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Orientador: Marcelo Nicolas Muscari Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica do sistema nervoso central (SNC), caracterizada pela infiltração de células do sistema imune neste compartimento, com destruição de mielina e perda de oligodendrócitos. O emprego do modelo experimental, a encefalomielite autoimune (alérgica) experimental (EAE), tem trazido grandes contribuições para a compreensão dos mecanismos envolvidos e o esclarecimento da patogênese de doenças autoimunes, tais como a EM. Apesar do modelo EAE ter sido estabelecido em 1940, os únicos (e últimos) trabalhos nos quais foi estudada a resposta cardiovascular destes animais foram publicados entre 1966 e 1972 (quando ainda não se tinha conhecimento da ocorrência do NO em sistemas biológicos). Atualmente sabemos que há alterações na produção de NO na EAE e da importância deste mediador no controle do tônus vascular. Os objetivos deste estudo foram investigar a reatividade vascular in vitro de aorta e artéria pulmonar provenientes de ratos portadores de EAE; bem como verificar a importância da produção endógena de NO, assim como a participação de produtos derivados da ciclooxigenase sobre a resposta vascular nos animais portadores da EAE e avaliar a evolução temporal de parâmetros hemodinâmicos (pressão arterial média e freqüência cardíaca), ao longo do desenvolvimento da doença EAE. O tratamento de ratos com o inibidor de iNOS aminoguanidina (AG) ou com o inibidor de COX-2 etoricoxibe (ETO) resultou em retardo do aparecimento dos sinais clínicos da EAE, sem modificar o perfil de perda ponderal que se segue à imunização com o antígeno de mielina. Não há diferenças significativas nos parâmetros hemodinâmicos, mesmo quando tratados com AG ou ETO. Tanto anéis de aorta como de artéria pulmonar de animais com EAE mostraram uma resposta diminuída a agonistas adrenérgicos vasoconstritores, os quais de alguma forma foram revertidas quando tratados com AG. Anéis de aorta de animais com EAE mostraram uma resposta aumentada à acetilcolina (ACh), a qual pode ser revertida pelo tratamento com AG ou ETO. Por outro lado as respostas dos tecidos de animais controle ou com EAE ao nitroprussiato de sódio (SNP) não foram diferentes. As ações vasorelaxantes do isoproterenol (ISO) não foram diferentes nos anéis de aorta provenientes dos diversos grupos experimentais, apesar da aparente maior potência do agonista nos tecidos dos animais com EAE, e a reversão pelo tratamento com AG. Contrariamente ao observado nos anéis de aorta, a resposta a ACh mostrou-se muito deprimida nos anéis de artéria pulmonar de ratos com EAE em relação aos animais controle. Neste tecido, a resposta máxima parece normalizar-se nos animais com EAE tratados com AG ou ETO. Com base nestes resultados, nós propomos que: o NO (derivado da iNOS) e/ou prostanóides (derivados da COX-2) podem estar envolvidos nos primeiros sinais clínicos da EAE, porém, a participação destes mediadores parece não ser relevante no equilíbrio hemodinâmico geral; há alteração na regulação simpática nos animais portadores da EAE e o NO derivado de iNOS parece mediar esta resposta contrátil deficiente; a resposta vasodilatadora simpática mediada por receptores ß-adrenérgicos parece não estar substancialmente alterada; há ocorrência de resposta relaxante dependente de endotélio alterada na EAE; aorta e artéria pulmonar mostraram alterações em sentidos opostos que podem ser normalizados através da inibição de iNOS ou COX-2; os efeitos do NO derivado de iNOS ou dos prostanóides sintetizados pela COX-2 são dependentes da função, fisiologia e/ou tipo particular de leito vascular Abstract: Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), characterized by the infiltration of immune system cells in this compartment, with destruction of myelin and loss of oligodendrocites. Experimental autoimmune (or allergic) encephalomyelitis (EAE) is a useful animal model for the study of human multiple sclerosis that shows characteristics similar to those shown by patients with MS. Last works in which was studied the cardiovascular reply of EAE animals was published between 1966 and 1972 (when it was unknown the occurrence of Nitric Oxide (NO) in the biological systems). Currently we know that exist alterations in the production of NO in the EAE and your importance in the control of tonus vascular. The purpose of the present study is to investigation of vascular reactivity in vitro of aorta and pulmonary artery from rats with EAE; as well as verifying the importance of the endogenous production, the participation of derived products from cyclooxygenase on the vascular response in the animals with EAE and evaluating hemodynamic parameters (average arterial pressure and cardiac frequency), to the long one of the development of disease EAE. The treatment of rats with aminoguanidine (AG) inhibitor of iNOS or with etoricoxibe (ETO) inhibitor of Cox-2, resulted in retarding showing of the clinical signals of the EAE, without modifying the profile that follows to the immunization with the myelin antigen. There is not significant differences in the hemodynamic parameters, when treated with AG or ETO. The rings of aorta, pulmonary artery from animals with EAE has a diminished response for adrenergic vasoconstrictor agonists, the response to revert when treated with AG. Rings of aorta from animals with EAE had shown a increase response to acetilcolina (ACh), which can to be revert by the treatment with AG or ETO. On the other hand the responses of blood vessel of animal control or with EAE to the nitroprussiato of sodium (SNP) had not differences. The vasodilation actions of isoproterenol (ISO) had not differences significant in rings of aorta from the diverse experimental groups, despite apparent potency and to revert the response of vasodilation when treated with AG. In contrast to the observed one in rings of aorta, the response for ACh it was decreased in rings of pulmonary artery of rats with EAE, when compared to the control animals. In this blood vessel, the maximum reply it seems to be normalized in the animals with EAE when treated with AG or ETO. These results suggest that: the nitric oxide (derived from iNOS) and/or prostanoids (derived from the Cox-2) can be involved in the first clinical signals of the EAE, however, the participation of these mediators seems not to be important in the general hemodynamic equilibrium; there is alteration in the sympathetic regulation in the animals with EAE, NO derivative of iNOS seems to mediate this deficient contrátil response; the vasodilator response mediated by ß-adrenergic receptor it seems not to be substantially modified; the response of dependent relaxation of endothelium it was altered in the animals with EAE; aorta and pulmonary artery showed alterations in opposed directions that can be normalized through the inhibition of iNOS or Cox-2; the effects of NO derivative of iNOS or prostanoids synthesis for the Cox-2 are dependents of the function, physiology and/or particular type of blood vessel Mestrado Farmacologia Mestre em Farmacologia

Orientador: Alessandro dos Santos Farias Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A encefalomielite experimental autoimune (EAE) é o modelo experimental da Esclerose Múltipla (EM) humana. A resposta inflamatória da EAE é caracterizada pela infiltração de células mononucleares no sistema nervoso central (SNC) e consequente destruição da mielina. Sabe-se que a doença é mediada por linfócitos T CD4+, os quais, segundo nossos dados, apresentam atividade citotóxica. Ainda, uma porcentagem das células T CD4+ infiltradas no SNC durante a fase aguda da doença apresenta também a expressão de CD8??. No presente estudo demonstramos a existência de células T CD4+CD8+ presentes tanto na periferia quanto no sistema nervoso central. Alguns clones dessas células duplo positivas (DP) apresentam dois receptores de célula T (TCR), o que nos sugere uma possível ação efetora dessas células, bem como contribuição na EAE. Além disso, observamos um enriquecimento de TCRs encefalitogênicos pelas células duplo positivas (DP) se comparado a T CD4+ Simples Positiva. Runx3 está envolvido na transcrição de genes da linhagem CD8, tais como perforinas, granzimas e a molécula do CD8. A expressão ectópica de Runx3 nas células T CD4+ pode ser a razão pela qual estas, segundo nossos dados, apresentem ação citotóxica. Nossos dados apontam que a expressão de Runx3 é importante para a escolha de clones encefalitogênicos na EAE, e que a células DP apresentam expressão intermediária desse gene se comparado as células TCD8+. Também demonstramos que na periferia embora haja expressão de LAMP1, marcador de citotoxicidade, esta é baixa se comparada ao Sistema Nervoso Central. Nossos dados sugerem que Runx3 é importante para linfócitos DP, por estar influenciando nas características citotóxicas dessas células Abstract: Autoimmune experimental encephalomyelitis (EAE) is the experimental model of human multiple sclerosis (MS). The inflammatory response of EAE is characterized by infiltration of mononuclear cells into the central nervous system (CNS) and consequent destruction of myelin. It is known that the disease is mediated by CD4+ T lymphocytes, which, according to our data, have cytotoxic activity. Furthermore, a percentage of CD4+ T cells infiltrated into the CNS during the acute phase of the disease also exhibits CD8?? expression. In the present study we demonstrated the existence of CD4+CD8+ cells present in both the periphery and the central nervous system. Some clones of these double positive cells (DP) present two T cell receptors (TCR), which suggests a possible effector action of these cells, as well as contribution in EAE. In addition, we observed an enrichment of encephalitogenic TCRs by double positive cells (DP) when compared to CD4+ T Simple Positive. Runx3 is involved in the transcription of genes of the CD8 lineage, such as perforins, granzymes and the CD8 molecule. The ectopic expression of Runx3 in CD4 + T cells may be the reason why these, according to our data, present cytotoxic action. Our data indicate that the expression of Runx3 is important for the choice of encephalitogenic clones in EAE, and that the DP cells present intermediate expression of this gene when compared to the CD8 + T cells. We also demonstrated that in the periphery although there is expression of LAMP1, a cytotoxicity marker, it is low compared to the Central Nervous System. Our data suggest that Runx3 is important for DP lymphocytes because it influences the cytotoxic characteristics of these cells Mestrado

Orientadores: Liana Maria Cardoso Verinaud, Rodolfo Thomé Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As causas das doenças autoimunes são multifatoriais. Estudos indicam que as infecções causadas por alguns vírus, bactérias ou fungos podem induzir a exarcebação ou o desencadeamento de algumas doenças autoimunes por diferentes mecanismos. Recentamente, alguns trabalhos têm demonstrado o pulmão como órgão-chave na imunopatogênese de doenças autoimunes e neurodegenerativas, tal qual, a Esclero Múltipla (EM). Isso porque, há relatos bem documentados na literatura que apontam o desencadeamento dos sinais clínicos desse tipo de doença autoimune, após infecções respiratórias, como gripes ou resfriados. Outro estudo aponta o pulmão como um órgão "licenciador" de células T infiltrantes do Sistema Nervoso Central (SNC). Entretanto, os mecanismos pelos quais ocorre essa associação entre pulmão e doenças autoimunes e neurodegenerativas não estão totalmente esclarecidos e os dados na literatura sobre essa associação são divergentes. Enquanto alguns trabalhos observaram que uma inflamação no pulmão pode ser benéfica para o prognóstico da EAE (Encefalomielite Autoimune Experimental) ¿ o modelo animal experimental da EM- outros mostraram que uma infecção pulmonar, como por exemplo, pelo vírus influenza, pode aumentar a severidade dessa doença. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi investigar se a infecção causada por Paracoccidioides brasiliensis (Pb), um fungo em que na maioria dos casos, o foco primário da infecção é no pulmão, pode alterar a progressão de doenças autoimunes e neurodegenerativas. Para tanto, utilizamos a EAE como modelo desse tipo de doença autoimune. Os resultados mostraram que a infecção inicial por P. brasiliensis em fêmeas induz um aumento da porcentagem de células T reguladoras (CD4+ CD25+) e de células T CD8+ produtoras de IL-10 no pulmão. Além disso, neste período de infecção, ocorreu um aumento significativo dos níveis de IL-10 sistêmicos no grupo de camundongos infectados, resultando na indução de um fenótipo imaturo de células dendríticas (DCs) esplênicas. Ensaios realizados ex vivo mostraram que essas DCs foram capazes de induzir a diferenciação de células T CD4+ produtoras de IL-10 em órgão linfoide periférico (baço). Corroborando esses resultados, quando submetidos à imunização com o peptídeo MOG35-55 para indução da EAE, no início da infecção por Pb, os camundongos infectados (grupo EAE_Pb) mostraram um retardo no aparecimento dos sinais clínicos da doença. Esse retardo ficou mais evidente em camundongos infectados pelo fungo via rota intranasal do que naqueles infectados via rota intravenosa e foi associado a um aumento significativo da expressão de ambas as citocinas imunossupressoras, IL-10 e TGF-beta, nas fases pré-aguda e aguda da EAE (8 e 15 dias após a indução da doença). Concomitantemente, foi observado um aumento significativo da porcentagem de células T reguladoras (Treg) que expressam a citocina imunossupressora TGF-beta nos pulmões e baços do grupo de camundongos EAE_Pb. Experimentos realizados ex vivo mostraram que estas células T reguladoras (Treg) de camundongos infectados foram capazes de inibir a proliferação de células T CD4+ CD25- de camundongos com EAE, aumentando, portanto, as evidências de que, além da ação direta das citocinas TGF-beta e IL-10, as células Treg também estariam contribuindo para o retardo no desenvolvimento da doença, por meio da inibição das células T CD4+ encefalitogênicas. Diante do exposto, os nossos resultados apontam o pulmão como um órgão importante para o estabelecimento e desenvolvimento de doenças autoimunes e neurodegenerativas, direcionando a aplicação de novas terapias contra essas doenças para esse órgão ao invés de exclusivamente, para o Sistema Nervoso Central (SNC) Abstract: The causes of autoimmune diseases are multifactorial. Studies have indicated that infections caused by some viruses, bacteria or fungi may induce the exacerbation or triggering of some autoimmune diseases by different mechanisms. Recently, some studies have demonstrated lung as a key organ in the immunopathogenesis of autoimmune and neurodegenerative diseases, such as Multiple Sclerosis (MS). In fact, well-documented reports in the literature indicate the triggering of clinical signs of this type of autoimmune disease after upper respiratory tract infections, such as flu or colds. Another study points to the lung as a "licensor" organ of central nervous system (CNS) infiltrating T cells. However, the mechanisms by which this association between lung and autoimmune and neurodegenerative diseases occurs are not fully understood and the data in the literature about this association are divergent. While some studies have shown that lung inflammation may be beneficial for the prognosis of EAE (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis) - the experimental animal model of MS - others have shown that a lung infection, such as the influenza virus infection, can increase the severity of this disease. Therefore, the aim of this study was to investigate whether the infection caused by Paracoccidioides brasiliensis (Pb) - a fungus in which in most cases the primary focus of infection is in the lung - can alter the progression of autoimmune and neurodegenerative diseases. For this purpose, we used EAE as a model of this type of autoimmune disease. The results showed that early infection by P. brasiliensis in females induces an increase in the percentage of regulatory T cells (CD4+ CD25+) and IL-10-producing CD8+ T cells in the lung. Furthermore, during this period of infection, there was a significant increase in systemic IL-10 levels in the group of infected mice, resulting in the induction of an immature phenotype of DCs in a peripheral lymphoid organ (spleen). In fact, ex vivo experiments showed that these DCs can induce differentiation of IL-10-producing CD4+ T cells. Corroborating these results, when submitted to immunization with the peptide MOG35-55 for induction of EAE, at the beginning of Pb infection, infected mice (EAE_Pb group) showed a delay in the clinical signs of the disease. This delay was more visible in Pb-infected mice by the intranasal route than in those infected by the intravenous route. Moreover, it was associated with a significant increase in the expression of both immunosuppressive cytokines, IL-10 and TGF-beta, at the pre-acute and acute phases of EAE (8 and 15 days after disease induction). Concurrently, a significant increase in the percentage of regulatory T cells (Treg) expressing immunosuppressive cytokine TGF-beta was observed in the spleen and lung of EAE_Pb mouse group. Ex vivo experiments showed that these regulatory T cells of infected mice were able to inhibit the proliferation of CD4+ CD25-T cells from EAE mouse group, therefore, providing evidence that these Treg cells, in addition to TGF-beta and IL-10 cytokines, could be contributing to the delay in the development of the disease. Taken together, our results point to the lung as an important organ for the development of autoimmune and neurodegenerative diseases, directing the emergence of new therapies against these diseases also to this organ instead of just the Central Nervous System (CNS) Doutorado Imunologia Doutora em Genética e Biologia Molecular CNPQ 140867/2016-3

Dissertação de mestrado em Ciências da Saúde, A Esclerose Múltipla (EM) é uma doença inflamatória crónica desmielinizante, caracterizada pela destruição da camada protetora que cobre os axónios, a bainha de mielina, e perda axonal. Geralmente afeta jovens adultos e causa incapacidades a vários níveis, nomeadamente motor, visual e cognitivo. Devido às caraterísticas debilitantes desta doença, existe uma necessidade crescente na descoberta de novos biomarcadores e possíveis alvos terapêuticos. Neste sentido, a pentraxina-3 (PTX3), uma proteína multifuncional envolvida na regulação do recrutamento de leucócitos para os tecidos, resposta inflamatória e manutenção da barreira hematoencefálica, poderá desempenhar um papel importante na patofisiologia desta doença. Para estudarmos esta hipótese, induzimos o modelo animal de EM, o modelo de encefalomielite experimental autoimune (EAE), em murganhos que não expressam PTX3 (Ptx3 -/- ) e murganhos selvagens (WT) e avaliamos a evolução da doença nestes animais. Para além disso, avaliamos a expressão de várias citoquinas inflamatórias e também marcadores de astrócitos e microglia no cerebelo destes animais, tanto na fase mais agressiva como na fase crónica da doença. Após esta análise verificamos que os animais Ptx3 -/- induzidos com EAEnão apresentam diferenças significativas em relação aos animais WT, em termos de score clínico e de peso corporal. No entanto, confirmamos que os animais EAE apresentam uma maior expressão de marcadores inflamatórios, como interleucina (Il) 6, Il12, Il17 e interferão gamma (Ifng), e de alguns marcadores de reatividade de astrócitos e microglia, em comparação com os animais não induzidos. Para além disso, estas diferenças são mais evidentes na fase mais precoce da doença do que na fase crónica. No que diz respeito a diferenças entre genótipos, estas apenas foram observadas na expressão do gene da fibulina-5 (Fbln5), da proteína de ligação ao cálcio (S100a10) e do complexo principal de histocompatibilidade 2 (Mhc2). Verificámos ainda que os animais Ptx3 -/- aparentam ter menos lesões no cerebelo do que os animais WT. Para além dos estudos em murganhos, estudámos também o efeito de alterações a nível do gene da PTX3 em pacientes de EM e controlos saudáveis. Estes pacientes foram genotipados para dois polimorfismos funcionais do gene da PTX3 e as frequências de haplótipos foram comparados entre grupos. No entanto, nenhum haplótipo estava significativamente relacionado com a suscetibilidade para EM. Medimos também os níveis de PTX3 no soro e verificamos que estes estavam aumentados em pacientes de EM quando comparados com controlos saudáveis, sugerindo um possível papel da PTX3 na patofisiologia de EM., Multiple Sclerosis (MS) is a demyelinating chronic inflammatory disease, characterized by degradation of the protective layer that covers the nerves, called the myelin sheath, and axonal loss. It generally affects young adults and causes disabilities at several levels, namely motor, visual and cognitive. Due to the disabling features of this disease, there is an increasing need for the discovery of novel biomarkers and possible therapeutic targets. In this sense, pentraxin-3 (PTX3), a multifunctional protein involved in the regulation of leukocyte recruitment into tissues, inflammatory response and maintenance of the blood brain barrier could play an important role in the pathophysiology of this disease. To study this hypothesis, we induced the widely used MS animal model, the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), in PTX3-null mice (Ptx3 -/- ) and wild-type mice (WT), and assessed the evolution of the disease in these animals. Furthermore, we evaluated the expression of several inflammatory cytokines and also microglial and astrocytic markers, in the cerebellum of these animals, both in the onset and in the chronic phases of disease. After this analysis, we verified that Ptx3 -/- mice present a similar disease course to WT animals. We confirmed that EAE animals present a higher expression of inflammatory markers, such as interleukin (Il) 6, Il12, Il17 and interferon gamma (Ifng), and of some astrocytic and microglial markers in comparison to non-induced controls. Moreover, these differences are more evident in the onset phase than in the chronic phase of disease. Differences between genotypes were only observed in the expression of fibulin 5 (Fbln5), calcium-binding protein (S100a10) and major histocompatibility complex class 2 (Mhc2) genes. In addition, we observed that Ptx3 -/- mice seem to present less cerebellum lesions than their WT littermates. Besides this analysis in the animal model, we also studied the effect of genetic variation in the PTX3 gene in MS patients and healthy controls. These patients were genotyped for two functional single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the PTX3 gene and the haplotype frequencies of the two SNPs were compared between the two groups. However, none of the haplotypes were significantly associated with MS susceptibility. On the other hand, PTX3 serum levels were increased in MS patients when compared to healthy controls, suggesting a possible role of this protein in the pathophysiology of MS., O trabalho apresentado nesta tese foi realizado no Instituto de Investigação em Ciências da Vida e Saúde (ICVS), Universidade do Minho. O financiamento é proveniente dos fundos da FEDER através do Programa Operacional Fatores de Competitividade – COMPETE, e dos fundos nacionais através da Fundação para a Ciência e Tecnologia sobre POCI-01-0145-FEDER-007038; e sobre o projeto NORTE-01-0145-FEDER 000013 do Programa Operacional Regional do Norte (NORTE 2020), sobre o Acordo de Parceria PORTUGAL 2020, através do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER).

Submitted by Luiza Ayumi Nishiyama Mimura (luizamimura@gmail.com) on 2019-04-26T17:17:12Z No. of bitstreams: 1 Tese 2019.pdf: 2103219 bytes, checksum: b9d344d9629b263e35917c8f748e2e79 (MD5) Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2019-04-29T12:34:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 mimura_lan_dr_bot.pdf: 2103219 bytes, checksum: b9d344d9629b263e35917c8f748e2e79 (MD5) Made available in DSpace on 2019-04-29T12:34:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 mimura_lan_dr_bot.pdf: 2103219 bytes, checksum: b9d344d9629b263e35917c8f748e2e79 (MD5) Previous issue date: 2019-03-01 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) A esclerose múltipla (EM) é uma doença crônica e desmielinizante do sistema nervoso central (SNC). A imunopatogênese da doença e do modelo, a encefalomielite autoimune experimental (EAE), envolve a ativação de diferentes populações de linfócitos, macrófagos e da microglia que liberam uma infinidade de mediadores pró-inflamatórios e radicais livres. A vitamina D3 (VitD) e seu análogo Paricalcitol (Pari) são dotados de atividade imunomoduladora e são utilizados em doenças autoinflamatórias e autoimunes. Recentemente, observamos que a VitD quando administrada logo após a indução da EAE controlava a doença com eficácia. Portanto, o objetivo deste trabalho foi comparar o potencial terapêutico da VitD e do Pari no desenvolvimento da EAE e avaliar se seriam eficazes em momentos mais avançados da doença. Camundongos C57BL/6 foram imunizados com glicoproteína do oligodendrócito da mielina (MOG) emulsionada com adjuvante completo de Freund e foram tratados com VitD ou Pari (0,1g/animal, 15 dias alternados, i.p.). A terapia foi iniciada sete dias após a indução, quando a resposta autoimune já estava estabelecida ou dez dias após a indução, quando os primeiros sintomas eram evidentes. A terapia com VitD ou Pari não determinou proteção contra a EAE quando iniciada dez dias após a indução. Terapias iniciadas no sétimo dia após a indução geraram resultados distintos e inesperados. A VitD determinou redução do escore clínico e da expressão de MHCII, NLRP3 e CX3CR1 no SNC e aumento de neutrófilos no pulmão e na permeabilidade da barreira intestinal. O Pari não determinou efeito protetor significativo, entretanto reduziu a expressão de CX3CR1 no SNC e de RORc em células do pulmão e aumentou a produção de IL-6 e IL-17 no intestino. Concluímos que a VitD, mas não seu análogo Pari, é eficaz no tratamento da EAE mesmo quando administrada na fase pré-clínica. Experimentos adicionais estão sendo realizados para esclarecer os mecanismos deste efeito diferencial entre VitD e Pari. Multiple sclerosis (MS) is a chronic and demyelinating disease of the central nervous system (CNS). MS and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) immunopathogenesis involve T lymphocytes, macrophages and microglial cells whose activation will release a plethora of pro-inflammatory mediators and free radicals. Vitamin D3 (VitD) and its analog Paricalcitol (Pari) are endowed with immunomodulatory activity and are used in autoinflammatory and autoimmune diseases. Recently, we demonstrated that VitD was able to control EAE development when administered soon after disease induction. Therefore, the aim of this work was to compare the therapeutic potential of VitD and Pari to control EAE development and also to evaluate if this therapeutic approach is efficient to control ongoing disease. C57BL/6 mice immunized with myelin oligodendrocyte glycoprotein emulsified with complete Freund’s adjuvant were intraperitoneally treated with VitD or Pari (0,1ug/animal, 15 every other day). Therapy was initiated 7 days post induction when the autoimmune response was already established or 10 days post induction when the first symptoms appeared. VitD or Pari therapy started ten days after induction did not determine protection. Therapy started seven days after disease induction brought forth unexpected results. VitD reduced disease severity, decreased MHCII, NLRP3 and CX3CR1 expression at the CNS, increased the percentage of neutrophils in the lungs and increased the permeability of the intestinal barrier. Pari therapy had no major protective effect; however it reduced CX3CR1 mRNA expression in the CNS, decreased expression of RORc in lung eluted cells and increased IL-6 and IL-17 production in the intestine. We conclude that VitD, but not its analog Pari, is effective to control EAE even if administered at the pre-clinical stage. Additional experiments are already being performed to elucidate the mechanisms involved in this differential effect of VitD and its analog. FAPESP: 2015/06706-8

Submitted by Juliana Helena dos Santos de Toledo (juliana.toledo@unesp.br) on 2019-04-12T14:00:08Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Juliana H. S de Toledo.pdf: 2151769 bytes, checksum: 0b6f7814ce276ba95191f39e5d4c9427 (MD5) Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2019-04-12T17:32:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 toledo_jhs_me_bot_par.pdf: 2151769 bytes, checksum: 0b6f7814ce276ba95191f39e5d4c9427 (MD5) Made available in DSpace on 2019-04-12T17:32:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 toledo_jhs_me_bot_par.pdf: 2151769 bytes, checksum: 0b6f7814ce276ba95191f39e5d4c9427 (MD5) Previous issue date: 2019-02-22 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica e desmielinizante do sistema nervoso central (SNC). A imunopatogênese da EM envolve linfócitos Th1, Th17 e Tc autorreativos e ativação de macrófagos e microglia, os quais liberam vários mediadores pró-inflamatórios e radicais livres. Não há cura para a EM e as terapias disponíveis desencadeiam efeitos colaterais. Neste contexto, testamos o potencial terapêutico da cisteína selenizada (CS), um produto em desenvolvimento pela empresa Biorigin, no controle da encefalomielite autoimune experimental (EAE). O potencial profilático/terapêutico foi testado por administração de CS durante 30 dias (14 dias antes seguido de 16 dias pós-indução da EAE) e o potencial terapêutico por administração da CS a partir de 1 ou 7 dias após a indução da doença. Os 3 procedimentos reduziram escore clínico e incidência da EAE. A estratégia profilática/terapêutica reduziu discretamente a expressão de componentes do inflamassoma NLRP3 e o percentual de macrófagos e microglia ativada no SNC. As duas estratégias terapêuticas determinaram redução significativa no escore clínico, no percentual de macrófagos e microglia ativada e na expressão de MHCII por estas células. A terapia com CS também reduziu a ativação do inflamassoma NLRP3 e a expressão de mRNA para iNOS e CX3CR1.A redução na percentagem de células dendríticas ativadas (DCs) (CD11b+MHCII+) e o aumento no percentual de DCs tolerogênicas (CD11b-CD103+) sugere o estabelecimento deum perfil regulador neste local. Nos linfonodos inguinais foi detectado um aumento discreto na expressão dos fatores de transcrição Foxp3, Tbet e GATA-3. Estes efeitos protetores foram concomitantes com níveis elevados de selênio no SNC. Ensaios de função renal e hepática sugerem que esta eficácia terapêutica não é acompanhada de efeitos colaterais. Para reforçar a possibilidade de translação dos resultados descritos no modelo para a doença humana, testamos a eficácia terapêutica da CS em camundongos SJL/J, os quais desenvolvem uma doença do tipo remitente-recorrente. O efeito foi similar ao descrito no modelo C57BL/6. Os resultados observados reforçam nossa hipótese de que este produto tem potencial para ser utilizado como terapia adjunta em pacientes com EM. Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory and demyelinating disease of the central nervous system (CNS). Its immunopathogenesis is complex and involves the interplay of distinct autoreactive T lymphocyte subsets and innate immune cells. The persistent inflammation observed in MS patients is related to oxidative stress and inflammasome activation which have been recently implicated in both, demyelination and axonal damage processes. Since the development of new therapeutic procedures remains necessary, we evaluated the efficacy of an antioxidant product to control experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) development. The selenized cysteine (SC) is an organic selenium, developed by a Brazilian company (Biorigin). For prophylactictherapeutic strategy, oral treatment with SC (45µg of selenium/dose) started 14 days before EAE induction and was daily extended until the acute phase of the disease. The precocious and delayed therapies have begun 1 or 7 days after MOG administration. The three therapeutic approaches reduced EAE incidence and clinical manifestations. Prophylactic-therapeutic strategy attenuated NLRP3 inflammasome activation and reduced the number of macrophages and activated microglia in the CNS. Precocious and delayed therapies were efficient in controlling EAE symptoms, reducing the percentage of macrophages and activated microglia and the MHCII expression. This protection was concomitant by less NLRP3 inflammasome activation and lower expression of mRNA for iNOS and CX3CR1. Reduction in the percentage of activated dendritic cells (DCs) (CD11b+MHCII+ ) and increase in the percentage of tolerogenic DCs (CD11b-CD103+ ) in the mesenteric lymph nodes suggest the presence of regulatory condition. Oral SC administration also slightly increase the expression of transcriptional factors Foxp3, Tbet and GATA-3 in inguinal lymph nodes. As elevated levels of selenium were determined in the CNS, we believe that SC could act directly in the neuroinflammation control. Hepatic and renal enzymes evaluation suggest that this product is safe for use. To reinforce the possibility to translate this treatment to MS patients, we evaluated SC therapeutic efficacy in a relapsing-remitting EAE model. Indeed, SC efficiently controlled the clinical manifestations in SJL/J mice. Our results emphasize that this organic selenium source has the potential to be used as an adjuvant therapy for MS patients.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Introdução: A esclerose múltipla (EM) é a doença desmielinizante inflamatória mais prevalente do sistema nervoso central (SNC) no mundo. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é o modelo animal estabelecido para o estudo da patogênese e novas terapias para a EM. Foi demonstrado que o óleo de copaíba possui propriedades anti-inflamatórias e neuroprotetoras. O β-cariofileno (BCP), um dos mais importantes sesquiterpenos deste óleo, modula a expressão do fator de transcrição NF-κB estimulando o receptor canabinóide 2 (CB2). Objetivo: Os perfis de IL-17, T-bet e GATA-3 foram avaliados in situ no SNC. Além disso, as possíveis propriedades de remielinização estimuladas por BCP em camundongos C57BL/6 com EAE foram investigadas. Métodos: A EAE foi induzida em três grupos de cinco camundongos C57BL/6 fêmeas, com administração de BCP em dois grupos (25 e 50mg/kg/dia) por gavagem, após o décimo dia de indução. Aos nove dias de tratamento, os três grupos foram eutanasiados e o SNC foi removido e preservado. Nos cortes histológicos, foram feitas as técnicas de imunoistoquímica e coloração pelo método de Weigert - Pal - Russel para mielina. Resultados: Para o grupo BCP (50mg/kg/dia) houve redução de IL-17 no encéfalo, cerebelo e medula (p

Submitted by Larissa Ragozo Cardoso de Oliveira (larissaragozo@yahoo.com.br) on 2018-08-27T12:48:05Z No. of bitstreams: 1 Tese.pdf: 1964088 bytes, checksum: c9b05c43c88cfe7ad7702d356663a44b (MD5) Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2018-08-30T19:53:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 oliveira_lrc_dr_bot_par.pdf: 648226 bytes, checksum: 44b2803d04e99dbcc0a7ccba943b57a8 (MD5) Made available in DSpace on 2018-08-30T19:53:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 oliveira_lrc_dr_bot_par.pdf: 648226 bytes, checksum: 44b2803d04e99dbcc0a7ccba943b57a8 (MD5) Previous issue date: 2018-07-30 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica e desmielinizante do Sistema Nervoso Central (SNC) que desencadeia diferentes graus de incapacidade física e cognitiva. Os tratamentos para a EM são baseados principalmente em drogas imunomoduladoras visando redução da gravidade e da frequência de recidivas, uma vez que não há cura para a doença. Estudos em modelo experimental de EM, denominado encefalomielite autoimune experimental (EAE) têm demonstrado o efeito imunomodulador da vitamina D (Vit D3) tanto na imunidade inata quanto na adaptativa. Neste contexto, nosso objetivo foi avaliar se a intervenção precoce com Vit D3 é capaz de bloquear a neuroinflamação em um modelo experimental de EM. Para isto, camundongos C57BL/6 fêmeas foram imunizados com MOG (glicoproteína da mielina do oligodendrócito) associada ao Adjuvante Completo de Freund e tratadas com Vit D3 por via intraperitoneal. A Vit D3 diminuiu, de forma significativa, a incidência e o escore clínico da doença. Este efeito protetor foi acompanhado da diminuição de entrada de linfócitos no SNC e também de redução no processo de desmielinização e expressão de MHCII em macrófagos e micróglia. A eficácia da Vit D3 também foi associada com controle local do estresse oxidativo, ou seja, nos animais tratados ocorreu normalização dos níveis de peroxidação lipídica e de proteína carbonil e também de enzimas antioxidantes (superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase). A terapia com Vit D3 também determinou redução significativa na expressão gênica de NLRP3, caspase 1 e IL-1β locais, que são marcadores típicos de ativação do inflamassoma. Também constatamos que a terapia precoce com Vit D3 normalizou a barreira hematoencefálica, principalmente no nível da medula espinhal. Estes resultados indicam que uma intervenção precoce com Vit D3 é capaz de controlar o processo neuroinflamatório que caracteriza a imunopatogênese da EAE e poderia, portanto, ser explorada como terapia adjunta em pacientes com EM. Multiple sclerosis (MS) is a chronic and demyelinating inflammatory disease of the Central Nervous System (CNS) that triggers different degrees of physical and cognitive disability. Treatments for MS are mainly based on immunomodulatory drugs that reduce severity and frequency of relapses. Studies in an experimental model of MS, called experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), have demonstrated the immunomodulatory effect of vitamin D (Vit D3) in both innate and adaptive immunity. In this context, our objective was to evaluate whether early intervention with Vit D3 was able to block neuroinflammation in EAE. Encephalomyelitis was induced in female C57BL / 6 mice by immunization with MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein) associated with Freund's Complete Adjuvant and two doses of pertussis toxin. Mice were treated with Vit D3 intraperitoneally. Treatment significantly decreased the incidence and clinical score of the disease. This protective effect was associate to decreased lymphocyte infiltration in the CNS and also reduced demyelination and MHCII expression in macrophages and microglia. Vit D3 also determined local control of oxidative stress, that is, normalization of the levels of lipid peroxidation and carbonyl protein and also of antioxidant enzymes (superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase). Vit D3 therapy reduced NLRP3, caspase-1 and local IL-1β mRNA expression in the CNS. In addition, this precocious Vit D3 therapy normalized the blood-brain barrier, mainly at the spinal cord level. These results indicate that an early intervention with Vit D3 is able to control the neuroinflammatory process that characterizes the immunopathogenesis of EAE and could therefore be explored as adjunctive therapy in MS patients. 2013/26257-8

Orientadores: Liana Maria Cardoso Verinaud, Rodolfo Thomé Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Células dendríticas (DCs) são células apresentadoras de antígenos com a capacidade de direcionar a resposta imune tanto para um contexto inflamatório como para um contexto anti-inflamatório dependendo de seu estado de maturação e/ou ativação. DCs imaturas são caracterizadas pela baixa expressão de moléculas de classe II do Complexo Maior de Histocompatibilidade (MHC-II) e moléculas coestimulatórias, como CD80 e CD86, e quando em contato com linfócitos T naïve estimulam sua diferenciação em células regulatórias. Por este motivo são também chamadas de DCs tolerogênicas. Já DCs maduras, por sua vez, expressam elevados níveis de MHC-II, CD80 e CD86, e induzem a geração de células T efetoras. Resultados anteriores do nosso grupo mostraram que o fármaco Cloroquina, mais conhecido por ser usado no tratamento da malária, possui efeitos tolerogênicos sobre as funções das DCs. Embora um número crescente de estudos tenha buscado avaliar o potencial terapêutico de geração e transferência de DCs tolerogênicas, pouco se conhece a respeito das vias de sinalização envolvidas em sua atividade supressora. Recentemente, foi verificado que a via de controle metabólico denominada mTOR (mammalian Target Of Rapamycin) desempenha importante papel na gênese de DCs tolerogênicas. Nesse contexto, o presente projeto tem o objetivo de avaliar a influência da via de sinalização mTOR sobre a atividade de Células Dendríticas tolerogências. Resultados apresentados nesta dissertação mostraram que a via de sinalização mTOR participa do mecanismo de ação da CQ sobre DCs uma vez que sua fosforilação se apresenta aumentada após o tratamento com este fármaco. Além disso, os efeitos moduladores da cloroquina sobre as DCs, visto por sua capacidade de inibir o completo amadurecendo destas células mesmo após um estímulo microbiano, foi revertido quando um inibidor da via mTOR foi adicionado na cultura. Embora parcial, este efeito inibidor foi demonstrado pela manutenção da morfologia das DCs após o estímulo, pela diminuição da expressão de moléculas apresentadoras de antígeno e de moléculas coestimulatórias, pela reduzida capacidade destas células de induzirem proliferação de linfócitos T e, ainda, por sua capacidade de induzir diferenciação de linfócitos T com perfil regulador. Em conjunto, estes resultados são sugestivos de um perfil tolerogênico das DCs. A via mTOR, entretanto, parece não estar envolvida no efeito da CQ sobre o perfil de liberação de citocinas inflamatórias e anti-inflamatórias pelas DCs. Em adição, o bloqueio da via mTOR inibiu a eficácia terapêutica das DCs tolerogênicas sobre o Sistema Nervoso Central de camundongos C57BL/6 portadores de Encefalomielite Autoimune Experimental, um modelo experimental da esclerose múltipla, quando estas células foram, adotivamente, transferidas para os animais. Estes dados sugerem fortemente a participação desta via de sinalização na indução de DCs com perfil tolerogênico e a manutenção de seu efeito mesmo após a transferência destas células para um sistema in vivo. Embora os efeitos da inibição da via mTOR tenham sido parciais, indicando a participação de outras vias de sinalização intracelular na indução do perfil tolerogênico das DCs, os resultados observados neste trabalho posicionam a via de sinalização celular mTOR como um dos mecanismos envolvidos na indução de tolerância imunológica Abstract: Dendritic cells (DCs) are antigen-presenting cells capable of directing the immune response both to an context inflammatory and to an anti-inflammatory depending on their state of maturation and / or activation. Immature DCs are characterized by the low expression of Class II molecules of the Major Histocompatibility Complex (MHC-II) and costimulatory molecules, such as CD80 and CD86, and when in contact with naïve T lymphocytes stimulate their differentiation in regulatory cells. For this reason, they are also called tolerogenic dendritic cells. Mature DCs, in turn, express high levels of MHC-II, CD-80 and CD-86, and induce generation of effector T cells. Previous findings from our group showed that the drug Chloroquine (CQ), better known to be used in the treatment of malaria, has tolerogenic effects on the functions of DCs. Although a growing number of studies have sought to assess the therapeutic potential of generation and transfer of tolerogenic DCs, little is known about the signaling pathways involved in their suppressive activity. Recently, the metabolic control pathway named mTOR (mammalian Target Of Rapamycin) was shown to play an important role in the genesis of tolerogenic DCs. In this context, the present project aimed to evaluate the influence of the mTOR signaling pathway on the activity of tolerogenic DCs. Results presented in this dissertation showed that the mTOR signaling pathway participates in the mechanism of action of CQ on DCs since its expression is increased after treatment of DCs with that drug. In addition, the modulating effects of chloroquine on dendritic cells, seen by their ability to inhibit the full maturing of these cells even after a microbial stimulus, was reversed when an inhibitor of the mTOR pathway was added to the culture. Although partial, this inhibitory effect was demonstrated by the maintenance of dendritic cell morphology after stimulation, by the decrease in the expression of antigen-presenting molecules and costimulatory molecules, by the reduced ability of these cells to induce proliferation of T lymphocytes, and by their ability to induce differentiation of T lymphocytes with regulatory profile. Taken together, these results are suggestive of a tolerogenic profile of DCs. The mTOR pathway, however, does not appear to be involved in the effect of CQ on the release profile of inflammatory and anti-inflammatory cytokines by DCs. In addition, blocking the mTOR pathway inhibited the therapeutic efficacy of tolerogenic DCs on the Central Nervous System of C57BL/6 mice bearing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, an experimental model of multiple sclerosis, when these cells were transferred to the animals. These data strongly suggest the participation of this signaling pathway in the induction of DCs with a tolerogenic profile and the maintenance of their effect even after the transfer of these cells to an in vivo system. Although the effects of inhibition of the mTOR pathway have been partial, indicating the participation of other intracellular signaling pathways in inducing the tolerogenic profile of DCs, the results observed in this work position the mTOR cell signaling pathway as one of the mechanisms involved in the induction of immunological tolerance Mestrado Imunologia Mestra em Genética e Biologia Molecular CAPES CNPQ 148543/2016-2

Submitted by Karen Henriette Pinke null (kpinke@ibb.unesp.br) on 2017-06-12T13:06:37Z No. of bitstreams: 1 Tese Karen H Pinke.pdf: 4584732 bytes, checksum: 6aaf28737188bcdd9ab5d0867adca83f (MD5) Rejected by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: O arquivo submetido está sem a ficha catalográfica. A versão submetida por você é considerada a versão final da dissertação/tese, portanto não poderá ocorrer qualquer alteração em seu conteúdo após a aprovação. Corrija esta informação e realize uma nova submissão com o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2017-06-13T16:17:26Z (GMT) Submitted by Karen Henriette Pinke null (kpinke@ibb.unesp.br) on 2017-06-13T19:12:30Z No. of bitstreams: 1 Tese Karen H Pinke.pdf: 4731413 bytes, checksum: c0779e983bdbdb52e983c0b5e2d28074 (MD5) Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-06-14T18:30:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pinke_kh_dr_bot_parc.pdf: 990061 bytes, checksum: cef12a1b4df21847d262d250f66ef475 (MD5) Made available in DSpace on 2017-06-14T18:30:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pinke_kh_dr_bot_parc.pdf: 990061 bytes, checksum: cef12a1b4df21847d262d250f66ef475 (MD5) Previous issue date: 2017-06-08 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) A Esclerose múltipla é uma doença autoimune degenerativa que acomete jovens adultos, causando danos neuroaxonais e áreas de desmielinização no sistema nervoso central (SNC) devido a uma resposta autoimune mediada por linfócitos Th1, Th17 e T citotóxicos. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) constitui seu principal modelo de estudo e mastócitos parecem contribuir para os processos inflamatórios envolvidos na patogênese da EM/EAE. Seguindo este raciocínio, substâncias estabilizadoras de mastócitos, como o fumarato de cetotifeno, poderiam afetar o desenvolvimento destas doenças através do bloqueio dos processos de exocitose e desgranulação. O objetivo principal deste trabalho foi avaliar o efeito desta droga no desenvolvimento da EAE. Para isto, camundongos C57BL/6 fêmeas submetidas à indução da EAE através da imunização com MOG/CFA e injeção de toxina pertussis, foram tratados com fumarato de cetotifeno (0,4 mg/kg via intraperitoneal) durante 11 dias, a partir do 7º dia após a indução. O efeito do tratamento no desenvolvimento clínico da EAE foi determinado pela avaliação de peso corporal e escore clínico. Posteriormente, parâmetros histopatológicos e imunológicos associados à doença, bem como a quebra da função da barreira hematoencefálica (BHE) foram avaliados. As comparações dos valores de incidência, escores clínicos diários e máximos, e de variação de peso corpóreo revelaram que o tratamento com cetotifeno reduziu a incidência e a gravidade da EAE. Este efeito protetor determinado pelo cetotifeno foi associado com a normalização da função da BHE e consequente ausência ou redução da infiltração de linfócitos no SNC, e ativação reduzida de micróglia. Também se verificou menor expressão gênica de quimase-1, mMCP-4 e carboxipeptidase-1 no SNC e grande ativação da resposta imune periférica em amostras de linfonodos e baço dos animais imunizados e tratados com cetotifeno. Considerando os resultados obtidos, concluiu-se que o tratamento com fumarato de cetotifeno impede o desenvolvimento clínico da EAE por mecanismos que envolvem a manutenção da função da BHE e consequente bloqueio da infiltração de linfócitos no SNC. Multiple sclerosis is one of the most prevalent neurological human diseases. It triggers axonal damage and demyelinated areas in central nervous system (CNS) by an autoimmune response mediated by Th1, Th17 and T cytotoxic lymphocytes. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most employed model of study this disease and mast cells appear to contribute to MS- and EAE- underlying immunopathogenesis. In this scenario, mast cell stabilizer drugs, such as ketotifen fumarate, could affect the development of these diseases by the blockage of exocytosis and degranulation. The aim of this study was to evaluate the effect of this drug on the development of EAE. For this, MOG/CFA-immunized female C57BL/6 mice were treated with ketotifen fumarate. The effect of treatment was determined by body weight loss and clinical score. Subsequently, EAE-associated histopathological and immunological parameters, as well as breakdown of blood-brain and blood-spinal cord barrier were analyzed. Comparisons about incidence values, daily and maximum clinical scores, and body weight loss revealed that ketotifen-treatment reduced the EAE-incidence and -severity. This protection was associated with the restoration of blood-spinal cord barrier function, absence or reduction of SNC lymphocytic infiltration and reduced microglial activation. Lower chymase-1, mMCP-4 and carboxypeptidase-1 gene expressions were also detected in the CNS, as well as higher activation of peripheral immune response in lymph node and splenic samples from immunized mice treated with ketotifen. Considering these results, it was concluded that the treatment with ketotifen fumarate prevents the clinical development of EAE by mechanisms related to maintenance of blood-spinal cord barrier function and consequent blockage of CNS inflammatory infiltrate. FAPESP: 14/00239-6

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A esclerose múltipla é uma doença autoimune, de fundo genético, que afeta o sistema nervoso central. As manifestações iniciais são derivadas de respostas imunológicas intensas que afetam principalmente a substância branca do cérebro e da medula espinhal, sendo seguida por uma fase crônica com caráter neurodegenerativo. Diante da complexidade da doença e da dificuldade de tratamento, nosso grupo de pesquisa tem estudado alternativas imunorregulatórias capazes de reduzir os sinais clínicos da doença que apresentem poucos ou nenhum efeitos adversos. Previamente a esse trabalho, utilizamo-nos de um protocolo para indução da tolerância oral a HPS65 produzida pela bactéria recombinante Lactococcus lactis atrevas do qual obtivemos bons resultados na prevenção dos sintomas da encefalomielite autoimune experimental (EAE) induzida em camundongos C57BL/6 pela imunização com o antígeno mieliníco MOG. No presente trabalho o mesmo protocolo foi utilizado para o tratamento da EAE depois da sua indução. Camundongos imunizados com MOG receberam por via oral a cepa Lactococcus lactis produtora da proteína de choque térmico HPS65, durante cinco dias. O tratamento foi eficiente na redução do índice clínico da EAE da mesma formar que na prevenção da doença. Foi observado por análise histológica e microscopia intravital que o tratamento inibiu o recrutamento de leucócitos para a medula espinhal tanto no parênquima quanto nos vasos sanguíneos que irrigam as meninges. Nos órgãos linfoides secundários, houve um aumento da frequência das células T reguladoras, principalmente aquelas que expressam a forma da embrana citocina TGF-B (latente associete peptide - LAP). Não houve alteração na frequência de linfócitos T CD4+ ativados nos animais tratados indicando que o mecanismo de inibição não envolve imunossupressão. Multiple sclerosis is a genetic and autoimmune disease that affects the central nervous system. The initial manifestations is an intense immune responses that primainly affect the white matter of the brain and spinal cord, followed by a chronic phase with a neurodegenerative character.Because of the complexity of the disease and the difficulty to treat, has been testing therapeutic alternatives that wold modulate the disease development presenting minimal sides effects. In a previus study, we used a protocol for the induction of oral tolerance using a recombinant HPS65 producing Lactococcus lactis and we obtained good results in the prevention of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), induced in C57BL / 6 mice by MOG immunization. In the present study, the same protocol was used for the treatment. In the present study, mice received orally HPS65-producing Lactococcus lactis strain for five days after disease induction. The treatment was as efficient in reducing the clinical score of EAE as the prevention protocol. Using histologicalIt analysis and intravital microscopy, we observed that the treatment inhibited the recruitment of leukocytes to the spinal cord, both in the parenchyma and in the blood vessels that irrigate the meninges. In the secondary lymphoid organs, there was an increase in regulatory T cells, especially those that express the membrane form of the cytokine TGF-B in the membrane (LAP). This effect occurred with no alteretion in the frequency of ativadet lynphocytes indicating that there immunoregulation was not associated with immunosuppressive.

Orientador: Leonilda Maria Barbosa dos Santos Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Esclerose Múltipla é uma doença crônica e incapacitante do Sistema Nervoso Central, que afeta pessoas com predisposição genética após a influência de fatores que ainda não são totalmente determinados. Atribui-se aos linfócitos T CD4+ um importante papel na patogenia da doença, principalmente pelo fato de que um modelo experimental de Esclerose Múltipla pode ser induzido em animais, após a transferência de células T reativas à mielina. No presente estudo nós demonstramos evidências sobre os efeitos dos imunomoduladores (IFN-beta and GA) sobre a ativação de moléculas regulatórias em pacientes com Esclerose Múltipla. A expressão de HLA-G e mRNA em pDCs, bem como os níveis de HLA-G solúvel no soro de pacientes foram avaliados. Além disso, nós demonstramos que pDCs de pacientes sem tratamento não expressam IDO quando essas células foram estimuladas com o agonista do receptor TLR9 mas os tratamento com imunomoduladores restauram a expressão de IDO aos níveis normais. Em termos de citocinas, observamos uma redução significativa na expressão de TGFß, IL-10, IL-6 e nenhuma expressão de IL-17, quando avaliamos os pacientes tratados com imunomoduladores. De maneira interessante, demonstramos que pacientes tratados com IFN-ß expressam de maneira significativa mais IL-27. Nós também demonstramos que Nanotubos de Carbono de Paredes Múltiplas (MWCNTs) internalizados por células apresentadoras de antígenos, estimulam a produção de IL-27 por essas células e que essa citocina afeta o desenvolvimento de células encefalitogênicas Th17 na Encefalomielite Experimental Autoimune (EAE) A EAE, um modelo experimental da Esclerose Múltipla, é uma doença autoimune mediada por células T CD4+ que pode ser induzida em animais susceptíveis tanto pela imunização com proteínas que compõe a mielina quanto pela proteína básica de mielina (MBP), ou pode ser induzida passivamente por transferência adotiva de linfócitos T CD4+ sensibilizados, em animais sem a doença. Foi determinada a expressão de citocinas pelas células T encefalitogênicas e os resultados revelaram uma redução significante na expressão de IL-17, o que sugere que o desenvolvimento das células Th17 foi prejudicado. Vistos em conjunto, nossos estudos ajudam a compreender o papel de algumas moléculas reguladoras no desenvolvimento da EM e EAE Abstract: Multiple sclerosis (MS) is a chronic disabling disease of central nervous system (CNS), which affects genetically predisposed persons after a trigger that has yet not to be determined. CD4 T lymphocytes have long been thought to be the most important immune cell subset in the pathogenesis of the disease, mostly because an MS-like disease can be induced in animal models by adoptive transfer of myelin-reactive T cells. In the present study, we demonstrated evidence about the effect of treatment with immunomodulators (IFN-beta and GA) in the activation of regulatory molecules by pDCs of MS patients. The expression of HLA-G and mRNA HLA-G in pDCs, as well as the level of soluble HLA-G in the serum of MS patients was evaluated. Moreover, we were able to demonstrate that pDCs from untreated MS patients do not express IDO when these cells were stimulated by agonist of TLR 9 but the treatment with the immunomodulators restores the expression of IDO to normal values. In terms of expression of cytokines, significant decrease in the expression of TGFß, IL-10, IL-6 and no expression of IL-17 was observed for patients treated with the immunomodulators. Interestingly patients treated with IFN-ß express significantly more IL-27. We also demonstrated that Multi Walled Carbon Nanotubes (MWCNTs), internalized by antigen presenting cells (APCs), stimulates the production of IL-27 by these cells and that this cytokine affects the development of encephalitogenic Th17 cell in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE). EAE, which is a model of multiple sclerosis, is a CD4+ T cell-mediated autoimmune disease that can be induced in susceptible animals either directly through their immunization with constituent proteins of myelin, such as the myelin basic protein (MBP), or passively by the adoptive transfer of sensitized CD4+ T lymphocytes into naïve animals. The expression of cytokines by encephalitogenic T-cell lines was determined, and the results revealed a significant reduction in the expression of IL- 17, which suggests that the development of Th17 cells was impaired. Taken together, our studies help to understand the role of some regulatory molecules in Multiple Sclerosis and EAE development Doutorado Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Doutor em Ciências CAPES FAPESP 2012/09879-2

A esclerose múltipla (EM) e o seu modelo animal de estudo, a encefalomielite autoimune experimental (EAE), são caracterizadas por neuroinflamação imunomediada e desmielinização no sistema nervoso central (SNC). Os tratamentos para a EM normalmente incluem o interferon-β (IFN-β) e destinam-se a reduzir o número de surtos e retardar a progressão da doença. No entanto, são apenas parcialmente eficazes, sugerindo a necessidade do desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. Os receptores toll like (TLRs) são receptores de reconhecimento de padrões do sistema imune inato e desempenham importante papel na iniciação de respostas inflamatórias e na indução da imunidade adaptativa. A sua participação na patogênese de doenças autoimunes têm sido estudada e foi também demonstrado que ligantes de TLRs podem suprimir a EAE. A genisteína é um fitoestrógeno obtido da soja com propriedades anti-inflamatórias. Alguns estudos mostraram seus efeitos benéficos na EAE e resultados promissores que sugerem potencial terapêutico na EM. Entretanto, os trabalhos realizados até o momento, utilizavam um protocolo de tratamento após o aparecimento dos sinais clínicos da doença e não abordavam a resposta imune inata. Neste contexto, o presente trabalho busca avaliar a modulação da resposta imune inata e a influência desta na resposta imune adaptativa, através dos TLRs, utilizando um tratamento com genisteína anterior ao aparecimento dos sinais clínicos da EAE, avaliando também os parâmetros no início do desenvolvimento da doença. Para isso, a EAE foi induzida em camundongos C57BL/6 fêmeas com o peptídeo MOG35-55 tratados ou não com genisteína. O tratamento com 200mg/kg de massa corporal por dia, via subcutânea, foi realizado do período -2 dias antes da indução até o dia +6 após a indução da EAE. Os parâmetros laboratoriais foram avaliados na medula espinhal no 7° dia pós indução e os sinais clínicos acompanhado s até o 21° dia pós indução. O tratamento com genisteína resultou em atraso no aparecimento e redução na pontuação dos sinais clínicos, concomitante à redução do infiltrado celular e da desmielinização da medula espinhal, reforçando seu potencial neuroprotetor em doenças autoimunes. Adicionalmente, foi observado aumento na intensidade mediana de fluorescência de TLR3 e TLR9 em macrófagos e células dendríticas e diminuição de TLR2 em células dendríticas, presentes na medula espinhal. A sinalização via TLR3 e TLR9 vêm sendo relacionada à maior produção de IFN-β em doenças autoimunes. De fato, o tratamento com genisteína aumentou a expressão relativa de RNAm para IFN-β na medula espinhal. Os níveis das citocinas próinflamatórias IL-6, IL-12p40 e da quimiocina CCL5 foram reduzidos. Além disso, foi observado diminuição na expressão dos fatores de transcrição RORγT e T-bet e aumento na produção da citocina TGF-β, sugerindo o estabelecimento de um ambiente imuno regulador. Estes resultados reforçam o potencial terapêutico da genisteína no tratamento da EAE e da EM, sugerindo que o seu uso, inclusive na forma de suplementação ou alimentação rica em soja, poderia se aliar a terapias já estabelecidas, melhorando o quadro clínico da doença e prevenindo novos surtos. Multiple sclerosis (MS) and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), its animal model, are both characterized by immune-mediated neuroinflammation and demyelination in the central nervous system (CNS). The treatments for MS, including IFN-β, are intended to reduce the number of relapses and slow the progression of the disease. However, these treatments are only partially effective, suggesting the need to develop new therapies. The toll-like receptors (TLRs) are patterns-recognition receptors, of the innate immune system, that play important roles in the initiation of inflammatory responses and induction of adaptive immunity. Its role in the pathogenesis of autoimmune diseases have been demonstrated and it was also shown that TLR ligands can suppress EAE. Genistein is a phytoestrogen obtained from soybeans with anti-inflammatory properties. Some studies showed beneficial effects on EAE treatment, suggesting therapeutic potential in MS. However, the work done to date, used a treatment protocol after the onset of clinical signs of the disease and did not address the innate immune response. In this context, the present work aims to evaluate the modulation of innate immune response, and its influence in the adaptive immune response, through the TLRs, using a treatment protocol prior the onset of the clinical signs of the EAE, by evaluating the parameters in the beginning of the development of the disease. EAE was induced in C57BL/6 females with MOG35-55 peptide. The animals were treated or not with 200mg/kg/day of genistein, subcutaneously, in the period between 2 days before induction and until the day 6 after induction of EAE. Laboratory parameters were evaluated in the spinal cord in the day 7 after induction and clinical signs monitored until day 21 after induction. Treatment with genistein resulted in delayed onset and reduced score of disease, concomitant with reduced cellular infiltration and demyelination in the spinal cord, reinforcing its neuroprotective potential in autoimmune diseases. Additionally, it was observed an increase in the median fluorescence intensity of TLR3 and TLR9 in macrophages and dendritic cells and decrease of TLR2 in dendritic cells in the spinal cord. The signaling via TLR3 and TLR9 is related to increase the production of IFN-β. In fact, treatment with genistein increases mRNA expression for IFN-β in the spinal cord. The levels of IL-6, IL-12p40 and CCL5 were reduced. Furthermore, the expression of ROR-γT and T-bet were decreased, and, together with increased production of TGF-β, suggest the development of a regulatory environment. These results heighten the therapeutic potential of genistein in the treatment of EAE and MS, suggesting that its use, including as a supplement or soy-enriched diet, could preventing new outbreaks.

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Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2016. As doenças de Parkinson, de Alzheimer e esclerose múltipla (EM), bem como os transtornos de humor, como a depressão, apresentam componentes inflamatórios. As células do sistema imune possuem 5 receptores que respondem ao neurotransmissor dopamina, os quais modulam diferentemente a inflamação. Assim, é esperado que o pramipexol (PPX), um agonista de receptores dopaminérgicos (D2/D3), tenha efeito imunomodulatório. Para testar essa hipótese foram utilizados dois modelos que causam neuroinflamação: a) a encefalomielite autoimune experimental (EAE), modelo de esclerose múltipla e b) a administração periférica de lipopolissacarídeo (LPS), modelo de transtorno depressivo maior. A EAE foi induzida em camundongos C57BL/6 através da administração do peptídeo 35-55 da glicoproteína de mielina oligodendroglial e o PPX (0,1 e 1 mg/kg/dia) foi administrado pela via intraperitoneal por 40 dias. A dose de 1 mg/kg inibiu completamente o surgimento dos sinais motores induzidos pela EAE, além de prevenir a desmielinização na medula espinhal. Além disso, o PPX teve um forte efeito anti-inflamatório, confirmado através da redução da infiltração de células inflamatórias, da ativação astroglial na medula espinhal, e da redução nos níveis de IL-17 nos linfonodos. Além disto, o PPX reverteu várias alterações induzidas pela EAE na medula espinhal e no estriado, incluindo a redução nos níveis de a-sinucleína, o aumento nos níveis de parkina, alteração na enzima glutationa peroxidase e a produção de espécies reativas de oxigênio. Em conjunto os dados sugerem que o PPX deve ser estudado como um possível agente farmacológico para tratar a EM. No modelo de depressão induzida por inflamação periférica através da injeção de LPS em camundongos Swiss, o PPX (1 mg/kg), foi administrado por 7 dias por via intraperitoneal. Uma hora após a última aplicação de PPX, injetou-se LPS (0,1 mg/kg) via intraperitoneal, 24 h depois foi dado início aos testes comportamentais. O LPS induziu comportamento tipo-depressivo no teste do nado forçado e no splash test, sem alterar a locomoção no teste do campo aberto. Também foi observado o aumento de Interleucina-1ß e adutos de 3-nitrotirosina no hipocampo dos animais tratados com LPS. Todos estes parâmetros foram revertidos pelo PPX, indicando que o PPX é capaz diminuir os eventos inflamatórios que podem estar associados ao comportamento tipo-depressivo. Os antagonistas de receptores dopaminérgicos, haloperidol e sulpirida, não reverteram o efeito tipo-antidepressivo do PPX, indicando que a atuação do PPX parece não ser mediada por estes receptores. Em conjunto, os dados sugerem que o PPX é capaz de causar uma forte diminuição em processos inflamatórios, tanto no modelo de EAE como no modelo de depressão, o que pode ser o mecanismo responsável por sua ação. Porém, mais estudos são necessários para confirmar esta hipótese. Abstract : Neurologic diseases as Parkinson's, Alzheimer's and multiple sclerosis (MS) as well as mood disorders, like major depression, present inflammatory components. Immune cells express 5 different dopamine receptors, which are known to modulate inflammation. In this context, it is expected that pramipexole (PPX), a dopamine D2/D3 receptor agonist, would have an immunomodulatory effect. To evaluate this hypothesis two neuroinflammatory disease models were used, the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mice model of MS, and the peripheral administration of lipopolysaccharide (LPS), a mice model of major depression disorder (MDD). EAE was induced in C57Bl/6 mice by the injection of the 35-55 peptide of myelin oligodendroglial glycoprotein. PPX (0.1 and 1 mg/kg) was administered by intraperitoneal route for 40 days. The dose of 1 mg/kg of PPX completely abolished motor impairment induced by EAE, and prevented medular demyelination. Besides, PPX had a marked anti-inflammatory effect, which was observed by reduction of inflammatory cells infiltration, astroglyal activation, and by decreasing IL-17 levels in lymph nodes. Besides, PPX reversed several alterations in the spinal cord and striatum induced by EAE, inclunding reduction in a-synuclein levels, enhancement of parkin levels, alteration in glutathione peroxidase activity and reactive oxygen species production. Together, these results suggest that PPX can be studied as a potential drug for MS treatment. In the MDD model induced by peripheral inflammation induced with the bacterial lipopolysacchired (LPS) administration in Swiss mice, PPX (1 mg/kg) was administered for 7 days by intraperitoneal route. One hour after the last PPX injection, LPS (0.1 mg/kg) was administered intraperitoneally, and 24 h later behavioral analysis were performed. LPS induced depressive-like behavior in the forced swimming test and splash test, without locomotor alterations in the open field test. It was also observed enhancement of Interleukin-1ß and 3-nitrotyrosin protein adducts in mice hippocampus of LPS treated animals. PPX reversed all these alterations, indicating that PPX can prevent the inflammatory events related to the depressive-like behavior. Interestingly, the dopamine receptor antagonists, haloperidol and sulpiride, did not reverse the PPX antidepressant-like effect in the forced swimming test, indicating that PPX effect seems to be unrelated by these receptors. Together, these results suggest that PPX present a marked antiinflammatory action, in both EAE and LPS models, suggesting that this could be the mechanism of action of PPX. Nevertheless, further studies are required to confirm this hypothesis.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE) é o modelo animal mais usado para o estudo de esclerose múltipla (EM), uma doença inflamatória do sistema nervoso central (SNC). A família de proteínas dos supressores da sinalização de citocinas desempenha papel crítico na regulação das respostas de citocinas. SOCS2 é conhecido por ser um modulador importante de respostas fisiológicas e na patogênese de determinadas doenças infecciosas e alérgicas. O papel de SOCS2 durante EAE ainda não foi explorado. EAE foi induzida em camundongos WT e SOCS2 deficientes (-/-), utilizando glicoproteína da mielina de (MOG35-55). Amostras de cérebro e medula espinhal foram examinadas durante o pico (dia 14) e fase de recuperação (dia 28) da doença. SOCS2 é regulado positivamente em cérebro de camundongos WT após a indução da EAE e animais SOCS2-/- são mais resistentes ao desenvolvimento de fase aguda. O atraso dos sinais graves da doença em camundongos SOCS2-/- foi associado com diminuição da expressão da 5-LO, AhR e IRF1 no cérebro, redução da frequência de células T inflamatórias (IFN+ e IL-17+) e modulação de citocinas no cérebro e medula espinhal. No entanto, enquanto que nos camundongos WT a escala clínica máxima de EAE foi seguida por uma recuperação progressiva, camundongos SOCS2-/- foram incapazes de recuperar-se dos danos locomotores que ocorreram durante a fase aguda, o que foi associado maior inflamação no SNC, resultando em uma resposta inflamatória prolongada na fase tardia da EAE. Nós também demonstramos que a atividade NLRP3 especificamente no SNC é um fator amplificador de EAE. NLRP3 é expresso e funcional em micróglias, mas não em astrócitos. Além disso, células F4/80+ de órgãos linfóides periféricos de animais com EAE são capazes de ativar NLRP3 em micróglia in vitro, mas não o fazem em astrócitos. Mostrou-se também que a micróglia produz de forma mais eficiente IL-1 após co-cultura com os linfócitos Th17 na presença de MOG. Juntos, estes resultados sugerem que SOCS2 desempenha um papel duplo na resposta imune durante a EAE. É necessário para a indução da fase aguda, mas tem um papel crucial na benéfico a fase de recuperação da doença, controlando o componente regulador de EAE. Além do mais, a atividade específica de NLRP3 no SNC é um fator amplificador da severidade de EAE. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) is the most widely used animal model for the study of Multiple Sclerosis, an inflammatory disease of the central nervous system (CNS). Suppressor of Cytokine Signaling (SOCS) family proteins play a critical role in regulating cytokine responses. SOCS2 is known to be a crucial modulator of physiological responses and in the pathogenesis of certain allergy and infectious diseases. The role of SOCS2 during EAE has not been explored yet. EAE was induced in WT and SOCS2 deficient (-/-) mice using Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein peptide (MOG35-55). Brain and spinal cord samples were examined during the peak (day 14) and recovery phase (day 28) of the disease. SOCS2 is upregulated in brain of WT mice after EAE induction and SOCS2-/- mice were more resistant to acute phase development. The postponement of the first severe signs of the disease in SOCS2-/- mice was associated with decreased expression of 5-LO, AhR and IRF1 in the brain and reduced frequency of inflammatory T cells (IFN-+ and IL-17+) and modulation of cytokines in the brain and spinal cord. However, while in WT mice maximal clinical EAE score was followed by a progressive recovery, the SOCS2-/- mice were unable to recover from the locomotor damage that occurred during the acute phase, which was associated with greater inflammation in the CNS, resulting in a prolonged inflammatory response in the late phase of EAE. We also demonstrate that NLRP3 activity specifically in the CNS is an amplifier factor of EAE. NLRP3 is expressed and functional in microglia, but not in astrocytes. Furthermore, F4/80+ cells from peripheral organs from animals with EAE are able to activate microglia NLRP3 in vitro, but do not in astrocytes. It was also shown that microglia produce more efficiently IL-1 after co-culture with lymphocytes Th17 in the presence of MOG. Altogether, these results suggest that SOCS2 plays a dual role in the immune response during EAE. It is necessary for induction of the acute phase but plays a crucial beneficial role in the recovery stage of the disease by controlling the regulatory component of EAE. In addition, NLRP3 specific activity in the CNS is an important factor for severity of disease.

Orientador: Alessandro dos Santos Farias Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A Encefalomielite Experimental Autoimune (EAE) é um modelo animal amplamente aceito para a Esclerose Múltipla (EM) e tem sido usado para estudar a patofisiologia da doença. A EAE foi inicialmente considerada uma patologia mediada por células Th1. Respostas imunes desenvolvidas após a imunização com antígenos de mielina para a indução da EAE revelaram uma predominância de células produtoras de IFN? no SNC de animais doentes. Entretanto, camundongos deficientes para IFN? não apresentaram resistência, mas sim maior susceptibilidade à EAE. Isto colocou em dúvida o papel do IFN? e, consequentemente, o papel das células Th1 na patogênese da EAE. Como alternativa à resposta do subtipo Th1 foi proposta a resposta Th17. Após a sua descoberta, foi mostrado que esta possuía um importante papel na EAE e outras patologias autoimunes. Hoje é aceito que células Th1 e Th17 apresentam um papel sinérgico durante o desenvolvimento da EAE. Interessantemente, parece que as células Th17 apresentam plasticidade durante a evolução da EAE. Foi mostrado que células Th17 autoagressivas reduzem a expressão de IL-17 quando chegam no SNC e passam a expressar IFN?. Desta forma é possível que na patologia da EAE IL-17 e IFN? sejam, ao menos em parte, produzidos pela mesma fonte. Isso mostra que mesmo células terminalmente diferenciadas podem sofrer transdiferenciação para outros subtipos. Apesar de ambos os subtipos de linfócitos, Th1 e Th17, apresentarem atividade próinflamatória, não está completamente claro como estas células, classicamente consideradas auxiliaries, seriam capazes de iniciar a doença quando adotivamente transferidas para animais saudáveis. Neste trabalho foi mostrado que células T CD4+ podem expressar moléculas associadas à citotoxicidade. Foi observado que fatores de transcrição (Runx3 e Eomes) estão envolvidos na produção de IFN? em células Th1 e de Granzimas e Perforinas em linfócitos T CD8+. Possivelmente estes fatores seriam capazes de direcionar as células T CD4+ para um perfil citotóxico capaz de mediar o dano inicial observado na EAE. Linfócitos T CD4+ produtores de IFN? encontrados no SNC apresentaram elevada expressão de IL-17 e de fatores de transcrição associados ao perfil Th17. Esta expressão foi maior que a dos linfócitos T CD4+ produtores apenas de IL-17. Ainda, estes linfócitos apresentavam produção de granzima B. Surpreendentemente, além desta alteração de perfil Th1-Th17, nós descobrimos que alguns linfócitos T CD4+ podem sofrer transdiferenciação e passar a expressar CD8? e CD8?, tornando-se células duplo-positivas. Fatores de transcrição importantes para a maturação de linfócitos no timo, Runx3 e ThPok, responsáveis respectivamente pela diferenciação em subtipos CD8+ e CD4+, possivelmente estão envolvidos neste mecanismo. Observamos um aumento da expressão de Runx3 nestes linfócitos T CD4+ que passaram a expressar CD8, o que não é típico em linfócitos maduros. Enquanto isso, a expressão de ThPok manteve-se relativamente constante. Não foi mostrado como as células T CD4+ encefalitogênicas pioneiras exercem sua função efetora. Além disso, a capacidade citotóxica destas células ainda precisa ser avaliada. Apesar disso, este trabalho contribuiu com a elucidação dos mecanismos da doença e este subtipo de célula pode ser promissor para o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento da EM Abstract: Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a widely accepted animal model of Multiple Sclerosis (MS) and has been used to study the pathophysiology of the disease. EAE was first considered a Th1 cell mediated pathology. Immune responses developed after immunization with myelin antigens for EAE induction revealed IFN?-producing cells domination in the CNS of animals with the disease. However, IFN?-deficient mice were not resistant, but were instead more susceptible to EAE. It has put under doubts the role of IFN? and, consequently, the role of Th1 cells on the EAE pathogenesis. As an alternative for Th1 subset it was proposed the Th17 subset. After its discovery, Th17 subset has been shown to perform an important role during EAE and other autoimmune pathologies. Today it is accepted that Th1 and Th17 cells present a synergic role during EAE development. Interestingly, it seems that Th17 cells present plasticity during the course of EAE. It was shown that autoagressive Th17 cells shut down the IL-17 expression when reach the CNS and start to produce IFN?. Therefore, it is possible that in the EAE pathology, both IL-17 and IFN? are, at least in part, produced by the same source. Despite both Th1 and Th17 subtypes present proinflammatory activity, it is not completely clear how these cells, classically regarded as a helper, would be able to initiate the disease when adoptively transferred to health animals. In this work we¿ve shown that T CD4+ cells can express cytotoxic associated molecules. It was observed that transcription factors (Runx3 and Eomes) are involved on IFN? production in Th1 cells and Granzyme and Perforin in CD8+ T lymphocytes. Maybe these factors can drive a cytotoxic profile that could account for the initial damage mediated by CD4+ cells. T CD4+ IFN? producing lymphocytes found in the CNS upregulated IL-17 and transcription factors associated with the Th17 subset. This expression was higher than solely IL-17 producing cells. Moreover, these lymphocytes presented Granzyme B production. Surprisingly, we found that some CD4+ T lymphocytes can undergo a differentiation and start to express CD8? and CD8? molecules, becoming a double positive cell. Transcription factors associated with lymphocytes intrathymic maturation, Runx3 and ThPok, respectively responsible for transdifferentiation in CD8+ and CD4+ subtypes, are possibly involved in this mechanism. We observed an upregulation of Runx3 expression in T CD4 lymphocytes that started to produce CD8, what isn¿t typical in mature lymphocytes. It was not shown how the pioneer CD4+ encephalitogenic T cells would exert its effector function. Moreover, the direct cytotoxic ability of these cells remain to be evaluated. Despite this, this work contributed to the elucidation of the disease mechanisms and this subset of cells can be promising to account for future therapies to treat MS Mestrado Imunologia Mestre em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2013/10637-6

Orientador: Liana Maria Cardoso Verinaud Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica de origem autoimune que afeta o sistema nervoso central (SNC), provocando disfunções neurológicas em decorrência de desmielinização axonal, principalmente na substância branca dos órgãos do SNC. A doença acomete mais de 2 milhões de pessoas no mundo todo e não tem cura. As abordagens terapêuticas utilizadas com sucesso consistem na aplicação de anticorpos monoclonais, citocinas imunomoduladoras e fármacos antiinflamatórios. Ainda assim, tais estratégias são dependentes de produtos de alto custo e toxicidade. A utilização de fármacos antimaláricos no tratamento da Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE, modelo experimental de EM), como cloroquina e diidroartemisinina, tem apresentado resultados promissores na atenuação do quadro clínico dos camundongos; entretanto, os efeitos tóxicos dessas substâncias constituem um importante fator limitante para a utilização clínica. Neste sentido, o presente trabalho teve por objetivo caracterizar os efeitos terapêuticos da primaquina (PQ), um fármaco antimalárico análogo à cloroquina mas com toxicidade reduzida, na EAE emvcamundongos C57BL/6. Para tanto, camundongos foram tratados com PQ por via intraperitoneal (i.p.) por cinco dias consecutivos e os efeitos da administração direta foram avaliados sobre as subpopulações de linfócitos T esplênicos. Semelhantemente, camundongos portadores de EAE foram tratados com PQ como acima e o desenvolvimento da doença foi avaliado. Os resultados obtidos mostraram uma redução significativa na severidade da EAE em camundongos tratados com primaquina em comparação com animais pertencentes ao grupo controle. A melhora no quadro clínico se correlacionou com (i) aumento na expressão de genes de citocinas anti-inflamatórias e decréscimo na expressão de genes de citocinas inflamatórias, (ii) redução na ativação de micróglia e (iii) diminuição da reatividade glial no SNC de camundongos tratados com PQ em relação aos não tratados. Também se verificou um aumento na frequência de células T reguladoras em baços de camundongos tratados com PQ. Posteriormente, células T reguladoras (Treg, CD4+CD25+) e células T efetoras (CD4+CD25- ) foram isoladas de baços de camundongos tratados com PQ e transferidas adotivamente a camundongos portadores de EAE. Foi observada uma redução na severidade da EAE em camundongos recipientes de células Treg em comparação com camundongos recipientes de células T efetoras. De forma semelhante ao observado em camundongos tratados diretamente com PQ, a menor severidade da EAE se correlacionou com redução na expressão de mediadores inflamatórios e de reatividade glial no SNC. A capacidade imunossupressora de PQ foi avaliada também. Neste sentido, células dendríticas (DCs) diferenciadas a partir de precursores de medula óssea foram tratadas com PQ e avaliadas quanto ao seu perfil fenotípico e funcional. Observou-se uma redução na expressão de marcadores de maturação de DCs tratadas com PQ (DC-PQ) em comparação às células não tratadas (DC-PBS). A transferência adotiva de DC-PQ resultou na redução do quadro clínico de EAE. Os resultados obtidos nesse trabalho permitem concluir que a primaquina é um fármaco eficaz na atenuação dos sintomas da EAE por meio da modulação de componentes celulares e moleculares do sistema imune Abstract: Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune chronic inflammatory disease that affects the central nervous system (CNS) causing neurological disorders arised from axonal demyelination, particularly in the white matter of the CNS organs. The disease affects more than 2 million people worldwide and still has no cure. The successfully used therapeutic approaches consist in the application of monoclonal antibodies, immunomodulatory cytokines and anti-inflammatory drugs. Still, such strategies are dependent on expensive and toxic drugs. The use of antimalarial drugs in the treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE, experimental model of MS), such as chloroquine and dihydroartemisinin, has shown promising results in attenuation of the clinical signs of mice; however, the toxic effects of these substances are an important limiting factor for clinical use. In this sense, this study aimed to characterize the therapeutic effects of primaquine (PQ), an antimalarial drug analog to chloroquine but with reduced toxicity, in EAE in C57BL / 6 mice. To this end, mice were treated with PQ intraperitoneally (i.p.) for five consecutive days, and the effects of direct administration were evaluated on spleen T lymphocyte subpopulations. Similarly, mice bearing EAE were treated with PQ as above, and disease development was evaluated. The results showed a significant reduction in the severity of EAE in mice treated with primaquine compared to animals in the control group. Amelioration of the clinical signs was correlated with (i) an increase in gene expression of anti-inflammatory cytokines and decrease in gene expression of inflammatory cytokines, (ii) reduction in microglia activation and (iii) the decreased CNS glial reactivity in mice treated with PQ compared to untreated group. There was also an increase in the frequency of regulatory T cells in the spleens of mice treated with PQ. Subsequently, regulatory T cells (Tregs, CD4+CD25+ ) and effector T cells (CD4+CD25-) were isolated from spleens of mice treated with PQ, and adoptively transferred to mice with EAE. It was observed a reduction in the severity of EAE in mice recipients of Treg cells compared to mice recipients of effector T cells. Similarly to what was observed in mice directly treated with PQ, the lower severity of EAE was correlated with a reduction in the expression of inflammatory mediators and glial reactivity in the CNS. The immunosuppressive capacity of PQ was evaluated as well. In this regard, dendritic cells (DCs) differentiated from bone marrow precursors were treated with PQ and assessed for phenotypic and functional profile. It was observed a reduction in the expression of DC maturation markers treated with PQ (DC-PQ) compared to untreated cells (DC-PBS). The adoptive transfer of DC-PQ resulted in the reduction of the clinical signs of EAE. The results of this work have shown that primaquine is an effective drug in ameliorating the symptoms of EAE through modulation of cellular and molecular components of the immune system Mestrado Imunologia Mestre em Genética e Biologia Molecular FAPESP

Orientadores: Leonilda Maria Barbosa dos Santos, Alessandro dos Santos Farias Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O Resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: The Abstract is available with the full electronic digital document Mestrado Imunologia Mestra em Genética e Biologia Molecular

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Outra Agência A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é o modelo para o estudo da Esclerose Múltipla (EM), sendo caracterizado por alterações histopatológicas que incluem inflamação, desmielinização e dano axonal. Por outro lado, o exercício físico regular é reconhecido por seus efeitos antiinflamatórios e neuroprotetores. Além disso, sugere-se que o exercício físico possa exercer alguns efeitos protetores contra desenvolvimento da caquexia que é uma condição associada ao desenvolvimento da apresentação clínica do modelo EAE. Entretanto, ainda não é claro na literatura o efeito do exercício físico regular sobre as alterações histopatológicas no sistema nervoso central (SNC) bem como as alterações metabólicas sistêmicas associadas ao modelo EAE. Portanto, as interações entre um programa de exercício físico regular o desenvolvimento bem como a progressão do modelo EAE foram avaliadas no presente estudo. Para isto, camundongos fêmeas C57BL/6 foram divididos em dois grupos: sedentários e exercitados. O exercício foi realizado na modalidade natação, 5 vezes por semana durante 30 minutos. Após 4 semanas do protocolo de exercício, o peptídeo MOG35–55 foi injetado para indução da EAE em metade dos animais sedentários e metade dos exercitados. O protocolo de exercício continuou até 10 dias após a indução (dpi), completando 6 semanas de exercício regular. As análises foram realizadas início da apresentação clínica (10 dpi), no pico da apresentação clínica (entre 14 e 20 dpi) e no período crônico da doença (42 dpi) e incluíram: avaliação do metabolismo sistêmico, microscopia intravital, histopatologia (inflamação e desmielinização), citometria de fluxo, imunohistoquímica de oligodendrócitos (CC1 e NG2/PDGFRα) e de dano axonal (SMI-32), Elisa (citocinas e fator de crescimento derivado do cérebro - BDNF) e western blot (PLP, MBP e SMI-32). Como principais resultados, observamos diferente escore clínico entre o início e o período crônico de apresentação clínica do EAE entre os animais sedentários e previamente exercitados. No entanto, embora este resultado tenha sido acompanhado de significante atenuação da perda de massa corporal pelos animais exercitados em comparação aos mantidos sedentários dos grupos EAE, não foram observadas diferenças metabólicas entre esses grupos. Além disso, a atenuação clínica não foi associada com menor infiltrado de células inflamatórias no pico da doença, mas com níveis alterados de citocinas e BDNF. Neste sentido, enquanto as citocinas foram diminuídas no cérebro e aumentadas na medula espinhal dos animais EAE exercitados em relação aos sedentários, a concentração de BDNF foi elevada nos dois compartimentos no pico da doença. Os animais exercitados apresentaram ainda redução de infiltrado de células CD4, CD8 e células B, de desmielinização e de dano axonal na medula espinhal aos 42 dpi em relação aos mantidos sedentários. Estes resultados corroboram as controvérsias apontadas na literatura entre neuroinflamação e neuroproteção com respostas específicas em cada compartimento do SNC analisadas neste estudo, ou seja, cérebro e medula espinhal. No entanto, este é o primeiro trabalho a mostrar tais interações em decorrência de um programa de exercício físico regular. Sugerimos que o exercício regular realizado antes da apresentação clínica possa ter atuado sinergicamente com as respostas moleculares na fase de desenvolvimento clínico e então modificado o curso crônico de alterações histopatológicas associadas ao modelo. Entretanto, estudos adicionais são necessários para melhor entendimento sobre as relações moleculares desses efeitos sinérgicos entre o exercício e as alterações histopatológicas do modelo EAE. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the model to study the Multiple Sclerosis (MS) disease and has been characterized by histopathological hallmarks that include inflammation, demyelination and axonal damage. On the other hand, regular physical exercise is recognized for its anti-inflammatory and neuro-protective effects. Besides, it is suggested that regular exercise can have some protective effect against cachexia, which is a condition associated to the EAE model following the clinical presentation of disease. However, it is not clear if exercise has beneficial effects in central nervous system (CNS) or in systemic metabolic alterations of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mice. Therefore, the interactions between a prior program of regular exercise and the development and progression of EAE model were evaluated in the present study. For that, female C57BL/6 mice were assigned in two groups: untrained and exercise-trained. The swimming exercise was realized 5 days a week by 30 minutes a day. After 4 weeks of physical exercise protocol, the peptide MOG35–55 was injected and the animals continued exercising until 10 days post induction, completing 6 weeks of regular exercise. Analyses were made at onset (10 dpi), first peak disease (between 14 and 20 dpi) and at chronic time point of disease (42 dpi) and included: systemic metabolic assessment, intravital microscopy, histopathology (inflammatory infiltrates and demyelination volume), flow cytometry profile of cells, immunohistochemistry for oligodendrocytes (CC1+, NG2+/PDGFRα) and axonal damage (SMI-32+), ELISA (cytokines and brain derived neurotrophic factor – BDNF) and western blot (PLP, MBP and SMI-32). We observed different clinical score from12 to 42 dpi between prior trained and untrained mice (P < 0.0001). Although there was an important attenuation of body weight loss by exercised EAE animals in comparison with the non-exercised ones, the metabolic alterations were not modified. Moreover, in spite of non effect on infiltrated cells, cytokines and BDNF levels were altered in association with clinical score attenuation in exercised EAE-mice. While cytokines were decreased in brain but increased in spinal cord, BDNF was elevated in both compartments in the exercised EAE-group in comparison to the untrained. Also, being physical trained alters specific profile of recruitment of leucocytes (CD4, CD8 and B cells) to the spinal cord and contribute to a lesser demyelization volume and axonal damage at 42 day post induction. These results corroborates the controvert features between neuroinflammation and neuroprotection with singular responses between the two CNS compartments at acute phase of disease. Regular exercise performed before induction acted synergistically with the EAE model and can have some protective effect at chronic time point. However, further studies are necessary to improve the understanding about the molecular outcomes of these synergic effects between prior exercise and pathologic hallmarks of EAE.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune, crônica, progressiva, inflamatória e desmielinizante do sistema nervoso central (SNC). Devido à similaridade clínica e histopatológica com esta doença, a encefalomielite autoimune experimental (EAE) apresenta um modelo clínico experimental amplamente aceito da EM, devido ao fato de ambos terem processos fisiopatológicos mediados por células Th1 e citocinas pró-inflamatórias, como Interferon-gama (INF-γ), Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) e, mais recentemente, células Th17, produtores principalmente de IL-17, e radicais oxigenados, como NO e H2O2 produzidos principalmente por células fagocitárias. Os medicamentos hoje utilizados para a EM atuam sobre esses mediadores inflamatórios, porém, apresentam inconvenientes como, custo elevado e/ou efeitos adversos pronunciados. Devido a isso, a pesquisa por novas drogas para o tratamento da EM, concentra-se em substâncias que sejam capazes de modular a produção desses mediadores inflamatórios com maiores vantagens para o paciente. No presente estudo a EAE foi induzida em camundongos fêmeas da linhagem C57BL/6 com a MOG35-55 e os animais foram tratados com a Licochalcona A (isolado e purificado a partir da Glycyrhizza inflata) em doses de 15 e 30 mg/kg/dia e com o trans-cariofileno (obtido comercialmente em doses de 25 e 50 mg/kg/dia por gavagem (via oral) a partir do 10° dia até o pico dos sintomas clínicos da doença. Para verificar o efeito deste tratamento os seguintes parâmetros foram utilizados: avaliação clínica dos animais, realizada diariamente através da pesagem e pontuação dos escores neurológicos; análise histopatológica por hematoxilina e eosina do tecido cerebral e medula espinhal; produção de NO, avaliada pelo método de Griess; produção de H2O2, pelo método de Pick & Mizel, ambos em cultura de células peritoneais;níveis de IFN-γ, IL-17, TNF-α, quantificados por ELISA no sobrenadante de cultura de esplenócitos. O resultados mostraram que tanto a Licochalcona A, como principalmente o trans-cariofileno nas maiores doses administradas causaram redução significativa na neuroinflamação e desmielinização no SNC. Os níveis de NO, H2O2, IFN-γ, IL-17, TNF-α também apresentaram acentuada redução estando correlacionados com a melhoria dos sintomas clínicos. Os resultados sugerem que a Licochalcona A e o trans-cariofileno podem modular a produção de mediadores inflamatórios, interferindo sobre a patogênese da EAE. Tais substâncias podem ser instrumentos importantes para o tratamento de doenças desmielinizantes inflamatórias do SNC, tais como a EAE, o modelo clínico experimental mais utilizado para a esclerose múltipla. The multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) with features to be chronic, progressive, inflammatory and demyelinating. Due to the clinical and histopathological similarity with experimental autoimmune encephalomyelitis disease (EAE) this became a widely accepted study animal model of MS because both have pathophysiological processes involving Th1 cells and soluble pro-inflammatory cytokines such as Interferon-gamma (INF-γ), tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and more recently Th17 cells, primarily producers of IL-17, oxygen free radicals as NO and H2O2 by phagocytic cells. Drugs currently used in fact act on these inflammatory markers but have many disadvantages such as high cost and/or pronounced adverse effects. Due to that, the search for new drugs to treat MS focuses on substances that are able to modulate the production of these inflammatory mediators with greater advantages to the pacient. In the present study EAE was induced in female mice C57BL6 lineage with the MOG35-55 and the animals were treated with Licochalcone A (isolated and purified from Glycyrhizza Inflata) in doses 15 and 30 mg/Kg/dia and with trans-caryophyllene (obtained commercially in doses of 25 and 50 mg/Kg/dia by gavage (oral administration) from day 10° until the peak of the clinical symptoms of the disease. To verify the effect of this treatment the following parameters were used: clinical evaluation, was made by a neurological score of symptoms and weighing; histopathological analysis, for hematoxylin and eosin staining of the brain and spinal cord tissue at the end of the experiment; production of NO, evaluated by Griess method; production of H2O2; by Pick Mizel, both in culture of peritoneal cells; quantification of IFN-γ, IL-17, TNF-α was made by ELISA on the surface of spleen cells culture. Both Licochalcone A, as mainly the trans-caryophyllene in higher doses caused significant reduction in neuroinflamação and demyelination in the CNS. The levels of NO, H2O2, IFN-γ, IL-17, TNF-α also showed sharp reduction being correlated with the improvement of clinical symptoms. The results suggest that the Licochalcone A and trans-caryophyllene can modulate the production of inflammatory mediators, interfering on the pathogenesis of EAE. Such substances may be important instruments for treatment of CNS demyelinating inflammatory diseases such as EAE, animal model more used for multiple sclerosis.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais O modelo de Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE) é o mais utilizado no estudo da neurite óptica. Este trabalho tem como objetivo avaliar a cinética da neurite óptica em modelo animal de EAE induzido por duas diferentes concentrações de Glicoproteína dos Oligodendrócitos da Mielina (MOG). Para a indução da EAE foram utilizadas fêmeas de camundongos da linhagem C57BL/6, divididas em dois grupos, um grupo induzido com 100 μg de MOG35-55 e um segundo grupo induzido com 300 μg de MOG35-55. Os animais foram diariamente avaliados por meio da análise do escore clínico entre os dias zero e 58 pós-imunização. Nos dias 7, 10, 14, 21 ou 58 pósimunização, os animais foram submetidos a eutanásia, e os nervos ópticos, dissecados em seu trajeto desde a parte posterior do globo ocular até o quiasma óptico. Posteriormente, foram avaliados os aspectos morfológico e imuno-histoquímico dos nervos ópticos. As alterações histopatológicas observadas em um ou em ambos os nervos ópticos consistiram de infiltrado celular inflamatório, tendo a neurite óptica gravidade diferente nos dois grupos estudados. A quimiocina CCL5 foi avaliada no dia 10 pós-imunização, primeiro dia em que foi detectado o infiltrado inflamatório. Os resultados sugerem que duas diferentes concentrações de MOG35-55 utilizadas na indução do modelo animal de EAE induzem duas diferentes formas de evolução da neurite óptica. The model of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) is the most used model in the study of optic neuritis. This study aims to evaluate the kinetics of optic neuritis in the EAE animal model induced by two different concentrations of Oligodendrocytes Myelin Glycoprotein (MOG). For induction of EAE were used female mice of the C57BL/6 lineage, divided into two groups, one group induced with 100 μg of MOG35-55 and a second group induced with 300 μg of MOG35-55. The animals were evaluated daily by analysis of clinical score between zero and 58 days after immunization. On days 7, 10, 14, 21 or 58 post-immunization, the animals were euthanized. The optic nerves were dissected from the back of the eyeball to the optic chiasm; subsequently the morphological and immunohistochemical aspects of the optic nerves were evaluated. The histopathological changes observed in one or in both optic nerves consisted of inflammatory cell infiltrate. Optic neuritis had different levels of severity in the two groups. The chemokine CCL5 was evaluated on day 10 post-immunization, the first day when the inflammatory infiltrate was detected. The results suggest that two different concentrations of MOG35-55 used in the induction of EAE animal model induce two different forms of optic neuritis evolution.

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A esclerose múltipla se caracteriza por gerar uma inflamação esmielinizantecrônica e de caráter autoimune no sistema nervoso central, gerando uma série desinais e sintomas clínicos. Um modelo experimental para estudo da esclerosemúltipla é a encefalomielite autoimune experimental (EAE). Durante o curso da EAE, observa-se no SNC, perda de contatos sinápticos, bem como aumento da gliose reativa, envolvendo tanto astrócitos quanto células microgliais. Assim, a amenização dessas alterações, por tratamentos farmacológicos, pode ser útil no tratamento dos sintomas da EM. Neste sentido, o emprego da pregabalina, um ligante da proteína ?2-? associada a canais de cálcio voltagem-dependentes em neurônios, pode se constituir numa estratégia para o controle dos sintomas da doença. Assim, o presente estudo investigou o efeito da pregabalina sobre o curso da EAE, através da análise clínica de ratos Lewis imunizados com MBP e avaliação imunoistoquímica da medula espinal, utilizando marcadores para sinapses, astrogliose e reação microglial. Adicionalmente, através de RT-PCR, avaliou-se a expressão gênica de interleucinas pró e anti-inflamatórias, bem como a recuperação motora nos grupos placebo e tratado, foi avaliada pelo walking track test (CatWalk System). Os resultados demonstraram que o tratamento com pregabalina foi capaz de atrasar e amenizar os sinais clínicos e morfológicos da EAE, bem como reduzir a perda sináptica e a reação astroglial na medula espinal. Ainda, o tratamento resultou numa regulação positiva de genes anti-inflamatórios. De forma similar, a administração desse fármaco permitiu um mais rápido restabelecimento de parâmetros de marcha. Os resultados do presente estudo indicam que a pregabalina apresenta características neuroprotetoras e antiinflamatórias que refletem positivamente na amenização da doença, mostrando potencial para o uso clínico, em associação aos imunomoduladores atualmente empregados Abstract: The multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease and neurodegenerative that affects young adults. It is characterized by generating a chronic demyelinating autoimmune inflammation in the central nervous system. An experimental model for the study of multiple sclerosis is the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), induced by immunization with antigenic proteins of myelin of the central nervous system, dissolved in adjuvants. The present study investigated the evolution of the disease in pregabalin treated animals up to the remission phase. The results demonstrated a delay on the onset of the disease with statistical differences at the 10th and the 16th day after immunization For the gait evaluation, the walking track test (CatWalk) was used to evaluate different parameters related to motor function. Although no difference between groups was obtained for the foot print pressure, the regularity index was improved post treatment, indicating a better motor coordination. The immunohistochemical analysis of synapse preservation and glial reactivity revealed that pregabalin treatment improved the overall morphology of the spinal cord. A preservation of circuits was depicted and astroglial reaction was downregulated during the course of the disease. RT-PCR data were in line with the immunolabeling observations and indicated a shift of the immune response towards an anti-inflammatory response. Overall, the present data indicate that pregabalin is efficient for reducing the seriousness of EAE, delaying its course as well as reducing synaptic loss and astroglial reaction Mestrado Clínica Médica Mestra em Clínica Médica

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) A dor cronica esta entre os principais sintomas da esclerose multipla. Sao escassas as pesquisas com compostos naturais na busca de tratamentos para os sintomas dessa doenca. As plantas pertencentes ao genero Phyllanthus e os agentes canabinoides tem mostrado efeitos positivos sobre a nocicepcao e a inflamacao. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito antihipernociceptivo de Phyllanthus amarus e do trans-cariofileno no modelo de encefalomielite autoimune experimental (EAE). Inicialmente foi feita a analise fitoquimica do extrato hexanico de Phyllanthus amarus (EHPa) e as principais lignanas encontradas foram filantina, nirantina e 5-demetoxinirantina. Para todos os experimentos realizados foram utilizados camundongos femeas C57BL/6J. Nao foram observadas alteracoes siginificativas nos testes iniciais (triagem farmacologica e rota rod). A nocicepcao foi avaliada pelo teste de placa quente e formalina na pata. Todas as doses de EHPa promoveram efeito antinociceptivo no teste de formalina, em ambas as fases, mas somente a dose de 400 mg/kg aumentou o tempo de permanencia dos camundongos sobre a placa aquecida. Na etapa seguinte, a EAE foi induzida por injecao subcutanea com 200 μg do peptideo de MOG35-55 dissolvida em CFA. Os animais foram avaliados quanto a hipernocicepcao mecanica (von Frey), a coordenacao motora, ao peso e ao desenvolvimento da doenca. Nenhuma das doses de Phyllanthus amarus administradas foi capaz de modificar os parametros analisados. Os mesmos experimentos foram realizados em animais com EAE, mas o tratamento com o transcariofileno nao previniu a reducao do peso, as alteracoes motoras, e nem modificou o desenvolvimento da doenca. No entanto, com relacao a hipernocicepcao, as tres doses foram efetivas em aumentar o limiar de nocicepcao, a partir do 6° dia apos a inducao da doenca. Quando o mecanismo de acao do trans-cariofileno foi avaliado, o efeito agudo da dose de 10 mg/kg foi bloqueado pela naloxona (antagonista opioide) e pelo AM630 (antagonista canabinoide). A resposta de proliferacao e producao de citocina, foi analisada apos sete dias de tratamento. Porem, a dose de 10 mg/kg do trans-cariofileno nao modificou a proliferacao das celulas T CD4+ e nem a producao de IFN-γ. Como conclusao, estes produtos naturais podem atuar de maneira diferente dependo do modelo empregado e metodo de extracao utilizado. Ainda que o extrato da planta nao tenha sido efetivo, o trans-cariofileno foi capaz de reduzir a hipernocicepcao induzida na EAE. Os resultados mostram a relevancia de estudos com produtos naturais para o emprego em neuropatias dolorosas FAPESP: 09/51882-8 BV UNIFESP: Teses e dissertações

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune que acomete o sistema nervoso central (SNC) promovendo inflamação, desmielinização e subsequente comprometimento neurológico. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é o modelo animal mais amplamente utilizado para o estudo da EM, podendo ser induzida por uma grande diversidade de protocolos. Porém, o resultado da doença pode ser diferente em cada modelo, dependendo das características genéticas dos animais utilizados, da fonte e concentração do material antigênico e do modo de aplicação do antígeno, refletindo, em parte, a heterogeneidade encontrada nas diversas formas clínicas da EM. Portanto, devido à diversidade de modelos de indução de EAE, vários fatores relacionados à resposta imunológica, permanecem pouco conhecidos. O presente trabalho buscou avaliar a diferença entre duas concentrações antigênicas, utilizadas na indução, sobre o desenvolvimento clínico da EAE e em diversos parâmetros da resposta imunológica. Para isto, a EAE foi induzida em camundongos da linhagem C57BL/6, utilizando-se a glicoproteína mielínica de oligodendrócitos (MOG35-55), em duas concentrações diferentes (100 ou 300 μg do peptídeo MOG35-55) e mantendo-se as concentrações de Mycobacterium tuberculosis (4 mg/mL) e toxina pertussis (300 ng) constantes. Foi então acompanhado o curso clínico da doença, nos dois protocolos utilizados, durante um período de 58 dias. Além disso, parâmetros da resposta imunológica, como avaliação do infiltrado celular no cérebro e dosagem de citocinas e quimiocinas no SNC e linfonodos inguinais foram acompanhados no 7°, 10°, 14°, 21° e 58° dias após a indução. Observou-se que embora não tenha ocorrido diferença significativa entre os grupos de animais imunizados em relação à pontuação do escore clínico, ocorreram diferenças importantes entre estes dois protocolos no que diz respeito ao perfil de citocinas, quimiocinas e infiltrado celular no cérebro. O aumento das citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas no SNC ocorreu de forma precoce no grupo imunizado com 100 μg do peptídeo MOG35-55, que também exibiu infiltrado celular precoce e mais intenso do que o grupo imunizado com 300 μg do peptídeo MOG35- 55. Além disso, o nível das quimiocinas CCL5 e CCL20 e das citocinas de perfil Th1 e Th17 foram, de forma geral, mais elevados no grupo imunizado com 100 μg do peptídeo MOG35-55. Os resultados sugerem que somente a variação na concentração antigênica do MOG35-55, no momento da indução, não é capaz de induzir diferentes cursos clínicos de EAE e que a concentração mais elevada do antígeno (300 μg do peptídeo MOG35-55) parece promover algum mecanismo regulador ou de tolerância, que deve ser melhor estudado. Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory autoimmune disease of central nervous system (CNS) that causes demyelination and neurological deficit. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common model for study this disease. The EAE can be induced by different protocols and the score of the disease is related to the genetic background of the animals, the concentration of antigen and the way of induction, reproducing the heterogeneity of the MS. Thus, due to the diversity of EAE induction, different factors related to immune response are still unclear. The aim of this study was evaluate the difference between two antigen concentrations in the development of EAE and the parameters of immune response. The EAE was induced in C57BL/6 female mice with the myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) in two different concentrations (100 or 300μg of MOG35-55), but keeping the same concentrations of Mycobacterium tuberculosis (4 mg/mL) and pertussis toxin (300 ng). The disease clinical signs were followed until the 58th day after induction in both protocols, and the immunological parameters, such as cellular infiltrate at brain and levels of cytokines and chemokines at CNS and lymph nodes, were evaluated at 7th, 10th, 14th, 21st and 58th days post induction. In relation to the clinical score, were not observed significant differences between the different protocols, however the cytokines, chemokines and cellular infiltrate profile at brain showed interesting results. The release of Th1 and Th17 cytokines and the CCL5 and CCL20 chemokines at CNS occurred early and more intense at 100μg MOG35-55 group, in accordance with the earlier and intense cellular infiltrate than 300μg MOG35- 55 group. In conclusion, the results suggest that only the differences in the MOG35-55 concentration at induction, is not capable of induce different clinical signs of EAE and that the 300 μg of MOG35-55 seems to promote a regulatory or tolerance mechanism that deserves further studies.

Multiple sclerosis is a neuroinflammatory disease that results in serious neurological disability. Besides physical impairment, behavioral symptoms are also common in patients with multiple sclerosis. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is considered to be a model of multiple sclerosis and mimics the main features of the disease, such as demyelination and motor impairment. In this work, we aimed to study behavioral parameters in animals with EAE using the MOG35-55 model in C57BL/6 mice. We analyzed memory and anxiety in animals using the elevated plus maze, the step down inhibitory avoidance task and the memory recognition test. No differences in any tests were found when comparing controls and animals induced with EAE. Therefore, we conclude that behavioral changes in animals with EAE induced with MOG35-55 are probably subtle or absent.

BACKGROUND: Pain is an important clinical manifestation in multiple sclerosis (MS) patients, though it has been neglected in clinical and experimental researches. OBJECTIVE: To investigate the nociceptive response in MOG35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)-induced mice. METHOD: EAE was induced in 8 to 10 week old C57BL/6 female mice with an emulsion of MOG35-55, Complete Freund Adjuvant, Mycobacterium tuberculosis H37 RA and pertussis toxin. Nociception was evaluated by the von Frey filaments method. A clinical scale ranging from 0 to 15 was used to assess motor impairment. RESULTS: Clinical evidence of disease started at day 10 and peaked at day 14 after immunization. Thereafter, there was no worsening of symptoms until day 26. The EAE-induced mice presented reduced pressure threshold at days 7th and 10th after immunization and before the onset of clinical motor signs. CONCLUSION : The hypernociception found validates MOG35-55 EAE as a model for the study of pain in multiple sclerosis. INTRODUÇÃO: Dor é uma manifestação importante em pacientes com esclerose múltipla (EM), mas que tem sido negligenciada na pesquisas clínica e experimental. OBJETIVO: Investigar a resposta nociceptiva de camundongos com encefalomielite autoimune experimental (EAE) induzida por MOG35-55. MÉTODO: A EAE foi induzida em camundongos C57BL/6 fêmeas de 8-10 semanas com emulsão contendo MOG35-55, Adjuvante Completo de Freund, Mycobacterium tuberculosis cepa H37 RA e toxina pertussis. A nocicepção foi medida pelo método de filamentos de von Frey. Uma escala clínica variando de 0 a 15 foi utilizada para avaliar a debilidade motora dos animais. RESULTADOS: Os sinais clínicos da doença iniciaram-se no dia 10 e a gravidade máxima foi alcançada no dia 14 após a imunização. Não houve piora dos sintomas até o dia 26. Os camundongos induzidos com EAE apresentaram diminuição do limiar de pressão nos dias 7 e 10 após a imunização e antes do início dos sinais motores. CONCLUSÃO: A hipernocicepção verificada valida a EAE induzida por MOG35-55 como um modelo para estudos de dor em esclerose múltipla.

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A Esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória, desmielinizante do sistema nervoso central (SNC). Sua etiologia é desconhecida, porém, sua progressão se deve a ocorrência de uma importante resposta auto-imune. O acetato de glatirâmer (AG) é um medicamento utilizado em pacientes com esclerose múltipla e é constituído por um copolímero de 4 peptídeos homólogos à proteína básica da mielina (MBP), capaz de diminuir a exacerbação e o número lesões da doença. Pouco se sabe sobre o impacto do tratamento com AG sobre o SNC, principalmente, se este medicamento influencia na estabilidade das sinapses medulares durante o curso da doença. Uma molécula importante para a manutenção do SNC é o complexo de histocompatibilidade principal de classe (MHC I), que participa na regulação homeostática e função sináptica. Para este estudo, utilizamos o modelo animal da EM, a Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE) e a avulsão de raízes motoras da medula espinhal para investigar a plasticidade sináptica e reatividade glial sobre o efeito do AG no SNC. A doença (EAE) foi induzida em camundongos C57BL/06 que foram dividivos em 4 grupos. Trinta animais foram submetidos à EAE e tratados com AG, sendo 15 tratados até o surto da doença e 15 tratados até a fase de remissão dos sinais clínicos. Para o grupo placebo, 30 animais foram tratados com solução salina e foram divididos também em 2 sub-grupos, com 15 animais tratados até o surto e 15 tratados até a remissão. Já a avulsão (AV) foi realizada em 20 ratos Lewis que foram divididos em 2 grupos com 10 animais cada, um grupo tratado com AG e um grupo tratado com placebo (salina) por 14 dias. Os resultados dos camundongos submetidos a EAE foram analisados por imunoistoquímica (n=5) e Western blotting (n=5). Uma análise qualitativa dos motoneurônios medulares e suas aferências também foi realizada através de microscopia eletrônica de transmissão (n=5). Os ratos avulsionados (n=20) foram divididos em grupos de 10 animais para o estudo imunoistoquímico e 10 para avaliação neuronal. Os resultados mostram que o AG tem a capacidade de diminuir a expressão de MHC classe I nos camundongos com EAE e nos ratos submetidos AV; também influencia a manutenção de sinapses e regula parte do processo inflamatório desenvolvido pela doença ou pela lesão mecânica. Houve uma diminuição, em ambos os experimentos (EAE e avulsão), da expressão da proteína astrocitária, GFAP- glial fibrillary acidic protein, assim como uma diminuição da reatividade microglial observada por Iba-1. Através da imunomarcação das sinapses na coluna anterior da medula espinhal, pode-se observara maior preservação desses inputs nos animais tratados. A avaliação da sobrevivência neuronal realizada nos ratos submetidos à AV também mostrou maior preservação de motoneurônios nos animais tratados. Portanto, o AG parece exercer um papel relevante no SNC diminuindo a expressão de MHC I e proporcionando melhor estabilidade sináptica e preservação neuronal, tanto em uma situação de lesão autoimmune quanto após traumas mecânicos no SNC Abstract: Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory and demyelinating disease, which etiology is unknown. Although it is the result of a major autoimmune response. The Glatiramer acetate (GA) is a drug used to treat MS and is composed by four peptides homologous to the myelin basic protein (MBP), that is able to reduce the exacerbation and injuries to the CNS. Nevertheless it is possible that GA develops a direct effect on the CNS by modulating the expression of the major histocompatibility complex of class I (MHC I), which has recently been involved in the synaptic plasticity process. For this study an animal model for MS was used, namely the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as well as the spinal motor root avulsion (AV) was used to investigate the synaptic plasticity and glial react in the CNS after GA treatment. EAE was induced in C57BL/6 mice which were divided into 4 groups. Thirty animals were induced to EAE and treated with GA, 15 animals were treated until the placebo group reached the exacerbation of the disease and other 15 animals were treated until the remission phase. The placebo treated group, treated up to the followed same procedures of the GA treated groups. However the animals were given only saline solution. In this way, 15 animals were treated up to the exacerbation phase and 15 animals were treated until the remission phase. The AV it was performed in 20 Lewis adult rats that were divided into 2 groups with 10 animals each. The first group was treated with GA (n=10) and second group was treated with saline (n=10) for 14 days. The treatment was initiated soon after the lesion. The EAE results were analyzed by immunohistochemistry (n = 5), Western Blotting (n = 5) and a qualitative analysis of spinal motoneurons and their afferents was also performed by transmission electron microscopy (n = 5). Avulsed animals (n=20) were divided into groups for the immunohistochemichal study (n=10) and for neuronal survival counting (n=10). The results showed that GA has the ability to decrease MHC class I expression in mice with EAE and in rats after AV. In this way, influences the synaptic plasticity and inflammatory processes regulation during the disease and after a mechanical injury. There was a decrease in astrocyte reactivity (GFAP-glial fibrillary acidic protein expression) and a decrease in microglial reactivity observed by Iba-1. Expression analyses immunolabeling was more preserved after GA administration and the neuronal count performed in the AV rats also showed increased motoneurons survival. Taken together, the present results indicate that GA plays a role in the CNS by reducing the MHC class I expression in the spinal cord and environmental. Thus providing better synaptic stability and neuronal preservation during the course of EAE and CNS lesion Mestrado Ciências Básicas Mestre em Clínica Médica

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais A Esclerose Múltipla é uma doença autoimune que acomete o Sistema Nervoso Central. O modelo animal mais amplamente utilizado para o estudo desta patologia é o da encefalomielite autoimune experimental (EAE), comumente induzida em camundongos. Em estudos anteriores, observou-se que o estrógeno representa um papel central na resposta imune e nas doenças imunomediadas. Os fitoestrógenos representam uma família de compostos vegetais com propriedades estrogênicas, pois apresentam muitas similaridades estruturais com os estrógenos endógenos, inclusive ligando-se aos seus receptores. O presente trabalho teve como objetivo testar o fitoestrógeno genisteína em camundongos da linhagem C57Bl/6 com EAE. Para isto, foi inicialmente padronizado o modelo de EAE e, posteriormente, o efeito imunomodulador da isoflavona genisteína foi analisado não somente através da avaliação clínica dos camundongos como também pela produção de citocinas Th1 e Th2, além da interação dos leucócitos com o endotélio cerebral. Multiple sclerosis (MS) is the most common non-traumatic, disabling neurological human inflammatory demyelinating disease of the CNS. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) models MS and is characterized as a CD4+ Th1 cell-mediated autoimmune disease. Recent data show that estrogen plays a pivotal role in the immune response as well as in immune-mediated diseases. Isoflavones are found in a variety of plants, especially in soy, and make up the most common form of phytoestrogens which demonstrate estrogenic properties due to their structural similarities with estrogens. Genistein is the major bioactive isoflavone. In the present report, we investigated the use of genistein for the treatment of the murine model of MS in C57Bl/6 mice. The genistein’s modulatory effects were evaluated after induction of EAE with MOG35-55, assessing not only clinical symptoms but also pro- and anti-inflammatory cytokines, and the leukocyte rolling and adherence in the CNS by performing intravital microscopy.

Orientadores: Wanderley Dias da Silveira, Leonilda Maria Barbosa dos Santos Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A Acupuntura é uma das mais antigas formas de tratamento que tem sobrevivido e evoluido não só no Extremo Oriente (China), mas em todo o mundo. A técnica consiste na inserção de agulhas em vários níveis de profundidade da pele em pontos específicos chamados de "Acupontos", podendo ser estimuladas manualmente ou com uma corrente de baixa tensão elétrica (Eletroacupuntura). Faz parte ainda de um conjunto de técnicas com fins terapêuticos da Medicina Tradicional Chinesa, sendo, atualmente, praticada como terapia primária e adjuvante para uma variedade de doenças e condições crônicas. De outro lado a Esclerose Múltipla é uma doença inflamatória crônica do sistema nervoso central, caracterizada pela infiltração de células do sistema imune neste compartimento, com destruição de mielina e perda de oligodendrócitos, é a mais comum das doenças auto-imunes do sistema nervoso central. Trata-se de uma doença que acomete principalmente adultos jovens, sendo mais frequente nas mulheres, causando múltiplos sinais e sintomas de disfunção neurológica. Aproximadamente 85% dos pacientes apresentam a forma recorrente - remitente (surto/remissão), que é caraterizada por apresentar manifestações sintomatológicas de disfunção neurológica (exacerbação, relapso ou ataque) com períodos de estabilização ou melhora (remissão). Terapias imunomoduladoras modernas vêm sendo empregadas no tratamento da Esclerose Múltipla, no entanto, não aliviam muitos dos sintomas, como dor e depressão, levando a uma piora na qualidade de vida. Pacientes, assim, procuram tratamentos alternativos, como a acupuntura, embora os benefícios desses tratamentos não tenham sido objetivamente avaliados. O emprego do modelo experimental, a Encefalomielite Autoimune (alérgica) Experimental, tem trazido grandes contribuições para a compreensão dos mecanismos envolvidos e o esclarecimento da patogênese de doenças autoimunes, tais como a Esclerose Múltipla. Este estudo foi, portanto, concebido para avaliar o efeito da eletroacupuntura sobre a qualidade de vida de pacientes com Esclerose Múltipla tratados com imunomoduladores e na modulação da resposta imune na encefalomielite autoimune experimental. No final do estudo foi observado que a Eletroacupuntura promove a melhora em vários aspectos da qualidade de vida dos pacientes com Esclerose Múltipla, especialmente a dor, e na Encefalomielite Autoimune (alérgica) Experimental foi observado que existe uma modificação da resposta imunológica. Além disso, os resultados também sugerem que o uso rotineiro de um questionário de autoavaliação da qualidade da vida deve ser incluído nas avaliações clínicas regulares dos pacientes Abstract: Acupuncture is one of the oldest forms of treatment that has survived and evolved not only in the Far East (China), but around the world. The technique involves inserting needles at various levels of depth of the skin at specific points called "Acupoints" and can be stimulated manually or with a low voltage electrical current (electroacupuncture). It is part of a set of therapeutic techniques the traditional chinese medicine and is currently practiced as primary therapy and adjuvant for a variety of diseases and chronic conditions. On the other hand the MS is a chronic inflammatory disease of the central nervous system characterized by infiltration of immune cells in this compartment, with destruction of myelin and oligodendrocytes loss. It is the most common of the autoimmune diseases of the central nervous system and is a disease that mostly affects young adults, being more common in women, causing multiple signs and symptoms of neurological dysfunction. Approximately 85% of patients present form recurrent-remitting MS (relapsing/remitting), which presenting symptom of neurological events (exacerbation, relapse or attack) with periods of stabilization or improvement (remission). Modern immunomodulatory therapies have been employed in the treatment of Multiple Sclerosis, however, do not alleviate many of the symptoms such as pain and depression, leading to deterioration in quality of life. Patients, therefore, seek alternative treatments such as acupuncture, although the benefits of these treatments have not been objectively evaluated. The use of model experimental autoimmune encephalitis has brought large contributions to the understanding of mechanisms and understanding the pathogenesis of autoimmune diseases such as MS. This study was therefore designed to evaluate the effect of electro on the quality of life of patients with multiple sclerosis treated with immunomodulators and modulation of immune response in experimental autoimmune encephalomyelitis. At the end of the study it was observed that electroacupuncture improved in various aspects of quality of life of patients with multiple sclerosis, especially pain, and it was observed that electroacupuncture modifies the immune response in the Autoimmune Encephalomyelitis Experimental. Moreover, the results also suggest that the routine use of a self-assessment of quality of life should be included in regular clinical evaluations of patients Doutorado Farmacologia Mestre em Farmacologia

Dissertação de mestrado em Ciências da Saúde, Multiple sclerosis (MS) is an immune-mediated demyelinating disease of the central nervous system (CNS), characterized by the presence of demyelination plaques, inflammation and gliosis that consequently lead to axonal damage. The sequence of events that leads to demyelination remains unclear and the pathophysiological mechanisms are diverse. Also, although this is a disease of the CNS, there is no doubt that, in terms of peripheral organs, the thymus, as the organ of T cell differentiation and maturation, plays an important role in the pathophysiology of the disease. Recently, the levels of lipocalin 2 (LCN2), an acute phase protein that is part of the defense system against bacteria, by binding to iron-loaded siderophores, were found to be increased in cerebrospinal fluid (CSF) and serum of MS patients, when compared to control subjects. Similarly, using the MS animal model of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), LCN2 was detected in brain parenchyma astrocytes, in regions typically affected in MS patients. This expression by astrocytes, together with an increased LCN2 level in the CSF, occurs during the active phases of the disease, which could point towards a role for LCN2 secreted by astrocytes in the mediation of inflammatory responses in the EAE model. Altogether, these findings support LCN2 as a valuable molecule for the diagnostic/monitoring of MS and suggest its potential involvement as a disease modulator. Of relevance, the exact role of LCN2 in the pathophysiology of the disease remains largely unknown and contradictory data exists on its potential protective or deleterious effect. Therefore, we sought to investigate the role of LCN2 in the onset and progression of the disease. Herein, we tackled the disease, by evaluating the role of LCN2, not only in the perspective of the CNS, but also on the perspective of peripheral organs such as the thymus. First we intended to perform a characterization of the thymus regarding thymocyte populations and histological morphology, in wild-type (WT) animals induced with EAE, in the onset and chronic phases of disease. Next, to further understand the role of LCN2 in MS pathology, we induced EAE both in LCN2- null mice and in WT littermates. Non-induced EAE animals were used as controls. The thymus of EAE animals was atrophied, as assessed by its weight, normalized for total body weight, and by the number of total cells. Also, we found a decrease in total cell number of all thymocyte populations, during the onset and chronic phases of EAE. In relative terms, the percentage of double positive cells was decreased, and the percentages of the cluster of differentiation (CD)4 and CD8 single positive cells were increased, during the onset phase. At the chronic phase, the proportions between the different populations were restored. LCN2-null mice induced with EAE did not present major alterations in terms of the clinical score, when compared with WT littermates also induced with EAE. Likewise, their thymic alterations were similar to the ones observed in WT EAE animals. Of relevance, as for the inflammatory profile in the cerebellum, LCN2-null mice presented less inflammation, as assessed by decreased expression levels of proinflammatory cytokines interferon (Ifn)-gamma, interleukin (Il)12a and Il17a. Also of interest, the cerebellum of LCN2-null mice presented a decrease in the percentage of lesioned areas. Finally, EAE animals, from both genotypes, presented an increase in the area positive for glial fibrillary acidic protein (GFAP), in the white matter of the cerebellum, in both the onset and chronic phases of disease. On the contrary, the expression levels of Gfap in the cerebellum were only increased at the onset phase of disease., A Esclerose Múltipla (EM) é uma doença autoimune desmielinizante do sistema nervosa central (SNC), caracterizada pela presença de placas de desmielinização, inflamação e gliose, que tem como consequência dano axonal. A sequência de eventos que induzem desmielinização permanecem desconhecidos, e os mecanismos patofisiológicos são diversos. Embora esta seja uma doença do SNC, não há dúvidas que, em termos de órgãos periféricos, o timo, sendo o órgão de maturação e diferenciação das células T, desempenha um papel importante na patofisiologia da doença. Recentemente, os níveis de lipocalin-2 (LCN2), uma proteína de fase aguda que participa no sistema de defesa contra infeções bacterianas, através da ligação a sideróforos, foram encontrados como estando elevados no líquido cefalorraquidiano (LCR) e no soro de doentes com EM, comparativamente aos controlos. Da mesma maneira, usando o modelo animal de EM de encefalomielite autoimune experimental (EAE), a LCN2 foi detetada em astrócitos do parênquima, em regiões tipicamente afetadas em doentes com EM. Esta expressão pelos astrócitos, associada a um aumento de LCN2 no LCR, ocorreu durante as fases ativas da doença, o que aponta para um papel da LCN2 secretada pelos astrócitos na mediação da response inflamatória no modelo de EAE. No seu conjunto, estas evidências suportam o papel da LCN2 como uma molécula importante no diagnóstico e/ou monitorização da EM, e sugere o seu possível envolvimento como moduladora da doença. É relevante dizer que o papel exato da LCN2 na patofisiologia da doença permanece desconhecido, e existem dados contraditórios no que diz respeito ao seu potencial efeito protetor ou deletério. Por isso, nós procurámos perceber o papel da LCN2 no onset e na progressão da doença. Assim, nós investigámos o papel da LCN2 na doença, não só na perspetiva do SNC, mas também dos órgãos periféricos, nomeadamente do timo. Primeiro pretendemos caracterizar o timo em relação às populações de timócitos e morfologia histológica, em animais wild-type (WT) induzidos com EAE, no onset e na fase crónica da doença. De seguida, para melhor entender o papel da LCN2 na patologia da EM, induzimos EAE em animais LCN2- null e em WT da mesma ninhada. Para além disso, usámos animais não induzidos como controlos. Nós observámos que o timo dos animais induzidos com EAE estava atrofiado, com base no seu peso, após normalização para o peso total do animal, e no número total de células. Para além disso, encontrámos uma diminuição no número total de células de todas as principais populações de timócitos, durante o onset e fase crónica da doença. No que diz respeito à percentagem de cada uma das populações de timócitos, durante o onset da doença, a percentagem de células duplas positivas encontrava-se diminuída, enquanto as percentagens das populações CD4+CD8- e CD4-CD8+ se encontrava aumentada. Na fase crónica da doença, as proporções entre as diferentes populações foram reestabelecidas. Os animais LCN2-null induzidos com EAE não apresentaram grandes alterações em termos de score clínico, quando comparados com os animais WT da mesma ninhada também induzidos com EAE. Para além disso, as alterações observadas no timo foram semelhantes às encontradas nos animais WT EAE. De relevância, no que diz respeito ao perfil inflamatório no cerebelo, os animais LCN2-null apresentaram menos inflamação, o que é suportado por níveis diminuídos dos níveis de expressão das citoquinas pró-inflamatórias interferão-gama, e interleucinas 12 e 17. É importante também referir que os cerebelos de animais LCN2-null apresentaram uma diminuição na percentagem de áreas com lesões. Os animais EAE, de ambos os genótipos, apresentaram um aumento na área positiva para GFAP, na substância branca do cerebelo, no onset e na fase crónica da doença. Pelo contrário, os níveis de expressão de Gfap no cerebelo só foram encontrados elevados no onset da doença.