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La barrière hémato-encéphalique (BHE) est une structure retrouvée au niveau des capillaires cérébraux. Elle représente un véritable obstacle pour les actifs qui doivent se rendre au cerveau pour y exercer un effet pharmacologique. Durant les étapes du développement du médicament, des modèles cellulaires in vitro sont utilisés pour l’évaluation de la perméabilité au cerveau des nouveaux médicaments. Le modèle assemblé avec des cellules endothéliales (CEs) isolées des capillaires des cerveaux de souris présente un intérêt particulier pour la recherche en raison de sa facilité d’obtention et sa pertinence pour le criblage des médicaments. Le but de ce projet a été de construire et de caractériser un modèle monocouche de CEs primaires de souris. En parallèle, un modèle monocouche de la lignée murine b.End3 a été investigué. L’évaluation de ces modèles a été basée sur les valeurs de TEER et de perméabilité aux marqueurs fluorescents, ainsi que sur la présence des protéines spécifiques de la BHE. La validation du modèle a été établie par la corrélation des résultats de perméabilité obtenus avec le modèle développé (in vitro) avec ceux obtenus chez la souris (in vivo). L’intégrité et l’expression des protéines spécifiques de la BHE du modèle primaire se sont montrées supérieures au modèle bEnd.3. La corrélation in vitro/in vivo du modèle primaire a abouti à un r2 = 0,765 comparé au r2 = 0,019 pour le modèle bEnd.3. Ce travail de recherche montre que le modèle primaire monocouche issu de cellules endothéliales cérébrales de souris est un modèle simple et fiable pour la prédiction de la perméabilité des actifs à travers la BHE., The blood-brain barrier (BBB), a central nervous system structure, is found in the cerebral capillaries. It represents a major obstacle for the drugs that have to reach the brain in order to exercise their pharmacological effect. In the early stages of the drug development, in vitro cell models are used to evaluate the brain permeability of new drugs. Models assembled using primary endothelial cells (ECs) isolated from mouse brain capillaries are of particular interest for research, as for their ease of obtaining and relevance for the drug screening. Thus, the goal of this project was to build and characterize a primary mouse monolayer model. At the same time, a murine b.End3 cell line monolayer model was investigated. The evaluation of these models was based on the TEER and fluorescent marker permeability values, as well as on the presence of the BBB hallmark proteins. The model validation was established by the correlation of the permeability data obtained with the in vitro model and the data obtained in mice (in vivo). As a result, the primary mouse model showed superior monolayer integrity and higher expression of the tight junction and membrane transporter proteins when compared with the bEnd.3 cell line model. The in vitro/in vivo correlation of the primary model resulted in r2 = 0.765 compared to the bEnd.3 model with r2 = 0.019. This research work shows that the primary monolayer mouse model is a simple and reliable model for predicting the drug permeability across the BBB.

Obesity results from an imbalance between calorie intake and energy expenditure. Therapies based to reduce energy intake are difficult to follow in our modern life, and drugs can display adverse effects. Alternative strategies are urgently required to fight obesity and associated metabolic disorders. Brown and brown-like adipocytes (BAs) store fat, but in contrast to white adipocytes, BAs are equipped to burn glucose and lipids to dissipate energy stored. BAs also secrete adipokines that signal other organs and regulate metabolism. Therefore, BAs represent promising cell targets to promote energy expenditure and counteract obesity. However, the scarcity of BAs in human adults is a major limitation for a BA-based therapy of obesity, and the notion to increase the BA mass by transplanting BA progenitors (BAPs) in obese patients recently emerged. The proof of concept has been done in murin models. The next challenge is to identify an abundant and reliable source of human BAPs. We recently described the capacity of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to generate BAPs. During my thesis, we established a procedure to generate hiPSC-BAP spheroids and a method for their differentiation at a high efficiency in hiPSC-brown-like adipospheres. The model was then enriched with Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMECs) to better mimic the adipose tissue microenvironment and to improve its therapeutic potential. BAPs derived from human iPSCs were maintained in suspension to form spheroids able to different into adipospheres. The structure of adipospheres was analysed by confocal microscopy and adipocytes were characterized at the molecular and metabolic levels. We generated adipospheres from two different hiPSC-BAP clones, which are able to fully differentiate from the surface to the core. We compared hiPSC-brown-like adipospheres with the ones generated by hanging drop method, and our model displays comparable pattern regarding to extracellular matrix and adipogenesis, despite the sizes are not defined. We also proved hiPSC-brown-like adipospheres promotes accumulation of brown-like adipocytes that are more biologically active compared to cells maintained in conventional monolayer cell cultures. In addition, hiPSC-brown-like adipospheres have a similar expression profile of extracellular matrix and G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) compared with human adipospheres derived from subcutaneous abdominal adipose progenitors, suggested the physiological relevance of the hiPSC-adiposphere model. Moreover, hiPSC-adipospheres display a more brown-like adipogenic potential than abdominal adipospheres opening the opportunity and advantages for anti-obesity drug testing and cell based therapy to increase the BA mass in patients. Furthermore, hiPSC-adipospheres express UCP1 that can response to the stimulation of 8-CPT-cAMP or 8-Br-cGMP acutely and chronically, which indicated that our 3D model display metabolic characteristics of brown-like adipocytes. Finally, enrichment with HDMECs was performed via co culture in suspension. HDMECs functionality was tested in vitro by LDL-uptake. We proved that hiPSC-BAPs and HDMECs can co-culture in 3D and differentiate into vascularized hiPSC-brown-like adipospheres with functional tubular-like structure formed inside. Moreover, our co-cultured 3D model can secrete factors like VEGF and FGF2 to support vascularization which mimic in vivo situation.Altogether, the hiPSC-brown-like adipposphere model represents an unlimited source of human BAPs that in a near future may be a suitable tool for both therapeutic transplantation and for drug screening allowing discovery of novel and safe anti-obesity drugs.; L'obésité est la conséquence d'un déséquilibre entre l'apport de calories et la dépense énergétique. Les thérapies basées sur la réduction de l'apport énergétique sont difficiles à suivre dans notre vie moderne et les médicaments anti obésité présentent d’importants effets secondaires. Des stratégies alternatives sont alors requises pour lutter contre l'obésité et les troubles métaboliques associés comme le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires. Les adipocytes bruns et de type brun, encore appelés beige ou brite (BA), stockent la graisse, mais contrairement aux adipocytes blancs, les BA sont équipés pour brûler les lipides et consommer le glucose afin de dissiper l'énergie stockée. Les BA sécrètent également des adipokines qui vont cibler d'autres organes et pour participer à la régulation des paramètres métaboliques. Ainsi, les BA représentent des cibles cellulaires prometteuses pour lutter contre l'obésité en favorisant la dépense énergétique. Cependant, la rareté des BA chez l’homme adulte, qui est accentuée chez les patients obèses, est une limitation majeure pour un traitement de l’obésité basé sur le BA. La notion d’augmenter la masse de BA en greffant des progéniteurs de BA (BAP) chez des patients obèses a récemment émergée. La preuve de concept a été faite dans des modèles murins. Le prochain défi consiste à identifier une source abondante et fiable de BAP humains. Nous décrivons dans cette thèse la capacité des cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSCs) à générer des BAP et capables de se différencier avec une grande efficacité dans un modèle en 3D en adiposphères. Les hiPSC- adiposphères ont un profil d'expression de la matrice extracellulaire et des récepteurs couplés à la protéine G (GPCR) similaires aux adiposphères humaines dérivées de progéniteurs adipeux abdominaux sous-cutanés. Ces résultats montrent la pertinence physiologique du modèle hiPSC-adiposphères. De plus, les hiPSC-adiposphères contiennent plus de cellules UCP1 positives que les adiposphères abdominales. L’expression de UCP1 dans les hiPSC-adiposphères est augmentée suite à la stimulation par le 8-CPT-AMPc ou du 8-Br-GMPc de manière aiguë et chronique. Ceci indique que notre modèle 3D présente les caractéristiques métaboliques des adipocytes de type bruns et peut répondre à un criblage de molécules visant à augmenter la dépense énergétique.Enfin, l'enrichissement du modèle 3D en cellules endothéliales humaines (HDMEC) a été réalisé via une co-culture en suspension. La fonctionnalité des HDMECs intégrées dans les hiPSC-adiposhères a été testée in vitro par la visualisation de l’absorption de LDL. Nous avons aussi montré que les hiPSC-BAs et les HDMEC pouvaient générer des structures de type vascularisées dans le core de la sphère.En conclusion, le modèle hiPSC-adiposphère représente une source illimitée d’adipocytes d’intérêt thérapeutique qui pourrait, dans un avenir proche constituer un nouvel outil approprié à la fois pour la transplantation chez les patients atteint d’obésité morbide et pour le criblage de médicaments. Le potentiel thérapeutique des hiPSC-adiposphères sera tester prochainement dans un modèle de souris obèses.