Search

We have demonstrated previously that the human picornavirus Echovirus 1 (EV1) triggers an infectious internalization pathway that follows closely, but seems to stay separate, from the epidermal growth factor receptor (EGFR) pathway triggered by epidermal growth factor (EGF). Here, we confirmed by using live and confocal microscopy that EGFR and EV1 vesicles are following intimately each other but are distinct entities with different degradation kinetics. We show here that despite being sorted to different pathways and located in distinct endosomes, EV1 inhibits EGFR downregulation. Simultaneous treatment with EV1 and EGF led to an accumulation of EGFR in cytoplasmic endosomes, which was evident already 15 min p.i. and more pronounced after 2 hr p.i. EV1 treatment led to reduced downregulation, which was proven by increased total cellular amount of EGFR. Confocal microscopy studies revealed that EGFR accumulated in large endosomes, presumably macropinosomes, which were not positive for markers of the early, recycling, or late endosomes/lysosomes. Interestingly, EV1 did not have a similar blocking effect on bulk endosomal trafficking or transferrin recycling along the clathrin pathway suggesting that EV1 did not have a general effect on cellular trafficking pathways. Importantly, EGF treatment increased EV1 infection and increased cell viability during infection. Simultaneous EV1 and EGF treatment seemed to moderately enhance phosphorylation of protein kinase C α. Furthermore, similar phenotype of EGFR trafficking could be produced by phorbol 12‐myristate 13‐acetate treatment, further suggesting that activated protein kinase C α could be contributing to EGFR phenotype. These results altogether demonstrate that EV1 specifically affects EGFR trafficking, leading to EGFR downregulation, which is beneficial to EV1 infection. peerReviewed

Echovirus 1 (EV1) kuuluu Pikornavirusperheeseen ja tarkemmin luokiteltuna Enterovirusten sukuun. EV1 on pieni ja vaipaton RNA-virus, jonka proteiinikuori koostuu neljästä proteiinista VP1-VP4. Infektion on osoitettu alkavan, kun EV1 tarttuu α2β1-integriiniin solun pinnalla, jonka jälkeen virus otetaan solun sisään kaveoliinivälitteistä endosytoosia sekä makropinosytoosia muistuttavalla mekanismilla. Toisaalta sitä, kuinka virus avautuu sekä vapauttaa RNA:nsa, ei vielä tarkalleen tiedetä. Tässä tutkimuksessa EV1 puhdistettiin ensin sakkaroosigradientilla, jonka jälkeen virus leimattiin fluoresoivalla amiinireaktiivisella värillä. Tulokset osoittivat, että leimauksen onnistumiseksi tarvitaan suhteellisen vähäinen leimamäärä, ja että vähäinen leimamäärä riittää fluoresenssin havaitsemiseksi sekä on tärkeä viruksen infektiivisyyden säilyttämiseksi. Leimattua EV1:stä käytettiin solukokeissa, joissa Fosfolipaasi C inhibiittoria (PLC-inhibiittori) käytettiin viruksen endosytoosin estämiseen, jolloin asettamamme hypoteesin mukaan endosytoosia ei tapahdu, vaan virus jää solun pinnalle. Immunofluoresenssikokeiden ja kvantitatiivisen analysoinnin perusteella endosytoosi estyi, vaikkakin ero kontrollisoluihin oli ainoastaan 10 %. Lisäksi toinen immunofluoresenssikoe osoitti, että EV1:n infektiivisyys laski käytettäessä PLC-inhibiittoria. Immunofluoresenssikokeissa ongelmia aiheuttivat tyhjät ja rikkinäiset viruspartikkelit, jotka havaittiin EV1:n karakterisoinnin aikana läpäisyelektronimikroskoopilla. Leimautuneet tyhjät ja rikkinäiset partikkelit aiheuttivat todennäköisesti väärää signaalia immunofluoresenssikokeissa, joiden perusteella voitiin todeta, että viruksen puhdistaminen ja leimaaminen vaativat lisää optimointia. Suora kapsidileima voisi onnistuessaan toimia työkaluna tulevissa viruksen avautumiskokeissa ja livetutkimuksissa, jolloin vasta-aineleimauksiin liittyvä taustafluoresenssi saataisiin minimoitua. Lisäksi PLC-inhibiittori voisi mahdollistaa viruksen avautumisen tutkimisen solun pinnalla endosomaalisten rakenteiden sijaan. Echovirus 1 (EV1) belongs to the family of Picornaviridae and more specifically to the genus Enterovirus. EV1 is a small, non-enveloped RNA-virus which has a capsid consisting of four proteins VP1-VP4. EV1 has been shown to bind to α2β1-integrin on the cell surface and then endocytosed inside the cell by a mechanism that resembles both caveolin-mediated endocytosis and macropinocytosis. Instead, uncoating and RNA release are poorly understood. Here, we have successfully purified EV1 with sucrose gradient and labeled the virus with an amine reactive dye. The results showed that for successful labeling, considerably low amount of dye is sufficient for signal detection, and according to end-point dilution assay, is necessary for maintaining virus infectivity. Capsid labeled EV1 was used in cellular studies where Phospholipase C-inhibitor (PLC-inhibitor) was tested as an endocytosis blocker. According to our hypothesis PLC-inhibitor blocks endocytosis, and as a result, virus remains on the cell surface. Indeed, based on immunofluorescence studies and quantification with Bioimage XD software, endocytosis was blocked, although difference to control cells was only 10%. Additionally, another immunofluorescence study showed that PLC-inhibitor decreased EV1 infection. Immunofluorescence studies were hindered by empty and disassembled virus particles, which were detected during EV1 characterization with transmission electron microcopy. Labeled empty and disassembled particles probably caused false signal in immunofluorescence studies, and thus, it was concluded that virus purification and labeling has to be more optimized for these kinds of studies. Fluorescent capsid label could provide us a tool for future uncoating and live imaging studies by minimizing non-specificity that is usually related to immunolabeling. In addition, PLC-inhibitor could enable uncoating studies to be carried out on the cell surface instead of endosomes.

Epidermaalinen kasvutekijäreseptori (EGFR) on yhdessä kollageeni- ja lamiinireseptori α2β1-integriinin kanssa tärkeä tekijä solun selviytymisen, kiinnittymisen ja jakautumisen säätelemisessä sekä syöpäsoluissa. Kasvutekijän sitoutumisen jälkeen EGFR:t dimerisoituvat, endosytoituvat klatriinivälitteisen endosytoosin kautta ja kulkeutuvat solun sisällä kolmen eri reitin mukaisesti: 1) EGFR-ligandi-kompleksi voi ubikitinaation seurauksena päätyä lysosomaaliseen pH:sta riippuvaan hajoitukseen, EGFR kierrättyy takaisin solukalvolle 2) ligandin irtoamisen tai 3) UBPY de-ubikitinaatioenstyymin toimesta. α2β1-integriinireseptori klusteroituu solukalvolle kiinnityttyään kollageeniin, lamiiniin, Echovirus1:een tai vasta-aineeseen ja endosytoituu ligandistaan riippuen joko klatriini- tai kaveoliini-lipidilauttavälitteisellä endosytoosilla. Proteiinikinaasi C:n (PKC) aktivaatio vaikuttaa sekä integriinin, että EGFR:n endosytoosissa. α2β1-integriinin endosytoosi on riippuvainen PKCα-aktivaatiosta. EGFR:lla threoniini 654:n fosforylaatio PKCα:n toimesta estää reseptorin ubikitinaation ja ohjaa sen kierrättävälle endosytoottiselle reitille. Aikaisempien tutkimuksiemme mukaan EGFR- ja α2β1-Integriiniendosomit kulkeutuvat solun sisällä hyvin lähellä toisiaan päätyen lopulta monivesikulaarisiin rakenteisiin. Reseptorit eivät kuitenkaan ole fyysisessä kontaktissa ja niiden vesikkelit ovat eri pH:ta. EGFR:n ja Integriinin välillä tiedetään kuitenkin olevan yhteyksiä ja α2β1-integriinin kautta tapahtuvan Echovirus1-infektion on havaittu vaikuttavan EGFR-hajotukseen. Tässä tutkimuksessa halusimme selvittää kuinka EV1-infektio vaikuttaa EGFR-säätelyyn. Keuhkosyöpäsolulinja A549:n EV1-infektoitujen ja infektoimattomien solujen lyso- tai proteosomaalinen hajotus estettiin bafilomysiiniA:lla, calpainilla tai bortezomibilla. PKCα:n vaikutusta tutkittaessa kinaasi aktivoitiin phorboli 12-myristaatti 13-asetaatilla. Käsiteltyjä soluja kuvattiin konfokaalimikroskoopilla joko pedattuina kaksiulotteisesti tai elävinä neliulotteisesti. Kvantitatiivinen kuvadata-analyysi tehtiin BioImageXD:llä. Kasvutekijällä aktivoituja A549-soluja kuvattiin myös transmissioelektronimikroskoopilla. Tuloksemme osoittivat että EGFR kulkeutui koeasetelmassamme samankaltaisten endosomaalisten rakenteiden kautta kuin EV1-α2β1-Integriinikompleksi. EV1-infektio vaikuttaa EGFR-kuljetukseen PKCα-aktivaatiota muistuttavalla tavalla: EGFR ohjautuu kierrättävälle endosytoosireitille ja sen hajotus heikkenee. Tuloksemme viittaavat EV1-infektion vaikuttavan EGFR:iin juuri PKCα-aktivaation kautta. EV1-α2β1-integriinikompleksin hajotuksen estyminen näytti myös lisäävän EGFR:n kertymistä solujen sisälle, joten viruksen vaikutus EGFR-reittiin välittyy vielä endosytoosin jälkeenkin. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia aikaisemmin tehtyjen havaintojen kanssa, joiden mukaan α2β1-integriinin ja EGFR:n välillä on selvä, vaikkakaan ei fyysinen, vuorovaikutus. On hyvin mahdollista että EV1 hyötyy EGFR:-hajotuksen hidastamisesta. Virukselle on hyödyllistä pitkittää EGFR:n solunsisäistä signalointia, joka säätelee Ras-ERK-signalointisarjan kautta mitogeneesiä ja PI3-Akt-signalointireitin kautta johtaa anti-apoptoottiseen signalointiin. Molempien signalointireittien säätely mahdollistaa virukselle paremmat solunsisäiset replikaatio-olosuhteet. Alongside with collagen and lamin receptor α2β1-Integrin, epidermal growth factor receptor (EGFR) is a crucial factor in cell survival, attachment, proliferation, mitosis and metastasis formation. Growth factor attachment dimerizes EGFRs which in turn induces clathrin dependent endocytosis of the EGFR-Ligand complex. EGFR has three distinct pathways within the cell: 1) EGFR-ligand complex undergoes lysosomal pH-dependent degradation by ubiquitination or gets recycled back to the cell surface through 2) ligand detachment or 3) UBPY de-ubiquitination enzyme. α2β1-Integrin clusters on cellular membrane after collagen, lamin, Echovirus1 or antibody attachment and gets endocytosed, depending on the ligand, either by clathrin or caveolae-lipidraft dependent endocytosis. Proteinkinase C (PKC) activation affects both integrin and EGFR endocytosis. α2β1-Integrin endocytosis is dependant on PKC α activation. Phosphorylation of EGFR threonine 654 by PKC α inhibits receptor ubiquitination and directs it to recyclive endosomal route. Our previous studies show close proximity between the EGFR and α2β1-Integrin endosomes as they get transported by intracellular pathways but these endosomes vary in pH and have no physical contact. EGFR and Integrin pathways have also been shown to be intertwined together and EV1 Infection through α2β1-Integrin is shown to affect EGFR-degradation. The goal of this study was to illustrate how EV1 infection modifies EGFR-regulation. Lyso- and proteosomal degradation in EV1 infected and uninfected A549 pulmonary cancer cells was inhibited by bafilomycinA, calpain or bortezomib. PKC α studies were performed by activating the kinase with phorbol 12-myristate 13-acetate. Treated cells were imaged with confocal microscope by 2D-imaging of fixed samples or 4D-imaging of live samples. Quantitative image analysis was performed with the BioImageXD image software. Growth factor activated cells were also imaged by transmission electron microscope. Our results show that in our laboratory model EGFR was transported through endosomal structures similar to the transport of EV1- α2β1-Integrin complex. EV1 was shown to affect EGFR transport with resemblance to PKCα activation: EGFR is directed to recyclive endosomal pathway with reduced receptor degradation. Further studies indicated that these results were indeed due to PKCα activation by EV1. The Inhibition of EV1- α2β1-Integrin complex degradation seemed to result in cytoplasmic EGFR accumulation proving that EV1 retains its effects on EGFR pathway also after the endocytosis. These results are consistent with the previous findings that show interplay between the α2β1-Integrin and EGFR. It’s very likely that down regulation of EGFR degradation is beneficial to EV1: Prolonged intracellular signaling by EGFR that regulates mitogenesis through PI3-Akt and Ras-ERK-signaling cascade results in anti-apoptotic signaling. Regulation of these two pathways enables favorable and better conditions for the EV1’s intracellular replication.

Solu ottaa sisäänsä materiaalia endosytoosin avulla. Koska soluun kuljetettavien molekyylien kirjo on laaja, soluun on kehittynyt erilaisia endosytoosireittejä. Fagosytoosin avulla soluun kuljetetaan suuria kiinteitä partikkeleita. Pinosytoosireittejä on useita, ja niiden avulla solu ottaa sisäänsä solukalvoa ja solun ulkopuolista nestettä sekä siihen liuenneita molekyylejä. Kasvutekijäreseptorit ovat solukalvon lävistäviä reseptorityrosiinikinaaseja. Kasvutekijän sitoutuminen reseptoriinsa saa aikaan reseptorien kasaantumisen, signalointikompleksien muodostumisen sekä reseptorin endosytoitumisen. Muodostuneet signalointikompleksit aloittavat soluissa viestiketjuja, jotka lopulta johtavat muutoksiin solujen jakaantumisessa, kasvussa, erilaistumisessa ja liikkumisessa. Integriinit ovat solukalvon tärkeimpiä adheesioreseptoreita, ja ne kiinnittävät solut viereisiin soluihin ja soluväliaineen proteiineihin. Integriinien kautta tapahtuva signalointi vaikuttaa muun muassa solujen muotoon, kiinnittymiseen ja erilaistumiseen. Integriinit voivat lisäksi toimia patogeenireseptoreina. Integriinien ja kasvutekijäreseptoreiden välillä on havaittu yhteistyötä. Echovirus 1 on ihmisen patogeeni, jonka reseptorina solukalvolla toimii α2β1-integriini. Viruksen sitoutuminen kasauttaa α2β1-integriinit solukalvolla, minkä jälkeen virus-reseptori -kompleksi endosytoidaan soluun. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, vaikuttavatko seerumin kasvutekijät α2β1-integriinin endosytoosiin ja echovirus 1:n infektiotehokkuuteen. Kasautuneen α2β1-integriinin endosytoositehokkuus selvitettiin kvantitatiivisen konfokaalimikroskopian avulla. Echovirus 1:n infektiivisyyttä eri seerumi- ja kasvutekijästimulaatioissa tutkittiin fluoresenssimikroskoopilla. Biokemiallisin menetelmin kartoitettiin α2-integriinin, echovirus 1:n ja kasvutekijäreseptoreiden määriä soluissa eri seerumi- ja kasvutekijästimulaatioissa. Tulosten mukaan kasvutekijät edistivät sekä α2β1-integriinin endosytoosia että echovirus 1 -infektiota ihmisen luusyöpäsoluissa, jotka ilmentävät runsaasti α2β1-integriiniä. Näiden solujen seeruminälkiinnyttäminen lisäsi joidenkin kasvutekijäreseptoreiden ilmentymistä, muttei vaikuttanut α2β1-integriinin määrään. Myös toisessa solulinjassa, ihmisen aortan sileissä lihassoluissa, seeruminälkiinnyttäminen aiheutti joidenkin kasvutekijäreseptoreiden määrän lisääntymistä. Toisin kuin luusyöpäsoluissa, sileissä lihassoluissa seeruminälkiinnyttäminen kuitenkin tehosti echovirus 1 -infektiota.

Integriinien ja kasvutekijäreseptorien kulku solussa yhdistyy monimutkaisen vuorovaikutusten verkoston kautta. Ympäristön olosuhteista riippuvaisesti integriinit ja kasvutekijäreseptorit kantavat pääasiallisen vastuun solun selviytymisestä, kasvusta, erilaistumisesta, vaeltamisesta ja lisääntymisestä. Integriinit kiinnittävät solut alustaansa ja kasvutekijäreseptorit voivat vastata liukoisten ligandien haasteisiin. α2β1-integriinit reagoivat ligandeihinsa, joita voivat olla matriksimolekyylit, virukset ja keinotekoisesti myös vasta-aineet. Integriinien klusterointi viruksella tai vasta-aineilla aiheuttaa integriinin internalisaation endosomeihin, kun taas sitoutuminen matriksimolekyyleihin saa aikaan integriinien kulkeutumisen fokaa-liadheesioihin. Epidermaalisen kasvutekijäreseptorin (EGFR) aktivaatio on riippuvaista kasvutekijäligan-din kiinnittymisestä reseptoriin. Integriinien klusteroituminen ja EGFR:n stimulaatio johtaa reseptorien internalisoitumiseen sekä aktivoituneeseen signaalivälitykseen, jonka täytyy olla tarkasti organisoitua sekä ajallisesti että paikallisesti. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli testata α2β1-integriinin ja stimuloidun EGFR:n vuorovaikutuksia. Tutkimuksessa selvitettiin α2β1-integriinien klusteroinnin vaikutusta EGFR:n polkuun ja EGF-stimulaation merkitystä α2β1-integriinin polkuun. Lisäksi tutkittiin EGFR:n ja α2β1-integriinin internali-saatiopolkujen vuorovaikutuksia. Tutkimuksessa käytettiin immunoleimaamista, konfokaalimikroskopiaa, läpäisyelektronimikroskopiaa ja elävien solun kuvaamista laajakenttämikroskoopilla. Tulokset osoittivat, että integriinien klusterointi hidastaa EGFR:ien hajotusta, mutta EGF-stimulaatio ei vaikuta integriinien hajotukseen. Tutkimuksessa havaittiin solun pinnalla olevaa kolokalisaatiota α2β1-integriinin ja stimu-loimattoman EGFR:n välillä. Stimulaation ja internalisaation jälkeen kolokalisaatiota löydettiin kuitenkin vain vähän. Elävien solujen kuvaaminen osoitti enemmän kolokalisaatiota perustuen todennäköisesti kuvausten heikompaan resoluutioon. Tutkimuksessa tarkasteltiin myös mahdollisia kolokalisaation virhe-tulkintoja laajakenttämikroskopiakuvausten analyyseissä. Tämän tutkimuksen tuloksista voidaan päätellä, että integriinien klusterointi toimii negatiivisena säätelijänä EGFR:ien hajotukselle. Vaikka EGFR ja α2β1-integriinit kolokalisoituvat osittain solun pinnalla, internalisaation jälkeen reseptoreja sisältävät endosomit kulkivat samoja reittejä ilman merkittävää kolokalisaatiota. Huolimatta vähäisestä kolokalisaa-tiosta EGFR:n ja integriinin välillä sytoplasmisissa rakenteissa, integriinin internalisaatioreitillä on selkeä vaikutus EGFR-reitin toimintaan solussa. EGFR:n vähentynyt hajoaminen solussa mahdollisesti lisää EGFR:n signalointia solussa, pitää solua pitempään hengissä ja voi olla siten edullinen viruksen lisäänty-misen kannalta. The pathways of integrins and growth factor receptors are connected through a complex network of inte-ractions in the cell. Depending on the environmental conditions these receptors are largely responsible for the survival, growth, differentiation, migration and proliferation of the cell. Integrins attach cells to the matrix and growth factor receptor enables cells to react to the soluble ligans. α2β1-integrins respond to their ligands i.e. matrix molecules, viruses, and artificially also antibodies. Integrin clustering by viruses or antibodies results in endocytosis of integrins to endosomes whereas binding to the matrix molecules targets integrins to focal adhesions. Epidermal growth factor receptor (EGFR) activation depends on binding of the growth factor ligand. Integrin clustering and EGFR activation result in receptor internaliza-tion and activation of signaling transduction pathways which have to be precisely orchestrated spatially and temporally. The aim of this study was to test the interactions between α2β1-integrin and EGFR triggered pathways. The objective of this study was to examine the clustering effects of α2β1-integrin on EGFR pathway and the effects of EGF-stimulation on α2β1-integrin pathway. Furthermore the interactions of the internaliza-tion pathways of EGFR and α2β1-integrin were studied. The testing included immunolabelling experi-ments, confocal fluorescence microscopy, transmission electron microscopy, and live-cell imaging. The results indicated that the clustering of integrins delay the degradation of EGFR but no effect on the deg-radation of integrins was discovered by the EGF-stimulation. In this study colocalization on the cell sur-face was observed between α2β1-integrin and unstimulated EGFR. However, after stimulation and inter-nalization very low levels of colocalization were found. The live cell imaging showed higher colocaliza-tion probably based on poor resolution. The possible misinterpretations of colocalization concerning the analysis of wide-field microscopy were also under consideration. Findings of this study suggest that the clustering of integrins functions as a negative regulator for EGFR degradation. Though EGFR and α2β1-integrin partly colocalize on the cell surface, after internalization, endosomes containing receptors fol-lowed the same routes without considerable colocalization. Regardless of the low colocalization between EGFR and integrins in the cytoplasmic structures, integrin internalization pathway clearly contributes to the EGFR route in the cell. Reduced degradation of EGFR in the cell probably enhances EGFR signal-ing, prolongs the life-time of the cell and may be thus advantageous to the proliferation of virus.

Kirsi Pakkanen haki väitöstutkimuksessaan monitieteellisen lähestymistavan avulla uusia näkökulmia virustutkimukseen. Tutkimus tuo uutta tietoa lipidikalvojen merkityksestä viruksen ja viruksen isäntäsolun elämässä. Tutkimuksessa selvisi, että koiran parvovirus, jota tutkimuksessa käytettiin mallina parvoviruksille ja yleisemmin vaipattomille viruksille, tarvitsee tietynlaisia isäntäsolun lipidikalvojen ominaisuuksia voidakseen vapautua solunsisäisten endosomirakkuloiden sisältä. Erityisen tärkeää tässä vapautumisessa näytti olevan kalvojen juoksevuus sekä jäykkien alueiden hallittu järjestäytyminen kolesterolin avulla. Hyödyntämällä molekyylejä, lääkeaineita, jotka muuttavat kolesteroliavusteista kalvon järjestäytymistä, voidaan estää virusta infektoimasta solua. Tällöin virus ei pääse vapautumaan solunsisäisistä rakkularakenteista eikä siten pääse solun tumaan, jossa infektio tapahtuisi. Solunsisäisten kalvojen ominaisuuksien muokkaaminen patogeeneille epäsuotuisaksi on tuore näkökanta viruslääkkeiden kehittelyyn, sillä tyypillisesti lääkeaineet ovat keskittyneet toimimaan proteiinien tasolla, esimerkiksi estämällä viruksen entsyymien toimintaa. Pakkasen tutkimuksessa erityisen huomion kohteena oli mielialalääke desipramiini. Jo käytössä olevana lääkkeenä desipramiini oli mielenkiintoinen kohde kalvovuorovaikutusten tutkimiseen sekä hyvä kandidaatti mahdolliseksi kalvoihin kohdistuvaksi virusinfektion estäjäksi. Desipramiinin havaittiin estävän virusinfektiota soluviljelmässä. Tarkoissa, tietokonemallinnukseen perustuvissa atomitason tutkimuksissa desipramiinin nähtiin muuttavan lipidikalvojen järjestyneisyyttävirukselle epäsuotuisaan suuntaan.Lisäksi Pakkanen selvitti mm. kuinka lipidikalvon koostumus ja koostumuksen säätelemät kalvon ominaisuudet voivat osallistua lisäämään solunsisäisten rakkuloiden, lysosomien, kestokykyä ja vähentämään kalvojen läpäisevyyttä. Triglyseridien läsnäolon yksinkertaisessa mallikalvosysteemissä havaittiin muuttavan dramaattisesti kalvon fysikaalisia ominaisuuksia, kuten esimerkiksi kalvon polaarisuutta ja veden pääsyä kalvon yläpinnan molekyylien tasolle. Väitöskirjatutkimukseen kuuluu viisi osatyötä, jotka muodostavat laajan monitieteellisen kokonaisuuden ja joissa hyödynnetään niin solubiologisia, biokemiallisia kuin biofysikaalisiakin menetelmiä. Understanding cellular functions and behaviour of biological membranes is essential in effort to understand the elaborate schemes pathogens such as viruses use to invade their host cells. In this thesis membrane interactions important for the entry of canine parvovirus (CPV), a model virus representing parvoviruses and non-enveloped viruses in general, were elucidated. Cholesterol-driven organisation of membranes was found to be important for the viral entry and without proper cholesterol-facilitated membrane organisation trafficking of the virus was impaired at the endosomal level and the infection inhibited. Desipramine, a tricyclic antidepressant, was found to inhibit CPV entry, which makes it an interesting candidate for an antiviral agent. In computational simulation studies desipramine was found to disintegrate cholesterol-based ordered regions in membranes. Elucidation of the properties of endosomal and lysosomal membranes has clear biomedical significance, both from the point of view of hindering the progression of pathogens in cells and in understanding inherent pathological processes such as hereditary diseases concerning lysosomes. The role of triglycerides in lysosomal membranes was studied in a model system. Triglycerides were found to cause significant differences in the polarity and water accessibility in the membrane. These could contribute to the barrier properties of lysosomes.