Search

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2018. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP-DF). CAPÍTULO I: Neste trabalho, foi estudada uma família na qual 3 irmãs apresentaram amenorréia primária por provável alteração na formação dos ductos de Müller (DMs), caracterizada por hipoplasia uterina, endométrio não responsivo a estrógenos e gestações tubárias. Através de sequenciamento exômico amplo seguido por análise genética abrangente foi identificado uma mutação em homozigose no gene Odd-skipped related 1 gene (OSR1), p.V108F. Para esclarecer os efeitos do Osr1 no desenvolvimento dos DMs, foram investigados o padrão de expressão pré-natal e pós-natal de Osr1/Osr1 nos DMs e endométrio, respectivamente, e se a deleção de Osr1 poderia afetar o desenvolvimento dos DMs, através do uso de camundongos geneticamente modificados. Foi demonstrado que o Osr1 é expresso nos DMs e nos ductos de Wolff (DWs) de embriões com 13,5 dias de gestação (E13,5). Curiosamente, os DMs não foram observados no lado esquerdo e estavam truncados rostralmente no lado direito de E13,5 Osr1 -/- nocautes. Após o nascimento, o Osr1 é expresso no útero de camundongos selvagens ao longo de todo o desenvolvimento, com expressão mais acentuada em dois períodos distintos, aos 14 dias pós natais (PND14) e PND28-PND35, que correspondem à adenogênese endometrial e o início da puberdade, respectivamente. No útero adulto, a proteína Osr1 é expressa principalmente nas células epiteliais luminais e glandulares do endométrio, como também no epitélio dos ovidutos, sendo observada menor expressão no estroma endometrial. Através de uma abordagem translacional, demonstramos que OSR1 é um novo candidato entre os fatores moleculares que modulam a formação e diferenciação de estruturas derivadas dos DMs. CAPÍTULO II: No presente estudo, foram investigados comparativamente o padrão de expressão de Mkrn3 no hipotálamo com as gônadas masculinas e femininas. Além disso, foram abordados o padrão de expressão temporo-espacial desta proteína durante o desenvolvimento sexual, e se ela é regulada nos compartimentos testiculares pelas gonadotrofinas. A quantificação por qPCR mostrou que os níveis de mRNA de Mkrn3 foram detectados em testículos e ovários de camundongos selvagens em todas as idades avaliadas, entretanto, o padrão de expressão de Mkrn3 foi dimórfico entre gônadas masculinas e femininas ao longo da vida. Curiosamente, a expressão de Mkrn3 foi maior entre PND28 e PND35 nos testículos, enquanto que nos ovários atingiu os menores níveis durante o mesmo período. Adicionalmente, a coloração de X-gal em cortes de testículos provenientes de camundongos Mkrn3-LacZ adultos mostrou que o Mkrn3 é principalmente localizado no compartimento intersticial, especificamente em células de Leydig, mas também foi detectado nos túbulos seminíferos com menor expressão. Estudos in vitro e in vivo demonstraram que o RNAm de Mkrn3 aumentou em culturas primárias de células de Leydig tratadas com hCG. Além disso, a administração aguda de agonista de GnRH em camundongos selvagens adultos aumentou a expressão de Mkrn3 nos testículos, enquanto a inibição do eixo HPG pela mesma substância administrada de forma crônica levou ao efeito oposto. Por fim, no grupo de animais que receberam injeção de hCG após a inibição do eixo HPG, foi observado aumento na expressão de Mkrn3. Em conjunto, análises de expressão durante o desenvolvimento e estudos in vitro e in vivo mostraram que o Mkrn3 é produzido nos testículos, predominantemente nas células de Leydig, e que sua expressão de RNAm aumenta após a puberdade e é responsiva à ativação do receptor LH/hCG. CHAPTER I: We present a family in which three sisters had a Mullerian Duct (MD) anomaly characterized by uterine hypoplasia, estrogen-unresponsive endometrium, primary amenorrhea, but spontaneous tubal pregnancies. Whole Exome Sequencing followed by comprehensive genetic analysis identified a novel homozygous variant in Odd-skipped related 1 gene (OSR1), p.V108F. To clarify the effects of Osr1 on MD development, we investigated prenatal and postnatal expression patterns of Osr1/Osr1 in the MDs and endometrium, respectively, and whether Osr1 deletion affects MD development, using genetically engineered mice. We showed that Osr1 is expressed in the MDs and Wolffian ducts (WDs) of E13.5 embryos. Interestingly, MDs are absent on the left side, and rostrally truncated on the right side of E13.5 Osr1-/-knockouts. Osr1 is expressed lifelong in WT mice uterus with two distinct peaks at PND14 and PND28-PND35, which correspond to endometrial adenogenesis and puberty initiation, respectively. Osr1 is expressed mainly in endometrial luminal and glandular epithelial cells, and less in stroma, with a high expression in oviduct epithelium. This pair-rule gene plays critical roles on embryonic patterning and tissue morphogenesis. Through a translational approach, we demonstrated that OSR1 is a novel candidate among the molecular factors that modulate the formation and differentiation of MD-derived structures.CHAPTER II: In the present study, we comparatively investigated the behavior of Mkrn3 expression in the hypothalamus versus male and female gonads. We also addressed the temporo-spatial expression pattern of this protein during sexual development, and whether it is regulated in the functional testicular compartments by gonadotropins. Quantification by qPCR showed that Mkrn3 mRNA levels was detected in testes and ovaries of wild-type mice at all ages evaluated, however, the pattern of Mkrn3 expression across lifespan differed between male and female gonads. Interestingly, Mkrn3 expression was highest by PN28 to PN35 in the testes, whereas it reached the nadir at the same postnatal ages in the ovaries. Moreover, X-gal staining of testes sections from adult Mkrn3-LacZ reporter mice showed that Mkrn3 is expressed mainly in the interstitial compartment, specifically in Leydig cells, but was also mildly detected in the seminiferous tubules. In vitro and in vivo studies demonstrated that the Mkrn3 mRNA levels increased in hCG-treated Leydig cells primary cultures. Furthermore, the acute administration of LHRH agonist in adult wild-type mice increased Mkrn3 expression in testes and the inhibition of the HPG axis, by chronic administration of LHRH agonist, leads to the opposite effect. Finally, the rescue of Mkrn3 expression was observed in the group of animals that received hCG injection after completing the HPG downregulation phase. Taken together, our developmental expression analyses, in vitro and in vivo studies showed that Mkrn3 is produced in the testis, predominantly in the Leydig cells, and that its mRNA expression increases after puberty and is responsive to LH/hCG receptor activation.

The structural analysis of oviducts in Boophilus microplus (Canestrini, 1887) in different stages of ingurgitation has indicated that they are constituted primarily of an internal cylinder and an external cylinder with different cell types being found between them. Copulated females in active ingurgitation process show typical variations along the internal cylinder, and three regions can be defined: anterior, ring-like and transitional. Based on such regionalization, hypotheses were raised about where and how fertilization takes place, a process yet to be clarified for the acari.

A pesquisa teve o objetivo de avaliar a ultra-estrutura dos ovaríolos de Tropidacris collaris (Stoll), submetido aos fotoperíodos de 10L:14E, 12L:12E e 14L:10E. Foram utilizadas 60 ninfas (30 machos e 30 fêmeas) no último estágio de desenvolvimento, sendo colocados 10 casais em cada tratamento. Trinta dias após atingirem o estágio adulto, as fêmeas foram sedadas com éter etílico e dissecadas sob estereomicroscópio. Os ovaríolos foram fixados em Karnovsky (glutaraldeido 2,5%, paraformaldeído 4% e tampão cacodilato de sódio 0,1 M) e analisados em microscopia eletrônica de transmissão e varredura. Os resultados mostraram não haver influência dos fotoperíodos sobre a ultra-estrutura dos ovaríolos, onde estes apresentaram-se revestidos por uma bainha espessa constituída por um material homogêneo e filamentoso. Na região do filamento terminal observaram-se células com núcleos volumosos, algumas com citoplasma escasso, além de estruturas filamentosas assumindo característica de tecido conjuntivo. No germário, as células germinativas são maiores, com núcleos volumosos, escassos citoplasma e membrana celular com interdigitações. As células foliculares são menores com núcleo pequeno, apresentando ainda projeções citoplasmáticas. No vitelário as células foliculares sofrem modificações na sua morfologia, variando de cúbica a achatada. The research evaluated the ultrastructure of the ovarioles of Tropidacris collaris (Stoll), submitted to photoperiods 10L:14D, 12L:12D and 14L:10D. Sixty nymphs (30 males and 30 females) in the last stage of development were paired in ten couples in each treatment. Thirty days after adult emergence, the females were immobilized with ethylic ether and dissected under stereomicroscope. The ovarioles were transferred to Karnovsky fixative (2.5% glutaraldehyde, 4% paraformaldehyde and 0.1 M sodium cacodylate buffer) and analyzed in transmission and scanning electron microscopes. The different photoperiods had no effect on the ovarioles' ultrastructure. Each ovariole is covered by a thick sheath constituted by a homogeneous and filamentous material. In the terminal filament, there are cells with large nuclei, some with scarce cytoplasm and projections cytoplasmatic, besides filamentous structures assuming characteristic of conjunctive tissue. In the germarium, the germ cells are big with large nuclei, scarce cytoplasm and plasma membrane containing interdigitations. The follicular cells are small with a small nucleus, yet presenting cytoplasmatic projections. In the vitellarium the follicular cells suffer modifications in their morphology varying from cubic to flat.

RESUMO A pesquisa teve o objetivo de descrever a histologia dos ovários, ovidutos laterais, oviduto comum e espermateca, e realizar a morfometria dos ovários de Tropidacris collaris (Stoll, 1813) (Orthoptera: Romaleidae), submetido aos fotoperíodos de 10L:14E, 12L:12E e 14L:10E. Para morfometria utilizou-se uma lupa binocular adaptada com uma ocular milimétrica, sendo registrado o comprimento e as larguras dos ovários. Posteriormente, os ovaríolos foram separados e contados. Para análise histológica, os órgãos foram fixados em Boüin alcoólico, incluídos em “paraplast” e corados pela H.E., tricrômico de Mallory e P.A.S (Ácido Periódico de Schiff). Os resultados mostraram que não houve influência dos fotoperíodos sobre a morfometria dos ovários, número de ovaríolos e histologia dos órgãos. Foram encontrados ovários préreprodutivos e reprodutivos. As médias do número de ovaríolos foram de 195,62, 202,62 e 208,25 para os fotoperíodos de 10L:14E, 12L:12E e 14L:10E, respectivamente, sendo mais numerosos no ovário esquerdo. Cada ovaríolo apresentou morfologia tubular com regiões bem distintas (filamento terminal, germário e vitelário). O oviduto lateral é revestido internamente por tecido epitelial simples cúbico com numerosas dobras, apoiado no tecido conjuntivo e externamente por uma camada de tecido muscular estriado. O oviduto comum apresenta a mesma constituição histológica do oviduto lateral, exceto pela presença de epitélio com íntima cuticular e uma camada muscular bem desenvolvida. A espermateca é constituída por tecido epitelial pseudo-estratificado colunar com íntima cuticular e tecido muscular estriado associado a tecido conjuntivo. ABSTRACT The research aimed to study the histology of ovaries, lateral oviducts, common oviducts and spermatheca, and morphometry of the ovaries of Tropidacris collaris (Stoll, 1813) (Orthoptera: Romaleidae), reared under the photoperiods 10:14, 12:12 and 14:10 (L:D). Morphometry was conducted using a binocular magnifying glass adapted with a milimetric ocular, being registered the length and the width of the ovaries. Subsequently the ovarioles were separated and counted. For the histological analysis, the organs were fixated in alcoholic Boüin, included in “paraplast” and stained by H.E., Mallory’s trichromic and P.A.S. Photoperiods studied did not influence the morphometry of the ovaries, number of ovarioles and the histology of the organs. The averages of the ovarioles number were of 195,62, 202,62 and 208,25 for the fotoperíodos of 10L:14D, 12L:12D and 14L:10D, respectively, being more numerous in the left-side ovary. Each ovarioles presented tubular morphology with distinct regions (terminal filament, germarium and vitellarium). The lateral oviducts are internally covered by simple cubic epithelial tissue with numerous folds, sustained on the connective tissue and, externally, by a striated muscular tissue layer. The common oviduct presents the same histological constitution of the lateral oviduct, except by the presence of the epithelium with cuticular intima and a well developed muscular layer. The spermatheca is constituted by columnar pseudo-stratified epithelial tissue with cuticular intima and striated muscular tissue associated to connective tissue.

At present not only is the site of fertilization in ticks still unknown but it is also unclear as to how this mystery can be solved. Signs of fertilization can be observed throughout the female genital tract and these can be clues for the elucidation of the unsolved questions relating to ticks fertilization. In Boophilus microplus (Canestrini, 1887) the most important signs are the following: the final eversion of the acrosomal canal in females ready for oviposition; the presence of small tubules, resembling the subplasmalemal process of the spermatozoon between the oviduct cells; budding nuclei throughout the female genital tract; and the two Feulgen and DAPI positive areas in the oocyte at vitelogenesis. These morphological characteristics suggest that fertilization takes place in the internal cylinder which extends from the uterus to the ovary itself. Até o momento, não só o lugar da fertilização em carrapatos é desconhecido, mas também não é claro como este mistério possa ser esclarecido. Sinais de fertilização podem ser observados ao longo do trato genital feminino e estes podem ser pistas para a elucidação das questões relacionadas à fertilização em ácaros. Em Boophilus microplus (Canestrini, 1887), os sinais mais importantes são os seguintes: a eversão final do canal acrossômico em fêmeas prestes à oviposição; a presença de pequenos túbulos assemelhando-se a processos subplasmalêmicos dos espermatozóides entre as células do oviduto; brotamentos nucleares ao longo do trato genital feminino e as duas áreas Feulgen e DAPI positivas nos ovócitos em processo de vitelogênese. Estas características morfológicas sugerem que a fertilização ocorra no cilindro interno, o qual se estende desde o útero até o ovário inclusive.

The structural analysis of oviducts in Boophilus microplus (Canestrini, 1887) in different stages of ingurgitation has indicated that they are constituted primarily of an internal cylinder and an external cylinder with different cell types being found between them. Copulated females in active ingurgitation process show typical variations along the internal cylinder, and three regions can be defined: anterior, ring-like and transitional. Based on such regionalization, hypotheses were raised about where and how fertilization takes place, a process yet to be clarified for the acari. Uma análise estrutural dos ovidutos de Boophilus microplus (Canestrini, 1887) em diferentes fases de ingurgitamento permitiu detectar que eles estão constituídos basicamente por dois cilindros celulares, um interno e outro externo; entre os quais foram encontrados diferentes tipos celulares. Fêmeas copuladas e em processo ativo de ingurgitamento mostram variações típicas ao longo do cilindro interno podendo ser definidas três regiões: anterior, anelar e de transição. Com base em tal regionalização, hipóteses sobre onde e como ocorre a fecundação, processo ainda não elucidado até o momento para ácaros, são levantadas.