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Radiotherapy is the main modality in cancer treatment but is associated with radiation damages on healthy tissues. Endothelial cells (ECs) play a key role in the evolution of radiation-induced normal tissue injuries. Cellular senescence is a powerful tumor suppressor mechanism but, long-term senescence is deleterious for tissue homeostasis. The presence of senescent cells within the radiation-induced lesions has been shown but their role is not well understood. We aimed to identify and understand the molecular mechanisms involved in radiation-induced senescence (RIS) and its role in radiation-induced lung injuries after stereotactic irradiation. In vivo, using luciferase knock-in mice (p16Ink4-LUC) to detect activation of a senescence player, we explored the presence of senescent cells in radiation-induced pulmonary injury. After high-dose lung irradiation of p16Ink4-LUC mice and using bioluminescence imaging we showed the overexpression of p16 in the irradiation field and its persistence up to 21 months after radiation exposure. Immunostainings revealed a panel of heterogeneous senescent cells including pneumocytes, macrophages and ECs. mRNA expression of 44 genes involved in senescence in 6 human primary irradiated ECs revealed that Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) are the most relevant in term of gene expression. The dynamic molecular profile associated to RIS in HUVECs was analyzed after 9 doses and 7 time points. Using a deep mathematical/bioinformatics analysis, we deciphered the dynamical transcriptional program involved in RIS and we identified IL1-signaling pathway as a key molecular hub which could modulate the senescence phenotype.; La radiothérapie constitue l’une des principales modalités de traitement des cancers, mais elle est associée à des atteintes radio-induites aux tissus sains. Les cellules endothéliales (CE) du système vasculaire sont connues pour participer à l’évolution de ces lésions. La sénescence cellulaire est un puissant mécanisme suppresseur de tumeurs mais sa persistance est délétère pour l’homéostasie tissulaire. La présence de cellules sénescentes dans les lésions radio-induites est déjà démontrée mais leur rôle reste encore à élucider. Nous avons cherché à identifier et à comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la sénescence radio-induite (SRI) ainsi que son rôle dans le développement des lésions après irradiation pulmonaire en conditions stéréotaxiques. In vivo, à l’aide de souris exprimant le gène de la luciférase, placé sous le contrôle de p16, acteur majeur de la sénescence, nous avons détecté des cellules sénescentes au sein de la lésion radio-induite. Nous avons observé par imagerie bioluminescente l’activation de p16 dans le champ d’irradiation et sa persistance jusqu’à 21 mois après irradiation. L’analyse des poumons a révélé une forte hétérogénéité des populations de cellules sénescentes, notamment des pneumocytes, des macrophages et des CE. L’analyse transcriptionnelle de 44 gènes liés à la sénescence, sur 6 types de CE, a montré que les CE de veine ombilicale (HUVEC) sont les plus pertinentes pour étudier la SRI. Le profil moléculaire dynamique des HUVEC a été analysé après 9 doses d’irradiation à différents pas de temps. Une analyse mathématique et bio-informatique approfondie a identifié la voie de l’IL-1 comme acteur clef impactant la sénescence.

Radiotherapy is the main modality in cancer treatment but is associated with radiation damages on healthy tissues. Endothelial cells (ECs) play a key role in the evolution of radiation-induced normal tissue injuries. Cellular senescence is a powerful tumor suppressor mechanism but, long-term senescence is deleterious for tissue homeostasis. The presence of senescent cells within the radiation-induced lesions has been shown but their role is not well understood. We aimed to identify and understand the molecular mechanisms involved in radiation-induced senescence (RIS) and its role in radiation-induced lung injuries after stereotactic irradiation. In vivo, using luciferase knock-in mice (p16Ink4-LUC) to detect activation of a senescence player, we explored the presence of senescent cells in radiation-induced pulmonary injury. After high-dose lung irradiation of p16Ink4-LUC mice and using bioluminescence imaging we showed the overexpression of p16 in the irradiation field and its persistence up to 21 months after radiation exposure. Immunostainings revealed a panel of heterogeneous senescent cells including pneumocytes, macrophages and ECs. mRNA expression of 44 genes involved in senescence in 6 human primary irradiated ECs revealed that Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) are the most relevant in term of gene expression. The dynamic molecular profile associated to RIS in HUVECs was analyzed after 9 doses and 7 time points. Using a deep mathematical/bioinformatics analysis, we deciphered the dynamical transcriptional program involved in RIS and we identified IL1-signaling pathway as a key molecular hub which could modulate the senescence phenotype.; La radiothérapie constitue l’une des principales modalités de traitement des cancers, mais elle est associée à des atteintes radio-induites aux tissus sains. Les cellules endothéliales (CE) du système vasculaire sont connues pour participer à l’évolution de ces lésions. La sénescence cellulaire est un puissant mécanisme suppresseur de tumeurs mais sa persistance est délétère pour l’homéostasie tissulaire. La présence de cellules sénescentes dans les lésions radio-induites est déjà démontrée mais leur rôle reste encore à élucider. Nous avons cherché à identifier et à comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la sénescence radio-induite (SRI) ainsi que son rôle dans le développement des lésions après irradiation pulmonaire en conditions stéréotaxiques. In vivo, à l’aide de souris exprimant le gène de la luciférase, placé sous le contrôle de p16, acteur majeur de la sénescence, nous avons détecté des cellules sénescentes au sein de la lésion radio-induite. Nous avons observé par imagerie bioluminescente l’activation de p16 dans le champ d’irradiation et sa persistance jusqu’à 21 mois après irradiation. L’analyse des poumons a révélé une forte hétérogénéité des populations de cellules sénescentes, notamment des pneumocytes, des macrophages et des CE. L’analyse transcriptionnelle de 44 gènes liés à la sénescence, sur 6 types de CE, a montré que les CE de veine ombilicale (HUVEC) sont les plus pertinentes pour étudier la SRI. Le profil moléculaire dynamique des HUVEC a été analysé après 9 doses d’irradiation à différents pas de temps. Une analyse mathématique et bio-informatique approfondie a identifié la voie de l’IL-1 comme acteur clef impactant la sénescence.

EPA:DHA 6:1 omega-3 formulation has been shown to induce a sustained endothelial NO synthase-derived formation of nitric oxide. This study examined if the intake of EPA:DHA 6:1 improves an established ageing-related endothelial dysfunction. Ageing-related endothelial dysfunction was characterized by a blunted NO-mediated component of relaxation, abolished EDH-mediated component and increased COX-derived endothelium-dependent contractile responses. Ageing increased vascular oxidative stress, expression of NADPH oxidase subunits, COX-2, eNOS, ACE, AT1R, and senescence markers, whereas COX-1 was down-regulated. Chronic intake of EPA:DHA 6:1 improved the NO-mediated relaxations, reduced EDCFs, vascular oxidative stress and normalized the expression of protein markers. In conclusion, chronic intake of EPA:DHA 6:1 prevented the ageing-related endothelial dysfunction in old rats, most likely by preventing activation of the local angiotensin system and the subsequent vascular oxidative stress., La présente étude évalue la capacité de la formulation d’oméga-3 EPA:DHA 6:1, une formulation capable d’induire la formation continue de monoxyde d’azote par la NO synthase endothéliale, à améliorer la dysfonction endothéliale liée à l’âge établie chez le rat. La dysfonction endothéliale liée à l’âge est caractérisée par une altération des composantes de la relaxation et une augmentation des réponses contractiles dépendantes de l’endothélium. L’âge augmente le stress oxydant vasculaire, l’expression de la NADPH oxydase, COX-2, eNOS, ACE, AT1R, et des marqueurs de senescence, alors que la COX-1 est sous-exprimé. La formulation EPA:DHA 6:1 améliore la composante NO, diminue l’EDCF et le stress oxydant vasculaire, et normalise l’expression des protéines cibles. En conclusion, la consommation chronique de EPA:DHA 6:1 améliore la dysfonction endothéliale liée à l’âge chez le rat, probablement en prévenant l’activation du système angiotensine locale et le stress oxydant en résultant.

L’endothélium constitue un élément primordial dans le maintien de l’homéostasie vasculaire en contrôlant plusieurs fonctions comme le tonus vasculaire. Le contrôle de l’état contractile du muscle lisse vasculaire par l’endothélium est multifactoriel. Notons parmi ces nombreux mécanismes la génération du monoxyde d’azote (NO) identifié comme étant un puissant vasodilatateur ou les facteurs hyperpolarisants dérivés de l’endothélium (EDHF) qui favorisent également la relaxation du muscle lisse sous-jacent. De façon intéressante, ces mécanismes impliqués dans les différentes fonctions endothéliales sont fortement dépendants des concentrations intracellulaires en calcium (Ca2+). Par ailleurs, une altération des dynamiques calciques endothéliales est dénotée en présence de dysfonction endothéliale associée à diverses pathologies telles que l’hypertension artérielle (HA). De ce fait, il est impératif de parfaire notre compréhension des dynamiques calciques endothéliales. Les études des 10 dernières années ont permis de mettre en lumière l’existence de signalisations calciques locales qui présentent un avantage considérable en termes de ciblage de fonctions spécifiques. Au sein de l’endothélium, une signalisation calcique locale nommée pulsars calciques a été décrite au niveau des projections myoendothéliales (PME) d’artères mésentériques de résistance de souris. Les pulsars calciques sont une libération de Ca2+ limitée, spontanée et oscillatoire provenant des récepteurs à l’IP3 (IP3R) localisés sur réticulum endoplasmique plongé dans cette PME. Cette structure anatomique est d’intérêt particulier puisqu’elle constitue le seul lieu de contact entre les cellules endothéliales (CE) et les cellules musculaires lisses (CML) de la paroi vasculaire. Il est maintenant reconnu dans la littérature que la PME constitue un microdomaine de signalisation où cohabitent signalisations calciques locales et effecteur dépendants du Ca2+ impliqués dans la régulation de l’état contractile des CMLs tels que les canaux potassiques dépendants du Ca2+ (KCa). L’activation des KCa engendre l’hyperpolarisation de la CE qui est transmise aux CMLs de façon à favoriser leur relaxation. Nonobstant l’identification de voies de signalisation activées par les pulsars calciques, notre compréhension des mécanismes qui régissent la stochasticité des pulsars calciques restait à établir. Par ailleurs, des études précédentes du laboratoire ont mis en relief une altération des dynamiques des pulsars calciques en condition pathologique d’HA. Il était donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent les pulsars calciques en condition physiologique afin de pouvoir identifier éventuellement la provenance de ces altérations pathologiques. Dans le cadre de cette thèse, le rôle potentiel de deux mécanismes de régulation a ainsi été évalué. Dans la première étude, il a été possible de démontrer que CaMKII, une kinase reconnue pour son rôle à titre de décodeur d’oscillations calciques, est impliquée dans une boucle de rétroaction négative des pulsars calciques. En effet, son inhibition produit un recrutement de sites actifs de pulsars suggérant que CaMKII peut contrôler négativement le nombre de sites présentant des pulsars calciques. Nous avons également démontré que ce contrôle provient de l’effet de CaMKII sur les l’IP3Rs. Dans la deuxième étude, nous avons évalué l’implication de la mitochondrie qui est reconnue pour agir à titre de barrière calcique dans différents types cellulaires. Nous avons tout d’abord démontré que la mitochondrie présente une localisation préférentielle à l’embouchure de la PME. Par ailleurs, nous avons démontré que le contrôle de la mitochondrie sur la dynamique des pulsars calciques est multifactoriel en étant impliqué dans la dispersion des pulsars ainsi qu’en régulant la nature de l’activité calcique dans la PME. Ces deux mécanismes ont été étudiés en condition physiologique sans stimulation des pulsars calciques démontrant ainsi le rôle de ces derniers en condition basale. Ainsi, cette thèse a permis de combler un vide dans la littérature en termes de connaissances sur les mécanismes qui régissent les pulsars calciques endothéliaux. Ces études permettront de fournir des pistes potentielles à évaluer dans le cadre de dysfonction endothéliale associée à une altération des dynamiques calciques intracellulaires., Endothelial cells (EC) are an important component of the vascular homeostasis. They modulate various vascular functions as vascular tone. The regulation of the smooth muscle cells (SMC) contractile state by the endothelium is multifactorial. Among those various factors, nitric oxide (NO) is identified as a potent vasodilator and the endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF), which modulates vascular tone by controlling smooth muscle membrane potential. Interestingly, literature shows that both mechanisms involved in endothelial function strongly rely on intracellular calcium (Ca2+) concentration. Moreover, endothelial dysfunction is highly correlated with Ca2+ dyshomeostasis as observed in arterial hypertension (AH). In this line of thought, it’s crucial to extend our knowledge on how intracellular calcium signalling is regulated. During the past 10 years, several studies have revealed the important role of targeting specific cellular function by local Ca2+ signals. Those evidences rely on the significant improvement in imaging technology. Recently, a new localized Ca2+ signalling pathway called Ca2+ pulsars has been described in native endothelial cells from mouse mesenteric resistance arteries. Ca2+ pulsars are a limited, spontaneous and oscillatory Ca2+ release from IP3 receptor (IP3R) located on the endoplasmic reticulum membrane within the myoendothelial projections (MEP). The MEP structure is highly interesting because it constitutes the only site where EC and smooth muscle cell (SMC) from the vascular wall can physically interact. It’s now largely accepted that MEPs act as microdomains for local Ca2+ signals and Ca2+-depend effectors implicated in the SMC contractile state regulation. Ca2+ pulsars have been shown to be able to modulate Ca2+-activated potassium channel (KCa) located on the plasma membrane of the MEP. Once activated, the K+ efflux will generate the endothelial membrane hyperpolarization, which once transmitted to the underlying SMC will induce their relaxation. Despite the identification of Ca2+ pulsars targeted pathways, little is known about how this local Ca2+ signal is regulated. A previous study from the laboratory of Dr. Ledoux has shown an alteration in Ca2+ pulsars dynamics in the pathological condition of AH. Consequently, it was essential to extend our knowledge on Ca2+ pulsars regulatory mechanisms to be able to identify the possible pathways implicated into this pathological alteration. In this thesis, two potential regulatory pathways have been investigated. In the first study, the implication of CaMKII, a kinase known to act as a Ca2+ sensor, was assessed by showing various activation states of the kinase depending on Ca2+ oscillation frequencies. We showed that CaMKII might be involved in a negative feedback loop according to its activation pathway. Inhibition of CaMKII in presence of KN-93 showed an increase in the number of Ca2+ pulsars active sites suggesting that CaMKII can control which Ca2+ pulsars site can be activated. This first study demonstrated that CaMKII may regulate the number of Ca2+ pulsars active sites by modulating IP3Rs activity. In the second study, we evaluated if the mitochondria could influence Ca2+ pulsars pattern. The rationale behind the choice of this potential regulatory mechanism is that mitochondria can act as a Ca2+ barrier in different cell types. We showed that mitochondria are preferential localized in front of the MEP in mouse mesenteric arteries. Furthermore, we demonstrated that regulation of Ca2+ pulsar dynamics by mitochondria is multifactorial. This organelle is involved in Ca2+ pulsars dispersion by its ability to reuptake intracellular Ca2+. In addition, mitochondria seems to be important to set the Ca2+ pulsar activity level probably by modulating the Ca2+ environment around the IP3Rs within the MEP. The impact on Ca2+ pulsars activity level may be mediated by mitochondria Ca2+ efflux mechanisms. In both studies presented in this thesis, the two mechanisms (CaMKII and mitochondria) have been studied in physiological conditions without any Ca2+ pulsars stimulation suggesting their role in basal control of Ca2+ pulsars dynamics. Thereby, both studies have filled a gap of knowledge regarding how the Ca2+ pulsar stochasticity is established in physiological conditions. This work brings out new avenues to investigate in endothelial dysfunction associated with intracellular Ca2+ homeostasis alteration.

EPA:DHA 6:1 omega-3 formulation has been shown to induce a sustained endothelial NO synthase-derived formation of nitric oxide. This study examined if the intake of EPA:DHA 6:1 improves an established ageing-related endothelial dysfunction. Ageing-related endothelial dysfunction was characterized by a blunted NO-mediated component of relaxation, abolished EDH-mediated component and increased COX-derived endothelium-dependent contractile responses. Ageing increased vascular oxidative stress, expression of NADPH oxidase subunits, COX-2, eNOS, ACE, AT1R, and senescence markers, whereas COX-1 was down-regulated. Chronic intake of EPA:DHA 6:1 improved the NO-mediated relaxations, reduced EDCFs, vascular oxidative stress and normalized the expression of protein markers. In conclusion, chronic intake of EPA:DHA 6:1 prevented the ageing-related endothelial dysfunction in old rats, most likely by preventing activation of the local angiotensin system and the subsequent vascular oxidative stress., La présente étude évalue la capacité de la formulation d’oméga-3 EPA:DHA 6:1, une formulation capable d’induire la formation continue de monoxyde d’azote par la NO synthase endothéliale, à améliorer la dysfonction endothéliale liée à l’âge établie chez le rat. La dysfonction endothéliale liée à l’âge est caractérisée par une altération des composantes de la relaxation et une augmentation des réponses contractiles dépendantes de l’endothélium. L’âge augmente le stress oxydant vasculaire, l’expression de la NADPH oxydase, COX-2, eNOS, ACE, AT1R, et des marqueurs de senescence, alors que la COX-1 est sous-exprimé. La formulation EPA:DHA 6:1 améliore la composante NO, diminue l’EDCF et le stress oxydant vasculaire, et normalise l’expression des protéines cibles. En conclusion, la consommation chronique de EPA:DHA 6:1 améliore la dysfonction endothéliale liée à l’âge chez le rat, probablement en prévenant l’activation du système angiotensine locale et le stress oxydant en résultant.

Capacity of curcumin, a polyphenol presenting vasculo-protective properties, to modulate secretion and miRNA and protein profiles of endothelial microparticles. 1. Congrès FSEV French Society of Extracellular Vesicules.

Radiotherapy is one of the main treatments against cancers. However, it presents a risk of adverse effects for the normal tissues surrounding the tumors. The vascular network and especially the endothelium are considered as main targets to limit normal tissue damages and prevent side effects of radiotherapy. Activated endothelial cells are involved in the chronic recruitment of thrombocytes and leukocytes, resulting in tissue complications. On the other hand, in inflammatory diseases, the glycans expressed on the surface of endothelial cells are modified and lead to immune cells recruitment. We sought to evaluate changes in endothelial glycome in a context of exposure to high dose of radiation, and studied the functional consequences on the recruitment of leukocytes. In vitro, the characterization of the glycome was performed on a primary endothelial cell model (HUVEC). Our results provide the first evidences of an endothelial modification of the glycome after exposure to ionizing radiation. We report an overexpression of high mannose N-glycans, O-glycans and syalilated motifs. At the same time, endothelial glycocalyx appeared to be damaged by exposure to radiation. Next, we evaluated these radiation-induced modifications of endothelial glycans on monocyte adhesion. We show that the radiation induced adhesion was mediated by overexpression of high mannose N-glycans. We also investigated changes in glycome in an irradiated mouse model of enteropathy and in resections of patients treated with radiotherapy. In mice, a transcriptomic study suggests changes in glycans following radiation exposure. Collectively, these findings on glycome changes provide a new perspective of the continuum of events leading to normal tissue complications. In the future, the study of the glycome should open new therapeutics opportunities for better management of tissue damages induced by radiation.; La radiothérapie constitue l’un des principaux traitements pour l’éradication des cancers. Cependant, elle présente un risque d’effets secondaires aux tissus sains environnant la tumeur. Dans ce processus, le système vasculaire et plus particulièrement l’endothélium jouent un rôle clé. Les cellules endothéliales activées favorisent le recrutement chronique des thrombocytes et des leucocytes, contribuant ainsi aux effets secondaires. D’autre part, dans les maladies inflammatoires, les glycanes exprimés à la surface des cellules endothéliales sont modifiés et influencent le recrutement des cellules immunitaires. Dans cette étude, nous avons évalué la modification des glycanes endothéliaux en réponse à une irradiation à forte dose, et étudié les effets fonctionnels de ces modifications sur le recrutement des leucocytes en utilisant un modèle de cellules endothéliales (HUVECs) in vitro. Nos résultats apportent les premières preuves d’une modification du glycome des cellules endothéliales en réponse à l’irradiation. Les N-glycanes hautement mannosylés, les O-glycanes et les motifs sialylées sont surexprimés. Parallèlement, le glycocalyx endothélial semble subir une dégradation. Nous avons évalué l’effet fonctionnel des modifications glycanique des cellules endothéliales irradiées sur l’adhésion d’une lignée de monocyte (THP-1). Nos résultats montrent que l’adhésion radio-induite est en partie due à la surexpression endothéliale des N-glycanes hautement mannosylés. Nous avons aussi évalué le glycome sur un modèle de souris irradiées et sur des pièces opératoires de patients traités par radiothérapies. Nos résultats de transcriptomiques sur la souris suggèrent l’existence de modifications glycaniques radio-induites in vivo. L’intégration de la composante glycanique permet de porter un regard nouveau sur le continuum d’évènement qui conduit aux lésions tissulaires radio-induites. A l’avenir, l’étude du glycome pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des effets secondaires de la radiothérapie.

L’endothélium vasculaire joue un rôle prépondérant dans la régulation du tonus vasculaire en générant l’oxyde nitrique (NO), la prostacycline (PGI2) et les facteurs hyperpolarisants dérivés de l’endothélium (EDHF) comme puissants vasodilatateurs. Ces mécanismes requièrent le calcium (Ca2+) à divers niveaux, démontrant l’importance des dynamiques calciques endothéliales. Une perturbation de l’homéostasie calcique est observée dans une dysfonction endothéliale liée à l’hypertension artérielle. Il est impératif d’approfondir nos connaissances sur les signalisations calciques endothéliales impliquées dans le contrôle du tonus vasculaire. Des études récentes ont montré qu’une variation locale de la concentration en Ca2+ libre intracellulaire ([Ca2+]i) est suffisante pour générer une réponse physiologique importante. Les pulsars calciques sont caractérisés par une augmentation de [Ca2+]i spontanée et transitoire spécifiquement localisée au niveau des projections myoendothéliales (PMEs). Ces PMEs sont des sites de communication privilégiés entre les cellules endothéliales (CEs) et les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs). Les pulsars calciques sont impliqués dans le mécanisme de l’EDHF via l’activation des canaux potassiques Ca2+-dépendant de moyenne conductance (KCa3.1 ou IKCa). Les travaux de cette thèse visent à améliorer nos connaissances sur les signalisations calciques locales en caractérisant une nouvelle voie de signalisation pouvant être impliquée dans la régulation du tonus vasculaire en condition physiopathologique. Outre les canaux KCa3.1 peu d’informations sont disponibles sur les cibles sensibles aux pulsars calciques. Une première étude a permis d’identifier la protéine kinase II dépendante du complexe Ca2+/calmoduline (CaMKII) sous ses isoformes α, β et δ dans les CEs d’artères natives de souris comme une cible pouvant être modulée par les pulsars calciques. Des études en immunofluorescence ont permis d’observer la localisation particulière de CaMKII endothéliale dans les PMEs, les sites des pulsars calciques. Une stimulation spécifique des pulsars calciques par la phényléphrine (PE) engendre un recrutement de CaMKII dans les PMEs. Sachant que CaMKII active l’oxyde nitrique synthase endothéliale (NOS3), nous avons évalué l’impact d’une stimulation des pulsars calciques sur la production de NO en présence d’un inhibiteur de CaMKII, le KN-93. Nous avons démontré que la production de NO est en partie dépendante de l’activation de CaMKII par les pulsars calciques. En utilisant un modèle d’hypertension induite par l’infusion chronique de PE, nous avons permis de mettre en évidence une perturbation dans la relation entre les pulsars calciques et CaMKII. Dans une seconde étude nous avons établi deux modèles (normo- et hypertendus) d’infusion chronique à l’angiotensine II (AngII) afin évaluer l’impact des ROS et de l’hypertension sur la voie de signalisation pulsars/CaMKII/NO. Nos résultats ont montré une augmentation des pulsars calciques accompagnée d’un recrutement de CaMKII dans les PMEs. Une stimulation aigue à l’AngII suggère que les ROS modulent les dynamiques calciques et que l’AngII stimule la production de NO. Cette étude propose que ces voies de signalisations impliquent les récepteurs de type 1 et 2 à l’AngII (AT1 et AT2). L’étude des pulsars calciques dépend fortement de la structure native des artères qui permet de conserver la formation des PMEs. La dernière étude présentée dans cette thèse a permis d’établir une relation entre les PMEs et les pulsars calciques dans trois lits vasculaires distincts (artères mésentériques, pulmonaires et coronariennes). Nos résultats ont montré que les paramètres cinétiques des pulsars calciques sont fortement conservés entre les différents lits vasculaires. Toutefois, la fréquence globale ainsi que le nombre de sites actifs des pulsars calciques diffèrent avec une proportion plus élevée dans les artères mésentériques et coronariennes comparativement aux artères pulmonaires. Ces résultats corrèlent avec le nombre plus élevé de PMEs retrouvé dans les artères mésentériques et coronariennes. Ces travaux suggèrent que les pulsars calciques sont fondamentaux pour les artères de résistance. Les études de cette thèse ont mené à l’identification d’une nouvelle voie de signalisation impliquant les pulsars calciques et CaMKII endothéliale dans la stimulation de la production de NO. Cette nouvelle voie de signalisation pourrait être impliquée dans la régulation du tonus vasculaire en condition physiopathologique. Les pulsars calciques semblent être fortement conservés entre les différentes artères de résistances et ce malgré la disparité dans les PMEs, suggérant un rôle prépondérant dans la fonction vasculaire. Ces travaux ouvrent une avenue pour le développement de potentielles cibles thérapeutiques pouvant contrer la dysfonction endothéliale associée à l’hypertension artérielle., In humans and in various animal models, the pathology of hypertension is often associated with an endothelial dysfunction characterized by a loss of balance between vasodilator and vasoconstrictor factors derived from the endothelium. The vascular endothelium plays a crucial role in the regulation of vascular tone by synthesizing and releasing NO, PGI2 and EDHF as potent vasodilators. These mechanisms require Ca2+ at different levels, showing the importance of endothelial calcium dynamics and their signaling pathways in endothelial function. Moreover, an alteration in Ca2+ homeostasis is observed in endothelial dysfunction associated with hypertension. Therefore, it is imperative to increase our knowledge on the various endothelial Ca2+ signaling involved in the control of vascular tone. Recent studies show that local change in [Ca2+]i is sufficient to generate a significant physiological response. Ca2+ pulsars are characterized by a spontaneous and transient increase in [Ca2+]i specifically localized within myoendothelial projections (MEPs). Those MEPs are privileged communication sites between endothelial cells (ECs) and vascular smooth muscle cells (VSMCs). Ca2+ pulsars are involved in the EDHF mechanism through activation of Ca2+-dependent potassium channels KCa3.1, suggesting a role in modulation of VSMCs contractility. This thesis aims to improve our knowledge on local Ca2+ signaling by characterizing a new signaling pathway that might be involved in the regulation of vascular tone in physiopathology. So far, besides KCa3.1 channels, little information is known on targets sensitive to Ca2+ pulsars. Thus, a first study identified the CaMKII as an attractive target that can be modulated by Ca2+ pulsars in native ECs from mesenteric arteries. CaMKII has the ability to decode Ca2+ oscillations similar to Ca2+ pulsars. This study first demonstrated that CaMKII is expressed in its isoforms α, β and δ in mice mesenteric arteries. Then, immunofluorescence studies have showed the particular localization of endothelial CaMKII within MEPs (Ca2+ pulsars sites). In addition, specific stimulation of Ca2+ pulsars with PE generates a recruitment of CaMKII within MEPs. Data from the literature suggest that CaMKII activates the NOS3, we evaluated the impact of Ca2+ pulsars stimulation on NO production in the presence of a CaMKII inhibitor, the KN-93. We have demonstrated that production of NO is partly dependent on the activation of CaMKII by Ca2+ pulsars. Finally, we have established a hypertension model induced by chronic infusion of PE, which showed an alteration in the relationship between Ca2+ pulsars and CaMKII. However, this particular model generates few ROS which is an important component involved in endothelial dysfunction associated with hypertension. In a second study, we established two chronic infused (normo- and hypertensive) AngII mice models to evaluate the impact of ROS and hypertension on Ca2+ pulsars/CaMKII/NO signaling pathway. Our results showed an increase in Ca2+ pulsars frequency along with a recruitment of CaMKII within MEPs. Acute AngII stimulation experiments supports data from the literature suggesting that ROS modulate Ca2+ dynamics and that AngII stimulated NO production. This study proposes that these signaling pathways involve AngII AT1 and AT2 receptors. Ca2+ pulsars study strongly depends on the native structure of the artery maintaining MEPs. Evidence shows that MEPs appear to vary between vascular beds, species and pathophysiological conditions. The latest study presented in this thesis has established a relationship between MEPs and Ca2+ pulsars in three distinct vascular beds (mesenteric, pulmonary and coronary arteries). Our results first showed that Ca2+ pulsars kinetic parameters are highly conserved among different vascular beds. However, Ca2+ pulsars frequency and number of active sites differ with a greater proportion in mesenteric and coronary arteries compared to pulmonary arteries. These results correlate with the highest number of MEPs found in mesenteric and coronary arteries. This study suggests that MEPs are essential to Ca2+ pulsars, which are fundamental for resistance arteries. Studies of this thesis led to the identification of a novel signaling pathway involving Ca2+ pulsars and endothelial CaMKII in stimulating NO production. This new signaling pathway may be involved in the regulation of vascular tone in pathophysiological conditions. Moreover, Ca2+ pulsars appear to be highly conserved among different resistance arteries despite the disparity in MEPs suggesting a key role in vascular function. This work opens an avenue for development of potential therapeutic targets that can counter endothelial dysfunction associated with arterial hypertension.

International audience; A growing number of evidences suggest that dietary polyphenols exhibit vascular protective properties by preventing the early stages of vascular dysfunction and atherosclerosis development. Using holistic nutrigenomic approaches, we have previously demonstrated that polyphenols may protect the integrity of vascular endothelium by reducing interactions between monocytes and endothelial cells. One important determinant of these inter-cellular interactions is the hemodynamic forces associated with blood flow, namely shear-stress. Usually, in-vitro studies aiming to decipher the impact of polyphenols on the molecular and cellular processes, are performed under static conditions. As chronic exposure of endothelial cells to laminar flow is known to affect endothelial cell functions, the aim of this work is to evaluate the impact of shear stress on the response of endothelial cells to polyphenols exposure. Primary human endothelial cells were grown under a 1Hz-pulsatile aortic shear-stress of 7 dyne/cm² to mimic as closely as possible physiological conditions, or under static conditions. Confluent cells were exposed to low concentrations of curcumin (0.5-1μM) for 3 hours prior to their stimulation by TNF-alpha for 4 hours and then cell adhesion assays were performed. Our first results demonstrate that the pre-exposure of endothelial cells to 0.5µM curcumin under a physiological flow reduced by 40% the adhesion of THP1 monocytes while only a 25% decrease is observed in static condition. This observation suggests that shear-stress can modulate the cellular effects of polyphenols. Further experimentations are ongoing to identify the impact of this shear-stress on the nutrigenomic and molecular responses to curcumin in endothelial cells

International audience

Recently, the use L-b-L assembly of natural polyelectrolytes has been suggested as a new technique of surface modification. The aim of our work was to develop multilayered films based on CHI and HA polymers bearing chemical. WJ-MSCs were seeded on these substrates. Biocompatibility was assessed by SEM and actin visualization. WJ-MSCs differentiation into endothelial phenotype was followed by western blot. First of all, SEM showed a fibroblastic morphology of adherent cells on CHI/HA and CHI-SH/HA-Thio as for control. WB analysis showed a rise of CD31, VEGF-R2 and VE-cadherin expression on CHI-SH/HA-Thio and CHI/HA. Films CHI-SH/HA-Thio were biocompatible and promoted endothelial differentiation potential, Récemment, l'utilisation de la technique d'assemblage couche par couche de polyélectrolytes naturels a été suggérée comme une nouvelle procédure de modification de surface. Le but de notre travail était de développer des films à base de CHI et de HA fonctionnalisés et réticulés. La biocompatibilité a été évaluée par MEB et visualisation des filaments d'actine. La différenciation endothéliale des CSMs a été suivie par Western Blot. Ensuite, la fonctionnalité des cellules a été évaluée par immunofluorescence du vWF et marquage au Dil-Ac-LDL. Le MEB a montré une morphologie fibroblastique des cellules sur CHI/HA et CHI-SH/HA-Thio. L'analyse par WB des cellules différenciées a montré une augmentation de l'expression de CD31, VEGF-R2 et VE-cadhérine sur CHI-SH/HA-Thio et CHI/HA. Les films CHI-SH/HA-Thio étaient biocompatibles et promouvaient le potentiel de différenciation endothéliale

National audience; MicroRNAs (miRNAs) are endogenous, noncoding, single-stranded RNAs and constitute a class of post-transcriptional regulators. We showed previously that flavanol metabolites decrease adhesion of monocytes to endothelial cells through modulation of expression of genes. The aim of this work was to identify the impact of flavanol metabolites at physiologically-relevant concentrations on the expression of miRNAs in endothelial cells. The use of microarrays revealed that 4’MEC, 4’MEC7G and EC4’S can modulate expression of miRNAs involved in the regulation of inflammation, cell adhesion or cell invasion, such as miR-221 or miR-181. These metabolites regulate the expression of different miRNAs that could exert post-transcriptional regulation of different target genes that are however involved in the same cellular pathways. These pathways mainly concern those involved in regulation of cell adhesion and transendothelial migration. Analyses of gene and protein expression of target genes revealed that miRNA could affect mRNA levels of certain genes, such as WASP1 and consequently the level of the protein, but also only decrease the translation and the protein quantity without affecting level of mRNA, as observed for BIRC2. In conclusion, these data provide an insight into new molecular mechanisms by which plasma flavanol metabolites at physiologically relevant concentrations may preserve vascular endothelium integrity.

The vascular endothelium barrier function is influenced by vascular endothelial cadherin (VE-cadherin) modifications such as its cytoplasmic tail tyrosine phosphorylation and its ecto-domain cleavage (sVE). The work reported herein was divided into two parts: 1- Study of VE-cadherin modifications and the mechanisms underlying these ones in the rheumatoid arthritis context. This work demonstrated that VE-cadherin is a target of TNFα, a highly important cytokine in rheumatoid arthritis (RA) pathogenesis. We found TNFα to induce sVE shedding in a Src kinase dependent manner, suggesting the involvement of phosphorylation mechanism in this process. In addition, this VE-cadherin cleavage requires matrix metalloproteinase activities such as that of MMP-2. Applying these fundamental data to clinical study showed that sVE was detected in sera of 63 RA patients and its titer was correlated with the disease activity. This finding suggests an obvious interest for assaying sVE in RA therapies. 2- Study of VE-cadherin tyrosine phosphorylation in a context of hormones-regulated angiogenesis during mouse estrous cycle. The results showed VE-cadherin phosphorylation at Y685 that was regulated along mouse estrous cycle allowing to proposing mouse estrous cycle as a physiological model for studying VE-cadherin phosphorylation in vivo. The analysis of VE-cadherin Y685F knock-in mice (VE-Y685F) showed that these mice exhibit a higher vascular permeability in uterus and ovaries and the skin small capillaries compared to wild-type animals. Moreover, VE-Y685F mice presented higher levels of soluble VE-cadherin compared to wild-type counterparts in two induced arthritis model. Altogether, sVE and VE-cadherin phosphorylation present an array of interests for RA therapies as well as developing new therapeutic tools in RA and other vascular diseases., La fonction de barrière de l'endothélium vasculaire est affectée par des modifications de la cadhérine des cellules endothéliales (VE-cadhérine) telles que la phosphorylation sur tyrosine dans son domaine cytoplasmique et le clivage de son domaine extracellulaire (sVE). Ce travail s'est articulé en deux parties : 1- Etude de ces modifications dans le contexte de la polyarthrite rhumatoïde (PR), et les mécanismes sous-tendus. Ce travail a permis de montrer que la VE-cadhérine est une cible du TNFα, une cytokine essentielle dans la PR, qui induit de la libération de sVE de façon dépendante de l'activité kinase de Src, suggérant l'implication d'un mécanisme de phosphorylation sur tyrosine dans ce processus. De plus, la VE-cadhérine est aussi la cible des protéases de la matrice extracellulaire telles que MMP-2. L'application de ces données fondamentales à la clinique a permis de montrer que sVE était retrouvée dans le sang de patients PR (n=63) et que son taux était corrélé à l'activité de la maladie. Ainsi, le dosage de sVE est d'intérêt dans la prise en charge des patients. 2-Etude de la phosphorylation de la VE-cadhérine dans un contexte d'angiogenèse hormono-régulée au cours du cycle ovarien chez la souris. Les résultats ont montré que le site Y685 de la VE-cadhérine est phosphorylé dans l'ovaire et l'utérus de souris de façon régulée pendant le cycle, ce qui permet de proposer ce modèle physiologique pour étudier la phosphorylation de la VE-cadhérine in vivo. L'analyse de souris knock-in Y685F de la VE-cadhérine (VE-Y685F) a montré que l'absence du site confère une perméabilité accrue dans l'ovaire et l'utérus mais aussi dans les petits capillaires de la peau. De plus, dans deux modèles d'induction d'arthrite, les souris VE-Y685F ont présenté un taux de sVE plus élevé que les contrôles. Au total, sVE et la phosphorylation de la VE-cadhérine ont un vaste champ d'application dans le traitement de la PR ainsi que pour le développement de nouvelles thérapies pouvant s'étendre à d'autres pathologies vasculaires.

Publication Inra prise en compte dans l'analyse bibliométrique des publications scientifiques mondiales sur les Fruits, les Légumes et la Pomme de terre. Période 2000-2012. http://prodinra.inra.fr/record/256699; International audience; Background: We previously showed, in healthy, middle-aged, moderately overweight men, that orange juice decreases diastolic blood pressure and significantly improves postprandial microvascular endothelial reactivity and that hesperidin could be causally linked to the observed beneficial effect of orange juice. The objective was to determine the effect of chronic consumption of orange juice on the gene expression profile of leukocytes in healthy volunteers and to assess to what extent hesperidin is involved in the effect of orange juice. Methodology/Principal Findings: Volunteers were included in a randomized, controlled, crossover study. Throughout three 4-week periods, volunteers consumed daily: 500 ml orange juice, 500 ml control drink plus hesperidin or 500 ml control drink and placebo. Blood samplings were performed on 10 overnight-fasted subjects after the 4-week treatment period. Global gene expression profiles were determined using human whole genome cDNA microarrays. Both orange juice and hesperidin consumption significantly affected leukocyte gene expression. Orange juice consumption induced changes in expression of, 3,422 genes, while hesperidin intake modulated the expression of 1,819 genes. Between the orange juice and hesperidin consumption groups, 1,582 regulated genes were in common. Many of these genes are implicated in chemotaxis, adhesion, infiltration and lipid transport, which is suggestive of lower recruitment and infiltration of circulating cells to vascular wall and lower lipid accumulation. Conclusions: This study shows that regular consumption of orange juice for 4 weeks alters leukocyte gene expression to an anti-inflammatory and anti-atherogenic profile, and hesperidin displays a relevant role in the genomic effect of this beverage.

Understanding Vascular Endothelium : Nature’s Container for Blood The entire cardiovascular system, from the chambers of the heart to the smallest capillaries of peripheral tissues, is lined by a single-cell-thick continuous layer—the vascular endothelium. For many years, this gossamer membrane was thought to function largely as an inert barrier, passively separating the reactive components of the circulating blood from the cells and connective tissue matrix of the various organs of the body....

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

The enhancement of cardiovascular pathology frequencies and unavailability of the adequate therapies will imply during the next decades an important requirement in vascular substitutes, especially for small calibre. The aim of this study is to elaborate a functional vascular substitute. We present here a new procedure to treat cryopreserved arteries based on their inner surface coating with poly(sodium-4-styrene sulfonate)/poly(allylamine hydrochloride) polyelectrolyte multilayer (PEM). We show that this treatment improves the mechanical properties of the cryopreserved vessel. In order to elaborate an antithrombogenic luminal surface two approaches have been considered. The first was to improve the endothelium formation when the terminal layer is a polycation. The second was to prevent cell adhesion on the negative luminal surface. In vitro results show that PEM allows the endothelial cell spreading and an enhancement of cell retention to shear stress. In vivo results show a good graft patency during three months of implantation after rabbit carotid replacement. All these promising results open the route towards the development of future new biocompatible tissue substitutes allowing long-term functionality after implantation.; L'augmentation de la fréquence des pathologies cardiovasculaires ainsi que les limites des thérapies disponibles, conduiront, ces prochaines décennies, à des besoins importants en substituts vasculaires, surtout de faibles calibres. L'objectif de ce travail est d'élaborer de nouvelles matrices naturelles vasculaires, répondant aux qualités nécessaires pour le remplacement de vaisseaux endommagés. Nous avons choisi de valoriser des artères ombilicales humaines cryoconservées et désendothélialisées en les fonctionnalisant avec un film de polyélectrolytes. Ces films sont construits par dépôts alternés d'hydrochlorure de polyallylamine (polycation) et de poly (sodium-4-styrène sulfonate) (polyanion). L'évaluation des propriétés biomécaniques de la paroi du greffon après dépôt du film montre la restauration de son élasticité perdue au cours de la congélation. Pour le développement d'une surface luminale non thrombogène deux approches ont été envisagées : 1)- Favoriser la formation d'un néo-endothélium vasculaire sur un film qui se termine par une couche positive, 2)- Empêcher toute adhésion cellulaire sur la surface luminale chargée négativement. La caractérisation in vitro des artères endothélialisées a montré que le film permettait le développement d'un endothélium avec une morphologie proche de l'artère native. Nous observons également une meilleure résistance des cellules au cisaillement. L'implantation chez le lapin d'artères non endothélialisées a montré une bonne fonctionnalité (perméabilité, résistance, structure...) des artères après trois mois d'implantation. Ces résultats encourageants permettent d'envisager une évaluation des substituts fonctionnalisés endothélialisés ou décellularisés chez le gros animal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie rare, caractérisée par une fibrose intimale, une hypertrophie de la média et une fibrose adventielle. Les lésions thrombotiques sont fréquentes même en l'absence d'embolie pulmonaire. Après un rappel sur la physiopathologie, le diagnostic et le traitement de l'HTAP, nous avons étudié l'hémostase au cours du cathétérisme cardiaque droit : du sang veineux mêlé a été prélevé chez 43 patients présentant une HTAP, dont 25 patients atteints d'HTAP primitive (HTAPP), 7 patients souffrant d'HTAP post-embolique et 11 patients porteurs d'une HTAP secondaire à une bronchopathie chronique obstructive (BPCO). Nous avons étudié les facteurs endothéliaux, la thrombomoduline ou TM, le "tissue factor pathway inhibitor" ou TFPI, l'activité antigénique du facteur Von Willebrand ou Ag-vWF et le "tissue plasminogen activator" ou tPA et le potentiel de génération et d'inhibition de la thrombine (thrombinographie) chez 21 patients sans traitement anticoagulant. Nous avons corrélé ces résultats aux données hémodynamiques. Il existe une corrélation entre deux facteurs endothéliaux (TFPI et TM) et les données hémodynamiques. La concentration de TM est corrélée avec les paramètres sévérité hémodynamique. Ces résultats soulignent l'importance de la dysrégulation endothéliale dans la physioathologie de l'HTAP et son impact sur la coagulation et probablement la vasoconstriction. Les résultats de la thrombinographie sont en faveur de l'existence d'un état pro-thrombotique. Cette hypercoagulabilité peut être liée à un défaut des systèmes de régulation de la TM et de l'activation de la protéine C. La TM semble jouer un rôle important dans l'HTAP. Le système de la protéine C reste à explorer.

SUMMARY 1. Cyclo-oxygenase 2 (COX-2) is implicated in multiple physiopathological processes. We have studied its physiological expression during chicken embryogenesis. 2. An original procedure was set to prepare a COX-2 probe from red blood cells. In situ hybridization, reverse transcription–polymerase chain reaction and northern blots, were performed on chick embryos from embryonic day (E) 3 to postnatal day 15. 3. In the mesonephros, the signal detected in mesonephric tubules presented a slow increase from E5 to E9, a plateau up to E12 and then a decrease, while the signal increased in the metanephros and then decreased after hatching. Transient expression of COX-2 mRNA in endothelial cells of the infundibulum of the aorta was also detected between E12 and E17. 4. This enzyme may have important roles in kidney morphogenesis during early embryonic stages and in tubular functions during development and in adult life. In the cardiovascular system, its vasodilatory effect could modulate the vasoconstrictor effect of the systolic pressure between E12 and E17 and contribute to a normal morphogenesis of the arterial tree and heart.

Non disponible / Not available, L'endothélium vasculaire est l'interface entre le sang et les tissus dans les vaisseaux sanguins. Les conditions hémodynamiques locales peuvent affecter, à travers le phénomène de mécanotransduction, des fonctions des cellules endothéliales (CE). Les variations du comportement des CE soumises à des contraintes mécaniques peuvent intervenir dans différents troubles cardio-vasculaires, notamment dans l'athérosclérose, la thrombose et l'inflammation. L'objectif de ce travail était d'étudier l'influence des contraintes mécaniques sur trois marqueurs des CE impliqués dans l'athérosclérose et la mécanotransduction, le vWF, la molécule d'adhésion ICAM-l, et la cavéoline-l à l'aide des réalisations de culture d'HUVEC et d'un système en flux. Parallèlement, les effets d'une cytokine, le TNF-a sur l'expression et la distribution de ces molécules ont été étudiés afin de préciser les différences entre facteurs biochimiques et facteurs mécaniques. La technique de microscopie à fluorescence à sectionnement optique nous a permis de visualiser la distribution de molécules cellulaires en trois dimensions sur une monocouche de CE. Nos résultats expérimentaux ont montré que les contraintes de cisaillement provoquaient des variations de la libération et de la synthèse du vWF, de l'expression de l'ICAM-l et de celle de la cavéoline-1. Par ailleurs, les distributions de ces molécules à la surface ou/et à l'intérieur des CE ont été également modifiées. L'ensemble de ces études suggère que la variation de la contrainte de cisaillement, tel que dans des sténoses ou bifurcations vasculaires in vivo, joue un rôle important dans l'athérogenèse, la thrombose et l'inflammation.