/1388) (p < 0,001) et elles étaient plus âgées (67,6 vs 55,7 ans ; p < 0,001). Cette étude met en évidence la complexité d’interpréter ces variants. Les états de mosaïque restent des événements rares qu'il faut démontrer par des analyses complémentaires avant de tester les descendants pour éviter les erreurs diagnostiques traumatisantes qu'induiraient la présence d'une HC ou d'ADNtc notamment en cas de variant de TP53.

The main role of platelets is to stop bleeding. They are produced in the bone marrow by megakaryocytes (MK) that are produced by the differentiation of hematopoietic stem cells (HSC). The objective of my thesis was to identify the cellular elements of the microenvironment controlling megakaryopoiesis. My work has identified a particular population of hepatic progenitors from the fetal liver capable of promoting in vitro the early stages of megakaryopoiesis from human and murine HSC (Brouard et al., 2017). The role of endothelial cells (EC), purified from human bone marrow, in late maturation stages was studied in co-culture experiments with predifferentiated MK. My results show that these EC have the unique property in comparison with EC from other tissues, of promoting the maturation of MK. A differential transcriptional analysis identified possible effectors that could lead to a better understanding of the mechanisms of megakaryopoiesis and improve platelet production in culture., Les plaquettes sanguines ont comme rôle principal d’arrêter les saignements. Elles sont produites dans la moelle osseuse par des mégacaryocytes (MK) qui proviennent de la différenciation des cellules souches hématopoïétiques (CSH). L’objectif de ma thèse a été d’identifier les éléments cellulaires du microenvironnement contrôlant la mégacaryopoïèse. Mon travail a permis d’identifier une population particulière de progéniteurs hépatiques du foie foetal capable de promouvoir in vitro les étapes précoces de la mégacaryopoïèse à partir de CSH humaines et murines (Brouard et al., 2017). Le rôle des cellules endothéliales (EC) dans les étapes tardives de maturation a été étudié après purification à partir de moelle humaine dans des expériences de co-culture avec des MK prédifférenciés. Mes résultats montrent que ces EC ont la propriété unique, par comparaison avec des EC d’autres tissus, de promouvoir la maturation des MK. Une analyse transcriptionnelle différentielle a permis d’identifier des effecteurs possibles ouvrant des pistes pour mieux comprendre les mécanismes de la mégacaryopoïèse et pour améliorer la production des plaquettes en culture.

Enseignement Introduction La régulation de l’expression des gènes est un facteur essentiel du développement embryonnaire précoce. C’est également une partie intégrante de la transformation cancéreuse. Il n’est donc pas surprenant que de nombreux gènes maîtres du développement entretiennent des liens étroits avec les cancers. Par exemple, dans le domaine des leucémies, les plus importants régulateurs de la différenciation initiale des cellules souches hématopoïétiques ont été découverts à l’oc...

Relatório de Estágio do Mestrado em Análises Clínicas apresentado à Faculdade de Farmácia The master's degree in clinical analyses from Faculdade Farmácia Universidade de Coimbra includes a student's final practice work as part of a course unit that aims the clinical analyses technician activities exercise in a real context of work. This practice work allows the acquisition of knowledge about the automatized equipment in use as well as the manual techniques required to the analytic processing of several parameters of biological samples through the quality controls. This enables to achieve results with greater efficiency.Due to the need of a more efficient way to resolve several clinic cases, we find nowadays, guidelines that allow the execution of more precise and exact tests. This is due, largely, to the exponential development of biotechnology, which gives his contribute to the optimization of clinical approaches and guarantee of quality standards. Furthermore, it is of notice the importance of competent professionals capable of analytic data interpretation and prompting of additional tests to support the clinical diagnosis.The master's degree in clinical analyses from Faculdade Farmácia Universidade de Coimbra includes a student's final practice work as part of a course unit that aims the clinical analyses technician activities exercise in a real context of work. This practice work allows the acquisition of knowledge about the automatized equipment in use as well as the manual techniques required to the analytic processing of several parameters of biological samples through the quality controls. This enables to achieve results with greater efficiency.Due to the need of a more efficient way to resolve several clinic cases, we find nowadays, guidelines that allow the execution of more precise and exact tests. This is due, largely, to the exponential development of biotechnology, which gives his contribute to the optimization of clinical approaches and guarantee of quality standards. Furthermore, it is of notice the importance of competent professionals capable of analytic data interpretation and prompting of additional tests to support the clinical diagnosis. O Mestrado em Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra inclui como unidade curricular um estágio final que tem como objetivo o exercício da atividade de técnico superior de análises clínicas em contexto real de trabalho. Este estágio permite a obtenção de conhecimento acerca dos equipamentos automatizados utilizados, bem como as técnicas manuais necessárias para o processamento analítico de vários parâmetros de amostras biológicas através de controlos de qualidade, permitindo, assim, obter uma maior eficiência nesses resultados.Devido à necessidade de resolução de variados casos clínicos de uma forma mais eficiente existem, hoje, guidelines que permitem a execução de testes mais precisos e exatos. Isto, deve-se, em grande parte, ao desenvolvimento exponencial da biotecnologia que contribuiu para uma otimização das abordagens clínicas e garantia de padrões de qualidade. Para além disso, denota-se a importância da existência de profissionais competentes para a interpretação dos dados analíticos e sugestão de análises complementares para suporte do diagnóstico do clínico.O Mestrado em Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra inclui como unidade curricular um estágio final que tem como objetivo o exercício da atividade de técnico superior de análises clínicas em contexto real de trabalho. Este estágio permite a obtenção de conhecimento acerca dos equipamentos automatizados utilizados, bem como as técnicas manuais necessárias para o processamento analítico de vários parâmetros de amostras biológicas através de controlos de qualidade, permitindo, assim, obter uma maior eficiência nesses resultados.Devido à necessidade de resolução de variados casos clínicos de uma forma mais eficiente existem, hoje, guidelines que permitem a execução de testes mais precisos e exatos. Isto, deve-se, em grande parte, ao desenvolvimento exponencial da biotecnologia que contribuiu para uma otimização das abordagens clínicas e garantia de padrões de qualidade. Para além disso, denota-se a importância da existência de profissionais competentes para a interpretação dos dados analíticos e sugestão de análises complementares para suporte do diagnóstico do clínico.

Tese de Doutoramento em Ciências da Saúde, Interleukin (IL)-10, an anti-inflammatory cytokine produced in all immune responses, stands out as a major inhibitor of inflammation. While the effect of pro-inflammatory cytokines in hematopoiesis is well recognized, little is known about the role that anti-inflammatory cytokines portray in the homeostasis maintenance of the hematopoietic system. The work described in this Doctoral Thesis aimed at expanding the current knowledge of how IL-10 impacts hematopoietic differentiation, and to what extent anti-inflammatory scenarios can modulate hematopoietic homeostasis, contributing to the development of hematologic disorders. We described a novel mouse model of inducible IL-10 expression (pMT-10 mice) and investigated how an anti-inflammatory scenario, provided by transient IL-10 over-expression, could modulate cell maturation profiles in response to induced pathology. Our approach consisted in using a model of dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis, as IL-10 signaling, particularly in macrophages, is essential for intestinal homeostasis. pMT-10 mice pre-conditioned with IL-10 for 8 days before DSS administration showed a milder colitic phenotype. This protection was due to a reduction in the inflammatory profile of Ly6C+ cell subset. Finally, we observed that IL-10 protection against DSSinduced colitis was not long-lasting. Further studies are required to fully elucidate the cellular and molecular bases of IL-10 short-term induced protection. However, this work highlights new possibilities for the mechanisms allowing IL-10 to control intestinal inflammation. We next aimed at exploring a role for IL-10 in medullary hematopoiesis. It is well established that the cell fate decisions occurring during the hematopoietic process depend on external cues. Immunologic stress, as in the context of neoplasias and infection, changes the hematopoietic output to guarantee a constant supply of required immune cells. A role for IL-10 in hematopoiesis, although largely unknown, is expected, as several studies show the involvement of this cytokine in the pathogenesis of hematopoietic disorders. We found that IL-10 over-expression in pMT-10 mice led to several hematological alterations, namely i) increased myeloid cell production in the BM; ii) anemia; and iii) extramedullary myelopoiesis. The hematologic alterations observed required signaling through the IL-10 receptor (IL-10R) complex, since pMT-10 animals deficient in the IL-10Rα chain display a normal phenotype. Moreover, transplantation assays showed that both lymphoid and myeloid cells are key players in IL-10-driven myeloexpansion. We hope to wrap our findings by identifying the IL-10 target population and assessing the existence of other mediators involved in the phenotype. Overall, this work reveals how IL-10 over-expression impacts hematopoiesis, and adds to our understanding of the control of normal hematopoietic differentiation., A interleucina (IL)-10 é uma citocina anti-inflamatória produzida no decorrer de todas as respostas imunes, que se destaca como um importante inibidor de inflamação. Apesar de o efeito das citocinas pró-inflamatórias na hematopoiese estar bem descrito, pouco se sabe sobre o papel que as citocinas que inibem as reações inflamatórias apresentam na homeostase do sistema hematopoiético. O trabalho descrito nesta Tese de Doutoramento teve como objectivo enriquecer o conhecimento atual de como a IL-10 afeta a diferenciação hematopoiética e, em que medida cenários anti-inflamatórios podem regular a homeostase hematopoiética, levando ao desenvolvimento de doenças hematológicas. Exploramos o modo como um cenário anti-inflamatório, proporcionado por uma sobre-expressão transitória de IL-10, pode modular os perfis de maturação celular em resposta a uma patologia induzida. Para este efeito, a nossa abordagem consistiu em usar um modelo de colite induzida por DSS, pois a sinalização de IL-10, particularmente em macrófagos, é essencial para a homeostase intestinal. Usando um modelo novo de sobre-expressão condicional de IL-10 (pMT-10), précondicionamos os ratinhos com IL-10 durante 8 dias, antes da induzirmos a doença. Os animais mostraram uma patologia menos acentuada. Esta proteção foi ainda mais notória aquando de um aumento da concentração de zinco no organismo dos animais. Esta observação deve-se possivelmente a uma redução no perfil inflamatório na população de células Ly6C+. Por fim, observamos que a proteção conferida pela IL-10, contra a colite, não é persistente. Deste modo, são necessários mais estudos para esclarecer as mecanismos celulares e moleculares pelos quais a IL-10 confere uma proteção transitória contra colite. No entanto, este trabalho demonstra novas possibilidades para o mecanismo pelo qual a IL-10 controla a inflamação intestinal. Exploramos depois um papel definitivo para a IL-10 na hematopoiese. As decisões que determinam o diferente tipo de diferenciação celular, que ocorrem durante o processo hematopoiético, dependem de sinais externos. O stress imunológico, por exemplo, durante cancro e infecção, altera a produção de células hematopoiéticas, de modo garantir um fornecimento adequado de células imunes. Uma função para a IL-10 na hematopoiese é esperada, dado que vários estudos mostram o envolvimento desta citocina no desenvolvimento de doenças hematopoiéticos. Neste trabalho descobrimos que a sobre-expressão de IL-10 em ratinhos pMT-10 leva a várias alterações hematológicas, como, i) aumento da produção de células mielóides na medula; ii) anemia; e iii) mielopoiese extramedular. As alterações hematológicas observadas requerem sinalização através do receptor da IL-10 (IL-10R), uma vez que os animais pMT-10, sem o IL-10R, apresentam um fenótipo normal. Além disso, experiencias de reconstituição do sistema imune demonstraram que tanto as células linfóides como as mielóides estão envolvidas na expansão mielóide induzida pela IL-10. Esperamos fechar este mecanismo de expansão mielóide identificando a população-alvo da IL-10 e avaliando a existência de outros mediadores envolvidos no fenótipo. Em suma, este trabalho demonstra como a sobre-expressão de IL-10 afeta a hematopoiese e enriquece o nosso conhecimento sobre o controle da diferenciação hematopoiética normal., Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) through the PhD fellowship SFRH/BD/ 84704/2012 and Project grant MYELOTEN - FCT-ANR/BIM-MEC/0007/2013, FEDER - Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional funds through the COMPETE 2020 - Operacional Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portugal 2020, and by Portuguese funds through FCT in the framework of the project "Institute for Research and Innovation in Health Sciences" (POCI-01-0145-FEDER-007274), Institut Pasteur | INSERM U668 | Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur | REVIVE Future Investment Program | ANR.

The CXCL12/CXCR4 signaling axis plays an essential role in the maintenance of hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) homeostasis and constitutes a key pathway through which the niches and HSPCs communicate in the bone marrow (BM). Heterozygous gain-of-function mutations of CXCR4, which engender a truncated receptor and affect its homologous desensitization in response to CXCL12, have been reported in the WHIM Syndrome (WS); a rare immunodeficiency notably characterized by lymphopenia. The mechanisms underpinning this remain obscure. Using a mouse model harboring a naturally occurring WS-linked Cxcr4 gain-of-function mutation, we explored the possibility that the lymphopenia in WS arise from defects at the HSPC level in the BM. We showed that Cxcr4 desensitization is required for proper quiescence/cycling balance of short-term HSCs as well as their differentiation into multipotent progenitors and downstream lymphoid-biased progenitors. Thus, our results suggest that efficient Cxcr4 desensitization is critical for lymphoid differentiation of HSPCs, and its impairment is a key mechanism underpinning the lymphopenia observed in WS mice. The role of Cxcr4 desensitization in regulating such lympho-hematopoiesis process implicated both intrinsic and extrinsic properties, thus raising the question of the impact of a gain-of-Cxcr4-function mutation on BM stroma. Therefore, the main part of my PhD project was dedicated to evaluate using this relevant knock-in model the impact of Cxcr4 desensitization on maintenance of BM mesenchymal elements. We have found unexpectedly that such regulatory mechanism is intrinsically required for regulating quiescence/cycling balance of mesenchymal stem cells (MSCs) and preserving their osteogenic potential through the control of Cxcl12 expression and availability in an autocrine manner. Therefore, these findings support autocrine and paracrine actions of the Cxcl12/Cxcr4 signaling axis within MSCs to regulate osteoblast differentiation while contributing to HSPC niches and hematopoiesis., Le couple CXCL12/CXCR4 joue un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques (CSPHs) et constitue un axe clé par lequel les niches et les CSPHs communiquent au sein de la moelle osseuse (MO). Des mutations hétérozygotes du gène CXCR4, qui tronquent le domaine C-terminal de la protéine et entraînent un défaut de désensibilisation homologue de CXCR4 et une hypersensibilité à CXCL12, ont été identifiées dans le Syndrome WHIM (SW), une immunodéficience rare caractérisée notamment par une lymphopénie. Les mécanismes sous-jacents de cette anomalie restaient inconnus. Grâce à un modèle murin porteur d’une mutation gain de fonction de Cxcr4 identifiée chez certains patients et phénocopiant la lymphopénie du SW, nous avons exploré la possibilité qu’un défaut de domiciliation, de différenciation ou d’expansion des CSPHs dans la MO soit à l’origine de la lymphopénie circulante. Nous avons mis en évidence que la désensibilisation de Cxcr4 régule la balance quiescence/cycle des CSHs à court terme ainsi que leur différenciation en progéniteurs multipotents et progéniteurs engagés vers le lignage lymphoïde. Nos travaux révèlent donc que la désensibilisation de Cxcr4 est requise à la différenciation lymphoïde des CSPHs et suggèrent que l’absence de ce processus soit à l’origine de la lymphopénie observée chez les souris mutantes et, par extrapolation, chez les patients. Ces altérations lymphoïdes impliquaient à la fois des défauts intrinsèques (CSPHs) et extrinsèques (stroma), ce qui nous a conduit à considérer l’impact de la mutation gain de fonction de Cxcr4 sur le stroma médullaire. Dans ce contexte, l’objectif principal de mon projet de thèse a consisté à investiguer à l’aide du modèle murin du SW le rôle de la désensibilisation de Cxcr4 dans le maintien des composantes mésenchymateuses au sein de la MO. Nos données ont permis de mettre en lumière que la désensibilisation de Cxcr4 est intrinsèquement requise à la régulation de l’équilibre quiescence/cycle des cellules souches mésenchymateuses (CSMs), ainsi qu’à la préservation de leur potentiel ostéogénique en contrôlant l'expression et la biodisponibilité de Cxcl12 de manière autocrine. Par conséquent, nos travaux suggèrent que les actions autocrines et paracrines de l’axe de signalisation Cxcl12/Cxcr4 au sein des CSMs régulent leur différenciation en ostéoblastes tout en contribuant au maintien des niches des CSPHs et au processus d’hématopoïèse.

International audience; Membrane-bound proteinase 3 (PR3m) is the main target antigen of anti-neutrophil cytoplasmic autoantibodies (ANCA) in granulomatosis with polyangiitis, a systemic small-vessel vasculitis. Binding of ANCA to PR3m triggers neutrophil activation with the secretion of enzymatically active PR3 and related neutrophil serine proteases, thereby contributing to vascular damage. PR3 and related proteases are activated from pro-forms by the lysosomal cysteine protease cathepsin C (CatC) during neutrophil maturation. We hypothesized that pharmacological inhibition of CatC provides an effective measure to reduce PR3m and therefore has implications as a novel therapeutic approach in granulomatosis with polyangiitis. We first studied neutrophilic PR3 from 24 patients with Papillon-Lefèvre syndrome (PLS), a genetic form of CatC deficiency. PLS neutrophil lysates showed a largely reduced but still detectable (0.5-4%) PR3 activity when compared with healthy control cells. Despite extremely low levels of cellular PR3, the amount of constitutive PR3m expressed on the surface of quiescent neutrophils and the typical bimodal membrane distribution pattern were similar to what was observed in healthy neutrophils. However, following cell activation, there was no significant increase in the total amount of PR3m on PLS neutrophils, whereas the total amount of PR3m on healthy neutrophils was significantly increased. We then explored the effect of pharmacological CatC inhibition on PR3 stability in normal neutrophils using a potent cell-permeable CatC inhibitor and a CD34+ hematopoietic stem cell model. Human CD34+ hematopoietic stem cells were treated with the inhibitor during neutrophil differentiation over 10 days. We observed strong reductions in PR3m, cellular PR3 protein, and proteolytic PR3 activity, whereas neutrophil differentiation was not compromised.

By integrating different biochemical pathways and generating energy in form of ATP, through the electron transfer associated to oxidative phosphorylation (OXPHOS), mitochondria play a key role in cellular metabolism. In the hematopoietic cells, the mitochondrial metabolism appears implicated in proliferation, differentiation, activation and self-renewal regulation. In this context, the aim of my PhD work was to unravel the response of bone marrow (BM) cells, B-cells and thymocytes to OXPHOS dysfunction. To do that, we have developed two original hematopoietic cell-specific murine models deficient in the mitochondrial proteins AIF or NDUFS4. Severe (AIF KO) or moderate (NDUFS4 KO) OXPHOS dysfunction leads to pleiotropic consequences on hematopoietic development, including pancytopenia, BM aplasia, alterations in the development of the B-cell and erythroid lineages and T-cell developmental blockade at the immature stage. Strikingly, in response to OXPHOS dysfunction, BM cells stimulate anaerobic glycolysis and mitochondrial biogenesis, whereas thymocytes favor the assimilation and degradation of fatty acids. Overall my work, which included in vivo, ex vivo and in vitro approaches, underlines the relevance of OXPHOS and mitochondrial metabolism in the development of the hematopoietic cells., Les mitochondries sont des organelles qui jouent un rôle clé dans le métabolisme cellulaire en centralisant la production d'ATP à partir de nombreux substrats via la phosphorylation oxydative (OXPHOS). Les réactions enzymatiques impliquées dans ce processus régulent la prolifération, la différenciation, l'activation et l'auto renouvellement cellulaire. Le but de mon travail a été d'identifier le rôle de l'OXPHOS dans l'hématopoïèse et les mécanismes d'adaptation métabolique des cellules sanguines de la moelle, des lymphocytes B et des thymocytes à la dysfonction mitochondriale. L'atout majeur de cette étude est la génération de deux modèles murins déficients pour les protéines mitochondriales AIF ou NDUFS4 dans le système hématopoïétique. Nous avons observé que l'absence de ces protéines entraine des dysfonctions de l'OXPHOS sévère (AIF KO) ou modérée (NDUFS4 KO), entrainant des anomalies dans le développement hématopoïétique. Dans les deux modèles, en réponse au stress métabolique induit par la dysfonction de l'OXPHOS, les cellules de moelle activent la glycolyse anaérobie et la biogenèse mitochondriale tandis que les thymocytes favorisent l'assimilation et la dégradation des acides gras. Cette étude multiparamétrique, incluant des approches in vivo, ex vivo et in vitro, souligne l'importance de l'OXPHOS et du métabolisme mitochondrial dans le développement hématopoïétique.

Tese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018 Submitted by Cristina Manessiez (camanessiez@fc.ul.pt) on 2018-06-08T15:39:48Z No. of bitstreams: 1 ulfc124454_tm_José_Marques.pdf: 3458044 bytes, checksum: 17413483af67a6c1c69ae049feab1d1b (MD5) Made available in DSpace on 2018-06-08T15:40:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc124454_tm_José_Marques.pdf: 3458044 bytes, checksum: 17413483af67a6c1c69ae049feab1d1b (MD5) Previous issue date: 2018

Mantle cell lymphoma (MCL) is an aggressive lymphoid cancer characterised by iterative clinical relapses and short survival. MCL displays complex genetics and hallmarks of misregulated expression of lineage specific genes. We have hypothesized that the latter might result from corruption of H3 lysine 9 trimethylation signaling. By screening for H3K9me3 levels across a cohort of 120 MCL cases, we found global reductions in H3K9me3 in 1/3 of cases. H3K9me3 depletion was linked to underexpression / attenuated activity of SUV39H1 and SETDB1 histone methylases, respectively, and to differential expression of key cancer signatures relating to embryonic/hematopoietic stem cell function, B cell differentiation, and DNA damage response. Targeted deep sequencing did not reveal association to mutations in known epigenetic modifiers, indicating a new, previously-unsuspected role for H3K9me3 in MCL pathogenesis. In keeping with this, knockdown of SUV39H1 increased tumour growth in MCL xenografts while SETDB1 depletion induced G1/S arrest coincident to reprogramming to a pre-B cell phenotype. Taken together this identifies convergence of H3K9me3 signaling pathways to essential targets for MCL disease pathogenesis. These are currently under investigation by H3K9me3 ChIP-seq. Survival analyses in the setting of a prospective clinical trial will establish the prognostic impact of H3K9me3 in MCL., Le lymphome à cellules du manteau (LCM) est un cancer lymphoïde agressif caractérisé par des rechutes itératives et un mauvais pronostique. Le LCM est associé à une génétique complexe et à des dérégulations de gènes tissu-spécifiques, potentiellement liées à des perturbations de la marque épigénétique H3K9me3. En criblant les niveaux d’H3K9me3 dans une cohorte de 120 cas de LCM, nous avons montré une perte de cette marque dans 30% des cas. Cette perte d’H3K9me3 a été reliée à une diminution de l’expression ou de l’activité des histones methyltransferases SUV39H1 et SETDB1, et à l’expression différentielle de programmes d’expression génique associés aux cellules souches embryonnaires ou hématopoïétiques, à la différentiation B et la réponse aux dommages à l’ADN. Un séquençage à haut-débit ciblé n’a pas permis de mettre en évidence de mutations associées à cette perturbation épigénétique.Nous avons également montré qu’une invalidation de l’expression de SUV39H1 causait une augmentation du volume tumoral dans un modèle de xénogreffe et qu’une perte de SETDB1 induisait un arrêt du cycle cellulaire en phase G1/S, associé à une reprogrammation cellulaire vers un phénotype pré-B. L’ensemble de ces données suggère une convergence des voies de signalisation associées à H3K9me3 vers des cibles essentielles à la pathogénèse du LCM. Les mécanismes épigénétiques associées à la régulation de ces cibles sont actuellement étudiés par immunoprécipitation de la chromatine associée à H3K9me3. Des analyses de survie dans le cadre d’un essai clinique prospectif permettront également d’établir l’impact pronostique des pertes d’H3K9me3 dans le LCM.

The human body has more than 200 different cell types each containing an identical copy of the genome but expressing a different set of genes. The control of gene expression is ensured by a set of regulatory mechanisms acting at different scales of time and space. Several diseases are caused by a disturbance of this system, notably some cancers, and many therapeutic applications, such as regenerative medicine, rely on understanding the mechanisms of gene regulation. This thesis proposes, in a first part, an annotation algorithm (GABI) to identify recurrent patterns in the high-throughput sequencing data. The particularity of this algorithm is to take into account the variability observed in experimental replicates by optimizing the rate of false positive and false negative, increasing significantly the annotation reliability compared to the state of the art. The annotation provides simplified and robust information from a large dataset. Applied to a database of regulators activity in hematopoiesis, we propose original results, in agreement with previous studies. The second part of this work focuses on the 3D organization of the genome, intimately linked to gene expression. This structure is now accessible thanks to 3D reconstruction algorithm from contact data between chromosomes. We offer improvements to the currently most efficient algorithm of the domain, ShRec3D, allowing to adjust the reconstruction according to the user needs.; Le corps humain compte plus de 200 types cellulaires différents possédant une copie identique du génome mais exprimant un ensemble différent de gènes. Le contrôle de l'expression des gènes est assuré par un ensemble de mécanismes de régulation agissant à différentes échelles de temps et d'espace. Plusieurs maladies ont pour cause un dérèglement de ce système, notablement les certains cancers, et de nombreuses applications thérapeutiques, comme la médecine régénérative, reposent sur la compréhension des mécanismes de la régulation géniques. Ce travail de thèse propose, dans une première partie, un algorithme d'annotation (GABI) pour identifier les motifs récurrents dans les données de séquençage haut-débit. La particularité de cet algorithme est de prendre en compte la variabilité observée dans les réplicats des expériences en optimisant le taux de faux positif et de faux négatif, augmentant significativement la fiabilité de l'annotation par rapport à l'état de l'art. L'annotation fournit une information simplifiée et robuste à partir d'un grand ensemble de données. Appliquée à une base de données sur l'activité des régulateurs dans l'hématopoieïse, nous proposons des résultats originaux, en accord avec de précédentes études. La deuxième partie de ce travail s'intéresse à l'organisation 3D du génome, intimement lié à l'expression génique. Elle est accessible grâce à des algorithmes de reconstruction 3D à partir de données de contact entre chromosomes. Nous proposons des améliorations à l'algorithme le plus performant du domaine actuellement, ShRec3D, en permettant d'ajuster la reconstruction en fonction des besoins de l'utilisateur.

The adipose tissue (AT) contains a lot of leukocytes that play a fundamental role in the regulation of AT metabolic activity. In a physiological situation, AT-leukocytes mostly display an anti-inflammatory profile (M2 macrophages, eosinophils, CD4 Th2 T cells and regulatory T cells). Obesity induces a shift in AT immune cells towards a pro-inflammatory phenotype (M1 macrophages, neutrophils, CD8 and CD4 Th1 T cells). This inflammatory state contributes to the development of the metabolic syndrome. In adults, circulating leukocytes are mostly produced in the bone marrow (BM) by hematopoietic stem cells (HSC). A few years ago, we have shown AT harbors a specific resident HSC population that can renew innate immune cells and especially macrophages in the AT, via in situ differentiation. This endogenous hematopoietic activity differs according to the localization of the fat pad, suggesting that like BM-HSC, AT HSC might be controlled by their environment. Considering the important role of leukocytes in the AT physiopathology and the role of resident HSC in this tissue, the objectives of this work were the followings: 1) To characterize the role of the AT hematopoiesis in the onset of metabolic diseases. 2) To characterize the AT HSC niche from a cellular and a molecular point of view, and the regulation of their activity by this environment. 3) To demonstrate the presence of an endogenous AT-hematopoiesis in humans. First, by using transplantation of sorted AT-HSC and gain and loss of function studies we showed that some of the inflammatory AT-macrophages inducing metabolic disease originate from resident AT-HSC. Transplantation of AT-HSC sorted from high fat diet-fed (HFD) mice is sufficient to induce AT-macrophage accumulation, and to transfer metabolic disease in control mice. Conversely, the transplantation of control AT-HSC improves both AT-inflammation and glucose homeostasis in HFD mice. Second, we showed that AT-HSC are preferentially localized in the core of sub-cutaneous AT that contains beige adipocytes, instead of the periphery that mostly harbors unilocular white adipocytes. Activation or inhibition of beige adipocytes induces a loss of this preferential localization, suggesting that modifications of the subcutaneous AT core region metabolism impact HSC behavior. This suggests that beige adipocytes might be a part of a hematopoietic niche in the AT. However, we were unable to characterize the cellular and/or molecular constituants of this niche. Finally, we showed for the first time that as in mice, human AT contains resident HSC. In methylcellulose semi-solid medium, human AT-HSC are able to produce myeloid clones. In vivo, after transplantation of human AT-HSC in immunodeficient mice, human immune cells are observed in the AT. These results show that human AT exhibit a functional endogenous hematopoietic activity. Altogether, we show in this study that the AT hematopoietic activity plays a crucial role in the control of energy balance. Although AT HSC are localized preferentially at the vicinity of beige adipocytes, molecular signals controlling this population remain to be characterized. Finally, we demonstrate for the first time an endogenous hematopoiesis in human AT, highlighting the physiopathological importance of our previous results obtained in mice.; Le tissu adipeux (TA) contient un grand nombre de leucocytes qui jouent un rôle fondamental dans la régulation de l'activité métabolique du TA. Chez l'individu sain, les leucocytes du TA ont un profil majoritairement anti-inflammatoire (macrophages M2, polynucléaires éosinophiles, lymphocytes T CD4 Th2 et T régulateurs). Chez le sujet obèse, on observe une modification des populations immunitaires vers un phénotype majoritairement pro-inflammatoire (macrophages M1, polynucléaires neutrophiles, lymphocytes T CD8 et T CD4 Th1). Cet état inflammatoire participe au développement du syndrome métabolique. Chez l'adulte, les leucocytes circulants sont principalement produits dans la moelle osseuse (MO) par des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Notre équipe a montré qu'une partie des leucocytes du TA sont produits in situ grâce à la présence de CSH tissulaires spécifiques, dont l'activité hématopoïétique diffère selon le dépôt adipeux. Ce résultat suggère que les CSH du TA pourraient être contrôlées par leur niche, comme c'est le cas dans la MO. Considérant le rôle prépondérant des leucocytes dans la physiopathologie du TA et le rôle des CSH dans ce tissu, les objectifs de cette thèse ont été les suivants : 1) Caractériser le rôle de l'hématopoïèse du TA dans le développement des maladies métaboliques. 2) Caractériser d'un point de vue cellulaire et moléculaire la niche des CSH du TA et la régulation de leur activité par cet environnement. 3) Mettre en évidence et caractériser l'activité hématopoïétique du TA chez l'homme. Concernant le premier objectif, nos résultats montrent que dans un modèle de diabète induit par un régime riche en gras, les CSH du TA produisent des macrophages pro- inflammatoires ayant un rôle direct dans le développement des altérations de l'homéostasie glucidique. La greffe de CSH du TA issues d'une souris diabétique dans une souris maintenue sous régime standard induit le transfert de la pathologie. Inversement, la greffe de CSH de TA d'une souris saine dans une souris diabétique améliore le phénotype métabolique. Concernant le second objectif, nous montrons que les CSH du TA se localisent préférentiellement dans le cœur du TA sous-cutané, région principalement composée d'adipocytes beiges, alors que la périphérie, constituée d'adipocytes blancs uniloculaires héberge moins de CSH. L'activation ou l'inhibition des adipocytes beiges diminue la quantité de CSH au cœur du tissu, montrant qu'un déséquilibre du métabolisme des adipocytes beiges a un impact sur les CSH, suggérant que ces adipocytes pourraient alors faire partie d'une niche hématopoïétique. Les approches in vitro ne nous ont pas permis d'aller plus loin dans la caractérisation des acteurs cellulaires et/ou moléculaires de cette niche. Concernant le troisième objectif, nous montrons pour la première fois la présence de CSH dans le TA chez l'homme. La fonctionnalité de ces CSH a été testée in vitro et in vivo. En culture en milieu semi-solide, les CSH de TA humain sont capables de donner des clones myéloïdes, comme chez la souris. In vivo, chez des souris immuno-déficientes reconstituées avec des CSH de TA humain, on retrouve des cellules immunitaires humaines dans le tissu adipeux, ce qui démontre leur capacité à reconstituer une partie du système immunitaire de ce tissu. En conclusion, ce travail de thèse a permis de montrer que l'activité hématopoïétique du TA joue un rôle crucial dans le maintien de la balance énergétique. Les CSH du TA résideraient préférentiellement dans une niche localisée au cœur du tissu, composée d'adipocytes beiges. La caractérisation des signaux moléculaires présents dans les différentes zones du TA permettra de proposer de nouvelles hypothèses sur la régulation de l'activité des CSH du TA. Chez l'homme, notre travail a permis de mettre en évidence une hématopoïèse tissulaire endogène au tissu adipeux, renforçant ainsi l'importance physiopathologique de nos précédents résultats obtenus chez la souris.

Sepsis is a complex syndrome in which systemic infection leads to exacerbated inflammation and immunosuppression that can lead to the development of secondary infections. The progression of this syndrome is correlated with a marked decrease in the number of protective immune cells, especially dendritic cells (DCs). Studies on preclinical mouse models have shown that restoring the numbers or function of DCs decreased immunosuppression and susceptibility to infections.Conventional DC (cDCs) and monocytes are part of the system of mononuclear phagocytes, important in homeostasis and pathological conditions. Conventional DCs have a role of antigen presentation and overall orchestration of the immune system. Monocytes and their derivatives have a role of tissue cleaning and local regulation of immunity. Monocytes can also develop functions homologous to those of cDCs under certain conditions. However, recent studies have shown that DC may have different or even antagonistic roles depending on their ontogeny.These cells originate from a bipotent hematopoietic precursor restricted to these two lineages, the MDP (Monocytes and DCs progenitor). It is known that systemic infection induces the massive generation of myeloid cells at the expense of lymphocytes. This mechanism is sometimes called emergency myelopoiesis. Historically, the distinction of cDCs from cells derived from monocytes has been complicated by the very similar phenotype of these different populations. This is why many studies analysing the impact of septicemia on DCs have not evaluated the subpopulations involved in details. Recent advances have been made in the identification of cDCs and cells derived from monocytes as well as their respective haematopoietic precursors. We then sought to re-evaluate whether the emergency myelopoietic process favoured certain populations of mononuclear phagocytes in a murine model of endotoxemia.In this study, we have shown that the systemic injection of lipopolysaccharides (LPS) induces the generation of antigen-presenting cells of monocytic origin (Mo-APC) in the spleen. We observed a parallel decrease in splenic cDCs numbers. In contrast to the decrease of cDCs numbers, Mo-APC generation is dependent on type I IFNs signalling. Moreover, we observed that LPS allows the induction of active monopoiesis in the bone marrow, depending on type I IFNs signalling.In parallel, we studied a recently discovered detection pathway for intracellular LPS potentially implicated in the reduction of cDCs number following LPS injection. This detection pathway is implicated in the lethality of LPS induced endotoxic shock. It activates the non-canonical inflammasome inducing pyroptotic cell death and the production of pro-inflammatory cytokines. We observed that this signaling pathway did not appear to be involved in the reduction of the splenic cDCs following LPS injection. However, high-throughput screening revealed potential regulators of non-canonical inflammasome, and in particular in the production of pro-inflammatory cytokines.Overall, this work contributes to the improvement of our knowledge concerning the plasticity of haematopoietic precursors of mononuclear phagocytes system in pathological conditions. In the future, this knowledge could allow the development of new therapeutic strategies aimed at limiting the immunosuppression of patients through the manipulation of myelopoiesis and mononuclear phagocytes.; La septicémie est un syndrome complexe au cours duquel une infection systémique conduit à une inflammation exacerbée et une immunosuppression pouvant mener au développement d’infections secondaires. La progression de ce syndrome est corrélée avec une diminution marquée du nombre de cellules immunitaires protectrices, notamment les cellules dendritiques (DC). Des études sur des modèles précliniques murins ont montré que restaurer les effectifs ou la fonction des DC permettait de diminuer l’immunosuppression et la susceptibilité aux infections. Les DC conventionnelles (cDC) et les monocytes font partie du système des phagocytes mononucléés, cruciaux à l’homéostasie et en conditions pathologiques. Les cDC ont un rôle de présentation des antigènes et d’orchestration globale du système immunitaire. Les monocytes et leurs dérivés ont un rôle d’assainissement des tissus et de régulation locale de l’immunité. Les monocytes peuvent également développer des fonctions homologues à celles des cDC dans certaines conditions. Cependant, de récentes études ont montré que les DC pouvaient avoir des rôles différents voire antagonistes selon leur ontogénie.Ces cellules proviennent chez l’adulte d’un précurseur hématopoïétique bipotent restreint à ces deux lignées, le MDP (Monocyte and DC progenitor). Il est connu qu’une infection systémique induit la génération massive de cellules myéloïdes au détriment des lymphocytes. Ce mécanisme est parfois appelé myélopoïèse d’urgence. Historiquement, la distinction des cDC des cellules dérivées de monocytes a été compliquée par le phénotype très proche de ces différentes populations. C’est pourquoi beaucoup d’études analysant l’impact des septicémies sur les DC n’ont pas évalué en détail les sous populations impliquées. De récentes avancées ont été réalisées concernant l’identification cDC et des cellules dérivées de monocytes ainsi que de leurs précurseurs hématopoïétiques. Nous avons alors cherché à évaluer si le processus de myélopoïèse d’urgence favorisait certaines populations de phagocytes mononucléés, dans un modèle murin d’endotoxémie.Au cours de cette étude, nous avons montré que la présence systémique de lipopolysaccharides (LPS) induit la génération de cellules présentatrices d’antigènes d’origine monocytaire (Mo-APC) dans la rate. Ce phénomène est corrélé avec une diminution du nombre des cDC splénique. Contrairement à la diminution des cDC, la génération des Mo-APC est dépendante de la signalisation des IFN de type I. De plus, nous avons observé que le LPS permet l’induction d’une monopoïèse active dans la moelle osseuse, dépendamment des IFN de type I.En parallèle, nous avons souhaité étudier une voie de détection du LPS intracellulaires récemment mise en évidence et potentiellement impliquée dans la diminution du nombre des cDC suite à l’injection de LPS. Cette voie de détection impliquée dans la létalité de l’endotoxémie active l’inflammasome non canonique induisant la mort cellulaire de type pyroptose et la production de cytokines pro-inflammatoires. Nous avons observé que cette voie de signalisation ne semblait pas impliquée dans la diminution de l’effectif des cDC spléniques suite à l’injection de LPS. Cependant, un criblage à haut débit a révélé des régulateurs potentiels de l’inflammasome non canonique, et en particulier au niveau de la production des cytokines pro-inflammatoires.Dans leur ensemble, ces travaux de thèse contribuent à l’amélioration des connaissances concernant la plasticité des précurseurs hématopoïétiques du système des phagocytes mononucléés en condition pathologique. A l’avenir, ces connaissances pourraient permettre le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à limiter l’immunosuppression des patients via la manipulation de la myélopoïèse et des phagocytes mononucléés.

Fanconi anemia (FA), a genetic disorder due to mutations in one of the FANC complementation group genes involved in DNA repair, causes bone marrow failure very early during childhood. We hypothesized that the FA hematopoietic defect could begin in utero, and asked whether during embryonic development, Fanc genes defect could impair the expansion of HSC pool in response to replicative stress, from the first stages of HSCs amplification, focusing on early development times, when HSC amplification takes place both in FL and PL, i.e. E11.5 - E12.5. Our results not only reveals that a deep HSCs defect is already present very early during Fancg-/- mouse development, but also shows for the first time that this is also the case in human FA development. This HSC defect is even more important in the mouse Pl, where high naïve HSC amplification takes place. Actually, this HC/HSC defect is even more important at E12.5 than that described for Fancg-/- adult mice, and resemble more to the BM failure observed in humans. Transcriptomic analysis of HSCs sorted from Fancg-/- E12.5 FL and Pl and from the human FL showed striking highly conserved biological processes involving G protein-coupled receptors pathways, and epigenetic dysregulations, which might represent a hallmark of FA HSCs dysfunction during development. Further studies to explore these epigenetic alterations during fetal life might lead to development of new therapeutic approaches to prevent development of leukemias and cancers in FA patients., L'anémie de Fanconi (AF), maladie génétique due à des mutations dans l'un des gènes du groupe de complémentation FANC impliqués dans la réparation de l'ADN, provoque une aplasie médullaire très tôt dans l'enfance. Nous avons émis l'hypothèse que le défaut hématopoïétique de l'AF pourrait débuter dès la vie in utero et nous nous sommes demandés si un défaut des gènes Fanc pourrait compromettre l'expansion des CSH en réponse au stress réplicatif, dès les premiers stades d'amplification des CSH au cours du développement embryonnaire. Pour cela, nous avons concentré notre étude sur les temps de développement précoce, au moment où l'amplification des CSH a lieu à la fois dans le FF et le Pl, c'est-à-dire E11.5 - E12.5. Nos résultats révèlent un défaut profond des CSH très tôt au cours du développement chez la souris Fancg-/-, plus important dans le Pl de souris, où une amplification importante de CSH naïves a lieu. Ce défaut de CH / CSH à E12.5 est bien plus grave que celui décrit chez les souris adultes Fancg-/- et ressemble bien plus à la défaillance médullaire observée chez l'homme. De plus, nous avons montré pour la première fois que ce déficit en CSH est également présent dans le FF AF humain. L'analyse transcriptomique des CSH triées à partir de FF et de placenta Fancg-/- E12.5, et de FF humain ont montré des processus biologiques extrêmement conservés, impliquant les voies des récepteurs couplés aux protéines G et des dérégulations épigénétiques qui pourraient représenter une caractéristique de dysfonctionnement des CSH Fanconi au cours du développement. Des études complémentaires visant à explorer ces altérations épigénétiques pendant la vie foetale pourraient conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques afin de prévenir le développement de leucémies et de cancers chez les patients Fanconi.

La génération des cellules hématopoïétiques, aussi connue sous le nom d'hématopoïèse, est contrôlée par l’activité conjuguée de facteurs de transcription lignée-spécifiques permettant l’expression, en temps et lieu, de gènes spécifiques nécessaires pour le développement cellulaire. Dans le cadre de notre étude, nous avons étudié les facteurs de transcription KLF2 et KLF4 qui jouent des rôles cruciaux dans la formation des lymphocytes B et T. KLF2 et KLF4 activent la transcription de gènes spécifiques via leur interaction avec le co-activateur (CBP). Leurs interactions avec CBP requièrent le domaine de transactivation (TAD) qui est localisé dans la région N-terminal des facteurs KLF2 et KLF4. Des études préalables ont montré que des domaines TAD sont aussi présents chez la protéine suppresseur de tumeur p53 et que ces domaines sont requis pour les interactions entre la protéine p53 et le co-activateur CBP. Récemment, plusieurs structures des TADs de p53 en complexe avec les domaines TAZ2 et KIX de CBP ont permis de démontrer que ces TADs sont de nature acide et contiennent un motif ΦΧΧΦΦ crucial pour la formation des interactions. De plus, il s’avère que ces TADs sont similaires aux TADs de KLF2 et KLF4. L’étude présentée dans ce mémoire relate la caractérisation structurelle et fonctionnelle des interactions formées par les facteurs de transcription KLF2 et KLF4 avec leur partenaire d'interaction, CBP, pour activer la transcription de gènes spécifiques. Nos analyses ont été faites en utilisant différentes techniques telles que le titrage calorimétrique isotherme (ITC), la résonance magnétique nucléaire (RMN) ainsi que des expériences de transactivation chez la levure. Notre étude permet une meilleure compréhension des rôles opposés mais complémentaires qu'ont les protéines KLF2 et KLF4 au cours du développement et de la différentiation des lymphocytes B et T en plus de fournir les détails mécanistiques à la base de leurs interactions. Ces informations seront potentiellement utiles pour le développement d'outils à des fins thérapeutiques dans le cadre des leucémies, notamment., Hematopoietic development is regulated through a combinatorial interplay between lineage-specific activators and the general transcription factors that enables cell-specific patterns of gene expression. In this study, the transcription factors KLF2 and KLF4 play crucial roles in lymphocytes B and T development by activating transcription of specific genes through interactions with the co-activator (CBP). These interactions involve the transactivation domains (TAD) localized in the N-terminal region of KLF2 and KLF4 factors. Previous studies have shown that TADs are also found in the tumor suppressor protein p53 and these TADs are responsible for the interactions between the p53 protein and the coactivator CBP. Recently, several structures of p53TADs in complex with the TAZ2 and KIX domains of CBP have shown that these TADs are acidic and possess a ΦΧΧΦΦ motif crucial for the formation of the interaction. Interestingly, these TADs are similar to the ones found on KLF2 and KLF4. This thesis provides a structural and functional characterization of the interactions formed by the transcription factors KLF2 and KLF4, which have opposing roles, and competes for the same interacting partner CBP to activate transcription. The analysis is done using isothermal titration calorimetry (ITC), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and a yeast activation assay. This study brings a greater understanding on the opposing roles yet complementary of KLF2 and KLF4 proteins involved in B and T lymphocytes specific lineages selection and also provides information for potential therapeutic research regarding disease such as leukemia.

Submitted by Marília Salgado Caxito null (mariliasalgado@ymail.com) on 2017-02-24T00:12:23Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO (MARÍLIA SALGADO CAXITO) - Defesa em 17-02-2017.pdf: 1916563 bytes, checksum: ad7825421c4deb080f61ac2ac7c94a42 (MD5) Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-03-06T13:44:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 caxito_ms_me_bot.pdf: 1916563 bytes, checksum: ad7825421c4deb080f61ac2ac7c94a42 (MD5) Made available in DSpace on 2017-03-06T13:44:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 caxito_ms_me_bot.pdf: 1916563 bytes, checksum: ad7825421c4deb080f61ac2ac7c94a42 (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) A Ehrlichiose Monocítica Canina (EMC), causada por Ehrlichia canis, destaca-se dentre as hemoparasitoses de cães. A EMC causa doença multissistêmica e pode ser classificada em fase aguda, subclínica ou crônica. A fase crônica caracteriza-se por hipoplasia/aplasia medular e muitos cães vêm a óbito por falência medular, embora as causas da supressão medular ainda sejam indefinidas. Neste estudo, foi investigado se a fase crônica resulta de alterações medulares iniciadas na fase aguda. Em particular, verificar se, durante a fase aguda, células precursoras podem ser parasitadas por E. canis e se processos imunomediados podem ser responsáveis por alterações hematológicas durante o curso da doença. Dezoito cães com EMC na fase aguda foram submetidos a exames hematológicos (hemograma, bioquímica sérica e mielograma) e sorológicos. A presença de E. canis foi confirmada mediante PCR e cultivo celular. A citologia de medula óssea revelou alterações principalmente na série eritróide que comumente estão associadas a doenças imunomediadas, inclusive em animais não anêmicos. Também confirmou-se a presença de E. canis na medula óssea de 11/18 cães e certa tendência entre a positividade das amostras medulares e a série eritróide, embora sem significância estatística. Os títulos sorológicos de 2560 em 9/18 e 10240 nos demais confirmou a resposta humoral exacerbada descrita pela literatura, contudo também sem relação significativa com a presença de E. canis na medula e algumas variáveis medulares. Este estudo evidenciou a importância do mielograma na EMC, inclusive para predizer alterações hematológicas em cães com hemograma normal. The Canine Monocytic Ehrlichiosis (CME), caused by Ehrlichia canis, one of the most frequent hemoparasites dogs. CME causes multisystemic disease and includes a acute, subclinical or chronic phase. The chronic phase is characterized by medullary hypoplasia/aplasia and many dogs die from bone marrow failure. However, the causes of medullary suppression remain unknow. In this study, we investigated whether the chronic phase can result from marrow changes initiated during the acute phase. In particular, we evaluated if precursor cells can be parasitized by E. canis during the acute phase and whether immune-mediated processes are responsible for hematological changes during the course of the disease. Eighteen dogs with CME in the acute phase were submitted to hematological (hemogram, serum biochemistry and myelogram) and serological tests. The presence of E. canis was confirmed by PCR and cell culture. Bone marrow cytology analyses mainly revealed changes in the erythroid series that are usually associated with immune-mediated diseases, including in non-anemic animals. This study confirmed the presence of E. canis in the bone marrow of the 11/18 dogs and a potential positive relation between the positivity of the marrow samples and the erythroid series was observed, although whithout statistical significance. The serological titers of 2560 in 9/18 and 10240 in the others confirmed an exacerbated humoral response to CME described in the literature, but they were not associated with the presence of E. canis in the bone marrow and medullary alterations. This study evidenced the importance of the myelogram, as well predicting hematological alterations in dogs with normal hemogram.

Sepsis is a complex syndrome in which systemic infection leads to exacerbated inflammation and immunosuppression that can lead to the development of secondary infections. The progression of this syndrome is correlated with a marked decrease in the number of protective immune cells, especially dendritic cells (DCs). Studies on preclinical mouse models have shown that restoring the numbers or function of DCs decreased immunosuppression and susceptibility to infections.Conventional DC (cDCs) and monocytes are part of the system of mononuclear phagocytes, important in homeostasis and pathological conditions. Conventional DCs have a role of antigen presentation and overall orchestration of the immune system. Monocytes and their derivatives have a role of tissue cleaning and local regulation of immunity. Monocytes can also develop functions homologous to those of cDCs under certain conditions. However, recent studies have shown that DC may have different or even antagonistic roles depending on their ontogeny.These cells originate from a bipotent hematopoietic precursor restricted to these two lineages, the MDP (Monocytes and DCs progenitor). It is known that systemic infection induces the massive generation of myeloid cells at the expense of lymphocytes. This mechanism is sometimes called emergency myelopoiesis. Historically, the distinction of cDCs from cells derived from monocytes has been complicated by the very similar phenotype of these different populations. This is why many studies analysing the impact of septicemia on DCs have not evaluated the subpopulations involved in details. Recent advances have been made in the identification of cDCs and cells derived from monocytes as well as their respective haematopoietic precursors. We then sought to re-evaluate whether the emergency myelopoietic process favoured certain populations of mononuclear phagocytes in a murine model of endotoxemia.In this study, we have shown that the systemic injection of lipopolysaccharides (LPS) induces the generation of antigen-presenting cells of monocytic origin (Mo-APC) in the spleen. We observed a parallel decrease in splenic cDCs numbers. In contrast to the decrease of cDCs numbers, Mo-APC generation is dependent on type I IFNs signalling. Moreover, we observed that LPS allows the induction of active monopoiesis in the bone marrow, depending on type I IFNs signalling.In parallel, we studied a recently discovered detection pathway for intracellular LPS potentially implicated in the reduction of cDCs number following LPS injection. This detection pathway is implicated in the lethality of LPS induced endotoxic shock. It activates the non-canonical inflammasome inducing pyroptotic cell death and the production of pro-inflammatory cytokines. We observed that this signaling pathway did not appear to be involved in the reduction of the splenic cDCs following LPS injection. However, high-throughput screening revealed potential regulators of non-canonical inflammasome, and in particular in the production of pro-inflammatory cytokines.Overall, this work contributes to the improvement of our knowledge concerning the plasticity of haematopoietic precursors of mononuclear phagocytes system in pathological conditions. In the future, this knowledge could allow the development of new therapeutic strategies aimed at limiting the immunosuppression of patients through the manipulation of myelopoiesis and mononuclear phagocytes., La septicémie est un syndrome complexe au cours duquel une infection systémique conduit à une inflammation exacerbée et une immunosuppression pouvant mener au développement d’infections secondaires. La progression de ce syndrome est corrélée avec une diminution marquée du nombre de cellules immunitaires protectrices, notamment les cellules dendritiques (DC). Des études sur des modèles précliniques murins ont montré que restaurer les effectifs ou la fonction des DC permettait de diminuer l’immunosuppression et la susceptibilité aux infections. Les DC conventionnelles (cDC) et les monocytes font partie du système des phagocytes mononucléés, cruciaux à l’homéostasie et en conditions pathologiques. Les cDC ont un rôle de présentation des antigènes et d’orchestration globale du système immunitaire. Les monocytes et leurs dérivés ont un rôle d’assainissement des tissus et de régulation locale de l’immunité. Les monocytes peuvent également développer des fonctions homologues à celles des cDC dans certaines conditions. Cependant, de récentes études ont montré que les DC pouvaient avoir des rôles différents voire antagonistes selon leur ontogénie.Ces cellules proviennent chez l’adulte d’un précurseur hématopoïétique bipotent restreint à ces deux lignées, le MDP (Monocyte and DC progenitor). Il est connu qu’une infection systémique induit la génération massive de cellules myéloïdes au détriment des lymphocytes. Ce mécanisme est parfois appelé myélopoïèse d’urgence. Historiquement, la distinction des cDC des cellules dérivées de monocytes a été compliquée par le phénotype très proche de ces différentes populations. C’est pourquoi beaucoup d’études analysant l’impact des septicémies sur les DC n’ont pas évalué en détail les sous populations impliquées. De récentes avancées ont été réalisées concernant l’identification cDC et des cellules dérivées de monocytes ainsi que de leurs précurseurs hématopoïétiques. Nous avons alors cherché à évaluer si le processus de myélopoïèse d’urgence favorisait certaines populations de phagocytes mononucléés, dans un modèle murin d’endotoxémie.Au cours de cette étude, nous avons montré que la présence systémique de lipopolysaccharides (LPS) induit la génération de cellules présentatrices d’antigènes d’origine monocytaire (Mo-APC) dans la rate. Ce phénomène est corrélé avec une diminution du nombre des cDC splénique. Contrairement à la diminution des cDC, la génération des Mo-APC est dépendante de la signalisation des IFN de type I. De plus, nous avons observé que le LPS permet l’induction d’une monopoïèse active dans la moelle osseuse, dépendamment des IFN de type I.En parallèle, nous avons souhaité étudier une voie de détection du LPS intracellulaires récemment mise en évidence et potentiellement impliquée dans la diminution du nombre des cDC suite à l’injection de LPS. Cette voie de détection impliquée dans la létalité de l’endotoxémie active l’inflammasome non canonique induisant la mort cellulaire de type pyroptose et la production de cytokines pro-inflammatoires. Nous avons observé que cette voie de signalisation ne semblait pas impliquée dans la diminution de l’effectif des cDC spléniques suite à l’injection de LPS. Cependant, un criblage à haut débit a révélé des régulateurs potentiels de l’inflammasome non canonique, et en particulier au niveau de la production des cytokines pro-inflammatoires.Dans leur ensemble, ces travaux de thèse contribuent à l’amélioration des connaissances concernant la plasticité des précurseurs hématopoïétiques du système des phagocytes mononucléés en condition pathologique. A l’avenir, ces connaissances pourraient permettre le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à limiter l’immunosuppression des patients via la manipulation de la myélopoïèse et des phagocytes mononucléés.

The human body has more than 200 different cell types each containing an identical copy of the genome but expressing a different set of genes. The control of gene expression is ensured by a set of regulatory mechanisms acting at different scales of time and space. Several diseases are caused by a disturbance of this system, notably some cancers, and many therapeutic applications, such as regenerative medicine, rely on understanding the mechanisms of gene regulation. This thesis proposes, in a first part, an annotation algorithm (GABI) to identify recurrent patterns in the high-throughput sequencing data. The particularity of this algorithm is to take into account the variability observed in experimental replicates by optimizing the rate of false positive and false negative, increasing significantly the annotation reliability compared to the state of the art. The annotation provides simplified and robust information from a large dataset. Applied to a database of regulators activity in hematopoiesis, we propose original results, in agreement with previous studies. The second part of this work focuses on the 3D organization of the genome, intimately linked to gene expression. This structure is now accessible thanks to 3D reconstruction algorithm from contact data between chromosomes. We offer improvements to the currently most efficient algorithm of the domain, ShRec3D, allowing to adjust the reconstruction according to the user needs., Le corps humain compte plus de 200 types cellulaires différents possédant une copie identique du génome mais exprimant un ensemble différent de gènes. Le contrôle de l'expression des gènes est assuré par un ensemble de mécanismes de régulation agissant à différentes échelles de temps et d'espace. Plusieurs maladies ont pour cause un dérèglement de ce système, notablement les certains cancers, et de nombreuses applications thérapeutiques, comme la médecine régénérative, reposent sur la compréhension des mécanismes de la régulation géniques. Ce travail de thèse propose, dans une première partie, un algorithme d'annotation (GABI) pour identifier les motifs récurrents dans les données de séquençage haut-débit. La particularité de cet algorithme est de prendre en compte la variabilité observée dans les réplicats des expériences en optimisant le taux de faux positif et de faux négatif, augmentant significativement la fiabilité de l'annotation par rapport à l'état de l'art. L'annotation fournit une information simplifiée et robuste à partir d'un grand ensemble de données. Appliquée à une base de données sur l'activité des régulateurs dans l'hématopoieïse, nous proposons des résultats originaux, en accord avec de précédentes études. La deuxième partie de ce travail s'intéresse à l'organisation 3D du génome, intimement lié à l'expression génique. Elle est accessible grâce à des algorithmes de reconstruction 3D à partir de données de contact entre chromosomes. Nous proposons des améliorations à l'algorithme le plus performant du domaine actuellement, ShRec3D, en permettant d'ajuster la reconstruction en fonction des besoins de l'utilisateur.

During my PhD, I worked on the development of an information theory based algorithm allowing the reconstruction of a wide variety of graphical model classes from observationnal datas. This method also allows to tackle the effect of latent (unobserved) latent variables ; which is essential given the difficultyto observe a biological/clinical system as a whole. Our method, called Miic (for Multivariate Information-based Inductive Causation), starts from a complete network (all nodes are connected to each other), and iteratively removes non essential edges from it. The second part of my thesis was to analyze and interpret the networks reconstructed from two kinds of biological datasets : Genomic dataset on one hand : Miic was used to learn networks of transcriptomic interactions driving the differentiation of the first hematopoietic cells of the embryo. Clinical datasets on the other hand : Miic was also used on two datasets extracted from two distinct cohort, obtained thanks to two collaborations, with la Pitié-Salpétrière (neurology dataset) and with Institut Curie Hospital (breast cancer dataset). The testing during Miic development, along with the results obtained when we analyzed the different applications presented in this manuscript show Miic’s efficiency at both confirming already known interactions, and getting previously unknown associations., L’algorithme développé durant ma thèse utilise la théorie de l’information pour l’apprentissage d’une grande variété de classes de modèles graphiques à partir de données issues uniquement de l’observation d’un système. Il permet également de prendre en compte les effets de variables dites « latentes » c’est-à-dire non observées durant l’expérimentation, un problème majeur de ce domaine de recherche. Notre méthode, baptisée Miic (Multivariate Information-based Inductive Causation), part d’un réseau entièrement connecté, et supprime de façon itérative les liens non essentiels à l’explication des données. La seconde partie de mon travail de thèse a été d’analyser les réseaux reconstruits sur deux types de données biologiques. Des données génomiques d’une part : Miic a été utilisé pour reconstituer les réseaux d’interactions transcriptomiques entre les facteurs de transcriptions responsables de la différentiation des premières cellules hématopoïétiques de l’embryon. Des données cliniques d’autre part : Miic a également été utilisé sur deux jeux de données issus de deux cohortes distinctes, obtenues grâce à des collaborations avec la Pitié-Salpétrière (données de neurologie) et avec l’Institut Curie (données sur le cancer du sein). Nous démontrons l’apport de la reconstruction de modèles graphiques sur l’analyse et la compréhension de ces données. Les tests réalisés durant le développement ainsi que les résultats obtenus via l’analyse des résultats des différentes applications présentées dans ce manuscrit démontrent l’efficacité de Miic non seulement pour la détection de relations précédemment inconnues, mais également pour le contrôle de la qualité de données de ce type.

Background: Crohn's disease (CD) pathogenesis is multifactorial involving genetic and environmental factors. Loss of function mutations in the nucleotide oligomerization domain 2 (NOD2) gene are the main genetic risk factor for CD. Like patients with CD, Nod2(KO) mice are characterized by an enhanced Th1 immune response and a defective mucosal barrier function evidenced by increased intestinal permeability. We previously showed that the latter is related to hematopoietic Nod2 deficiency. Our aim was to explore the mechanisms by which Nod2 expressed in the hematopoietic and in the nonhematopoietic compartments interplay to control epithelial paracellular permeability. Methods: Depletion of CD4(+) T cells in Nod2(KO) mice and treatments with inhibitors were conducted in chimeric mice transplanted with bone marrow cells from Nod2-deficient donors into Nod2-sufficient recipients or vice versa. Caco-2 cells overexpressing a NOD2 gene which did or did not include a CD-associated polymorphism were treated with inhibitors or siRNAs and cocultured with hematopoietic cells from Peyer's patches. Results: In vivo and in vitro Nod2 in hematopoietic cells regulates epithelial paracellular permeability through cytokine production influencing myosin light chain kinase (MLCK) activity. Indeed, tumor necrosis factor-a and interferon-g secretion by CD4(+) T cells upregulated expression and activity of epithelial MLCK leading to increased epithelial tight junction opening. When stimulated by muramyl dipeptide, Nod2 in the nonhematopoietic compartment normalized the permeability and T-cell cytokine secretion and regulated MLCK activity. This MLCK regulation is mediated by TAK1 and RICK-dependent mechanisms. Conclusions: Our study demonstrates how hematopoietic and nonhematopoietic Nod2 regulate intestinal barrier function, improving our knowledge on the mechanisms involved in CD pathogenesis.

Stem cells (SCs) differ from progenitors and differentiated cells on many aspects. Notably, SCs display particular characteristics in fundamental cellular processes, and ribosome biogenesis (RiBi) has recently been proposed to play an important role in the regulation of SCs. During my thesis, I have used various approaches to study the role and regulation of RiBi in SC populations, using in vivo and ex vivo mouse models.Using genetic inactivation of the RiBi factor Notchless (Nle), I have participated to the analysis of its role in the adult hematopoietic system and intestinal epithelium, and in the establishment of the first cell lineages during early embryogenesis. In vivo, constitutive Nle deficiency causes early embryonic lethality, and I showed ex vivo that Nle inactivation in embryonic SCs induces a ribosomal stress response mediated by the tumor suppressor p53, and proliferation/survival defects. Conditional Nle inactivation in the adult mouse also induces activation of p53 in hematopoietic and intestinal SCs in vivo, leading to their rapid elimination.In parallel, I have used different methods to analyze the RiBi activity of hematopoietic SCs (HSCs) and immature progenitors at homeostasis, in vivo in the adult mouse. Thus, I have unraveled variations in the RiBi activity of these populations, and notably uncovered previously unsuspected RiBi activity in HSCs despite their quiescent state.Altogether, my work supports the hypothesis of a role for RiBi in the regulation of SCs and provides better understanding of the activity of this process during hematopoietic differentiation.; Les cellules souches (CS) se démarquent des progéniteurs et cellules différenciées à de nombreux égards. Notamment, les CS présentent des caractéristiques particulières dans des processus cellulaires fondamentaux, et il a été récemment proposé que la biogenèse des ribosomes (BiRi) participe à la régulation des CS. Pendant ma thèse, j’ai utilisé diverses approches pour étudier le rôle et la régulation de la BiRi dans des populations de CS, in vivo et ex vivo dans des modèles murins.Grâce à un modèle d’inactivation génétique du facteur de BiRi Notchless (Nle), j’ai participé à l’étude de son rôle dans le lignage hématopoïétique et l’épithélium intestinal adultes, et cours du développement embryonnaire précoce. In vivo, la perte constitutive de Nle entraîne une létalité embryonnaire, et j’ai montré ex vivo que l’inactivation de Nle dans des CS embryonnaires induit une réponse au stress ribosomique médiée par le suppresseur de tumeur p53, et des défauts de prolifération/survie. L’induction de la perte de Nle chez l’adulte active également p53 dans les CS hématopoïétiques et intestinale, entraînant leur rapide élimination.En parallèle, j’ai utilisé plusieurs méthodes pour mesurer l’activité de BiRi des progéniteurs immatures et CS hématopoïétiques (CSH) à l’homéostasie, in vivo chez la souris adulte. J’ai ainsi mis en évidence des variations de l’activité de BiRi dans ces populations, révélant notamment une activité de BiRi des CSH jusqu’ici insoupçonnée du fait de leur quiescence.Dans l’ensemble, mon travail renforce l’idée d’un rôle de la BiRi dans la régulation des CS, et apporte une meilleure compréhension de la régulation de ce processus dans le lignage hématopoïétique.

Stem cells (SCs) differ from progenitors and differentiated cells on many aspects. Notably, SCs display particular characteristics in fundamental cellular processes, and ribosome biogenesis (RiBi) has recently been proposed to play an important role in the regulation of SCs. During my thesis, I have used various approaches to study the role and regulation of RiBi in SC populations, using in vivo and ex vivo mouse models.Using genetic inactivation of the RiBi factor Notchless (Nle), I have participated to the analysis of its role in the adult hematopoietic system and intestinal epithelium, and in the establishment of the first cell lineages during early embryogenesis. In vivo, constitutive Nle deficiency causes early embryonic lethality, and I showed ex vivo that Nle inactivation in embryonic SCs induces a ribosomal stress response mediated by the tumor suppressor p53, and proliferation/survival defects. Conditional Nle inactivation in the adult mouse also induces activation of p53 in hematopoietic and intestinal SCs in vivo, leading to their rapid elimination.In parallel, I have used different methods to analyze the RiBi activity of hematopoietic SCs (HSCs) and immature progenitors at homeostasis, in vivo in the adult mouse. Thus, I have unraveled variations in the RiBi activity of these populations, and notably uncovered previously unsuspected RiBi activity in HSCs despite their quiescent state.Altogether, my work supports the hypothesis of a role for RiBi in the regulation of SCs and provides better understanding of the activity of this process during hematopoietic differentiation.; Les cellules souches (CS) se démarquent des progéniteurs et cellules différenciées à de nombreux égards. Notamment, les CS présentent des caractéristiques particulières dans des processus cellulaires fondamentaux, et il a été récemment proposé que la biogenèse des ribosomes (BiRi) participe à la régulation des CS. Pendant ma thèse, j’ai utilisé diverses approches pour étudier le rôle et la régulation de la BiRi dans des populations de CS, in vivo et ex vivo dans des modèles murins.Grâce à un modèle d’inactivation génétique du facteur de BiRi Notchless (Nle), j’ai participé à l’étude de son rôle dans le lignage hématopoïétique et l’épithélium intestinal adultes, et cours du développement embryonnaire précoce. In vivo, la perte constitutive de Nle entraîne une létalité embryonnaire, et j’ai montré ex vivo que l’inactivation de Nle dans des CS embryonnaires induit une réponse au stress ribosomique médiée par le suppresseur de tumeur p53, et des défauts de prolifération/survie. L’induction de la perte de Nle chez l’adulte active également p53 dans les CS hématopoïétiques et intestinale, entraînant leur rapide élimination.En parallèle, j’ai utilisé plusieurs méthodes pour mesurer l’activité de BiRi des progéniteurs immatures et CS hématopoïétiques (CSH) à l’homéostasie, in vivo chez la souris adulte. J’ai ainsi mis en évidence des variations de l’activité de BiRi dans ces populations, révélant notamment une activité de BiRi des CSH jusqu’ici insoupçonnée du fait de leur quiescence.Dans l’ensemble, mon travail renforce l’idée d’un rôle de la BiRi dans la régulation des CS, et apporte une meilleure compréhension de la régulation de ce processus dans le lignage hématopoïétique.