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Le syndrome de Tatton-Brown-Rahman (TBRS) est une maladie génétique rare caractérisée par une taille plus grande que la normale, une déficience intellectuelle et des traits faciaux dysmorphiques. Ce trouble est associé à une mutation fonctionnelle de DNMT3A, une enzyme responsable de l’établissement de modifications de la méthylation de l’ADN impliquée dans la régulation des gènes et indispensable au développement. Actuellement, nous ne savons pas comment les mutations fonctionnelles de la protéine DNMT3A peuvent être à l'origine d’altération lors du développement neurologique et d'autres problèmes observés chez les patients atteints de TBRS. Ainsi, il existe un besoin urgent de développer des modèles chez l’humain pour comprendre les causes moléculaires et cellulaires du TBRS et pour trouver des traitements potentiels et spécifiques pour les patients. Par conséquent, nous proposons d'utiliser des cellules souches pluripotentes induites (iPSC), une technologie qui permet de convertir les cellules d'un patient en cellules souches, que nous avons reprogrammées en progéniteurs neuronaux (NPC). Grâce à cette approche, nous avons pu effectuer une série d’analyses bio-informatiques, nous permettant de déterminer comment les cellules neuronales sont affectées. Le séquençage des profils de méthylation et de transcription des cellules iPSC et NPC nous a permis de démontrer que les mutations étudiées dans le domaine Mtase du gène DNMT3A induisent des changements de méthylation et d’expression significatifs dans les cellules mutées, et ce pour les deux types cellulaires (iPSC et NPC). L’annotation des régions et des transcrits différentiellement méthylés et exprimés a permis d’associer ces derniers à des gènes et des enrichissements biologiques liés au développement ainsi qu’au neurodéveloppement démontrant ainsi une perturbation de ces processus. Dans l'ensemble, ce projet permettra de découvrir l’impact des mutations dans le gène DNMT3A et fournira un modèle fonctionnel permettant de tester de nouvelles avenues thérapeutiques pour traiter le TBRS., Tatton-Brown-Rahman syndrome (TBRS) is a rare genetic disorder characterized by larger than normal height, intellectual disability, and dysmorphic facial features. This disorder is associated with a functional mutation in DNMT3A, an enzyme responsible for establishing DNA methylation changes involved in gene regulation and essential for development. Currently, we do not know how functional mutations in the DNMT3A protein may cause neurodevelopmental impairment and other problems seen in patients with TBRS. Thus, there is an urgent need to develop models in humans to understand the molecular and cellular causes of TBRS and to find potential and specific treatments for patients. Therefore, we propose to use induced pluripotent stem cells (iPSC), a technology that converts a patient's cells into stem cells, which we reprogrammed into neuronal progenitors (NPCs). Using this approach, we were able to perform a series of bioinformatics analyzes allowing us to determine how neuronal cells are affected. The sequencing of the methylation and transcription profiles of iPSC and NPC cells allowed us to demonstrate that the mutations studied in the Mtase domain of the DNMT3A gene induce significant methylation and expression changes in the mutated cells, for both cell types (iPSC and NPC). Annotation of the differentially methylated and expressed regions and transcripts allowed them to be associated with genes and biological enrichments related to development as well as neurodevelopment, demonstrating a disruption of these processes. Overall, this project will uncover the impact of mutations in the DNMT3A gene and provide a functional model for testing new therapeutic avenues for treating TBRS.

In his prescient article “More is different”, P. W. Anderson counters the reductionist argument by highlighting the crucial role of emergent properties in science. This is particularly true in biology, where complex macroscopic behaviours stem from communication and interaction loops between much simpler elements. As an illustration, I hereby present three different instances in which I developed and used quantitative methods in order to learn new biological processes.For instance, the regulation and eventual rejection of tumours by the immune system is the result of multiple positive and negative regulation networks, influencing both the behaviour of the cancerous and immune cells. To mimic these complex effects in-vitro, I designed a microfluidic assay to challenge melanoma tumour spheroids with multiple T cells and observe the resulting interactions with high spatiotemporal resolution over long (>24h) periods of time. Using advanced image analysis combined with mathematical modelling I demonstrate that a positive feedback loop drives T cell accumulation to the tumour site, leading to enhanced spheroid fragmentation. This study sheds light on the initiation if the immune response at the single cell scale: showing that even the very first contact between T cell and tumour spheroid increases the probability of the next T cell to come to the tumour. It also shows that it is possible to recapitulate complex antagonistic behaviours in-vitro, which paves the way for the elaboration of more sophisticated protocols, involving for example a more complex tumour micro-environment.Many biological processes are the result of complex interactions between cell types, particularly so during development. The foetal liver is the locus of the maturation and expansion of the hematopoietic system, yet little is known about its structure and organisation. New experimental protocols have been recently developed to image this organ and I developed tools to interpret and quantify these data, enabling the construction of a “network twin” of each foetal liver. This method makes it possible to combine the single-cell scale and the organ scale in the analysis, revealing the accumulation of myeloid cells around the blood vessels irrigating the foetal liver at the final stages of organ development. In the future, this technique will make it possible to analyse precisely the environmental niches of cell types of interest in a quantitative manner. This in turn could help us understand the developmental steps of crucial cell types such as hematopoietic stem cells.The interactions between bacteria and their environment is key to understanding the emergence of complex collective behaviours such a biofilm formation. One mechanism of interest is that of rheotaxis, whereby bacterial motion is driven by gradients in the shear stress of the fluid the cells are moving in. I developed a framework to calculate the semi-analytical equations guiding bacteria movement in shear stress. These equations predict behaviours that aren’t observed experimentally, but the discrepancy is solved once rotational diffusion is taken into account. Experimental results are well-fitted by the theoretical prediction: bacteria in droplets segregate asymmetrically when a shear is generated in the media.Although relating to very different topics, these three studies highlight the pertinence of quantitative approaches for understanding complex biological phenomena: biological systems are more than the sum of their constituents.a; Les systèmes biologiques sont bien plus que la somme de leurs constituants. En effet, ils sont souvent caractérisés par des comportements macroscopiques complexes résultant de boucles d'interactions et de rétroactions. Par exemple, la régulation et le rejet éventuel des tumeurs par le système immunitaire est le résultat de multiples réseaux de régulation, influençant à la fois le comportement des cellules cancéreuses et immunitaires. Pour simuler ces effets complexes in-vitro, j'ai conçu une puce microfluidique permettant de confronter des sphéroïdes de mélanome à de multiples cellules T et d'observer les interactions qui en résultent avec une haute résolution spatio-temporelle et sur de longues périodes de temps. En utilisant de l'analyse d'images avancée, combinée à des modèles mathématiques, je démontre qu'une boucle de rétroaction positive conduit l'accumulation de cellules T sur la tumeur, ayant pour conséquence une fragmentation accrue des sphéroïdes. Cette étude met en lumière l'initiation de la réponse immunitaire à l'échelle de la cellule unique : elle montre que même le tout premier contact entre une cellule T et un sphéroïde tumoral augmente la probabilité que la cellule T suivante arrive sur la tumeur. Elle montre également qu'il est possible de récapituler des comportements antagonistes complexes in-vitro, ce qui ouvre la voie à l'élaboration de protocoles plus sophistiqués, impliquant par exemple un micro-environnement tumoral plus complexe.De nombreux processus biologiques sont le résultat d'interactions entre de multiples types de cellules, en particulier au cours du développement. Le foie fœtal est le lieu de la maturation et de l'expansion du système hématopoïétique, mais on sait peu de choses sur sa structure et son organisation. De nouveaux protocoles expérimentaux ont été récemment mis au point pour imager cet organe et j'ai développé des outils pour interpréter et quantifier ces données, permettant la construction d'un "réseau jumeau" de chaque foie fœtal. Cette méthode permet de combiner les échelles unicellulaire et de l'organe dans une seule analyse, révélant l'accumulation de cellules myéloïdes autour des vaisseaux sanguins irriguant le foie fœtal aux derniers stades du développement de l'organe. À l'avenir, cette technique permettra d'analyser précisément les environnements de cellules d'intérêt de manière quantitative. Ceci pourrait à son tour nous aider à comprendre les étapes du développement de types cellulaires cruciaux tels que les cellules souches hématopoïétiques.Les interactions entre les bactéries et leur environnement sont essentielles pour comprendre l'émergence de comportements collectifs complexes tels que la formation de biofilms. Un mécanisme d'intérêt est celui de la rhéotaxie, par lequel le mouvement bactérien est entraîné par les gradients de la contrainte de cisaillement du fluide dans lequel les cellules se déplacent. J'ai développé une méthode pour calculer les équations semi-analytiques guidant le mouvement des bactéries dans la contrainte de cisaillement. Ces équations prédisent des comportements qui ne sont pas observés expérimentalement, mais la divergence est résolue une fois que la diffusion rotationnelle est prise en compte. Les résultats expérimentaux correspondent bien à la prédiction théorique : les bactéries dans les gouttelettes se séparent de manière asymétrique lorsqu'un cisaillement est généré dans le milieu.

La consommation d’alcool pendant la grossesse peut entraîner des conséquences néfastes sur le développement de l’enfant et mener aux troubles du spectre de l’alcoolisation fœtale (TSAF). Cependant on en connaît peu sur son effet durant la période de préimplantation. Cette période est reconnue comme étant sensible à l’environnement, majoritairement dû au fait qu’elle est caractérisée par la reprogrammation dynamique des profils de méthylation de l’ADN. L’alcool est reconnu pour altérer les mécanismes impliqués dans les processus de méthylation de l’ADN (e.g., cycle du folate, actions des DNMTs). Récemment, nous avons démontré qu’une exposition prénatale à l’alcool éthylique durant la préimplantation altère les futurs profils de méthylation de l’ADN du cerveau et augmente le nombre de défauts morphologiques à la mi-gestation. Il n’y a présentement aucun traitement pour les TSAF, mais certaines études suggèrent qu’une diète enrichie en donneurs de groupement méthyles (e.g., folate, choline), nécessaires aux réactions de méthylation, pourrait atténuer les effets d’une exposition prénatale à l’alcool. C’est pourquoi nous avons voulu déterminer si une diète enrichie en donneurs de groupements méthyles pouvait apporter une protection aux embryons ayant subi une exposition prénatale à l’alcool durant la préimplantation. Pour ce faire, une diète standard ou enrichie a été donné à des souris 4 semaines avant la gestation et pendant celle-ci. Les femelles gestantes ont reçu une dose d’alcool au jour E2.5, puis nous avons récolté les embryons à E10.5 et E18.5 pour évaluer les anomalies physiques et faire l’analyse de la méthylation des cerveaux antérieurs. Nos résultats démontrent que la diète enrichie prévient ou élimine un certain nombre de défauts morphologiques à E10.5 et E18.5. Nous avons aussi observé que la diète enrichie n’affectait pas la mise en place et le maintien de la méthylation et l’expression des gènes à empreintes durant le développement. La diète enrichie en donneurs de groupements méthyles aide donc à prévenir certains effets nuisibles de l’exposition prénatale à l’alcool survenant durant la préimplantation., Alcohol consumption during pregnancy can have a significant impact on the development of the child and lead to fetal alcohol spectrum disorders (FASD). Nonetheless, little is known about its effect during the pre-implantation period. However, we know that this period is very sensitive to the environment, mainly because of major reprogramming of DNA methylation patterns. Moreover, alcohol can alter the mechanisms involved in DNA methylation processes (e.g., folate cycle, actions of DNMTs). Recently, we have shown that prenatal alcohol exposure (PAE) during preimplantation alters future DNA methylation patterns of the young embryo brain and increases the number of morphological defects. There is currently no treatment for FASD, but studies suggest that a diet enriched in methyl donors (e.g., folate, choline), which are necessary for methylation reactions, may mitigate the effects of PAE. Therefore, we wanted to determine if a diet enriched in methyl group donors could provide protection to embryos against a PAE during preimplantation. To do so, a standard or enriched diet was given to mice 4 weeks before and during gestation. Pregnant females were exposed to alcohol at day E2.5, then we harvested embryos (E10.5, E18.5) to assess physical abnormalities and analyse forebrain methylation. Our results demonstrate that the enriched diet reduces or eliminate defects at E10.5 and E18.5. We also observed that the fortified diet did not affect the establishment and maintenance of methylation and expression of imprinted genes during development. Thus, our results show that a methyl enriched diet can prevent some of the adverse effects of prenatal alcohol exposure occurring during preimplantation.

Several steps of sturgeon somatic cell nuclear transfer (SCNT) have been recently established, but improvements are needed to make it a feasible tool to preserve the natural populations of this group of endangered species. The donor cell position inside the recipient egg seems to be crucial for its reprogramming; therefore by injecting multiple donor somatic cells instead of a single cell with a single manipulation, we increased the potential for embryo development. Using the Russian sturgeon Acipenser gueldenstaedtii as a multiple cell donor and sterlet Acipenser ruthenus as the non-enucleated egg recipient, we obtained higher proportion of eggs developing into embryos than previously reported with single-SCNT. Molecular data showed the production of a specimen (0.8%) contained only the donor genome with no contribution from the recipient, while two specimens (1.6%) showed both recipient and donor genome. These findings are the first report of donor DNA integration into a sturgeon embryo after interspecific cloning. In all, we provide evidence that cloning with the multiple donor somatic cells can be feasible in the future. Despite the fact that the sturgeon cloning faces limitations, to date it is the most promising technique for their preservation.

Reprogramming of cultured cells using Xenopus egg extract involves controlling four major steps: plasma membrane permeabilization, egg factors import into the nucleus, membrane resealing, and cell proliferation. Using propidium iodide to assess plasma membrane permeability, we established that 90% of the cultured fin cells were permeabilized by digitonin without any cell losses. We showed that egg extract at metaphase II stage was essential to maintain nuclear import function in the permeabilized cells, as assessed with a fusion GFP protein carrying the nuclear import signal NLS. Moreover, the Xenopus-egg-specific Lamin B3 was detected in 87% of the cell nuclei, suggesting that other egg extract reprogramming factors of similar size could successfully enter the nucleus. Lamin B3 labelling was maintained in most cells recovered 24 h after membrane resealing with calcium, and cells successfully resumed cell cycle in culture. In contrast, permeabilized cells that were not treated with egg extract failed to proliferate in culture and died, implying that egg extract provided factor essential to the survival of those cells. To conclude, fish fin cells were successfully primed for treatment with reprogramming factors, and egg extract was shown to play a major role in their survival and recovery after permeabilization.

Pluripotent stem cells (PSC) are characterized by their abilities to self-renew and to differentiate into any somatic cell type. Many kinds of PSC have been derived from different mammalian species and using various culture conditions. However, they self-renew in different states of pluripotency, each with its own specificities. To better understand those differences, from one PSC line to another, it is necessary to look at the root of pluripotency: the peri-implantation embryo. Pluripotent embryonic cells go through a pluripotency continuum, the characteristics of which change during development. The various processes involved in the regulation of pluripotency in vivo are shared by PSC in vitro. In the rabbit, different PSC lines are available and self-renew at different levels of pluripotency. Rabbit pluripotent embryonic cells are easily accessible since implantation occurs lately in rabbits. Moreover, a great number of embryos can be harvested from a single rabbit. Rabbits are also phylogenetically close to rodents and primates. Finally, rabbit early embryonic development does not have many unique features compared to other studied mammals. However, the characteristics of the different processes regulating pluripotency during the pre-implantation development are relatively poorly defined compared to those of mice and primates. To fill this gap, I performed several transcriptomic analyses on rabbit pre-implantation embryos, completed by molecular analysis of their metabolism and epigenome. Thanks to those data, I could decipher the first embryonic lineages segregations, as well as the processes regulating the pluripotency continuum in the rabbit embryo. Those results show that the rabbit continuum of pluripotency is fairly similar to that of other eutherian mammals, while the mouse one as diverged a lot. That information also offers new avenues for the study of pluripotency in vitro. Heterochromatin and the cell-cycle seem to be promising targets to manipulate rabbit PSC. I conducted preliminary experiences using inhibitors of enzymes promoting the formation of heterochromatin on cultured rabbit embryos. I also used the same inhibitors on a rabbit PSC line in vitro. In both cases, those inhibitors had an impact on the pluripotency state of the treated cells., Les cellules souches pluripotentes (PSC) sont caractérisées par leurs capacités à s’autorenouveler et à pouvoir se différencier dans tous les types cellulaires somatiques. De nombreuses lignées de PSC ont été dérivées chez les mammifères, dans différents milieux de culture et issues de différentes espèces. Elles s’autorenouvèlent cependant dans différents états de pluripotence, chacun ayant ces propres caractéristiques. Afin de mieux comprendre cette variabilité d’une lignée de PSC à l’autre, il est nécessaire de se pencher sur la source de la pluripotence : l’embryon péri-implantatoire. Les cellules pluripotentes embryonnaires progressent le long d’un continuum de pluripotence, dont les caractéristiques évoluent au cours du développement. Les nombreux processus impliqués dans la régulation de la pluripotence in vivo sont communs aux PSC in vitro. Chez le lapin, différentes lignées de PSC sont accessibles à différents niveaux de pluripotence. De plus, les cellules embryonnaires pluripotentes de lapin sont facilement accessibles du fait de l’implantation tardive chez le lapin et du grand nombre d’embryons produits par lapine. Enfin, le lapin est proche phylogénétiquement des rongeurs et des primates et son développement embryonnaire présente peu de particularités par rapport aux autres mammifères étudiés. Cependant, les caractéristiques des différents processus régulant la pluripotence au cours du développement embryonnaire pré-implantatoire du lapin sont relativement peu connus par rapport à ceux de la souris et des primates. C’est pourquoi j’ai réalisé différentes analyses transcriptomiques sur l’embryon préimplantatoire de lapin, complétées par des analyses moléculaires sur le métabolisme et l’épigénome. Grâce à ces données, j’ai pu décrire la ségrégation des premiers lignages embryonnaires, ainsi que les processus régulant le continuum de pluripotence dans l’embryon de lapin. Ces résultats montrent que le continuum de pluripotence chez le lapin est très similaire à celui des autres espèces de mammifères euthériens, là où celui de la souris possède de nombreuses particularités. Ces informations offrent également de nouvelles pistes dans l’étude de la pluripotence in vitro. L’hétérochromatine et le cycle cellulaire semblent ainsi être des cibles prometteuses dans la manipulation de PSC de lapin. J’ai pu réaliser des expériences préliminaires à l’aide d’inhibiteurs ciblant les enzymes favorisant la formation de l’hétérochromatine sur des embryons en culture. J’ai également utilisé ces inhibiteurs sur une lignée de PSC in vitro. Dans les deux cas, ces inhibiteurs ont permis de manipuler l’état de pluripotence des cellules traitées.

Concomitantly with the development of the embryo and extra-embryonic structures, initial chicken egg defenses are progressively altered, which suggests that alternative mechanisms appear to protect the embryo until hatching. To better understand the role of extra-embryonic fluids in the chicken egg defense during incubation, we analyzed the biochemical composition and antibacterial properties of the chicken amniotic and allantoic fluids. As for humans, the chicken amniotic fluid protects the embryo against mechanical shocks and microbial infections. Moreover, at the 12th day of incubation, the transfer of antibacterial molecules from the egg white increases the antibacterial potential of the chicken amniotic fluid, thus protecting the embryo until hatching, and probably after, all along its digestive tract, after oral absorption of the amniotic fluid. Some of these antibacterial proteins are specific to oviparous species and/or birds, which highlights the processes of evolution and adaptation of birds to their terrestrial environment. On the other hand, the antibacterial potential of the allantoic fluid still needs to be explored, but our study demonstrated the presence of active proteases, which could contribute to the digestion and recycling of embryonic metabolic wastes.; Avec le développement concomitant de l’embryon et des structures extra-embryonnaires, les défenses initiales de l’oeuf de poule s’altèrent, ce qui suggère la mise en place de systèmes relais pour protéger l’embryon jusqu’à son éclosion. Pour comprendre le rôle des fluides extra-embryonnaires dans cette fonction, nous avons analysé la composition et les propriétés biochimiques et antibactériennes des fluides amniotique et allantoïque de l’oeuf. Comme chez l’humain, le fluide amniotique chez la poule protège l’embryon contre les agressions physiques et microbiennes. De plus, nous avons démontré que le transfert des molécules antibactériennes du blanc au 12ème jour d’incubation augmente son potentiel antibactérien, assurant ainsi une protection de l’embryon jusqu’à l’éclosion, et probablement après, dans son tractus digestif, après l’ingestion du fluide amniotique. Les spécificités phylogénétiques de certaines des protéines identifiées suggèrent un processus d’adaptation des oiseaux à la flore microbienne terrestre. Pour le fluide allantoïque en revanche, nous n’avons pas pu confirmer son rôle antibactérien, mais nous avons mis en évidence la présence de protéases actives qui pourraient contribuer à la digestion et au recyclage des déchets métaboliques de l’embryon.

The common Midwife toad (Alytes obstetricans) is a species of amphibian in which parental care is performed exclusively by the male. Indeed, after mating, during which the male actively helps the female for the emission of the eggs, he attaches the clutch around the joints of his hind limbs and thus carries it throughout embryonic development. Amphibians are very sensitive to the abiotic environment, especially to hydric and thermal conditions. To avoid extreme temperatures, they can behaviourally thermoregulate, for example by selecting refuges with favourable microclimatic conditions. The common Midwife toad has shown a selection of their refuges based on their hydric and thermal properties. The early stages of development are particularly sensitive to temperature. Parents can then carry out parental care to limit the effects. A paternal phenological effect has been observed in common Midwife toad, whose males favour higher temperatures when they carry eggs. Parental care is costly for adults, however. The common Midwife toad exhibited decreased locomotion performances during egg carrying, which could lead to decreased fitness. In addition, parental care strongly influences the development of young. The thermal environment encountered during the embryonic stage, and therefore during the period of parental care in the common Midwife toad, had both short-term and persistent effects on the phenology. The thermal environment encountered during the larval stage can also be decisive. In the common Midwife toad, the postnatal thermal environment induced a switch to multi-year development during development at 16 ° C, with overwintering at the tadpole stage, whereas it was annual during development at 20 ° C and 24 ° C. The postnatal thermal environment has also involved morphological, physiological, and behavioural changes. Finally, an involvement of physiology, and in particular heart rate, has been observed throughout the embryonic and larval development of the young., L’Alyte accoucheur (Alytes obstetricans) est une espèce d’amphibien où les soins parentaux sont réalisés par le mâle exclusivement. En effet, après l’accouplement, durant lequel le mâle participe activement à l’émission des oeufs, il attache sa ponte autour des articulations de ses membres postérieurs et la porte ainsi pendant tout le développement embryonnaire. Les amphibiens sont très sensibles à l’environnement abiotique, notamment aux conditions hydriques et thermiques. Pour éviter les températures extrêmes, ils peuvent thermoréguler comportementalement, par exemple en sélectionnant des refuges aux conditions microclimatiques favorables. Les Alytes accoucheurs ont montré une sélection de leurs refuges sur la base de leurs propriétés hydriques et thermiques. Les stades de développement précoces sont particulièrement sensibles à la température. Les parents peuvent alors réaliser des comportements parentaux pour en limiter les effets. Un effet phénologique paternel a été observé chez les Alytes accoucheurs, dont les mâles favorisent des températures plus élevées lorsqu’ils portent des oeufs. Les comportements parentaux sont cependant coûteux pour les adultes. Les Alytes accoucheurs ont présenté des performances de locomotion diminuées pendant le port des oeufs, ce qui pourrait induire une diminution de l’aptitude. De plus, les comportements parentaux influencent fortement le développement des jeunes. L’environnement thermique rencontré pendant le stade embryonnaire, et donc pendant la période de soins parentaux chez l’Alyte accoucheur, a eu des effets à court terme et des effets persistants sur la phénologie. L’environnement thermique rencontré pendant le stade larvaire peut également être déterminant. Chez l’Alyte accoucheur, l’environnement thermique postnatal a induit un basculement vers un développement pluriannuel lors d’un développement à 16°C, avec un hivernage au stade têtard, alors qu’il a été annuel lors d’un développement à 20°C et 24°C. L’environnement thermique postnatal a également impliqué des modifications morphologiques, physiologiques et comportementales. Enfin, une implication de la physiologie, et notamment de la fréquence cardiaque, a été observée tout au long du développement embryonnaire et larvaire des jeunes.

The integrated innate immune features of the calcareous egg and its contents are a critical underpinning of the remarkable evolutionary success of the Aves clade. Beginning at the time of laying, the initial protective structures of the egg, i.e., the biomineralized eggshell, egg-white antimicrobial peptides, and vitelline membrane, are rapidly and dramatically altered during embryonic development. The embryo-generated extra-embryonic tissues (chorioallantoic/amniotic membranes, yolk sac, and associated chambers) are all critical to counteract degradation of primary egg defenses during development. With a focus on the chick embryo (Gallus gallus domesticus), this review describes the progressive transformation of egg innate immunity by embryo-generated structures and mechanisms over the 21-day course of egg incubation, and also discusses the critical interplay between autonomous development and maternal anticipation.

The deubiquitylation module of SAGA is required for the removal of mono-ubiquitin from histone H2B. Here we investigated the role of SAGA deubiquitinase module in transcriptional regulation. We found that Atxn7l3 is essential for embryonic development. To get better insight into ATXN7L3, we carried out mESC differentiation assays. Our results showed that ATXN7L3 promoted the differentiation of cardiomyocyte cells, but not ectoderm neural precursor. Thereby, ATXN7L3 might function in a tissue-specific manner. To understand the molecular mechanisms underlying these phenotypes, we performed transcriptomic and ChIP-Seq analyses from Atxn7l3-/- mESC. Unexpectedly, although H2Bub1 levels significantly increased in the gene body of every expressed gene, the genome-wide occupancy of Pol II was only modestly changed in Atxn7l3-/- mESCs. Thus, H2Bub1 deubiquitination did not directly regulate global Pol II transcription., L’ensemble des protéines du DUBm de SAGA sont requises pour le clivage de molécules d’histones H2Bub1, nous étudions le rôle du DUBm de SAGA dans la régulation de la transcription. Nous avons démontré que la protéine ATXN7L3 est essentielle pour le développement embryonnaire. Pour avoir un meilleur aperçu de la fonction d’ATXN7L3, nous avons effectué des expériences de différentiation de mESC en l’absence d’ATXN7L3. Nous avons observé qu’ATXN7L3 promeut la différenciation des mESC en cardiomyocytes, mais pas en précurseurs de l’ectoderme neural. De ce fait, ATNX7L3 pourrait fonctionner de manière tissue-spécifique. En outre, nous avons effectué des analyses transcriptionnelles et ChIP-seq de mESC Atxn7l3-/-. De façon inattendue, les niveaux de H2Bub1 sont significativement plus élevés dans le corps de l’ensemble des gènes transcrits en l’absence d’ATXN7L3. Cependant, l’occupation de l’ARN polymérase II sur l’ensemble de ces gènes ne varie que modestement dans ces cellules Atxn7l3-/-. Ainsi, la déubiquitination de H2Bub1 ne régule pas directement la transcription par l’ARN polymérase II de l’ensemble du génome.

The deubiquitylation module of SAGA is required for the removal of mono-ubiquitin from histone H2B. Here we investigated the role of SAGA deubiquitinase module in transcriptional regulation. We found that Atxn7l3 is essential for embryonic development. To get better insight into ATXN7L3, we carried out mESC differentiation assays. Our results showed that ATXN7L3 promoted the differentiation of cardiomyocyte cells, but not ectoderm neural precursor. Thereby, ATXN7L3 might function in a tissue-specific manner. To understand the molecular mechanisms underlying these phenotypes, we performed transcriptomic and ChIP-Seq analyses from Atxn7l3-/- mESC. Unexpectedly, although H2Bub1 levels significantly increased in the gene body of every expressed gene, the genome-wide occupancy of Pol II was only modestly changed in Atxn7l3-/- mESCs. Thus, H2Bub1 deubiquitination did not directly regulate global Pol II transcription., L’ensemble des protéines du DUBm de SAGA sont requises pour le clivage de molécules d’histones H2Bub1, nous étudions le rôle du DUBm de SAGA dans la régulation de la transcription. Nous avons démontré que la protéine ATXN7L3 est essentielle pour le développement embryonnaire. Pour avoir un meilleur aperçu de la fonction d’ATXN7L3, nous avons effectué des expériences de différentiation de mESC en l’absence d’ATXN7L3. Nous avons observé qu’ATXN7L3 promeut la différenciation des mESC en cardiomyocytes, mais pas en précurseurs de l’ectoderme neural. De ce fait, ATNX7L3 pourrait fonctionner de manière tissue-spécifique. En outre, nous avons effectué des analyses transcriptionnelles et ChIP-seq de mESC Atxn7l3-/-. De façon inattendue, les niveaux de H2Bub1 sont significativement plus élevés dans le corps de l’ensemble des gènes transcrits en l’absence d’ATXN7L3. Cependant, l’occupation de l’ARN polymérase II sur l’ensemble de ces gènes ne varie que modestement dans ces cellules Atxn7l3-/-. Ainsi, la déubiquitination de H2Bub1 ne régule pas directement la transcription par l’ARN polymérase II de l’ensemble du génome.

Cells are the basic building blocks of all living organisms. All living organisms share life processes such as growth and development, movement, nutrition, excretion, reproduction, respiration and response to the environment. In cell biology research, understanding cells structure and function is essential for developing and testing new drugs. In addition, cell biology research provides a powerful tool to study embryo development. Furthermore, it helps the scientific research community to understand the effects of mutations and various diseases. Time-Lapse Fluorescence Microscopy (TLFM) is one of the most appreciated imaging techniques which can be used in live-cell imaging experiments to quantify various characteristics of cellular processes, i.e., cell survival, proliferation, migration, and differentiation. In TLFM imaging, not only spatial information is acquired, but also temporal information obtained by repeating imaging of a labeled sample at specific time points, as well as spectral information, that produces up to five-dimensional (X, Y, Z + Time + Channel) images. Typically, the generated datasets consist of several (hundreds or thousands) images, each containing hundreds to thousands of objects to be analyzed. To perform high-throughput quantification of cellular processes, nuclei segmentation and tracking should be performed in an automated manner. Nevertheless, nuclei segmentation and tracking are challenging tasks due to embedded noise, intensity inhomogeneity, shape variation as well as a weak boundary of nuclei. Although several nuclei segmentation approaches have been reported in the literature, dealing with embedded noise remains the most challenging part of any segmentation algorithm. We propose a novel 3D denoising algorithm, based on unsupervised dictionary learning and sparse representation, that can both enhance very faint and noisy nuclei, in addition, it simultaneously detects nuclei position accurately. Furthermore, our method is based on a limited number of parameters, with only one being critical, which is the approximate size of the objects of interest. The framework of the proposed method comprises image denoising, nuclei detection, and segmentation. In the denoising step, an initial dictionary is constructed by selecting random patches from the raw image then an iterative technique is implemented to update the dictionary and obtain the final one which is less noisy. Next, a detection map, based on the dictionary coefficients used to denoise the image, is used to detect marker points. Afterward, a thresholding-based approach is proposed to get the segmentation mask. Finally, a marker-controlled watershed approach is used to get the final nuclei segmentation result. We generate 3D synthetic images to study the effect of the few parameters of our method on cell nuclei detection and segmentation, and to understand the overall mechanism for selecting and tuning the significant parameters of the several datasets. These synthetic images have low contrast and low signal to noise ratio. Furthermore, they include touching spheres where these conditions simulate the same characteristics exist in the real datasets. The proposed framework shows that integrating our denoising method along with classical segmentation method works properly in the context of the most challenging cases. To evaluate the performance of the proposed method, two datasets from the cell tracking challenge are extensively tested. Across all datasets, the proposed method achieved very promising results with 96.96% recall for the C.elegans dataset. Besides, in the Drosophila dataset, our method achieved very high recall (99.3%).; Les cellules sont les éléments constitutifs de base de tout organisme vivant. Tous les organismes vivants partagent des processus vitaux tels que croissance, développement, mouvement, nutrition, excrétion, reproduction, respiration et réaction à l’environnement. En biologie cellulaire, comprendre la structure et fonction des cellules est essentielle pour développer et tester de nouveaux médicaments. Par ailleurs, cela aide aussi à l’étude du développement embryonnaire. Enfin, cela permet aux chercheurs de mieux comprendre les effets des mutations et de diverses maladies. La vidéo-microscopie (Time Lapse Fluorescence Microscopie) est l’une des techniques d’imagerie les plus utilisées afin de quantifier diverses caractéristiques des processus cellulaires, à savoir la survie, la prolifération, la migration ou la différenciation cellulaire. En vidéo-microscopie, non seulement les informations spatiales sont disponibles, mais aussi les informations temporelles en réitérant l’acquisition de l’échantillon, et enfin les informations spectrales, ce qui génère des données dites « cinq dimensions » (X, Y, Z + temps + canal). En règle générale, les jeux de données générés consistent en plusieurs (centaines ou milliers) d’images, chacune contenant des centaines ou milliers d’objets à analyser. Pour effectuer une quantification précise et à haut débit des processus cellulaires, les étapes de segmentation et de suivi des noyaux cellulaires doivent être effectuées de manière automatisée. Cependant, la segmentation et le suivi des noyaux sont des tâches difficiles dû notamment au bruit intrinsèque dans les images, à l’inhomogénéité de l’intensité, au changement de forme des noyaux ainsi qu’à un faible contraste des noyaux. Bien que plusieurs approches de segmentation des noyaux aient été rapportées dans la littérature, le fait de traiter le bruit intrinsèque reste la partie la plus difficile de tout algorithme de segmentation. Nous proposons un nouvel algorithme de débruitage 3D, basé sur l’apprentissage d’un dictionnaire non supervisé et une représentation parcimonieuse, qui à la fois améliore la visualisation des noyaux très peu contrastés et bruités, mais aussi détecte simultanément la position de ces noyaux avec précision. De plus, notre méthode possède un nombre limité de paramètres, un seul étant critique, à savoir la taille approximative des objets à traiter. Le cadre de la méthode proposée comprend le débruitage d’images, la détection des noyaux et leur segmentation. Dans l’étape de débruitage, un dictionnaire initial est construit en sélectionnant des régions (patches) aléatoires dans l’image originale, puis une technique itérative est implémentée pour mettre à jour ce dictionnaire afin d’obtenir un dictionnaire dont les éléments mis à jour présentent un meilleur contraste. Ensuite, une carte de détection, basée sur le calcul des coefficients du dictionnaire utilisés pour débruiter l’image, est utilisée pour détecter le centre approximatif des noyaux qui serviront de marqueurs pour la segmentation. Ensuite, une approche basée sur le seuillage est proposée pour obtenir le masque de segmentation des noyaux. Finalement, une approche de segmentation par partage des eaux contrôlée par les marqueurs est utilisée pour obtenir le résultat final de segmentation des noyaux. Nous avons créé des images synthétiques 3D afin d’étudier l’effet des paramètres de notre méthode sur la détection et la segmentation des noyaux, et pour comprendre le mécanisme global de sélection et de réglage de ces paramètres significatifs sur différents jeux de données.

In humans, the success of fertilization and embryonic development leading to the birth of ahealthy child lies mainly in the quality of reproductive cells. Oxidative damage to sperm DNAis a major cause of male infertility. In order to provide optimal and appropriate therapeuticmanagement, I first developed and validated a diagnostic test for sperm DNA oxidation byimmunodetection of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG), a major adduct of nuclearoxidation. This thesis work determined, for the first time, a threshold for the oxidation ofsperm DNA in relation to conventional sperm parameters. In a second step, I focused on themost common chromatin and sperm DNA disorders in male infertility, namely chromatincondensation anomalies, sperm DNA fragmentation and oxidation. A correlation betweenDNA oxidation, particularly the mean fluorescence intensity, and the percentage offragmented sperm was found. To objectify the impact of this nuclear sperm damage inclinical practice, I studied, after cryopreservation, the beneficial effects of hypotaurinesupplementation to the selection and freeze/thaw media of seed samples. A decrease incryocapacitation and the percentage of fragmented and decondensed sperm has beenfound, as well as an improvement in sperm vitality and progressive mobility. Finally, sincethe ultimate goal of the sperm cells is to participate in the genesis of a new individual, I haveshown that the fragmentation and oxidation of sperm DNA has an impact at key moments inthe kinetics of early embryonic development following ICSI without modifying the obtainingof good quality blastocysts. This thesis work has led to a better understanding of thepathophysiology of male infertility and the identification of new sperm biomarkers related tonormal embryonic development., Chez l’Homme, les succès de la fécondation et d’un développement embryonnaire aboutissant à la naissance d’un enfant en bonne santé résident principalement dans la qualité des cellules reproductrices. Les dommages oxydants de l’ADN spermatique sont une cause majeure d’infertilité masculine. Afin de permettre une prise en charge thérapeutique optimale et adaptée, j’ai tout d’abord mis au point et validé un test diagnostique de l’oxydation de l’ADN spermatique par immunodétection du 8-hydroxy-2'-desoxyguanosine (8-OHdG), adduit majeur de l'oxydation nucléaire. Ce travail de thèse a déterminé, pour la première fois, un seuil d’oxydation de l’ADN spermatique en relation avec les paramètres conventionnels spermatiques. Dans un second temps, je me suis focalisée sur les atteintes de la chromatine et de l’ADN spermatique les plus fréquentes en cas d’infertilité masculine, à savoir les anomalies de condensation de la chromatine, la fragmentation et l’oxydation de l’ADN spermatique. Une corrélation entre l’oxydation de l’ADN, tout particulièrement la moyenne d’intensité de fluorescence, et le pourcentage de spermatozoïde fragmenté a été mise en évidence. Pour objectiver l’impact de ces dommages nucléaires spermatiques en pratique clinique, j’ai étudié, après cryopréservation, les effets bénéfiques d’une supplémentation en hypotaurine des milieux de sélection et de congélation/décongélation des échantillons. Une baisse de la cryocapacitation et du pourcentage de spermatozoïde fragmenté et décondensé ont été retrouvées ainsi qu’une amélioration de la vitalité et de la mobilité progressive spermatique. Enfin, comme le spermatozoïde a pour but ultime de participer à la genèse d’un nouvel individu, j’ai mis en évidence que la fragmentation et l’oxydation de l’ADN spermatique avaient un impact à des moments clés de la cinétique du développement embryonnaire précoce suite à une ICSI sans pour autant modifier l’obtention de blastocystes de bonne qualité. Ce travail de thèse a permis de mieux comprendre la physiopathologie de l’infertilité masculine et de mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs spermatiques en lien avec un développement embryonnaire normal.

Les usages et détournements de la théorie darwinienne furent nombreux en France dès les années 1860. Les libres penseurs s’en firent étendard quand les meilleurs naturalistes du Muséum de Paris l’accusaient communément de « galimatias » ou de « conte de fées ». Dans ce contexte hostile, Darwin trouva son meilleur défenseur et son principal adversaire en la personne d’Armand de Quatrefages, professeur d’anthropologie de 1855 à 1892. Quatrefages a beaucoup écrit sur Darwin, vantant son « ouvrage remarquable » et étendant à sa propre conception des races le principe général de la sélection naturelle. Cependant, il récusait l’hypothèse des origines animales de l’homme. Il développa la doctrine adverse des « oscillations raciales » fondées sur l’action des milieux, les arrêts ou les excès de développement embryonnaire. Cette thèse matricielle fut consignée avant lui par Étienne Serres et Isidore Geoffroy Saint-Hilaire. Mais il lui donna la meilleure audience sous le nom de « théorie évolutive humaine ». Toujours créationniste, Quatrefages mit ainsi en accord, aux yeux de ses critiques, sa raison et sa foi. Darwin’s theory of evolution has been used and misused in numerous cases in France ever since the 1860s. The free thinkers adopted it as their banner, whereas it was deemed a “twaddle” or a “fairy tale” by the best naturalists of the Muséum of Paris. In this hostile context, Darwin found his best defender alongside his main opponent in Armand de Quatrefages, Professor of anthropology from 1855 till 1892. Quatrefages wrote a lot on Darwin, praising his “remarkable work” and widening the general principle of natural selection and struggle for life to his own conception of races. However, he rejected the hypothesis of the animal origins of Man. He developed the opposite doctrine of “racial oscillations” based on the influence of the environment, the “arrests” or the “excesses” of embryonic development. This matrix thesis was recorded before him by Étienne Serres and Isidore Geoffroy Saint-Hilaire. But he gave it the best audience under the name of “human evolution theory”. Still a creationist, Quatrefages thus matched together his reason and his faith to the eyes of his critics.

Aquaculture has developed rapidly in recent years and has become one of the primary contributors to food supply worldwide. However, the immense fishing pressure on wild and commercial-farmed populations has caused population depletion. Furthermore, limited juvenile crayfish production for aquaculture and suboptimal feeding strategies (such as high inputs of artificial diets) has hindered the development of sustainable aquaculture industry. Improving fisheries management is now necessary, based on a better scientific knowledge of population dynamics, reproductive ecology, and optimal feeding strategies, in particular by determining optimal environmental parameters for reproduction and refining artificial diets inputs. In this thesis, we focused on three main questions. First (1) what is the population and reproduction dynamics of adult crayfish living in commercial ponds and how should we adjust the aquaculture management? Second (2) what are the optimal temperatures for artificial reproduction and embryonic development? And third (3) what are the optimal levels of feeding and protein composition of artificial food for crayfish growth? For the first question (1), we studied the population dynamics and reproductive pattern of red swamp crayfish (Procambarus clarkii) by estimating growth, mortality rates, and exploitation rate of a commercial population, as well their reproductive parameters (GSI, HSI, ovarian development, and fecundity). Results showed that spawning activities took place from September to November, with a mean fecundity of 429 ± 9 eggs per female, and two recruitments yearly. There were five growth cohorts and male P. clarkii were overexploited. We thus suggest reducing fishing intensity on immature crayfish and avoid sex selection during the reproductive period to improve the overall sustainability of commercial P. clarkii populations. For the second question (2), we experimentally tested the effects of water temperature to improve reproductive outputs and embryonic development. Results showed that manipulating water temperature was an effective way to induce spawning in females and optimize embryonic development to improve juvenile production, with optimal temperatures of 21 - 25°C and 25°C, respectively. We also built a temperature-dependent developmental model for P. clarkii, D (developmental time, days) = 3140837(T-2.03)-3.76. Finally, for the third question (3), we experimentally tested the effects of five different feeding levels and reduced dietary protein levels (2 experiments) on growth performance and muscle composition of juvenile P. clarkii with natural food Hydrilla verticillata. Results showed that reducing the amounts of an artificial diet to 60% satiation and/or reducing the dietary protein level of the artificial diet to a level of 26% did not significantly affect the growth performance and muscle composition of P. clarkii. Stable isotope analysis suggested that crayfish switched diets to easily available H. verticillata when feeding levels or dietary protein levels decreased. This thesis thus explored new alternatives to traditional crayfish aquaculture by adjusting fishing effort and season, manipulating crayfish culture temperature, and refining feeding strategies to reduce production costs while improving the productivity and sustainability of crayfish aquaculture.; L'aquaculture s'est développée rapidement ces dernières années et est devenue l'un des principaux contributeurs à l'approvisionnement alimentaire dans le monde. En effet, l'immense pression de pêche exercée sur les populations sauvages et d'élevage entraîne progressivement l'épuisement des stocks. Le nombre limité de larves fournies pour l'aquaculture et des stratégies d'alimentation non optimales (par exemple un apport élevé en aliments artificiels) entravent le développement d'une industrie aquacole efficace. Une gestion plus durable de l'aquaculture nécessite maintenant une amélioration de la gestion des pêches, de la reproduction artificielle et des stratégies d'alimentation. Dans cette thèse, nous nous sommes intéressés à trois questions principales : (1) quelle est la dynamique de population et l'écologie de la reproduction des écrevisse de Louisiane en bassins articifiels ? (2) Quelles sont les temperatures optimales pour permettre une reproduction artificielle et un développement embryonnaire optimal chez cette espèce ? (3) Quelle est la quantité et la composition alimentation optimale en bassin pour assurer une bonne croissance des juvéniles en générant un minimum de déchets ? Cette thèse repose sur plusieurs étapes et approches expérimentales. Pour la question (1) nous avons étudié la dynamique de population et lareproduction de l'écrevisse de Louisiane (Procambarus clarkii) en évaluant la croissance, les taux de mortalité et le taux d'exploitation de populations cultivées en bassins commerciaux, ainsi que différents indices reproducteurs (GSI, HSI, développement ovarien et fécondité). Les résultats montrent quela ponte de P. clarkii se déroule en Chine de septembre à novembre, avec une fécondité moyenne de 429 ± 9 œufs par femelle, avec deux recrutements par an. Il y avait cinq cohortes de croissance at les résultats montrent que les mâles P. clarkii étaient surexploités. Nous suggérons donc de réduire l'intensité de la pêche sur les écrevisses immatures et d'éviter la sélection des mâles en période de reproduction afin d'améliorer la durabilité globale des populations commerciales de P. clarkii. Pour la question (2), nous avons testé les effets de la température de l'eau sur les performances de reproduction et de développement embryonnaire de P. clarkii. Les résultats montrent que la manipulation de la température de l'eau est un moyen efficace d'induire le frai chez les femelles et d'optimiser le développement embryonnaire pour améliorer la production larvaire, avec des températures optimales de 21 - 25°C et 25°C, respectivement. Nous avons élaboré un modèle de développement dépendant de la température pour P. clarkii, exprimé en D (durée du développement, jours) = 3140837 (T-2.03) -3.76. Enfin, pour la question (3), nous avons testé les effets de la réduction des niveaux d'alimentation et des niveaux de protéines sur les performances de croissance et la composition musculaire de P. clarkii juvéniles ayant accès à des aliments naturels tels que les macrophytres Hydrilla verticillata dans des mares commerciales Les résultats montrent que la réduction des quantités de nourriture artificielle à 60% de satiété ou à 26% de protéines n'affectait pas de manière significative les performances de croissance et la composition musculaire des écrevisses. En effet, une analyse des isotopes stables suggère que les écrevisses compensent la réduction de nourriture artificielle ou de protéines en consommant plus de macrophytes naturels H. verticillata facilement disponibles. Cette thèse propose donc de nouvelles alternatives à la reproduction artificielle traditionnelle en ajustant le prélèvement d'adultes, en manipulant la température de culture et en affinant les stratégies d'alimentation, afin de réduire les coûts de production tout en améliorant la productivité et la durabilité de l'aquaculture d'écrevisses.

Aquaculture has developed rapidly in recent years and has become one of the primary contributors to food supply worldwide. However, the immense fishing pressure on wild and commercial-farmed populations has caused population depletion. Furthermore, limited juvenile crayfish production for aquaculture and suboptimal feeding strategies (such as high inputs of artificial diets) has hindered the development of sustainable aquaculture industry. Improving fisheries management is now necessary, based on a better scientific knowledge of population dynamics, reproductive ecology, and optimal feeding strategies, in particular by determining optimal environmental parameters for reproduction and refining artificial diets inputs. In this thesis, we focused on three main questions. First (1) what is the population and reproduction dynamics of adult crayfish living in commercial ponds and how should we adjust the aquaculture management? Second (2) what are the optimal temperatures for artificial reproduction and embryonic development? And third (3) what are the optimal levels of feeding and protein composition of artificial food for crayfish growth? For the first question (1), we studied the population dynamics and reproductive pattern of red swamp crayfish (Procambarus clarkii) by estimating growth, mortality rates, and exploitation rate of a commercial population, as well their reproductive parameters (GSI, HSI, ovarian development, and fecundity). Results showed that spawning activities took place from September to November, with a mean fecundity of 429 ± 9 eggs per female, and two recruitments yearly. There were five growth cohorts and male P. clarkii were overexploited. We thus suggest reducing fishing intensity on immature crayfish and avoid sex selection during the reproductive period to improve the overall sustainability of commercial P. clarkii populations. For the second question (2), we experimentally tested the effects of water temperature to improve reproductive outputs and embryonic development. Results showed that manipulating water temperature was an effective way to induce spawning in females and optimize embryonic development to improve juvenile production, with optimal temperatures of 21 - 25°C and 25°C, respectively. We also built a temperature-dependent developmental model for P. clarkii, D (developmental time, days) = 3140837(T-2.03)-3.76. Finally, for the third question (3), we experimentally tested the effects of five different feeding levels and reduced dietary protein levels (2 experiments) on growth performance and muscle composition of juvenile P. clarkii with natural food Hydrilla verticillata. Results showed that reducing the amounts of an artificial diet to 60% satiation and/or reducing the dietary protein level of the artificial diet to a level of 26% did not significantly affect the growth performance and muscle composition of P. clarkii. Stable isotope analysis suggested that crayfish switched diets to easily available H. verticillata when feeding levels or dietary protein levels decreased. This thesis thus explored new alternatives to traditional crayfish aquaculture by adjusting fishing effort and season, manipulating crayfish culture temperature, and refining feeding strategies to reduce production costs while improving the productivity and sustainability of crayfish aquaculture.; L'aquaculture s'est développée rapidement ces dernières années et est devenue l'un des principaux contributeurs à l'approvisionnement alimentaire dans le monde. En effet, l'immense pression de pêche exercée sur les populations sauvages et d'élevage entraîne progressivement l'épuisement des stocks. Le nombre limité de larves fournies pour l'aquaculture et des stratégies d'alimentation non optimales (par exemple un apport élevé en aliments artificiels) entravent le développement d'une industrie aquacole efficace. Une gestion plus durable de l'aquaculture nécessite maintenant une amélioration de la gestion des pêches, de la reproduction artificielle et des stratégies d'alimentation. Dans cette thèse, nous nous sommes intéressés à trois questions principales : (1) quelle est la dynamique de population et l'écologie de la reproduction des écrevisse de Louisiane en bassins articifiels ? (2) Quelles sont les temperatures optimales pour permettre une reproduction artificielle et un développement embryonnaire optimal chez cette espèce ? (3) Quelle est la quantité et la composition alimentation optimale en bassin pour assurer une bonne croissance des juvéniles en générant un minimum de déchets ? Cette thèse repose sur plusieurs étapes et approches expérimentales. Pour la question (1) nous avons étudié la dynamique de population et lareproduction de l'écrevisse de Louisiane (Procambarus clarkii) en évaluant la croissance, les taux de mortalité et le taux d'exploitation de populations cultivées en bassins commerciaux, ainsi que différents indices reproducteurs (GSI, HSI, développement ovarien et fécondité). Les résultats montrent quela ponte de P. clarkii se déroule en Chine de septembre à novembre, avec une fécondité moyenne de 429 ± 9 œufs par femelle, avec deux recrutements par an. Il y avait cinq cohortes de croissance at les résultats montrent que les mâles P. clarkii étaient surexploités. Nous suggérons donc de réduire l'intensité de la pêche sur les écrevisses immatures et d'éviter la sélection des mâles en période de reproduction afin d'améliorer la durabilité globale des populations commerciales de P. clarkii. Pour la question (2), nous avons testé les effets de la température de l'eau sur les performances de reproduction et de développement embryonnaire de P. clarkii. Les résultats montrent que la manipulation de la température de l'eau est un moyen efficace d'induire le frai chez les femelles et d'optimiser le développement embryonnaire pour améliorer la production larvaire, avec des températures optimales de 21 - 25°C et 25°C, respectivement. Nous avons élaboré un modèle de développement dépendant de la température pour P. clarkii, exprimé en D (durée du développement, jours) = 3140837 (T-2.03) -3.76. Enfin, pour la question (3), nous avons testé les effets de la réduction des niveaux d'alimentation et des niveaux de protéines sur les performances de croissance et la composition musculaire de P. clarkii juvéniles ayant accès à des aliments naturels tels que les macrophytres Hydrilla verticillata dans des mares commerciales Les résultats montrent que la réduction des quantités de nourriture artificielle à 60% de satiété ou à 26% de protéines n'affectait pas de manière significative les performances de croissance et la composition musculaire des écrevisses. En effet, une analyse des isotopes stables suggère que les écrevisses compensent la réduction de nourriture artificielle ou de protéines en consommant plus de macrophytes naturels H. verticillata facilement disponibles. Cette thèse propose donc de nouvelles alternatives à la reproduction artificielle traditionnelle en ajustant le prélèvement d'adultes, en manipulant la température de culture et en affinant les stratégies d'alimentation, afin de réduire les coûts de production tout en améliorant la productivité et la durabilité de l'aquaculture d'écrevisses.

During development, cell differentiation frequently occurs upon signaling from gradients of molecules, called morphogens. A simple paradigm to study morphogens is the Bicoid gradient, which determines antero-posterior patterning in fruit fly embryos. This transcription factor allows the rapid expression of its major target gene hunchback, in an anterior domain with a sharp boundary. Using the MS2 system to fluorescently tag RNA in living embryos, we were able to show that the ongoing transcription process at the hunchback promoter is bursty Surprisingly, it takes only 3 minutes, from the first hints of transcription at the anterior to reach steady state with the setting of the sharp expression border in the middle of the embryo. To better understand the role of transcription factors other than Bicoid in this process, I used a two-pronged strategy involving synthetic MS2 reporters combined with the analysis of the hunchback MS2 reporter in various mutant backgrounds. The synthetic reporter approach, indicate that Bicoid is able to activate transcription on its own when bound to the promoter but in a stochastic manner. The binding of Hunchback to the Bicoid-dependent promoter reduces this stochasticity while Caudal might act as a posterior repressor gradient. Altogether, this work provide a new light on the mechanisms insuring a precise transcriptional response downstream of Bicoid., La différenciation des cellules est souvent déclenchée par les gradients de molécules appelées morphogènes. Un paradigme simple pour l’étude des morphogènes est le gradient de Bicoid, qui détermine l’identité cellulaire le long de l’axe antéro-postérieur chez la mouche du vinaigre. Ce facteur de transcription permet l'expression rapide de son principal gène cible, hunchback, dans la moitié antérieure de l’embryon dans un domaine d’expression avec une bordure très franche. En utilisant le système MS2 rendant fluorescents des ARN dans les embryons vivants, nous avons montré que la transcription au promoteur d’hunchback est « bursty ». De manière surprenante, il suffit de 3 minutes, après la première détection de transcription à l’antérieur, pour que la bordure franche du domaine d’expression soit précisément positionnée au milieu de l’embryon. Afin de mieux comprendre le rôle des facteurs de transcription autres que Bicoid dans ce processus, j’ai utilisé une double stratégie impliquant des gènes rapporteurs MS2 synthétiques combinés à l’analyse du gène rapporteur hunchback MS2 dans des contextes génétiques mutants. L’analyse des gènes rapporteurs synthétiques indique que Bicoid est capable d’activer la transcription à elle seule en se fixant sur le promoteur mais de manière stochastique. La fixation d’Hunchback sur un promoteur régulé par Bicoid réduit cette stochasticité alors que Caudal agirait comme un gradient postérieur répresseur. L’ensemble de ces travaux apporte un éclairage nouveau sur les mécanismes assurant une réponse transcriptionnelle précise en aval du morphogène Bicoid.

International audience; Cryopreservation of genetic resources is of major interest for the security of biodiversity and the sustainability of the agronomic industry. Cryopreservation of somatic cells is one means of preserving the genome of both parents, but regeneration of functional breeders requires the mastering of somatic cell NT (SCNT). In mammals, SCNT consists of injecting the somatic nuclei into enucleated recipient oocytes to obtain clones that bear the genome of the donor. Cloning in fish presents some advantages over cloning in mammals: oocytes are produced by the hundreds, and development is external. Moreover, embryonic genome activation takes place after 10 mitoses only. These features are favourable to a better understanding of cellular reprogramming of the somatic cell. Nonenucleated oocytes are often used for SCNT, which allows the production of 2n clones bearing only the donor genome when the maternal chromatin is spontaneously removed by an unknown mechanism (25% of cases). This ability can help us understand the fate of the maternal chromatin and the role of its surrounding factors on the cellular behaviour of the somatic cell during the first developmental steps of embryonic development: meiosis resumption (MR) and mitosis. In this study, fin somatic cells and mature oocytes were obtained from a 2-year-old goldfish (Carassius auratus). For SCNT, the whole fin cell was injected into the sperm entry site, and the oocyte was activated by water contact after 30min to begin the development. Somatic and maternal chromatin behaviour during MR and early mitosis were characterised by immunofluorescence (Hoechst/Vybrant labelling for chromatin identification and α-tubulin for spindle organisation). Variability in chromatin condensation was observed after the somatic cell injection before the activation. Clone analysis (n=16) revealed that some of them presented a condensed somatic nuclei (71%) and others presented a decondensed nuclei (29%). After activation, most clones underwent normal polar body extrusion of the maternal chromatin (66%, n=69/95 clones v. 96%, n=96/100 controls oocytes) without extrusion of a somatic polar body. Afterward, clones that presented a first symmetric division (n=14/35) were analysed at the 2-cells stage and compared with fertilized embryos (n=7). The maternal chromatin was observed as fragmented on the cleavage furrow (79%), where it cannot contribute to the development. Spindle defects were observed in 50% of clone cells (v. 0% in controls), such as multicentrosomal spindles, chromosome misalignment, abnormal segregation, and DNA fragmentation. To conclude, those clone (2n or 3n) defects are probably due to the chromatin condensation observed before activation. The fish oocyte volume did not allow the MR of the condensed somatic chromatin, and that may induce an abnormal anaphase and the following clone developmental defects.

A large amount of chemicals are released to the environment each year. Among them, bisphenol A (BPA) is of utmost concern since it interferes with the reproductive system of wild organisms due to its capacity to bind to hormone receptors. Additionally, BPA epigenotoxic activity is known to affect basic processes during embryonic life. However, its effects on primordial germ cells (PGCs) proliferation and migration, both mechanisms being crucial for gametogenesis, remain unknown. To investigate the effects of BPA on PGCs migration and eventual testicle development, zebrafish embryos were exposed to 100, 2000 and 4000 &micro, g/L BPA during the first 24 h of development. Vasa immunostaining of PGCs revealed that exposure to 2000 and 4000 &micro, g/L BPA impaired their migration to the genital ridge. Two pivotal genes of PGCs migration (cxcr4b and sdf1a) were highly dysregulated in embryos exposed to these doses, whereas DNA methylation and epigenetic marks in PGCs and their surrounding somatic cells were not altered. Once embryos reached adulthood, the morphometric study of their gonads revealed that, despite the reduced number of PGCs which colonized the genital ridges, normal testicles were developed. Although H3K9ac decreased in the sperm from treated fishes, it did not affect the progeny development.

Oviparous vertebrates produce multiple forms of vitellogenin (Vtg), the major source of yolk nutrients, but little is known about their individual contributions to reproduction and development. This study employed a CRISPR/Cas9 genome editing to assess essentiality and functionality of zebrafish (Danio rerio) type-I and -III Vtgs. The multiple CRISPR approach employed to knock out (KO) all genes encoding type-Ivtgs(vtg1, 4, 5, 6,and7) simultaneously (vtg1-KO), and the type-IIIvtg(vtg3) individually (vtg3-KO). Results of PCR genotyping and sequencing, qPCR, LC-MS/MS and Western blotting showed that onlyvtg6andvtg7escaped Cas9 editing. In fish whose remaining type-Ivtgswere incapacitated (vtg1-KO), and invtg3-KO fish, significant increases in Vtg7 transcript and protein levels occurred in liver and eggs, a heretofore-unknown mechanism of genetic compensation to regulate Vtg homeostasis. Fecundity was more than doubled invtg1-KO females, and fertility was ~halved invtg3-KO females. Substantial mortality was evident invtg3-KO eggs/embryos after only 8 h of incubation and invtg1-KO embryos after 5 d. Hatching rate and timing were markedly impaired invtgmutant embryos and pericardial and yolk sac/abdominal edema and spinal lordosis were evident in the larvae, with feeding and motor activities also being absent invtg1-KO larvae. By late larval stages,vtgmutations were either completely lethal (vtg1-KO) or nearly so (vtg3-KO). These novel findings offer the first experimental evidence that different types of vertebrate Vtg are essential and have disparate requisite functions at different times during both reproduction and development.

Nuclear transfer consists in injecting a somatic nucleus carrying valuable genetic information into a recipient oocyte to sire a diploid offspring who bears the genome of interest. It requires that the oocyte (maternal) DNA is removed. In fish, because enucleation is difficult to achieve, non-enucleated oocytes are often used and disappearance of the maternal DNA was reported in some clones. The present work explore which cellular events explain spontaneous erasure of maternal DNA, as mastering this phenomenon would circumvent the painstaking procedure of fish oocyte enucleation. The fate of the somatic and maternal DNA during meiosis resumption and first cell cycle was studied using DNA labeling and immunofluorescence in goldfish clones. Maternal DNA was always found as an intact metaphase within the oocyte, and polar body extrusion was minimally affected after meiosis resumption. During the first cell cycle, only 40 % of the clones displayed symmetric cleavage, and these symmetric clones contributed to 80 % of those surviving at hatching. Maternal DNA was often fragmented and located under the cleavage furrow. The somatic DNA was organized either into a normal mitotic spindle or abnormal multinuclear spindle. Scenarios matching the DNA behavior and the embryo fate are proposed.

The emergence of the mesoderm is an important -but still poorly understood- evolutionary transition. Previously, the team identified a mechanosensitive pathway inducing mesoderm specification in bilaterian embryos. The mechanical constraints of the first morphogenetic movements induce the phosphorylation of the junctional ßcat and the activation of the pathway. To test its evolutionary origins, we worked on the cnidarian Nematostella vectensis, who diverged from bilaterians more than 600 million years ago. We tested the activation of the ßcat mechanosensitive pathway by mechanical cues and its role in endomesoderm specification. By carrying out immunofluorescence imaging at the gastrulation stage, we showed that the ßcat is phosphorylated (p-ßcat) in the constricted cells of the future endomesoderm. We observed that the inhibition of the actin network densification - upon morpholinos injections (StbmMO) - inhibits the p-ßcat. This phosphorylation is mechanosensitive since we rescued p-ßcat levels to normal by compressing inhibited embryos. Through computer analysis, we found that the junctional actin signals and the p-ßcat signals are positively correlated. We postulate that the tensions induced by the actomyosin network, necessary for blastopore invagination, trigger the ßcat pathway. We also identified genes whose expression is altered by StbmMO injections and so maybe by mechanical constraint inhibition. These results indicate that the ßcat mechanosensitive pathway is conserved in a cnidarian and therefore dates back more than 600 million years.; L'émergence du mésoderme est une transition évolutive importante mais encore mal comprise. Précédemment, l’équipe a identifié une voie mécanosensible induisant la différenciation du mésoderme chez des embryons bilatériens. Les contraintes mécaniques des premiers mouvements morphogénétiques induisent la phosphorylation de la ßcat jonctionnelle et l’activation de la voie. Pour en tester les origines évolutives, nous avons travaillé sur le cnidaire, Nematostella vectensis, dont le dernier ancêtre commun avec les bilatériens remonte à plus de 600 millions d'années. Nous avons testé l'activation de la voie mécanosensible ßcat suite à la gastrulation. En réalisant des immunofluorescences, nous avons montré que la ßcat est phosphorylée (p-ßcat) dans les cellules constrictées du futur endomésoderme en début de gastrulation. Nous avons observé que l'inhibition de la densification du réseau d'actine - par injections de morpholinos de Strabismus (StbmMO) - inhibe la p-ßcat. Cette phosphorylation est mécanosensible puisque nous avons ramené les niveaux de p-ßcat à la normale en comprimant les embryons inhibés. Grâce à une analyse informatisée, nous avons révélé que les signaux d'actine jonctionnelle et de p-ßcat sont positivement corrélés. Nous postulons que les tensions induites par le réseau d’actomyosine, nécessaires à l'invagination du blastopore, déclenchent la voie ßcat. Nous avons commencé à tester la fonctionnalité de cette voie en identifiant des gènes dont l'expression est modifiée par injections de StbmMO. Ces résultats indiquent que la voie mécanosensible ßcat est conservée et remonte donc à plus de 600 millions d'années.

Divers transcrits acquièrent une asymétrie spatiale au sein de certaines cellules procaryotes et eucaryotes, phénomène qualifié de « localisation des ARNs ». Chez les types cellulaires dotés d’une polarisation marquée, notamment les neurones ou certains embryons, la localisation des ARNm constitue un mécanisme élégant permettant de restreindre l’expression et l’activité protéique associée à un contexte spatiotemporel précis. Bien que diverses techniques d’imagerie permettent d’apprécier la distribution spatiale des transcrits à haute résolution, elles se prêtent difficilement à l’étude systématique de l’asymétrie spatiale du transcriptome. Cette thèse retrace d’abord le développement de méthodes biochimiques de fractionnement cellulaire et extracellulaire couplées au séquençage à haut débit des ARNs comme approche systématique dans l’étude de la localisation des ARNs. Ces méthodologies, qualifiées collectivement de CeFra-seq (« Cell Fractionation – RNA-seq »), se veulent complémentaires aux outils d’imagerie. Le chapitre 4 est consacré à une description technique détaillée de l’approche CeFra-seq chez les cellules humaines leucémiques K562, accompagnée d’étapes de validation et de transformation de données. Les chapitres subséquents traitent ensuite de l’application de ces méthodologies pour explorer quatre questions fonctionnelles chez divers systèmes biologiques. Le chapitre 6 tire profit de l’approche CeFra-seq pour explorer les propriétés subcellulaires des ARNs ciblés aux vésicules extracellulaires (VEs). Les VEs correspondent à un groupe hétérogène de structures nanoscopiques constituées d’une bicouche lipidique qui contiennent un répertoire spécifique d’acides nucléiques et des protéines. Ubiquitaire au sein des liquides biologiques, les VEs ont été associées à la communication intercellulaire dans divers contextes, de la présentation des antigènes à la progression tumorale. Or, les mécanismes qui déterminent la localisation préférentielle de certains ARNs aux VEs demeurent nébuleux. En contrastant de manière systématique les populations d’ARNs contenus dans ces structures aux répertoires subcellulaires obtenus par l’approche de CeFra-seq, mon travail a permis de mettre en évidence certaines propriétés associées au ciblage extracellulaire, notamment l’accessibilité cytosolique, la taille des ARNs ainsi que des éléments de séquence en cis. Le chapitre 7 propose une comparaison extensive des propriétés morphologiques et transcriptomiques des VEs issues d’une série de lignées cellulaires humaines et de lignées embryonnaires de Drosophile. Ce travail révèle que les VEs de Drosophile sont plus petites que celles des cancers humains et que l’enrichissement d’ARNs courts transcrits par la polymérase III prévaut chez les VEs des deux espèces. Ensemble, ces résultats valident l’hypothèse d’une conservation élevée des phénomènes d’export de l’ARN. Le chapitre 8 étend CeFra-seq à un nouveau contexte biologique : le développement embryonnaire de la Drosophile. Ici, cette méthodologie conduit à l’établissement de répertoires de transcrits dotés d’une forte asymétrie spatiale et temporelle au cours de l’embryogenèse. L’analyse des mutants SLBP, un facteur de maturation des ARNs d’histone, et de Chk1, régulateur des voies de dommage à l’ADN, montre ensuite que la déplétion de ces protéines compromet sélectivement l’expression des transcrits zygotiques, identifiés grâce à la méthode CeFra-seq. Le chapitre 9 relate une étude des ARNs antisens issus du locus des histones pendant l’embryogenèse de la Drosophile. L’expression de ces transcrits non-polyadénylés fluctue pendant le développement et dépend de la protéine SLBP. Ici, l’approche CeFra-seq révèle que ces transcrits antisens, strictement zygotiques, co-ségréguent avec leurs ARNm complémentaires, un résultat qui évoque la formation d’ARN double-brin, puis de petits ARN interférents. Pour faire suite à cette hypothèse, j’ai démontré que de petits transcrits issus du locus des histones s’associent au facteur catalytique de la machinerie d’interférence aux ARNs, Argonaute-2. De plus, la déplétion d’Argonaute-2 mène à une dérepression des ARNm d’histones. Ensemble, ces résultats suggèrent un modèle de transcription antisens zygotique précoce menant à la formation de petits ARNs interférents qui contribuent à l’élimination des ARNm d’histones contribués maternellement. Ainsi, cette thèse est échafaudée sur le développement d’une approche versatile de l’étude systématique de la localisation des ARN, CeFra-seq, décrite dans le chapitre 5. La mise au point de cette approche débouche ensuite sur des études fonctionnelles visant à mieux comprendre les propriétés des ARNs ciblés au VEs (Chapitre 6) et le degré de conservation de ce ciblage (Chapitre 7). La suite de la thèse exploite l’approche CeFra-seq pour explorer le phénotype transcriptomique de la déplétion de SLBP chez l’embryon de Drosophile (Chapitre 8), ainsi que les propriétés et fonctions d’ARN antisens issus du locus des histones chez l’embryon précoce (Chapitre 9)., Several RNA transcripts acquire spatially-resolved patterns in diverse prokaryotic and eukaryotic cells, a phenomenon termed “RNA localization”. In highly polarized cells, such as neurons or certain embryos, mRNA localization provides an elegant mechanism to restrict protein expression and activity to a narrow spatiotemporal context. Diverse imaging approaches have been developed to study RNA localization, including RNA in situ hybridization and the MS2 system. While these techniques enable the visualization of RNA spatial distributions at a high resolution, they hardly allow for systematic, transcriptome-wide analyses of spatial asymmetry. The first part of this thesis encompasses the development of biochemical, cell fractionation and extracellular milieu processing methods coupled to deep sequencing as a novel approach to study transcriptome-wide RNA localization. These methods, collectively termed CeFra-seq (“Cell Fractionation – RNA-seq”), are propose as a complementary tool with imaging approaches. Chapter 5 consists of a detailed technical description of the CeFra-seq methodology, along with a validation workflow and a relevant data transformation toolkit. The subsequent chapters discuss applications of these methods to investigate four outstanding questions in different biological systems. Chapter 6 relies on CeFra-seq to explore the subcellular properties of RNAs targeted to extracellular vesicles (EVs). EVs form a group of heterogeneous nanoscopic structures delimited by a phospholipid bilayer that contain specific repertoires of protein and nucleic acids. Ubiquitous in biological fluids, EVs have been associated to intercellular communication in diverse biological contexts, notably antigen presentation and tumor progression. Yet, the mechanisms that account for the enrichment of specific RNAs in EVs remain unclear. By systematically contrasting RNA populations found in EVs with subcellular distributions, my work has revealed diverse properties linked to EV targeting, including cytosolic accessibility, RNA length and cis-acting elements. Chapter 7 consists of an extensive comparison of the morphological and transcriptomic properties of EVs derived from several human and Drosophila cell lines. This work reveals that Drosophila EVs are smaller than their human counterparts and that they are both enriched in short, Polymerase III transcripts. Together, these results emphasize the high conservation of RNA export processes. Chapter 8 extends subcellular fractionation approaches coupled to deep sequencing in an additional biological system: Drosophila embryogenesis. Here, the method leads to repertoires of transcripts displaying high spatial and temporal asymmetry during development. The analysis of SLBP mutants, a factor involved in histone mRNA processing, and Chk1 mutnts, a regulator of the DNA damage response, shows that the depletion of these proteins selectively hampers the expression of zygotic transcripts, identified through CeFra-seq. Chapter 9 recounts a study of antisense transcripts derived from the histone gene locus during Drosophila embryogenesis. The expression of these non-polyadenylated RNAs fluctuates during development and depends on the protein SLBP. Here, CeFra-seq reveals that these antisense RNAs, which are strictly zygotic, co-segregate with their complementary mRNAs, hinting at the formation of double-stranded RNAs, precursors of small interfering RNAs. To follow-up on this hypothesis, I show that small RNAs derived from the histone gene locus bind to the catalytic factor of the RNA-induced silencing complex, Argonaute-2. In addition, depleting Argonaute-2 leads to a derepression of histone mRNAs. Together, these results suggest a model wherein precocious zygotic antisense transcription leads to the formation of small interfering RNAs, which contribute to the clearance of maternally deposited histone mRNAs. Hence, this thesis reflects the development and application of a versatile approach to study RNA localization, termed CeFra-seq and described in chapter 5. The use of this method leads to functional studies aiming to investigate the properties of EV-targeted RNAs (Chapter 6) and the extent of evolutionary conservation of this targeting process (Chapter 7). The rest of the thesis exploits the CeFra-seq approach to explore the transcriptomic phenotype of SLBP depletion in Drosophila embryos (Chapter 8), as well as the properties and functions of antisense RNAs produced by the histone gene locus in early embryos (Chapter 9).

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) is a very promising cloning technique for reconstruction of endangered animals. The aim of the present research is to implement the interspecific SCNT (iSCNT) technique to sturgeon; one fish family bearing some of the most critically endangered species. We transplanted single cells enzymatically isolated from a dissociated fin-fragment of the Russian sturgeon (Acipenser gueldenstaedtii) into non-enucleated eggs of the sterlet (Acipenser ruthenus), two species bearing different ploidy (4n and 2n, respectively). Up to 12% of the transplanted eggs underwent early development, and one feeding larva (0.5%) was successfully produced. Interestingly, although this transplant displayed tetraploidism (4n) as the donor species, the microsatellite and species-specific analysis showed recipient-exclusive homozygosis without any donor markers. Namely, with regards to this viable larva, host genome duplication occurred twice to form tetraploidism during its early development, probably due to iSCNT manipulation. The importance of this first attempt is to apply iSCNT in sturgeon species, establishing the crucial first steps by adjusting the cloning-methodology in sturgeon’s biology. Future improvements in sturgeon’s cloning are necessary for providing with great hope in sturgeon’s reproduction.

Integrative analysis of developing coffee seeds reveals the key cellular, metabolic, and regulatory processes associated with acquisition of desiccation tolerance in intermediate seeds, The ‘intermediate seed’ category was defined in the early 1990s using coffee (Coffea arabica) as a model. In contrast to orthodox seeds, intermediate seeds cannot survive complete drying, which is a major constraint for seed storage and has implications for both biodiversity conservation and agricultural purposes. However, intermediate seeds are considerably more tolerant to drying than recalcitrant seeds, which are highly sensitive to desiccation. To gain insight into the mechanisms governing such differences, changes in desiccation tolerance (DT), hormone contents, and the transcriptome were analysed in developing coffee seeds. Acquisition of DT coincided with a dramatic transcriptional switch characterised by the repression of primary metabolism, photosynthesis, and respiration, and the up-regulation of genes coding for late-embryogenesis abundant (LEA) proteins, heat-shock proteins (HSPs), and antioxidant enzymes. Analysis of the heat-stable proteome in mature coffee seeds confirmed the accumulation of LEA proteins identified at the transcript level. Transcriptome analysis also suggested a major role for ABA and for the transcription factors CaHSFA9, CaDREB2G, CaANAC029, CaPLATZ, and CaDOG-like in DT acquisition. The ability of CaHSFA9 and CaDREB2G to trigger HSP gene transcription was validated by Agrobacterium-mediated transformation of coffee somatic embryos.

Il est connu qu’une exposition prénatale à l’alcool (EPA) peut entrainer des dérégulations épigénétiques dans les cellules du cerveau en développement et être responsable de certains phénotypes du Trouble du Spectre de l’Alcoolémie Fœtale (TSAF) comme les troubles neurodéveloppementaux (TND). Les conséquences d’une EPA très tôt dans le développement sur le paysage épigénétique embryonnaire et extra-embryonnaire sont toutefois peu connues. Notre hypothèse est qu’une EPA durant la période préimplantatoire va initier des dérèglements des profils de méthylation d’ADN qui seront amplifiés et perpétués au cours du développement. Ces dérèglements seront visibles dans le cerveau et le placenta des embryons plus tard dans la gestation. Nous avons développé un modèle murin d’EPA en injectant avec de l’éthanol (EtOH) ou de la saline (Ctrl) des femelles souris gestantes au jour embryonnaire 2.5 (E2.5) soit au stade 8-cellules. Des embryons et placentas furent récoltés aux jours E10.5 et E18.5. Un système d’évaluation morphologique a permis de montrer une augmentation significative des anomalies visibles des embryons EtOH. Les profils de méthylation d’ADN ont par la suite été établis par Reduced Representation Bisulfite Sequencing sur 8 échantillons contrôles et 12 échantillons EtOH de cerveaux antérieurs et de placentas au stade E10.5. Des analyses bio-informatiques ont démontré 686 et 2942 régions différentiellement méthylées (DMTs) respectivement dans le cerveau antérieur et le placenta. Nous avons aussi trouvé 21 DMTs communément affectés dans chacun des tissus. Étonnamment, nous avons aussi observé des différences spécifiques aux sexes dans la dérégulation de profils de méthylation en réponse à l’EPA. Notre étude montre, pour la première fois, qu’une EPA très tôt dans le développement embryonnaire entraine des dérégulations de la méthylation d’ADN perceptibles plus tard dans le développement. Ces résultats nous en apprennent davantage sur comment les perturbations épigénétiques peuvent altérer le fonctionnement normal du cerveau et mener à des TNDs chez les enfants atteints du TSAF., Prenatal alcohol exposure (PAE) is known to altered epigenetic profiles in cells during brain development and be part of the molecular basis underpinning Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) etiology. However, the consequences of a PAE during very early embryonic life on the future epigenetic landscape of embryonic and extraembryonic tissues remain unknown. Our research hypothesis is that a PAE during preimplantation will initiate DNA methylation dysregulation that will later be observable in the developing conceptus. We believe that these original epigenetic alterations will be perpetuated and amplified in the developing brain as well as in the placental tissue. To test this, we instigated FASD in mouse 8-cell embryos by injecting ethanol at 2.5 days of pregnancy (E2.5). We collected FASD (ethanol) and control (saline) E10.5 and E18.5 embryos and placentas. Dissection scoring showed an increase in morphological abnormalities in EtOH embryos of both stages. We then established genome-wide quantitative DNA methylation profiles of forebrains and placentas of E10.5 embryos by Reduced Representation Bisulfite Sequencing. Bioinformatic analyses of FASD samples (n=12) vs controls samples (n=8) revealed 686 and 2942 differentially methylated tiles (DMTs) in forebrain and placenta samples respectively. Unexpectedly, we highlighted sex-specific DNA methylation perturbations and gene expression pattern in response to ethanol exposure. Interestingly, we also uncovered 21 specific regions abnormally methylated in both FASD forebrain and placenta samples. Our study establishes for the first time that early embryonic PAE can cause epigenetic dysregulations that leads to permanent alteration in the future epigenetic program of brain and placenta cells and that some of these dysregulations are sex-specific. Altogether, our results allow us to have a better understanding of how epigenetic perturbations can alter the normal function of the brain and lead to neurodevelopmental disorders present in children with FASD.

La compréhension et le contrôle de la qualité d’un ovocyte (que l’on peut définir comme sa capacité à être fécondé puis à permettre le bon développement d’un embryon) est une problématique socio-économique importante ayant des implications significatives en élevage et en médecine humaine.

The epithelio-mesenchymal transition (EMT) is a well-known mechanism by which epithelial cells lose their adherent connections and gain migratory properties, associated with a gain of a mesenchymal phenotype. This EMT is required in numerous processes as gastrulation, organogenesis, fibrosis and cancers. Various molecular pathways orchestrate the EMT depending on the EMT biological context. Recently, our laboratory highlighted the implication of the cytoplasmic Notch pathway in the dorso-medial lip (DML) EMT. In the DML tissue, theEMT is synchronized with differentiation pathways, to generate cells forming the primary myotome. Our laboratory showed that neural crests cells expressing DLL1 activate NOTCH receptor of the DML cells, via a “kiss and run” model. This leads to NOTCH cleavage, releasing an activated intra-cytoplasmic NOTCH domain (NICD). In the cytoplasm, NICD inhibits the GSK3ß kinase, leading to the stabilization of SNAIL and the free cytoplasmic ßcatenin. These molecules translocate into the nucleus and lead to the activation of MRF as Myf5 (ß-catenin) and to the repression of adherent genes (SNAIL). Therefore, Notch cytoplasmic pathway allows a synergized induction of both, the EMT and myogenic programs. This pathway remains controversial and the precise mechanism how NICD inhibits GSK3ß needs to be elucidated. Therefore, the aim of my thesis project was to clarify how NICD inhibits GSK3ß activity. First, I confirmed that NICD and GSK3ß physically interact by CoIP. Moreover, I demonstrated that the serin-threonin kinase AKT, known to inhibit GSK3ß by phosphorylation and also to mediate EMT in cancer, can physically interact with NICD in the cytoplasm. I have also shown that AKT mediates the induction of the myogenic program through the inhibitory phosphorylation of GSK3ß and that SNAIL is downstream of AKT. Together, these experiments indicate that AKT mediates, through phosphorylation, the cytoplasmic NICD inhibition of GSK3ß leading to myogenesis. A comparison of the chicken NICD1 and the 4 isoforms of mouse NICD highlighted that these 5 proteins induce EMT and myogenesis similarly. The dissection of the different conserved domains in the 5 different NICD proteins demonstrated that the RAM domain, known to activate transcription by binding to RBPJ, is necessary and sufficient for GSK3ß inhibition. A second axis of the thesis has been to test the involvment of the cytoplasmic Notch pathway in other EMT contexts. First, I highlighted that this pathway induces myogenesis, showing that NICD inhibits GSK3ß activity in the ventro-lateral lip. I further demonstrated that the cytoplasmic Notch pathway is implicated in the EMT and differentiation of the neural crests cells delaminating from the dorsal neural tube. Particularly, I have shown a co-activation of the Wnt and Notch pathway in premigratory and migratory neural crests. Moreover, I demonstrated a cytoplasmic inhibition of the kinase activity of GSK3ß by NICD, as well as the induction of the differentiation by cytoplasmic ß-catenin or SNAIL2. In a third axis of my thesis, I tried to clarify the regulatory mechanism involved in Notch activation. Previously it has been demonstrated that in all the DML cells Notch can be activated by an overexpression of DLL1 and that an ectopic expression of NICD in the DML cells induce a massive differentiation and depletion of the progenitor pool. To determine if the regulation of this initiation of the myogenic program occurs before or after Notch activation, I designed a plasmid to visualize Notch activation in vivo. In order to be able to follow the DLM cells and Notch activation in vivo, I initiated a collaboration with an ILM team to create a vertical SPIM biphoton microscope. In the future, this microscope will allow us to follow cells in living chicken embryos [etc...], La transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) est un processus incontournable dans de nombreux contextes normaux et pathologiques, tels que gastrulation, organogenèse, fibroses et cancers. Cette transformation de cellule épithéliale en cellule mésenchymateuse est indissociable de l'acquisition de propriétés migratoires et est généralement associée à un changement de destin cellulaire. Différentes voies moléculaires sont impliquées selon le contexte de l'EMT concernée. Récemment, notre laboratoire a mis en évidence que la voie Notch cytoplasmique contrôle l'EMT des cellules de la lèvre dorso-médiale du somite (DML). Les crêtes neurales exprimant DLL1 activent « en passant » le récepteur NOTCH, liberant ainsi le domaine intra-cytoplasmique de NOTCH (NICD). Dans le cytoplasme, NICD inhibe la kinase GSK3ß, conduisant à la stabilisation de SNAIL, un gène maître de la transition épithélio-mésenchymateuse. Il en résulte une libération de la βcaténine des jonctions adhérentes qui, après translocation dans le noyau, active la transcription des gènes de la myogénèse (Myf5). Ainsi, l'activation de la voie Notch cytoplasmique permet une induction concomitante de l'EMT et de la myogénèse. La fonction cytoplasmique de Notch reste controversée et le mécanisme par lequel NICD inhibe GSK3ß reste obscur. Au cours de ma thèse j'ai cherché à élucider le mécanisme par lequel NICD inhibe l'activité kinase de GSK3ß. J'ai confirmé l'interaction de GSK3ß et de NICD en démontrant leur interaction via CoIP. Après avoir démontré l'implication de la sérine-thréonie kinase AKT dans la myogenèse des cellules de la DML, j'ai mis en évidence, via CoIP et électroporation, que l'inhibition GSK3ß par NICD est très certainement médiée par AKT, connue pour être impliquée dans l'EMT et inhiber GSK3ß par phosphorylation. En comparant le NICD1 de poulet et les 4 NICD de souris, j'ai montré que l'expression exogène de ces 5 molécules induit l'EMT et la différenciation myogénique de manière similaire. J'ai aussi montré que parmi des différents domaines de NICD, le domaine RAM, connu pour se lier à l'ADN (via RBPJ), est nécessaire et suffisant à l'inhibition de GSK3ß. Un second axe de ma thèse a été de tester l'implication de la voie Notch cytoplasmique dans d'autres contextes d'EMT. Pour ce faire, j'ai mis en évidence que cette voie est impliquée dans les autres lèvres du dermomyotome mais aussi dans les crêtes neurales qui délaminent du toit du tube neural. J'ai en particulier mis en évidence une co-activation des voies Wnt et Notch, une inhibition de la kinase GSK3ß par NICD cytoplasmique ainsi qu'une inhibition de la différenciation en présence d'une ß-caténine mutée, retenue à la membrane, ou en présence d'une molécule SNAIL2 dominant-négative. Le dernier axe de ma thèse a consisté à élucider le mécanisme de régulation de l'induction de l'EMT et de la myogenèse via l'activation de NICD. Il a été mis en évidence que toutes les cellules de la DML peuvent être activées via DLL1 et que la surexpression massive de NICD dans la DML provoque une différenciation massive et une déplétion du groupe de cellules progénitrices. Afin de déterminer si la régulation de cette initiation se fait avant ou après induction de NICD, j'ai créé un plasmide permettant de répondre à cette question et afin de visualiser son expression in vivo, j'ai initié une collaboration avec une équipe de l'ILM afin de créer un microscope vertical SPIM biphoton permettant l'observation d'embryon de poulets vivants [etc...]

Genomic imprinting refers to the epigenetic mechanism by which approximately 120 genes are expressed in a parent-of-origin manner. This parental asymmetry in gene expression is mediated through differential profiles of DNA methylation established in the oocyte and the sperm and maintained after fertilization in the developing individual. In mammals, imprinted genes are essential for normal embryo development as well as behavioral and physiological functions after birth. Clarifying the regulation and the function of those genes is thus fundamental in the field of developmental biology and health. During my PhD, I functionally characterized the imprinted Zdbf2 locus in mice. Zdbf2 is a paternally expressed gene, conserved from mouse to human, whose biological function was unknown. I revealed that Zdbf2 activation in the post-natal brain requires an indelible epigenetic signal that is established during the first days of embryogenesis. Additionally, I provided in vivo evidence that early programming of Zdbf2 is essential for proper growth after birth. By generating multiple CRISPR-mediated genetic mutants with varied doses of Zdbf2 in the hypothalamo-pituitary axis, I finally demonstrated that Zdbf2 is a growth-promoting gene, with a dose-sensitive effect and acting independently of its parental origin. Altogether, my work shed light onto the crucial function of a mammalian imprinted gene, from its regulation in the early embryo to its role in adult physiology., L’empreinte parentale est un mécanisme de régulation épigénétique qui réduit l’expression d’environ 120 gènes à une seule dose parentale. L’expression monoallélique dépend de marques différentielles de méthylation de l’ADN, établies dans l’ovocyte et le spermatozoïde et maintenues après fécondation dans l’individu en développement. Chez les mammifères, les gènes soumis à empreinte sont essentiels au développement embryonnaire et à certaines fonctions comportementales et physiologiques après la naissance. Définir les mécanismes de régulation et la fonction des gènes soumis à empreinte est une question cruciale en biologie du développement et en pathologie. Mon travail de thèse a concerné l’étude fonctionnelle du locus Zdbf2 chez la souris. Zdbf2 est un gène exprimé paternellement, conservé chez l’humain, mais dont la fonction était inconnue. J’ai pu démontrer que l’activation de Zdbf2 dans le cerveau de souris pré-pubères dépend d’un signal épigénétique indélébile mis en place dès les premiers jours de développement embryonnaire. Cette programmation précoce de Zdbf2 assure une croissance normale du nouveau-né. Mes résultats indiquent de plus que la dose, mais pas l’origine parentale de Zdbf2 est essentielle. Ces découvertes ont été possibles par la création de divers modèles mutants avec des variations de la dose de Zdbf2 dans l’axe hypothalamo-hypophysaire. Ce travail met en lumière la fonction cruciale d’un gène soumis à empreinte, de sa régulation dans l’embryon précoce à son rôle sur la physiologie adulte.

Supplemental information for this article can be found online at:http://dx.doi.org/10.7717/peerj.5534#supplemental-information; The family of forkhead box (Fox) transcription factors regulates gonadogenesis and embryogenesis, but the role of in reproduction is unknown. Evolutionary history of in vertebrates was examined and the gene was found to exist in most vertebrates, including mammals, ray-finned fish, amphibians, and sauropsids. By quantitative PCR and RNA-seq, we found that had an ovarian-specific expression in zebrafish, a common feature of maternal-effect genes. In addition, it was demonstrated using in situ hybridization that was a maternally-inherited transcript that was highly expressed even in early-stage oocytes and accumulated in the developing eggs during oogenesis. We also analyzed the function of in female reproduction using a zebrafish CRISPR/cas9 knockout model. It was observed that embryos from the -deficient females had a significantly lower survival rate whereby they either failed to undergo cell division or underwent abnormal division that culminated in growth arrest at around the mid-blastula transition and early death. These mutant-derived eggs contained dramatically increased levels of , a cell cycle inhibitor, and reduced , a component of mTOR and regulator of cell survival, which were in line with the observed growth arrest phenotype. Our study shows for the first time that is an essential maternal-effect gene and may be required for proper cell division and survival via the p21 and mTOR pathways. These novel findings will broaden our knowledge on the functions of specific maternal factors stored in the developing egg and the underlying mechanisms that contribute to reproductive success.

The emergence of the mesoderm is an important -but still poorly understood- evolutionary transition. Previously, the team identified a mechanosensitive pathway inducing mesoderm specification in bilaterian embryos. The mechanical constraints of the first morphogenetic movements induce the phosphorylation of the junctional ßcat and the activation of the pathway. To test its evolutionary origins, we worked on the cnidarian Nematostella vectensis, who diverged from bilaterians more than 600 million years ago. We tested the activation of the ßcat mechanosensitive pathway by mechanical cues and its role in endomesoderm specification. By carrying out immunofluorescence imaging at the gastrulation stage, we showed that the ßcat is phosphorylated (p-ßcat) in the constricted cells of the future endomesoderm. We observed that the inhibition of the actin network densification - upon morpholinos injections (StbmMO) - inhibits the p-ßcat. This phosphorylation is mechanosensitive since we rescued p-ßcat levels to normal by compressing inhibited embryos. Through computer analysis, we found that the junctional actin signals and the p-ßcat signals are positively correlated. We postulate that the tensions induced by the actomyosin network, necessary for blastopore invagination, trigger the ßcat pathway. We also identified genes whose expression is altered by StbmMO injections and so maybe by mechanical constraint inhibition. These results indicate that the ßcat mechanosensitive pathway is conserved in a cnidarian and therefore dates back more than 600 million years., L'émergence du mésoderme est une transition évolutive importante mais encore mal comprise. Précédemment, l’équipe a identifié une voie mécanosensible induisant la différenciation du mésoderme chez des embryons bilatériens. Les contraintes mécaniques des premiers mouvements morphogénétiques induisent la phosphorylation de la ßcat jonctionnelle et l’activation de la voie. Pour en tester les origines évolutives, nous avons travaillé sur le cnidaire, Nematostella vectensis, dont le dernier ancêtre commun avec les bilatériens remonte à plus de 600 millions d'années. Nous avons testé l'activation de la voie mécanosensible ßcat suite à la gastrulation. En réalisant des immunofluorescences, nous avons montré que la ßcat est phosphorylée (p-ßcat) dans les cellules constrictées du futur endomésoderme en début de gastrulation. Nous avons observé que l'inhibition de la densification du réseau d'actine - par injections de morpholinos de Strabismus (StbmMO) - inhibe la p-ßcat. Cette phosphorylation est mécanosensible puisque nous avons ramené les niveaux de p-ßcat à la normale en comprimant les embryons inhibés. Grâce à une analyse informatisée, nous avons révélé que les signaux d'actine jonctionnelle et de p-ßcat sont positivement corrélés. Nous postulons que les tensions induites par le réseau d’actomyosine, nécessaires à l'invagination du blastopore, déclenchent la voie ßcat. Nous avons commencé à tester la fonctionnalité de cette voie en identifiant des gènes dont l'expression est modifiée par injections de StbmMO. Ces résultats indiquent que la voie mécanosensible ßcat est conservée et remonte donc à plus de 600 millions d'années.

The presence of subfertile bulls in the market of Animal Insemination negatively influences the efficacy of breeding farms. The evaluation of bull fertility, based on the combined analysis of genetic, morphological, kinetic and metabolic markers of the semen, is not sufficient to identify subfertile bulls before entering semen production. It suggests the implication of other factors, especially epigenetic ones. Within the epigenetic markers, DNA methylation holds a crucial position: indeed, its reprogramming is indispensable to the fundamental processes that are germinal cell differentiation, spermatogenesis and the embryonic development. Whereas several studies have showed that the alteration of spermatic methylation profiles are associated with subfertility in humans, only a little data exists concerning bovines. The aim of this thesis is the characterization of the methylome of bovine semen and the identification of new reliable markers of male fertility at an early stage. This study is part of a larger project called SeQuaMol (Molecular Quality of Semen) which rely on a common laboratory between INRA and the ALLICE federation. The characterization of the bovine sperm methylome was achieved by using a multiscale approach (global, pangenomic and sequencespecific). The analyses made it possible to observe the hypomethylation of the bovine semen. Hypomethylation affects genes that are crucial for the differentiation of the germline, spermatic functions, and also on satellite sequences.The identification fertility biomarkers was carried out by using a pangenomic approach (Reduced Representation Bisulfite Sequencing, RRBS). The analysis has been performed on a cohort of 94 bulls, including subjects of the Holstein race and Montbeliard race, categorized according to the adequacy between a genetic indicator of fertility and their actual fertility. The process also includes bulls from 4 other breeds in order to obtain an estimate of the genetic variability linked to the breed. This analysis has required the optimization and the automation of the protocol for the high throughput preparation of RRBS libraries, as well as the development of the whole bioinformatic pipeline and data statistics. Several thousands of biomarkers of fertility have been identified, which allow to predict in a robust way the fertility status. Furthermore, a process of integration of genotype and epigenotype data has been started, which underlines the potential interaction between these levels of information. Finally, we have highlighted the influence of the age of semen production on the methylome. Altogether, theses data suggest that modifications of the semen methylome can affect genes that are involved in the process of early and late embryo development, and parts of the functioning of the sperm cell. The biomarkers identified will form a basis for the pursuit of the SeQuaMol project, of which the completion will be the development of technological and statistical tools that may be used routinely to improve male’s fertility prediction.; La présence de taureaux sub-fertiles sur le marché de l’Insémination Animale (IA) influence négativement l’efficacité des élevages. L’évaluation de la fertilité des taureaux, basée sur l’analyse combinée de marqueurs génétiques, morphologiques, cinétiques et métaboliques de la semence, n’est pas suffisante pour identifier les taureaux sub-fertiles avant leur entrée en production. Cela suggère l’implication d’autres facteurs, notamment d’origines épigénétiques. Parmi les marques épigénétiques, la méthylation de l’ADN tient une place essentielle : son remaniement est en effet indispensable aux processus fondamentaux que sont la différenciation des cellules germinales, la spermatogénèse et le développement embryonnaire précoce. Alors que chez l’Homme, de nombreuses études ont montré que des altérations des profils de méthylation spermatiques sont associées à la sub-fertilité, très peu de données existent chez le bovin. L’objectif de ce travail de thèse est la caractérisation du méthylome de la semence bovine et l’identification de nouveaux marqueurs fiables de la fertilité mâle à un stade précoce. Cette étude s’inscrit dans un large projet intitulé SeQuaMol (pour « Qualité Moléculaire de la Semence »), mis en place au sein d’un laboratoire commun entre l’INRA et la fédération ALLICE. La caractérisation du méthylome spermatique bovin a été réalisée en utilisant une approche multi-échelle (globale, pangénomique et séquence-spécifique). Les analyses ont permis de révéler l’hypométhylation très marquée du spermatozoïde bovin. L’hypométhylation affecte des gènes importants pour la différenciation de la lignée germinale, les fonctions spermatiques, ainsi que des séquences satellites. L’identification de biomarqueurs de la fertilité a été réalisée en utilisant une approche pangénomique (Reduced Representation Bisulfite Sequencing, RRBS). L’analyse a été effectuée sur une cohorte de 94 taureaux, dont les individus de races Holstein et Montbéliard ont été catégorisés en fonction de l’adéquation entre un indicateur génétique de la fertilité et leur fertilité réelle. Le dispositif inclus également des taureaux de 4 autres races pour obtenir une estimation de la variabilité épigénétique liée à la race. Cette analyse a nécessité l’optimisation et l’automatisation du protocole pour la préparation des banques RRBS à haut-débit, ainsi que la mise au point de l’ensemble de la procédure de traitement bio-informatique et statistique des données. Plusieurs milliers de biomarqueurs de la fertilité ont été identifiés et permettent de prédire de façon robuste le statut de fertilité. De plus, une démarche d’intégration des données de génotype et d’épigénotype a été amorcée, soulignant les interactions potentielles en ces strates d’informations. Enfin, nous avons mis en évidence l’influence de l’âge à la production de semence sur le méthylome. L’ensemble de ces données souligne que les modifications du méthylome spermatique peuvent affecter des gènes impliqués dans les processus précoces et plus tardifs du développement, ainsi que quelques voies du fonctionnement du spermatozoïde. L’ensemble des biomarqueurs identifiés serviront de base à la poursuite du projet SeQuaMol, dont l’aboutissement sera le développement d’outils technologiques et statistiques pouvant être utilisés en routine pour améliorer la prédiction de la fertilité mâle.

Cell migration is a crucial process during embryonic development, wound healing, immune system but also metastasis. Success of these processes relies on the capacities of cells to sense an asymmetric signal, interpret it and orient themselves to migrate in a directed manner. In vivo, migration is guided by several signals from the cellular microenvironment. Hypoxia, or decrease in the level of tissue oxygen, is an important feature of the cellular environment in the embryo and in solid tumors. Owing to the limitation of oxygen diffusion, hypoxia often generates oxygen gradients in vivo. We have developed an original method in which epithelial cells themselves generate oxygen gradient in vitro. And interestingly, these cells are able to migrate directionally to higher oxygen concentrations. This aerotaxis ability is independent of mitochondrial respiration and hypoxia response pathway. The reactive oxygen species (ROS) would mediate the migratory response to the gradient. The asymmetric production of ROS between the front and the back of the cells would be at the origin of the differential activation of the EGFR receptor and the persistence of cells towards higher oxygen concentrations. This chemoattractant capacity of oxygen, known in bacteria, but not described for eukaryotic cells, could play a major role in embryonic development and in metastatic dissemination; La migration cellulaire dirigée est un processus crucial lors du développement embryonnaire, de la cicatrisation, de la réponse immunitaire mais aussi lors de la formation de métastases. La réussite de ces processus nécessite que les cellules perçoivent un signal asymétrique, l'interprète et s'oriente pour migrer de façon dirigée. In vivo, la migration est dirigée par de nombreux signaux du microenvironnement cellulaire. L'hypoxie, ou diminution du niveau d'oxygène tissulaire, est une caractéristique importante de l'environnement cellulaire dans l'embryon et dans les tumeurs solides. Du fait de la limitation de la diffusion de l'oxygène, l'hypoxie génère in vivo des gradients d'oxygène. Nous avons développé une méthode originale dans laquelle des cellules épithéliales génèrent elles-mêmes gradient d'oxygène in vitro. Et de façon très intéressante, ces cellules sont capables de migrer de façon directionnelle vers des concentrations en oxygène plus élevées. Cette capacité d'aérotaxie est indépendante de la respiration mitochondriale et des acteurs de réponse à l'hypoxie. Les dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) seraient les médiateurs de la réponse migratoire au gradient. La production asymétrique de ROS entre l'avant et l'arrière des cellules serait à l'origine de l'activation différentielle du récepteur EGFR et de la persistance des cellules vers des concentrations plus importantes en oxygène. Cette capacité chimio-attractante de l'oxygène, connue chez les bactéries, mais non décrite pour des cellules eucaryotes, pourrait jouer un rôle majeur lors du développement embryonnaire et dans la dissémination métastatique

Meiosis resumption and early mitosis pattern after somatic cell nuclear transfer in goldfish. 6. International Workshop on the Biology of Fish Gametes