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CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O advento sistema CRISPR/Cas9 tornou o processo de edição gênica consideravelmente mais fácil e direto, uma vez que retirou empecilhos técnicos relacionados aos sistemas já disponíveis. Desta forma, foram permitidos diversos avanços no entendimento da função de elementos genômicos, assim como a produção de embriões geneticamente modificados com diversas finalidades. O atual trabalho objetivou a edição gênica no gene da beta-lactoglobulina em células somáticas bovinas objetivando a produção futura de embriões da espécie geneticamente modificados. Considerando-se que a hipersensibilidade a essa proteína responde pela maior parte das alergias ao leite bovino, a produção de animais cujo leite não contenha essa molécula é de grande interesse para a indústria de laticínios. Durante os experimentos, foi possível obter uma linhagem de células bovinas MDBK expressando a enzima Cas9 (MDBK-Cas). Usando células MDBK e as células MBDK-Cas foi possível se obter com sucesso edições gênicas no locus beta-lactoglobulina utilizando-se os componentes do sistema CRISPR/Cas9 na forma de mRNA da proteína Cas9 e sgRNAs. Conclui-se que o sistema CRISPR/Cas9 pode ser usado com os sgRNA desenhados neste estudo para editar o gene da betalactoglobulina em células MDBK. Assim, células MDBK podem ser utilizadas como alvo o locus em estudo. Modelos de estudos para edição do genoma bovino. Em vista da escassa literatura constando de trabalhos em que tenha sido feita a edição gênica em embriões bovinos, os dados gerados por esse trabalho colaborarão para o avanço do estado da arte no que diz respeito a engenharia gênica de bovinos e no conhecimento do funcionamento do sistema CRISPR/Cas9. The advent of the CRISPR / Cas9 system made the process of gene editing considerably easier and more straightforward, since it removed technical impediments related to the systems already available. In this way, several advances were made in the understanding of the function of genomic elements, as well as the production of genetically modified embryos for various purposes. The present work aimed at the genetic editing of the beta-lactoglobulin gene in bovine somatic cells aiming at the future production of genetically modified embryos of the species. Considering that hypersensitivity to this protein accounts for most of the allergies to bovine milk, the production of animals whose milk does not contain this molecule is of great interest to the dairy industry. During the experiments, it was possible to obtain a lineage of bovine MDBK cells expressing the Cas9 enzyme (MDBK-Cas). Using MDBK cells and MBDKCas cells it was possible to successfully obtain gene editions at the beta-lactoglobulin locus using the components of the CRISPR / Cas9 system as mRNA of the Cas9 protein and sgRNAs. It is concluded that the CRISPR / Cas9 system can be used with the sgRNAs designed in this study to edit the beta-lactoglobulin gene in MDBK cells. Thus, MDBK cells can be targeted as the locus under study. Models of studies for editing the bovine genome. In view of the scarce literature consisting of studies in which bovine embryos have been genetically engineered, the data generated by this work will contribute to the advancement of the state of the art regarding the genetic engineering of cattle and the knowledge of the functioning of the system CRISPR / Cas9.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Hidroxiapatita (HA) foi sintetizada em meio aquoso com recipiente imerso em banho ultrassônico e testada para atuar como adsorvente das proteínas do soro de leite α- lactoalbumina (ALA) e β-lactoglobulina (BLG). Inicialmente foram realizadas análises para caracterizar o adsorvente. A relação cálcio/fosfato da HA sintetizada foi de 1,57. A partir da difração de raios X, verificou-se que o material apresentava elevada pureza, baixa cristalinidade (9 %) e cristais com tamanho médio de 27 nm. A espectroscopia de infravermelho revelou: (1) picos característicos de HA para o íon PO 43− nas regiões de 561, 1028 e 603 cm -1 e para o íon OH - nas regiões de 1630 e 3068 cm -1 , bem como (2) picos de baixa intensidade em 880 e 1049 cm -1 referente ao íon CO 32− , associado a impurezas. Análises de espectroscopia Raman revelaram picos característicos para grupos PO 4 nas regiões de 430, 590, 962 e 1047 cm- 1 . Por meio do Potencial Zeta, verificou-se a interação entre as HAs comercial e sintetizada e as proteínas ALA e BLG comerciais. Objetivando compreender melhor o comportamento adsortivo da HA, utilizou-se ALA e BLG comerciais para a realização de experimentos cinéticos, nos valores de pH 3,4; 6,0; 7,0 e 8,0, e isotérmicos, em pH 3,4 e 6,0, nas temperaturas de (5, 15, 25, 35 e 45 °C). Os modelos matemáticos de pseudo- primeira ordem, pseudo-segunda ordem e de difusão de partículas foram ajustados aos dados cinéticos. O modelo de pseudo-segunda ordem foi o que levou ao melhor ajuste para todos os tratamentos. Os modelos isotérmicos de Langmuir e Freundlich ajustaram-se aos dados de equilíbrio obtidos em pH 6,0, no entanto, para o pH 3,4 os modelos não levaram a bons ajustes. A precipitação seletiva utilizando citrato de sódio (20 g∙L -1 ) foi empregada para separar as proteínas ALA e BLG do soro de leite doce. O resultado foi um aumento da relação ALA/BLG de 0,34 no soro para 9,27 no precipitado ressuspendido. Em relação à BLG, ocorreu um aumento de 2,93 no soro para 22,60 da relação BLG/ALA na fase fluida. Em seguida, empregou-se a adsorção em HA para isolar as proteínas ALA e BLG. A recuperação de BLG na fase fluida foi semelhante para a HA comercial e a sintetizada. No entanto, para a dispersão em que o precipitado foi ressuspendido, a adsorção de ALA foi superior para a HA sintetizada comparado à HA comercial. Para a dessorção das proteínas, as melhores condições foram obtidas em tampão fosfato de sódio 0,4 mol∙L -1 em pH 6,8 a 50 °C sob agitação (50 rpm/1 h), em que, obteve-se rendimento superior a 80 % (m/v) para todos os tratamentos. Ao final do processo de separação, recuperou-se 26 e 53 % (m/v) da ALA presente, inicialmente, no soro de leite utilizando as HAs comercial e sintetizada, respectivamente. Em relação à BLG, a recuperação foi 65 e 70 % (m/v) utilizando as HAs comercial e sintetizada, respectivamente. As informações contidas neste trabalho poderão auxiliar no desenvolvimento de processos em que se pretende utilizar a HA como adsorvente para as proteínas ALA e BLG. Hydroxyapatite (HA) was synthesized in aqueous medium in the presence of ultrasound and tested to act as an adsorbent of whey proteins α-lactoalbumin (ALA) and β-lactoglobulin (BLG). Initially, analyzes were performed to characterize the adsorbent. The calcium/fosfate ratio of synthesized HA was 1.57, below the stoichiometric HA value that is 1.67. From the X-ray diffraction analyzes, it was found that the material had high purity, low crystallinity (9%) and crystals with an average size of 27 nm. Infrared spectroscopy revealed: (1) peaks for the PO 43− ion in the regions of 561, 1028 and 603 cm -1 , for the OH - ion 1630 and 3068 cm -1 and (2) presence of a low-intensity peak at 880 and 1049 cm -1 for the CO 32− ion. Raman spectroscopy analyzes revealed characteristic peaks for PO 4 groups in the 430, 590, 962 and 1047 cm -1 regions. The characterization analyzes showed that the proposed process for HA synthesis produces a material with high purity and low crystallinity. Through the Zeta Potential was verified the interaction between the commercial and synthesized HAs and the ALA and BLG proteins. To understand the adsorptive behavior of HA and the proteins ALA and BLG, experiments were performed at pH 3.4; 6.0; 7.0 and 8.0 for the kinetic experiments; and (5, 15, 25, 35 and 45 °C) at pH 3.4 and 6.0 for the isothermal curves. The kinetic models of pseudo-first order, pseudo-second order and particle diffusion were fitted to the data. The pseudo-second order model obtained the best fit for all treatments, indicating the occurrence of chemisorption. The Langmuir and Freundlich isothermal models adjusted to the equilibrium data obtained at pH 6.0, however, at pH 3.4 the models did not adjust. Selective precipitation was employed to separate the ALA and BLG proteins present in the sweet whey. The result was an increase in the ALA/BLG ratio of 0.34 in serum to 9.27 in the resuspended precipitate. For the BLG, there was an increase from 2.93 to 22.60 in the BLG/ALA ratio in the fluid phase. Then, BLG adsorption was applied to the fluid phase with similar results for commercial and synthesized HA. For the resuspended precipitate, the ALA adsorption was higher for the synthesized compared to the commercial HA. For proteins desorption, 0.4 mol.L -1 of sodium phosphate buffer at pH 6.8 at 50 °C under agitation (50 rpm/1 h) was used, yield greater than 80% (m /v) was obtained for all treatments. At the end of the process, 26 and 53% (m/v) of ALA, present initially in the whey, was recovered using commercial and synthesized HAs, respectively. For BLG, the recovery was 65 and 70% (m/v) using the commercial and synthesized HAs, respectively. The information contained in this work can help in the development of processes in which HA is to be used as an adsorbent for ALA and BLG proteins.

Este trabajo tiene como objetivo el desarrollo de nanoestructuras producidas a partir de β-Lactoglobulina para la posterior encapsulación y liberación controlada de riboflavina (vitamina B2). Estos nanosistemas se consiguieron fabricar gracias a las propiedades gelificantes que posee la β-Lg, seleccionando para ello diferentes condiciones de pH, temperatura, tiempos de calentamiento y concentraciones de proteína iniciales. Las nanoestructuras se caracterizaron en términos de tamaño medio, índice de polidispersidad (PDI), potencial zeta y eficiencia de asociación y capacidad de carga de la riboflavina. El tamaño medio de las nanoestructuras formadas fue de 77.69 ± 5.92 nm para muestras sin riboflavina y 81,81 ± 7,72 nm con la riboflavina encapsulada, presentando un PDI de 0.182 ± 0.003 y 0,261 ± 0,005 respectivamente. Los nanosistemas mostraron una eficiencia de asociación del 75,54 ± 0,54% y una capacidad de carga del 5.84 ± 0.10%. Por último se realizó un ensayo de estabilidad frente a la luz para ver como afectaba a la estabilidad de las nanoestructuras fabricadas.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico A encapsulação de moléculas bioativas é utilizada há décadas pelas industrias de alimentos e representa uma real oportunidade de desenvolvimento de produtos inovadores. Dada a sua versatilidade funcional, as proteínas do leite, em particular as proteínas do soro de leite, tem sido utilizadas para fins de encapsulação por meio de diferentes técnicas. Complementarmente, estudos recentes mostraram a habilidade de proteínas alimentares de carga oposta de se co-associar formando micro-esferas através da coacervação complexa. Compreender as forças que governam o processo de coacervação de hetero-proteínas e o efeito da presença de pequenos ligantes (bioativos) são pré-requisitos para o uso de coacervados complexos de hetero-proteínas como agentes de encapsulação. Neste contexto, o objetivo do meu projeto de tese foi entender o mecanismo de coacervação complexa entre β-lactoglobulina (β-LG) e lactoferrina (LF) na ausência ou na presença de pequenos ligantes. As condições ótimas para a coacervação entre β-LG e LF foram identificadas como sendo entre os pH 5.4 – 6.0 e em presença de um excesso molar de β-LG. Interessantemente, LF demonstrou uma seletividade de coacervação com a β-LG A, a isoforma ligeiramente mais eletronegativa. A nivel molecular, a presença de dois sítios de interação da β-LG com a LF foram evidenciados. Em complemento, hetero-complexos como o pentâmero LF(β-LG 2 ) 2 e outros complexos maiores (LFβ- LG 2 ) n foram identificados como constituintes da fase coacervada. Para avaliar o efeito da presença de pequenos ligantes na coacervação complexa entre β-LG e LF, foram usados modelos de moléculas hidrofóbica (ANS) e hidrofílica (ácido fólico). Embora nas condições experimentais os pequenos ligantes não tenham interagido com a β-LG, ambos interagiram com a LF induzindo sua auto-associação em nano- partículas. Concentrações relativamente elevadas de pequenos ligantes afetaram a interação entre as duas proteínas levando a uma transição entre os regimes de coacervação e agregação. Le bénéfice de l’encapsulation des molécules bioactives a séduit les industries agroalimentaires depuis plusieurs décennies et constitue toujours un levier de développement pour des produits innovants. Plus récemment des études ont montré la capacité de protéines alimentaires de charge opposée à s’assembler en microsphères par coacervation complexe. La compréhension des forces gouvernant le processus de coacervation complexe entre protéines et l’influence exercée par la présence de petits ligands (bioactifs) demeurent des prérequis pour l’utilisation des coacervats complexes de protéines comme agent d’encapsulation. Dans ce contexte, l’objectif de mon projet de thèse a été de comprendre le mécanisme de coacervation complexe entre une protéine chargée négativement, la β-lactoglobuline (β-LG), et une protéine chargée positivement, la lactoferrine (LF), issues du lactosérum en absence et en présence de petits ligands. Les conditions optimales de coacervation entre la β-LG et la LF ont été définies entre pH 5.4 et 6.0 ainsi qu’en présence d’un excès de β-LG. La LF a présenté une coacervation préférentielle avec le variant A de la β-LG qui se distingue du variant B par la substitution de 2 acides aminés. Au niveau moléculaire, deux sites de fixation de la β-LG sur la LF ont été identifiés. En outre, par la mesure d’une part des coefficients de diffusion rotationnel et d’autre part de la cinétique de diffusion des entités moléculaires constituant les coacervats, il est suggéré que ces derniers sont formés à partir de β-LG libre, de pentamère, LF(β- LG 2 ) 2 , ainsi que des entités plus larges, (LFβ-LG 2 ) n . Afin d’évaluer l’effet de la présence de petits ligands sur la coacervation complexe entre la β-LG et la LF, des ligands modèles, l’un hydrophobe (ANS), l’autre hydrophile (acide folique) ont été utilisés. Dans les conditions expérimentales testées ces deux ligands n’ont pas d’affinité pour la β-LG, mais après interaction avec la LF ils sont capables d’induire son auto-association en nanoparticules. En concentrations élevées de ligands, la coacervation complexe entre la β-LG et la LF est perturbée et une transition vers un régime d’agrégation est observée. Encapsulation of bioactives has been used by the food industries for decades and represents a great potential for the development of innovative products. Given their versatile functional properties, milk proteins in particular from whey have been used for encapsulation purposes using several encapsulation techniques. In parallel, recent studies showed the ability of oppositely charged food proteins to co-assemble into microspheres through complex coacervation. Understanding the driving forces governing heteroprotein coacervation process and how it is affected by the presence of ligands (bioactives) is a prerequisite to use heteroprotein coacervates as encapsulation device. In this context, the objective of my thesis work was to understand the mechanism of complex coacervation between β-lactoglobulin (β-LG) and lactoferrin (LF) in the absence and presence of small ligands. The conditions of optimal β-LG - LF coacervation were found at pH range 5.4-6 with a molar excess of β-LG. Remarkably, LF showed selective coacervation with β-LG A, the slightly more negative isoform. At molecular level, the presence of two binding sites on LF for β-LG was evidenced. Moreover, the heterocomplexes such as pentamers LF(β-LG 2 ) 2 and quite large complexes (LFβ-LG 2 )n were identified as the constituent molecular species of the coacervate phase. To evaluate the β-LG - LF complex coacervation in the presence of small ligands, models of hydrophobic (ANS) and hydrophilic molecules (folic acid) were used. Although under the experimental conditions tested the small ligands did not interact with β-LG, both interacted with LF inducing its self- association into nanoparticles. High relative concentrations of small ligands affected the interaction between the two proteins leading to a transition from coacervation to aggregation regime.

Informações sobre peso à desmama de bezerros Nelore foram utilizadas após ajuste para idade padrão aos 205 dias, sexo, idade da mãe, touro e mês de desmama, para separar as reprodutrizes em dois grupos, segundo o peso de suas crias. As médias de peso dos bezerros ajustadas pelo método dos quadrados mínimos e erros-padrão (LSM± SE) foram para os grupos pesados (P) e leves (L) 163,21± 2,18kg e 134,44± 2,18kg, respectivamente, com 41 animais em cada grupo. Essas reprodutrizes foram submetidas a coleta de sangue para estudo de polimorfismos do gene da beta-lactoglobulina, por meio da técnica de PCR-RFLP. A amplificação e a digestão de um fragmento do gene da beta-lactoglobulina entre o éxon II e III identificou os genótipos 1AA, 24AB e 56BB, com as freqüências de 0,16 e 0,84 para os alelos A e B, respectivamente. Os 24 animais com genótipo AB apresentaram LSM± SE de peso de seus produtos de 149,50± 4,17kg, e os 56 animais de genótipo BB tiveram média de 148,44± 2,73kg. O teste do qui-quadrado não apresentou significância (P>0,05), isto é, os grupos P e L não diferiram entre si quanto às freqüências alélicas apresentadas para esse gene. O genótipo das reprodutrizes não afetou o peso à desmama de suas crias, o que sugere haver outros fatores genéticos e não genéticos de maior magnitude que afetam o peso à desmama. Weaning weights from a Nelore herd were used after adjustment of means for 205 days of age, sex, age of dam, sire and weaning month, and resulted into two groups of cows that differed by the weaning weight of their calves. The least square means (LSM) and standard error (SE) were for heavy group 163.21± 2.18kg and for light group 134.44± 2.18kg, with 41 animals in each group. These animals were genotyped by DNA polymorphisms of beta -lactoglobulin gene, using PCR-RFLP. After amplification and digestion of a beta-lactoglobulin gene fragment between II and III exon, genotypes 1AA, 24AB and 56BB were identified, with 0.16 and 0.84 frequencies for A and B alleles, respectively. The 24AB and 56BB cows showed calves with LSM± SE of 149.50± 4.17kg and 148.44± 2.73kg respectively, for weaning weight. No difference (P>0.05) was found and the heavy and light groups were similar for the allelic frequencies for this gene. The dam’s genotype did not affect the weaning weight of the calves. This suggests of having other factors, genetic or non-genetic, with major magnitude that affect the weaning weight.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico In this work we studied the adsorption behavior of the proteins α-lactalbumin (α-La), β-Lactoglobulin (β-Lg) and of the glicomacropeptídeo (GMP) in multiple-walled carbon nanotubes (MWCNT) in the presence and absence of electrolytes of Hofmeister series at different pH values, aimed in the understanding of the mechanism of protein adsorption on carbon nanotubes (NCTS). We investigated the effect of pH of the reaction medium, nature of electrolyte and protein structure on the amount adsorbed (Γ) of different proteins and of the GMP. A variation in net charge of protein and of the electrolyte nature changes the process of nanotube-protein interaction. The Γ of α-La is greater when its net charge is positive (pH 3) and β-Lg when the net charge is negative (pH 9). The high values of Γ demonstrated the big potential of NCTs in the protein adsorption. At pH 9 there is an increase in Γ of α-La due to the presence of 100,0 mM electrolyte, for [α-La] ≈ 0,7000 mg mL-1 in the presence of only buffer pH 9 are: Γ Buffer/α-La = 197,0 mg g-1, going to Γ NaSCN/α-La = 233,0 mg g-1, Γ Na2SO4/α-La = 281,0 mg g-1, Γ NaHPO4/α-La = 256,0 mg g-1, opposite behavior was observed for β-Lg. At pH 9 the highest values of Γ were observed for the GMP and the process was little influenced by electrolytes. The results show that the mechanism of adsorption depend on the nature of the polyelectrolyte, and the isotherms of β-Lg and α-La features of monolayer adsorption while the adsorption isotherms GMP did not fit well to Langmuir model featuring two characterizing the regions of saturation adsorption bilayer. In addition, that is the first time that thermodynamic parameters were determined for adsorption of proteins in NCTs using two models: the Langmuir model and the thermodynamic model of infinite dilution. The thermodynamic analysis based on calorimetric titrations showed that the adsorption of proteins in all conditions evaluated occurs spontaneously (ΔadsG°

Con el objeto de caracterizar el gen de la k-caseína (k-CN) y beta-lactoglobulina (BLG) y determinar la asociación entre éstos sobre la producción y composición de la leche en la raza Criollo Limonero, se utilizó la técnica de la reacción en cadena de polimerasa y la detección de polimorfismo en la longitud de los fragmentos restringidos (PCR-RFLP) en 50 vacas en producción, de la estación local Carrasquero del Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA-Zulia). Los genotipos fueron determinados a través de electroforesis en geles de agarosa. Las frecuencias obtenidas del locus de la k-CN fueron A (0,41) y B (0,59) y las frecuencias genotípicas fueron AA (0,10), AB (0,62) y BB (0,28), mientras que, para BLG, las frecuencias observadas fueron A (0,21) y B (0,79) con frecuencias genotípicas de AA (0,06), AB (0,30) y BB (0,64). Estos resultados mostraron que la población estudiada se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg (P

This work presents, in its first chapter, a brief review on production and compositions of cheese whey, emphasizing the nutritional and technological properties of whey proteins. Subsequently, the main methods of separation of whey proteins are addressed, using aqueous two-phase systems (ATPS) as an efficient and economically viable liquid-liquid extraction technique for separation of alpha-lactalbumin (α-la) and beta-lactoglobulin (β-lg) proteins. The second chapter describes the formation and determination of the phase equilibrium of new ATPS formed by copolymer L64 + organics salts (ammonium citrate, sodium citrate, sodium succinate or sodium tartrate) + H2O at different temperatures (278.15, 288.15 and 298.15 K). Microcalorimetric measurements showed that the phase separation process in these systems was exothermic and the salt sodium citrate (Na3C6H5O7) was more effective in promoting phase separation than ammonium citrate ((NH4)3C6H5O7). The capacity of the different anions in inducing ATPS formation with L64 followed the order: citrate (C6H5O73–) > tartrate (C4H4O62–) > succinate (C4H4O42–). Finally, the third chapter describes an application of ATPS formed by polymer PEO 1500 + organics salts (sodium citrate, sodium succinate or sodium tartrate) + H2O for partition of α-la and β-lg proteins. In addition the thermodynamical parameters (ΔtrH°, ΔtrS° e ΔtrG°) associated with protein transfer from the bottom phase (BP) to the top phase (TP) were determined. The results showed that the partition from BP to TP is thermodynamically favorable to α-la (- 6.61 < ΔtrG° < - 0.77 kJ mol-1), but is unfavorable for β-lg (2.68 < ΔtrG° < 6.20 kJ mol-1). Additionally, this process occurs with loss of configurational entropy (- 9.23 < TΔtrS° < - 1.34 kJ mol-1) and the intermolecular interactions between proteins and poly(ethylene glycol) molecules are more favorable than intermolecular interactions between proteins and salt molecules (-7.95 < ΔtrH° < -1.42 kJ mol-1) for both proteins in all ATPS studied. To explain the partition behavior of α-la and β-lg the model derived from the Flory-Huggins theory was used and it was observed that α-la partition to the TP was enthalpically driven, while the β-lg partition to the BP was entropically driven. Este trabalho apresenta, no primeiro capítulo, uma breve revisão sobre obtenção do soro do leite e sua composição, destacando as propriedades nutricionais e tecnológicas das proteínas do soro. Posteriormente, aborda os principais métodos de separação das proteínas do soro, apresentando a utilização de sistemas aquosos bifásicos (SABs) como uma técnica eficiente e economicamente viável de extração líquido-líquido para separação das proteínas α-lactoalbumina (α-la) e β-lactoglobulina (β-lg). O segundo capítulo descreve a obtenção e a determinação do equilíbrio de fase de novos SABs constituídos pelo copolímero L64 + sais orgânicos (citrato de amônio, citrato de sódio, succinato de sódio ou tartarato de sódio) + H2O em diferentes temperaturas (5, 15 e 25 °C). Medidas microcalorimétricas mostraram que o processo de separação de fases nestes sistemas foi exotérmico e o sal citrato de sódio (Na3C6H5O7) foi mais efetivo em promover a separação de fases que o sal citrato de amônio ((NH4)3C6H5O7). A capacidade dos diferentes ânions em induzir a formação de SABs com L64 obedeceu à seguinte ordem: citrato (C6H5O73–) > tartarato (C4H4O62–) > succinato (C4H4O42–). Por fim, o terceiro capítulo aborda uma aplicação dos SABs constituídos pelo polímero PEO 1500 + sais orgânicos (citrato de sódio, succinato de sódio ou tartarato de sódio) + H2O para a partição das proteínas α-la e β-lg. Além disso, os parâmetros termodinâmicos (ΔtrH°, ΔtrS° e ΔtrG°) associados à transferência das proteínas da fase inferior (FI) para a fase superior (FS) dos sistemas foram determinados. Os resultados obtidos mostraram que a partição da FI para FS é termodinamicamente favorável para α-la (- 6,61 < ΔtrG° < - 0,77 kJ mol-1), mas é desfavorável para β-lg (2,68 < ΔtrG° < 6,20 kJ mol-1). Além disso, este processo ocorre com perda de entropia configuracional (- 9,23 < TΔtrS° < - 1,34 kJ mol-1) e as interações intermoleculares entre moléculas de proteína e polietilenoglicol são mais favoráveis que as interações intermoleculares entre moléculas de proteína e sal (- 7,95 < ΔtrH° < - 1,42 kJ mol-1), para ambas as proteínas em todos os SABs estudados. Para explicar o comportamento de partição das proteínas, o modelo derivado da teoria de Flory-Huggins foi utilizado e observou-se que a partição da α-la para a FS foi entalpicamente dirigida, enquanto a partição da β-lg para a FI foi entropicamente dirigida.

Con el objeto de caracterizar el gen de la beta-lactoglobulina (BLG) en la raza Criollo Limonero, se utilizó la técnica PCR-RFLP en 163 animales puros de la estación local Carrasquero (Carrasquero-estado Zulia), los genotipos fueron determinados a través de electroforesis en geles de agarosa. Las frecuencias obtenidas del locus de la BLG fueron A (0,22) y B (0,78) y las frecuencias genotípicas fueron AA (0,07 ); AB (0,29) y BB (0,64), la población estudiada se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg (P

El objetivo del presente trabajo fue estudiar la funcionalidad de hidroxipropilmetilcelulosas y sus mezclas con beta-lactoglobulina en coloides alimentarios. Los estudios realizados muestran que estos polisacáridos en solución presentan un comportamiento complejo que se manifiesta en la asociación/autoensamblaje mediado por interacciónes hidrofóbicas y modulado fuertemente por el pH, como tambien por la concentración y la temperatura. A pH3 la asociación/autoensamblaje de hidroxipropilmetilcelulosas se ve impedida en solución. El grado de asociación/autoensamblaje tambien puede modificarse por la aplicación de ultrasonidos de lata intensidad, impactando en algunas propiedades físicoquímicas de las celulosas. En la interfase aceite/ agua, las hidroxipropilmetilcelulosas, especialmente las de bajo peso molecular, presentan una importante actividad, la cual está modulada tambien por el pH. Las hidroxipropilmetilcelulosas presentan buenas propiedades emulsificantes a ambos pH. En las mezclas con beta-lactoglobulina se observa la misma tendencia con la variación del pH y la concentración de los biopolimeros en las mezclas. Existe distinta interacción entre ellos lo cual afecta su comportamiento en solución y en los coloides estudiados. Asi, el conocimiento y la caracterización de estos biopolimeros permitiran la manipulación de propiedades macroscopicas de productos alimenticios, controlando las interacciónes de un modo deseable, logrando asi la optimización en el uso de los ingredientes. The objective of the present work was to study the hydroxypropylmethylcelluloses and their mixtures with beta-lactoglobulin in food colloids. The studies showed that these polysaccharides have a complex behavior in solution, leading to self-assembled structures by hydrophobic interactions, strongly modulated by pH, but also by polysaccharide concentration and temperature. Particularly at pH3, the hydroxypropylmethylcelluloses self-assembly would be impeded. The self- assembly degree could also be modified by the application of highintensity ultrasound that impacted in some physico-chemical properties. At the oil-water interface, the hydroxypropylmethylcelluloses, especially those with low molecular weight, showed a high interfacial activity also modulated by pH. Good emulsifying activity was observed for all the hydroxypropylmethylcelluloses at both pH. The same was observed in the mixtures with beta-lactoglobulin as affected by pH and concentration of componenets. The different interactions observed affected their behavior in solution and in food colloids (interfaces and emulsions). Thus, the knowledge and the characterization of these biopolymers would allow the manipulation of the macroscopic properties of food products and optimizing the use of these ingredients. Fil: Camino, Nerina Andrea. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito protetor das frações protéicas do soro do leite sobre as vilosidades intestinais de camundongos Balb/C, infectados por Escherichia coli 0157:H7 amostra ATCC 43895. Oito grupos, compostos por seis fêmeas cada um, foram separados aleatoriamente e receberam dieta padrão (AIN93G) (grupo controle) e modificada (AIN93 modificada com adição das frações: alfa-lactalbumina, beta-lactoglobulina e concentrado protéico total) e água ad libitum por sete dias. Os grupos desafiados receberam alíquotas de 0,5ml de E. coli O157: H7, na concentração de 7 x 1010UFC/ml por meio de cânula de gavagem. Os animais foram acompanhados clinicamente e sacrificados, no 8º dia experimental, conforme recomendações do CETEA/UFMG. As amostras das porções intestinais foram submetidas à histopatologia e morfometria. As análises estatísticas foram realizadas pela técnica de pareamento através do Teste t-Student e pelo teste ANOVA ONE WAY incluindo análise de variância e teste de comparação múltipla segundo Tukey (Software GraphPad Prism 3.0.3® - San Diego CA). As frações beta-lactoglobulina e alfa-lactalbumina exerceram efeito protetor sobre as vilosidades intestinais do jejuno distal e íleo (p < 0,05), respectivamente, em camundongos Balb/C infectados por E. coli 0157:H7. Por outro lado, o concentrado protéico total (WPC) não demonstrou efeito protetor sobre as vilosidades intestinais. O soro do leite apresenta grande potencial para o controle de infecções intestinais causadas por E. coli 0157:H7 The effect of dietary whey protein concentrate on adhesion and colonization of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in small intestine of Balb/C mice was available. Eight groups of the six females each one, had been separate and had randomly and received diet standard (AIN93G) (control group) and modified (AIN93 modified with addition from the fractions: alpha-lactalbumin and beta-lactoglobulin and total whey protein concentrate - WPC) and water ad libitum per seven days. The blunt groups had received aliquot from 0,5ml of E. coli O157: H7 (ATCC 43895), in the concentration of 7 x 1010 UFC/ml by means of gavage cannula. The animals had been examined clinically and sacrificed, in 8º experimental day, as recommendations of the bioethics committee (CETEA/UFMG). The samples of the intestinal portions had been submitted to the histopathology and morphometry. The statistical analyses had been carried through by the Test t-Student and by test ANOVA ONE WAY including analysis of variance and test of multiple comparison according to Tukey (Software GraphPad Prism 3.0.3® - San Diego HERE). The fractions beta-lactoglobulin and alpha-lactalbumin had protective effect on the intestinal vilosity of the distal part on the jejune and the ileum (p< 0,05), respectively, in Balb/C mice infected by E. coli 0157: H7. On the other hand, the WPC did not demonstrate protective effect on the intestinal vilosity. The whey protein presents great potentialfor the control of intestinal infections caused by E. coli 0157: H7

O objetivo deste trabalho foi recuperar e fracionar as proteínas do soro de leite por meio da técnica de coacervação, utilizando o polissacarídeo carboximetilcelulose sódica (CMC). O soro de leite foi obtido da fabricação industrial do queijo tipo frescal. Foram estudados concentrações do polímero (0,1% a 0,9% CMC p/v) e valores de pH, a fim de se obter uma precipitação seletiva das proteínas do soro de leite, sendo as condições otimizadas para produção em piloto. Mediante ajuste gradual, foi possível obter, no pH 3, uma precipitação das proteínas totais (PT/CMC); no pH 4, da beta-lactoglobulina (beta-Lg/CMC) e, no pH 3,2, a maior proporção de alfa-lactoalbumina (alfa-La/CMC). Os coacervados foram separados, por aplicação de força centrífuga, e caracterizados em relação à composição centesimal e perfil eletroforético. O maior rendimento foi verificado no fracionamento da beta-lactoglobulina, com 86% de recuperação dessa classe de proteínas do soro desnatado. O coacervado beta-lactoglobulina-CMC (beta-Lg/CMC) apresenta maior conteúdo protéico, provavelmente em conseqüência da proporção estabelecida entre os hidrocolóides coacervados. O coacervado composto pela alfa-La/CMC apresentou menor conteúdo protéico e porcentagem de recuperação dessas proteínas presentes no soro. This work aimed to recover and fractionate milk whey proteins through the coacervation technique, using sodium carboxymethyl cellulose (CMC) polysaccharide. Milk whey was obtained from the manufactured cheese type "frescal". Polymer concentration (0.1-0.9% CMC w/v) and pH values were studied in order to obtain a selective precipitation of whey proteins; conditions were optimized to pilot scale production. After pH gradual adjustment the precipitation of total proteins (PT/CMC) was achieved for pH 3; for pH 4 beta-lactoglobulin (beta-Lg/CMC) precipitation and for pH 3.2 the greatest proportion of alpha-lactoalbumin (alpha-La/CMC) precipitation. Coacervates were separated by centrifuge force, and characterized in relation to their composition and electrophoretic profile. The highest yield was obtained from fractionation of beta-Lg/CMC with precipitation of 86% of this whey protein type. Highest protein content was showed by beta-Lg/CMC, probably due to the proportion among hydrocolloids. The alpha-La/CMC showed minor protein content and yield recuperation of this whey protein fraction.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico A cromatografia de troca iônica é uma técnica que há décadas vem sendo estudada, mas apenas recentemente começou a ser amplamente difundida na purificação de macromoléculas. Para se conhecer os fundamentos e aplicações desta técnica, foi realizada uma revisão sobre o assunto, no formato de artigo, enfocando principalmente a purificação de proteínas. Foram abordados tópicos como a estrutura protéica, o mecanismo de troca iônica, os diversos fatores que influenciam este processo e apresentados exemplos de aplicação da cromatografia de troca iônica na purificação de proteínas. Para que esses processos sejam economicamente viáveis e operacionalmente seguros devem ser otimizados, sendo importante o conhecimento do equilíbrio termodinâmico do processo. Foram determinadas as isotermas de adsorção para as proteínas α-lactoalbumina (α-la) e β-lactoglobulina (β-lg) em uma coluna de troca iônica em sistemas monocomponentes, a quatro temperaturas (283.15 K, 293.15 K, 303.15 K e 313.15 K). Dentre os cinco diferentes tipos de modelos de isotermas ajustados, os modelos de Langmuir, Jovanovic e Toth apresentaram os melhores resultados. A análise termodinâmica baseada na equação não-linear de van t Hoff demonstrou que o processo de troca iônica para as duas proteínas nas condições estudadas é endotérmico, entropicamente dirigido, ocorrendo de maneira espontânea (∆G0ad < 0) com o aumento da temperatura. Por fim, foram estudados sistemas multicomponentes formados por α-la e β-lg em diferentes proporções (1:1, 1:3, 3:1 e 1:2). Foi proposta uma modificação no método de análise frontal empregado para a determinação das isotermas de adsorção competitivas. Ao invés do método proposto por Jacobson et al. (1987) para sistemas multicomponentes, foi utilizado o método proposto por Jacobson et al. (1984) para sistemas monocomponentes, aplicado simultaneamente para os diferentes compostos do sistema. O modelo competitivo de Langmuir se ajustou satisfatoriamente aos dados experimentais, comprovando que a alternativa proposta pode ser aplicada a sistemas multicomponentes formados por macromoléculas. The ion-exchange chromatography is a technique that has been studied at a long time, but just now began to be diffused to macromolecules purification. To a better understanding of this technique, a review was made, focusing mainly the purification of proteins. It was seen topics as protein structure, the mechanism of ion- exchange, the factors that influence this process and many examples of application of ion-exchange chromatography in the proteins purification. For these processes to be economically viable and operationally safes, they should be optimized, being important the knowledge of the thermodynamic equilibrium of the process. It was obtained the adsorption isotherms of α-lactalbumin (α-la) and β-lactoglobulin (β-lg) presents in single-component systems, in a ion-exchange column at four temperatures (283.15 K, 293.15 K, 303.15 K and 313.15 K). The adjustment of five different isotherm models was verified, and the Langmuir, Jovanovic and Toth models presented the best results. Thermodynamic analysis based on the non-linear van't Hoff equation demonstrated that the process of ion-exchange of both proteins in the studied conditions is endothermic, entropically driven, occurring spontaneously (∆G0ad < 0) with the increase of temperature. Finally, it was studied multicomponent systems formed for α-la and β-lg at different proportions (1:1, 1:3, 3:1 and 1:2). A modification was proposed in the frontal analysis method used for the determination of competitive adsorption isotherms. Instead of the method proposed by Jacobson et al. (1987) for multicomponent systems, the method proposed by Jacobson et al. (1984) for single-component systems was used, applied simultaneously for each compound of the complex system. The competitive Langmuir model was adjusted satisfactorily to the experimental data, showing that this alternative method can be applied to multicomponent systems formed by macromolecules.

Con el objeto de caracterizar el gen de la beta-lactoglobulina (BLG) en la raza Criollo Limonero, se utilizó la técnica PCR-RFLP en 163 animales puros de la estación local Carrasquero (Carrasquero-estado Zulia), los genotipos fueron determinados a través de electroforesis en geles de agarosa. Las frecuencias obtenidas del locus de la BLG fueron A (0,22) y B (0,78) y las frecuencias genotípicas fueron AA (0,07 ); AB (0,29) y BB (0,64), la población estudiada se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg (P