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Makroavtofagija je večstopenjski proces za lizosomsko razgradnjo znotrajceličnih komponent, ki vzdržuje celično ravnovesje in omogoča učinkovit odziv celic na stresne razmere. Vloga plektina, ki uravnava organizacijo citoskeleta v sesalskih celicah, je pri poteku makroavtofagije slabo raziskana. Z uporabo plazmida ptfLC3, ki kodira reporterski protein LC3 (označevalec avtofagnih predelkov), in fluorescenčne mikroskopije smo ovrednotili različne parametre makroavtofagije v astrocitih, ki so izražali plektin, in v astrocitih z izbitim genom za plektin. Ugotovili smo, da plektin v astrocitih sodeluje pri pozicioniranju in/ali transportu avtofagnih predelkov, določa velikost avtolizosomov (pozni intermediati avtofagne poti), uravnava potek bazalne makroavtofagije in je nujno potreben za učinkovit avtofagni odgovor v stimuliranih razmerah, kot so stradanje in virusne okužbe. Avtofagija je pogosto tarča virusov, ki jo lahko izkoristijo za virusno razmnoževanje in preživetje v gostiteljskih celicah. Z imunocitokemično detekcijo okuženih celic v celični kulturi astrocitov smo potrdili, da nevrotropni flavivirusi, ki povzročajo okvare v delovanju osrednjega živčnega sistema, okužijo človeške in mišje astrocite. Pokazali smo, da okužba astrocitov, ki vršijo številne homeostazne in metabolne procese v možganih, z izbranimi nevrotropnimi flavivirusi značilno poveča raven astrocitne avtofagije. Pri tem ne pride do okvar v poznih stopnjah avtofagije ali sprememb v velikosti avtofagnih predelkov. Mehanizem delovanja nevrotropnih flavivirusov v astrocitih vključuje prerazporeditev celičnega citoskeleta, saj smo ugotovili, da okužba z virusom klopnega meningoencefalitisa (TBEV) inducira izrazite spremembe v arhitekturi plektinskega, vimentinskega in mikrotubulskega omrežja ter poveča izražanje aktina. Zaključili smo, da je avtofagen odgovor v astrocitih, ki ga sprožijo nevrotropni flavivirusi, odvisen od plektina ter najverjetneje povezan s spremembami v organizaciji vimentinskega omrežja in/ali mikrotubulov. Macroautophagy is a complex multistep process for lysosome-mediated degradation of intracellular components. Its main functions are to maintain cellular homeostasis by removing damaged organelles and to promote cell survival under stress conditions by recycling cell nutrients. Plectin is an important cytolinker protein which regulates the organization of cytoskeleton in mammalian cells. The involvement of plectin in macroautophagy is still poorly understood. Using plasmid ptfLC3, encoding reporter protein LC3 (a marker of autophagic compartments), and fluorescence microscopy we evaluated multiple parameters of macroautophagy in plectin-expressing and plectin-null astrocytes. We show that in astrocytes plectin is involved in autophagic compartment positioning, autolysosome size regulation, basal autophagy fine-tuning and triggering efficient autophagic response in stimulated conditions such as starvation and viral infections. Autophagy is often manipulated by viruses from different families to facilitate their replication and survival in host cells. Immunocytochemical detection of infected cells in astrocyte cell culture revealed that neurotropic flaviviruses, associated with severe neurological complications in humans, infect human and mouse astrocytes. We found that infection of astrocytes, neuroglial cells performing numerous homeostatic and metabolic processes in the brain, with selected neurotropic flaviviruses induces autophagy, without affecting late autophagy events or the size of autophagic compartments. We suggest that the mechanism of action involves flavivirus-induced reorganization of host cell cytoskeleton, as tick-borne encephalitis virus (TBEV) triggered vast changes in plectin, vimentin and microtubule networks, as well as the increase in the amount of actin in infected astrocytes. In conclusion, virus-triggered autophagic response in astrocytes, infected by neurotropic flaviviruses, depends on plectin and is most likely connected to massive reorganization of vimentin filaments and/or microtubules.

Integrins are heterodimeric adhesion molecules that bind cells to extracellular matrix, and upon clustering, form multimolecular focal adhesions (FAs), reorganising cytoskeletal networks and regulating cell proliferation, migration and survival. Microtubules (MT) are stabilised in the vicinity of FAs through interaction with the components of the cortical microtubule stabilising complex (CMSC). KANK family proteins within the CMSC, KANK1 or KANK2, bind talin1 or talin2 within FA and thus mediate actin-MT crosstalk. A comparative analysis between the melanoma cell line MDA-MB-435S and cell clones with decreased expression of integrin αV showed that these cells preferentially use integrin αVβ5 for adhesion, and identified key components of integrin αVβ5 adhesion complexes, including talin1 and talin2. The data also revealed decreased levels of several components of the CMSC including KANK2. KANK2 knockdown in MDA-MB-435S cells mimicked the effect of integrin αV knockdown and resulted in increased sensitivity to MT poisons, paclitaxel (PTX) and vincristine, and decreased migration, thus showing that KANK2 is a key molecule enabling the actin-MT crosstalk important for both sensitivity to MT poisons and cell migration. Here, we aimed to distinguish which talin isoform bound KANK2. Immunofluorescence analysis showed that talin1 knockdown led to disruption of integrin αVβ5 FAs along with reduction of KANK2, indicating that talin1 is the central adapter protein for FA formation. Conversely, talin2 knockdown slightly increased integrin αVβ5 FA size but did not affect the αVβ5, talin1 or KANK2 localisation. However, knockdown of either talin1, talin2 or KANK2 increased the velocity of MT growth, as shown by live cell microscopy of fluorescent EB3-Dendra2, indicating that talin2 might link αVβ5 FAs to the CMSC. Biochemical isolation and western blotting of crosslinked FA proteins upon knockdown of talin2 showed a reduced amount of KANK2 with unchanged levels of integrin β5 and talin1. Finally, talin2 knockdown mimicked changes observed upon KANK2 knockdown i.e. increased sensitivity to PTX and reduced migration. These data elucidate the cell- type-specific role of talin2 and KANK2 isoforms which contribute to actin-MT crosstalk and the consequential response to MT poison PTX and cell migration.

Bardet Biedl syndrome is a genetic disorder caused by the dysfunction of the BBSome, an octameric cargo adaptor protein complex. The BBSome facilitates the transport of signaling receptors into and out of the primary cilium, a microtubule based sensory organelle of the cell. The first part of this thesis focuses on the elucidation of the assembly of the BBSome in living cells. We generated a library of human and mouse cells lines deficient in the individual BBSome subunits and transduced them with the other YFP tagged subunits. We employed biochemical assays, immunofluorescence and quantitative fluorescence microscopy techniques to analyze the individual steps in the BBSome assembly pathway. We revealed that the BBSome assembly occurs sequentially in spatially regulated steps. We showed that BBS4 nucleates the assembly of a pre-BBSome at the pericentriolar satellites. The translocation of the pre-BBSome to the ciliary base is facilitated by BBS1. We also revealed that in a BBS chaperonin deficient cell line, BBS12 KO cells, a small fraction of the BBSome and/or BBSome sub-complexes are still able to form and localize to the cilium. This could suggest that the BBS chaperonins might act later in the BBSome assembly pathway providing a means for quality control for the BBSome. Ciliary ectocytosis...

Die syndromische Surveillance mit Daten aus dem AKTIN-Notaufnahmeregister hat das Ziel, die aktuelle Inanspruchnahme einer Auswahl von Notaufnahmen in Deutschland zu beobachten und verschiedene Indikatoren, wie z. B. die Gründe für eine Vorstellung in der Notaufnahme, abzubilden. Seit Beginn der COVID-19-Pandemie werden Notaufnahmedaten aus dem AKTIN-Notaufnahmeregister für die syndromische Surveillance genutzt. Der Beitrag erläutert den aktuellen Stand der Notaufnahmesurveillance am RKI und das im Februar 2022 weiterentwickelte, wöchentliche Berichtsformat.

Modern society gives humanity many guarantees and many benefits. Although one of the biggest problems nowadays is that most of us spend much time sitting at computers or TVs. Another problem is the excess of an unsuitable diet, which threatens our health. This lifestyle harms our health and contributes to the outbreak of diseases in civilization, among other things. These diseases are the leading cause of death in civilized countries. It is no wonder that some parts of society are already aware of this issue, and its goal is to motivate people to spend their free time actively, for example, with regular exercise or sports. It is necessary to emphasize the relationship between health problems and a sedentary lifestyle by integrating such topics into teaching grammar school subjects. We could combine chemistry, biology and physical education with helping students find new ways to understand the importance of physical activity. The work focuses on skeletal and smooth muscle because it is closely related to movement and is also the subject of teaching in secondary schools. However, in the current teaching materials, this topic is conceived rather descriptively, with students learning many medical terms, and the interpretation of the mechanism of muscle activity is limited to skeletal muscles. This...

Lebenswichtige Vorgänge entwickeln sich häufig dynamisch und in Abstimmung an die Umgebungsverhältnisse. Um den biologischen Abläufen innerhalb der Zelle geeignete Bedingungen zu gewährleisten, verfügen Zellen über zahlreiche Kompartimente mit einer strukturell und biochemisch spezifischen Zusammensetzung. Allerdings sind die überwiegend selbstständig organisierten Zellstrukturen nicht voneinander unabhängig und regulieren sich wechselseitig. Die Untersuchung von Ordnungsprinzipien in lebender Materie erfordert daher nicht nur Mikroskopiemethoden, die hochauflösende Beobachtungen ermöglichen, sondern auch Modellbildungen, um die Komplexität der erfassten Vorgänge reduzieren zu können. In der vorliegenden Arbeit werden selbstorganisierte Strukturbildungsprozesse an Lebendkulturen menschlicher Zellen untersucht. Hierzu werden fluoreszenzmarkierte Zellstrukturen mittels konfokaler Lichtmikroskopie abgebildet und deren orts- wie zeitabhängigen Rückwirkungen unter biochemischer Einflussnahmen quantifiziert. Die Ergebnisse dokumentieren eine gitterartige Anordnung der Austrittsstellen des endoplasmatischen Retikulums. Deren Eigenschaften werden entscheidend von der Beschaffenheit des endoplasmatischen Retikulums bestimmt und können mit einem diffusionsbestimmten Entmischungsprozess erklärt werden. Dabei wird eine kontrast- und auflösungsverbesserte Bildgebungsmethode konfokaler Aufnahmen charakterisiert und am tubulären Netzwerk des endoplasmatischen Retikulums angewandt. Außerdem werden die Bewegungen von Aktinfilamenten im Zellkern analysiert. Somit bildet nukleares Aktin dynamische und anpassungsfähige Strukturen, die einer heterogenen Subdiffusion in der viskoelastischen Umgebung des Zellkerns nach dem Modell einer zeitveränderlichen fraktionalen Brownschen Bewegung unterliegen. Zusammen mit den Modellerklärungen vermitteln die Ergebnisse dieser Arbeit neuartige Erkenntnisgewinne über die vielschichtigen Wechselbeziehungen zwischen der Organisation und Dynamik selbstorganisierter Vorgänge innerhalb von Zellen.

Die vorliegende Arbeit behandelt die Generierung und Charakterisierung rekombinanter Aktin-modifizierender Fusionstoxine mit dem Ziel der selektiven Inhibition der Chemotaxis humaner neutrophiler Granulozyten. Der klinische Hintergrund dieser Zielsetzung liegt in der Behandlung von Polytraumapatienten. Das Erleiden eines stumpfen Thoraxtraumas verschlechtert die Prognose polytraumatisierter Patienten signifikant. Grund dafür ist vermutlich eine systemische Entzündungsreaktion, die im weiteren Verlauf oftmals zur Entstehung des Acute Respiratory Distress Syndrome‘s (ARDS) führt. Eine Schlüsselrolle in der Pathogenese des ARDS spielen ins Lungenparenchym einwandernde Monozyten und neutrophile Granulozyten. Aus diesem Grund ist die Entwicklung neuartiger pharmakologischer Optionen, welche gezielt die Migration neutrophiler Granulozyten hemmen, von großem wissenschaftlichen und medizinischen Interesse. Ausgangpunkt für das neuartige rekombinante Fusionstoxin ist das clostridiale C2-Toxin, ein binäres Aktin-ADP-ribosylierendes Protein, welches aus der Enzymkomponente C2I und der Translokations- und Bindungskomponente C2IIa besteht. Durch Fusion eines spezifisch an neutrophile Granulozyten und Monozyten bindenden Peptids mit der C2I- Enzymuntereinheit wurde das neuartige P1_C2I-Toxin generiert. Dies erfolgte durch Einfügen der P1-Sequenz in das für C2I-codierende Plasmid mittels erfolgreicher Exponential Megaprimer Polymerasekettenreaktion. Anhand Zytotoxizitäts- und Zellabrundungsassays wurde ein möglicher Vergiftungseffekt von P1_C2I auf CHO-K1- Fibroblasten und epitheliale HeLa- und Vero-Zellen untersucht. Hierbei ergab sich auch über einen längeren Inkubationszeitraum von 24 Stunden mit hohen Toxinkonzentrationen keinen Anhaltspunkt für zytotoxische Effekte von P1_C2I. Aus der Versuchsreihe ging ebenfalls hervor, dass trotz der gentechnischen Modifikation des P1_C2I-Toxins die zelluläre Aufnahme in CHO-, HeLa- und Vero-Zellen bei gleichzeitiger Inkubation mit der Bindungs- und Translokationsdomäne C2IIa unbeeinträchtigt bleibt. Bei der Untersuchung des Effekts von P1_C2I auf humane neutrophile Granulozyten und promyeloischen Leukämiezellen (NB4-Zellen) zeigte sich ein von der Konzentration abhängiger 92 Zusammenfassung Vergiftungseffekt von P1_C2I in der sequentiellen in-vitro-ADP-Ribosylierung. Der direkte Vergleich bei der Vergiftung von PMNs mit P1_C2I bzw. C2I ergab keinen signifikanten Unterschied in der Analyse der ADP-Ribosylierungsstatus von Aktin. Somit ist der beobachtete Vergiftungseffekt nicht auf die gentechnische Modifikation des P1_C2I-Toxins zurückzuführen. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen auf einen bisher nicht näher charakterisierten, vermutlich unspezifischen Aufnahmemechanismus der C2I- Enzymuntereinheit für humane neutrophile Granulozyten und NB4-Zellen bei Inkubation mit höheren Konzentrationen des Toxins hin. Diese Aufnahmemechanismen des C2I-Toxins spielen eine möglicherweise unterschätzte Rolle. Für zukünftige, vom C2I-Toxin abgeleitete pharmakologische Wirkstoffe könnten derartige unspezifische Aufnahmemechanismen potenziell zu zahlreichen, unerwünschten Arzneimittelnebenwirkungen führen. Aus diesem Grund ist die genauere Charakterisierung dieser Aufnahmemechanismen wichtig.

Cell migration is crucial for such physiological and pathological processes as wound healing, emryonal development, immune response, and methastasizing of the cancer cells. It is tightly coupled with cell polarization, nuclear traslocation, and turnover of actin cytoskeleton. Substantial, but so far poorely explored, part of actin cytoskeleton is perinuclear actin cap - dome-like structure above the nucleus costructed from perinuclear actin fibers. At the apical side of the nucleus perinuclear actin fibers are associated with LINC complex through nesprin proteins; at the edges of the cell they are anchored to focal adhesions. In the literature there were assumptions that this type of actin fibers can generate traction forces for nuclear reorientation during cell migration. The aim of this thesis is to elucidate the mechanism involved in the attachment of perinuclear actin to the LINC complex and the nucleus, thereby regulating the formation of the perinuclear actin cap. In addition, we aimed to establish a semi- automatic tool for perinuclear actin fibers quantification. Rat2 fibroblasts were used as the model cell line because they contain well-developed perinuclear actin cap. We focused on the inactivation of LINC complex components, namely Giant nesprin proteins (nesprin 1 and nesprin 2) and...

Filamentous actin (F-actin) is a dynamic polymer providing mechanical forces to change cell morphology. Calcium is a known modulator of actin cytoskeleton organization, required for many cellular functions including cell migration, wound closure and exocytosis. EFHD2/Swiprosin-1 (Swip-1) is an actin-binding protein that can link calcium directly to actin network rearrangements. Upregulation of Swip-1 has been found in a number of pathologies including neurodegenerative diseases and invasive cancer highlighting its importance to study. A role of Swip-1 in cell migration had been previously shown, however, how Swip-1 regulates the underlying F-actin rearrangements, especially in response to calcium, had not been solved, yet. Drosophila Swip-1 is upregulated in highly motile pupal macrophages and localizes to the protruding lamellipodia. CRISPR/Cas9-mediated swip-1 null mutants are viable, fertile but their macrophages display disrupted lamellipodia formation and defects in integrin-dependent migration. Moreover, Swip-1 is also crucial for the rapid reorganization of F-actin at a wound edge necessary for the healing process to re-establish tissue integrity. Single-cell ablation in the Drosophila larval epidermis showed dramatic reduction of wound closure in swip-1-deficient flies. Rescue experiments unambiguously showed that calcium binding to Swip-1 is essential for lamellipodia formation for both migration and wound closure. Mechanistically, Swip-1 can cross-link actin networks. Upon calcium ion binding to Swip-1 these crosslinks become transient, relaxing the actin meshwork and allowing severing and branching to take place. At low calcium levels, Swip-1 stabilizes this network. Notably, the calcium-dependent cross-linking activity had previously not been addressed. A stable yet dynamic network is also required for regulated exocytosis of secretory vesicles in the Drosophila larval salivary gland. Here, Swip-1 is necessary for the efficient cargo expulsion to the lumen. However, the regulatory mechanism seems to be independent of its calcium binding. Rather, changes in phosphorylated non-muscle myosin II might change the contractility of the F-actin coat surrounding the vesicles. This suggests a role of Swip-1 in a signal pathway upstream of the phosphorylation of myosin regulatory light chain.

Fitoplazme (rod 'Candidatus Phytoplasma') su fitopatogene bakterije bez stanične stijenke, obligatni unutarstanični paraziti floema biljaka i kukaca. Uzročnici su bolesti i gubitaka prinosa inih usjeva u svijetu. Prijenos fitoplazmi kukcima-vektorima uglavnom ovisi o površinskim fitoplazmatskim proteinima. Za antigenski membranski protein (AMP) 'Ca. P. asteris' pokazano je da stupa u interakciju s proteinom aktinom, mikrofilamentom kukaca. Stamp je antigenski membranski protein pronađen samo u ‘Ca. P. solani’. Njegova aminokiselinska sekvenca podudara se s proteinom AMP ‘Ca. P. asteris’ 26 – 40%, a sa sekvencom AMP ‘Ca. P. japonicum' 40%. S obzirom na sličnosti i moguće uloge ovih proteina, cilj istraživanja bio je ispitati protein – protein interakciju fitoplazmatskog proteina Stamp porijeklom iz vinove loze (V. vinifera) i aktina (HoACT) porijeklom iz kukca-vektora Hyalesthes obsoletus. Dizajnirani su ekspresijski plazmidi s ugrađenim cjelovitim i mutiranim genima stamp ST6 i ST9, te plazmidi s genom HoACT kako bi se istražila njihova interakcija. Istraživanje je obuhvaćalo korištenje bimolekularne fluorescencijske komplementacije (BIFC) in planta i metodu kopurifikacije proteina pull-down. Rezultati kopurifikacije proteina su dokazali interakciju hidrofilne regije proteina Stamp i HoACT. Metodom BIFC u listovima duhana Nicotiana benthamiana interakcija nije potvrđena te je metodu potrebno prilagoditi kako bi se razjasnili uvjeti interakcije proteina in planta.

The genetic diversity was studied of Cryptosporidium scrofarum (syn Cryptosporidium pig genotype II) of domestic pigs (Sus scrofa domesticus) from Punjab, India. Nested PCR amplification targeting the 18S rRNA and actin gene loci from Cryptosporidium positive samples was carried out, and the amplicons were sequenced. Phylogenetic comparison of a partial 18S rRNA gene revealed that they were genetically most similar to C. scrofarum isolated from other parts of the world. However, comparison of sequences representing a fragment of the genomic actin locus identified a new genotype conserved within the isolates sampled from India but distinct from other published sequences, suggesting the presence of a different Indian genotype., U ovom je radu istraživana genetička raznolikost Cryptosporidium scrofarum (syn Cryptosporidium pig genotype II) domaćih svinja (Sus scrofa domesticus) iz regije Punjab, Indija. Provedeno je umnožavanje 18S rRNA i lokusa aktin-gena pomoću ugniježđene PCR metode iz uzoraka pozitivnih na Cryptosporidium te su sekvencirani amplikoni. Filogenetska usporedba parcijalnog 18S rRNA gena pokazala je da su uzorci genetski najsličniji C. scrofarum izoliranom u drugim dijelovima svijeta. Također, usporedba sekvencija dijela lokusa genomskog aktina otkrila je novi genotip očuvan unutar izolata uzorkovanih u Indiji, ali različitih od drugih objavljenih sekvencija, upućujući na postojanje zasebnog indijskog genotipa.

Cell migration is highly dependent on the precise orchestration of the assembly and disassembly of filamentous actin at their leading edge. Therefore, the temporal and spatial regulation of WAVE activity as the main regulator of Apr2/3 for branched actin polymerization is crucial for efficient lamellipodia-driven cell motility. This work shows that wave mutant Drosophila macrophages completely lack lamellipodia that causes severe migration defects. However, they still respond to wound signals by relying on rudimentary filopodia based migration. Furthermore, it could be shown that the disruption of the WIRS receptor binding site within the WRC does not interfere with wound response of macrophages. The non-receptor tyrosine kinase Abl is assumed to be a key regulator of WAVE, altering its activity via phosphorylation. The results in this study confirm that the active form of Abl is an effector of WAVE. The loss of abl and the overexpression of Abl kinase dead transgene leads to an increase of cell spreading. Further, WAVE localization at the membrane is elevated in the absence of Abl. This alteration seems to influence random migration by reducing the explorative behavior of macrophages. However, loss of abl did not affect the responsiveness of macrophages to external damage signals. WAVE possesses four tyrosine residues within the WHD: Y127 is a Src kinase target and Y153 of the Abl kinase. The WAVE phospho-mutant Y153F is still phosphorylated via Abl. This indicates that additional tyrosine sites are targeted by Abl. Nevertheless, the phosphorylation of Y153 results in an elevated F-actin level that indicates the physiological relevance of this tyrosine residue. This suggests that phosphorylation of Y153 activates WAVE and the WRC, which is consistent with the results of previous studies. The analysis of random migrating macrophages revealed that this leads to a reduction of cell speed. In contrast, the phosphorylation of Y127 in the WHD showed neither an impact on the F-actin level nor on the migratory behavior of macrophages. Interestingly, the simultaneous phosphorylation of both residues leads to a drastic reduction of lamellipodial structures in macrophages. These cells exhibited extended filopodia and showed a stellar cell shape comparable to wave mutant macrophages. Consequently, in vivo migrating macrophages show a reduction of cell speed and a negative impact on the persistence of these cells. Individual phospho-mimicking mutation of Y127 or Y153 also do not interfere with the viability of the flies, whereas the simultaneous phosphorylation of both sites lead to late pupal lethality. These results indicate that phosphorylation of multiple tyrosine residues has a negative regulatory effect on WRC function. In conclusion, it can be shown that phosphorylation state of WAVE finetunes WRC activity., Die Migration von Zellen ist im hohen Maße von dem Auf- und Abbau der Aktinfilamente am Leitsaumen der Zellen abhängig. Dabei ist die lokale und zeitgenaue Regulation von WAVE als Schlüsselregulator des Arp2/3 Komplexes für vernetzte Aktin Polymerisierung entscheidend für eine effiziente, durch das Lamellipodium getriebene, Zellbewegung. Diese Arbeit zeigt, dass mutierte wave Makrophagen in Drosophila keine Lamellipodia mehr ausbilden, was starke Migrationsdefekte zur Folge hat. Dennoch reagieren weiter sie auf Wundsignale, die sie mittels einer rudimentären, filopodialen Migration erreichen. Jedoch konnte gezeigt werden, dass die Zerstörung der WIRS Rezeptor-Bindestelle im WRC die Wundantwort der Makrophagen nicht beeinträchtigt. Die Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinase Abl wird als Schlüsselregulatoren für WAVE vermutet, indem sie mittels Phosphorylierung die Aktivität verändert. Die Ergebnisse dieser Studie bestätigen, dass die aktive Form von Abl ein Effektor von WAVE ist. Der Verlust von abl sowie die Überexpression des dominant negativen Transgens führen zu einer gesteigerten Zellspreizung. Weiter ist in der Abwesenheit von Abl die Membranlokalisation von WAVE erhöht. Diese Veränderung hat Einfluss auf die freie Migration, indem sie das explorative Verhalten der Zellen senkt. Jedoch hat der Verlust von abl keine Auswirkung auf das Reaktionsvermögen von Makrophagen auf externe Beschädigungssignale. WAVE besitzt vier Tyrosine in der WHD: Y127 ist ein vorhergesagtes Ziel der Src Kinase und Y153 der Abl Kinase. Die WAVE Phospho-Mutante Y153F wird jedoch immer noch von Abl phosphoryliert. Das weist darauf hin, dass noch weitere Tyrosine relevante Ziel von Abl sind. Nichtsdestotrotz führt die Phosphorylierung von Y153 zu einer Erhöhung des F-Aktin Level, was die physiologische Relevanz dieses Tyrosins unterstreicht. Es kann angenommen werden, dass die Phosphorylierung von Y153 aktivierend auf WAVE und den WRC wirkt. Dieses Ergebnis ist konsistent mit denen anderer Studien. Die Analyse der Migration von Makrophagen zeigt, dass die Phosphorylierung von Y153 zu einer Reduktion der Geschwindigkeit führt. Im Gegensatz dazu hat die Phosphorylierung von Y127 weder einen Einfluss auf das F-Aktin Level noch auf das Migrationsverhalten der Makrophagen. Interessanterweise führt die gleichzeitige Phosphorylierung von beiden Tyrosinen zu einer drastischen Reduktion von lamellipodialen Strukturen. Diese Zellen stellen verlängerte Filopodien aus und besitzen eine sternförmige Zellform, die mit mutierten wave Makrophagen vergleichbar ist. In migrierenden Makrophagen führt dies zu einer Reduktion in der Geschwindigkeit und hat einen negativen Einfluss auf die Persistenz der Zellen. Die individuelle Phosphorylierung von Y127 oder Y153 hat keinen negativen Einfluss auf die Viabilität der Fliegen, wohingegen die gleichzeitige Phosphorylierung zu Letalität im späten Puppenstadium führt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Phosphorylierung von multiplen Tyrosinen einen negativ regulatorischen Effekt auf die Funktion des WRC hat. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der Phosphorylierungs-Status von WAVE wichtig ist für die Regulation der Aktivität des WRC.

Durch massive Aktivierung des angeborenen Immunsystems kann es zu systemischen Entzündungsreaktion kommen. Als chemotaktischer Lockstoff fördert die Komplementkomponente C5a die Diapedese von neutrophilen Granulozyten durch Endothelspalten und die Migration durch das Gewebe. Dies stellt ein Schlüsselschritt in inflammatorischen Prozessen dar und setzt die Anpassung der Zellform voraus. C5a ist in die dynamische Adaptation des Zytoskeletts involviert und in die damit verbundenen Veränderungen der biomechanischen Eigenschaften von Neutrophilen. Die vorliegende Arbeit stellt einen ersten Schritt zur Charakterisierung des Einflusses von C5a auf die mechanischen Eigenschaften von humanen neutrophilen Granulozyten dar. Hierzu wurde die zelluläre Verformbarkeit von Neutrophilen mit Hilfe des Optical Stretchers - einer kontaktfreien Technologie für die quantitative Analyse der Zellmechanik - untersucht. Wir konnten zeigen, dass die Stimulation mit C5a zu einer erhöhten maximalen relativen Verformbarkeit im Optical Stretcher führt. Wir vermuten, dass die durch C5a induzierten Veränderungen der Neutrophilen-Zell-Mechanik und - Motilität durch eine Modulation des Aktinfilamente-Netzwerkes vermittelt werden. Diese Arbeit unterstreicht die Rolle des Zytoskeletts und der Zellmechanik als ein potenzielles pharmakologisches Ziel und soll ein besseres Verständnis darüber liefern, was die neutrophilen Granulozyten bewegt.

ARP2/3 is an evolutionarily conserved heteroheptameric protein complex. Its main activity lies in the nucleation of dendritic actin filaments that are involved in membrane remodeling. ARP2/3 takes part in plasma membrane remodeling and the formation of cytoplasmic protrusions that serve in the amoeboid motion of mammalian cells and some protists and plays role in exocytosis and endocytosis of animal and yeast cells. The main objective of this work was to find a connection between the ARP2/3 complex and the regulation of the plant endomembrane system. Using TIRF microscopy we visualized the localization of the ARP2/3 complex in the cortical layer of plant cells and compared it to the localization of several endomembrane markers from the Rab family and an exocytotic marker Exo84b. In the vicinity of the plasma membrane, the ARP2/3 complex subunits localized to dynamic dots very similar to the localization of Exo84b protein. Colocalization analysis showed that a small portion of Exo84b marker and ARP2/3 complex signals colocalize and this result was seconded by the biochemical approach of coimmunoprecipitation. Key words: ARP2/3, endomembrane system, cortical layer, RabA1g, RabC1, RaD2a, Exo84b

Die Proteine Aktin und Myosin sind Schlüsselakteure des eukaryotischen Lebens. Während Aktin μm-lange, dynamische Filamente formt, die eine Hauptkomponente des Zytoskeletts sind, läuft der molekulare Motor Myosin entlang dieser Filamente und treibt so eine Vielzahl essentieller Prozesse, wie beispielsweise den intrazellulären Transport und die Muskelkontraktion, an. Entsprechend ihrer biologischen Relevanz sind Fehlfunktionen von Aktin und Myosin meist mit schwerwiegenden medizinischen Problemen verbunden. Die Funktion beider Proteine ist eng mit der Hydrolyse von ATP, wie auch mit ihrer Struktur verknüpft. Die Aufklärung dieser Struktur ist daher entscheidend für die Entschlüsselung der zugrunde liegenden molekularen Details. Obwohl die Struktur beider Proteine bereits zuvor aufgeklärt wurde, ist der strukturelle Effekt der ATP Hydrolyse und der anschließenden Freisetzung des anorganischen Phosphats noch unbekannt. Weiterhin ist der Einfluss von Sequenzvariationen und der Bindung kleiner Moleküle auf die Stabilität des Aktinfilaments bisher nicht aufgeklärt. In meiner Doktorarbeit habe ich mit Hilfe der Transmissionselektronen-Kryomikroskopie (Kryo-EM) insgesamt 19 hochaufgelöste Strukturen von Aktinfilamenten (F-Aktin) sowie von aktingebundenem Myosin (Aktomyosin) gelöst. Anhand von Strukturen verschiedener Nukleotidzustände präsentiere ich zunächst den strukturellen Wandel von Aktin und Myosin entlang ihres ATPase-Zyklus. Die Daten deuten darauf hin, dass der ATPase-Zyklus von Myosin nicht ausschließlich auf mechanischer Kopplung basiert, sondern zu großenTeilen auf struktureller Flexibilität beruht. Sie veranschaulichen außerdem die Konformationsänderungen, die mit der Freisetzung von ADP und der Bindung von ATP einhergehen. Die strukturellen Veränderungen in F-Aktin sind im Allgemeinen kleiner als die in Myosin und beschränken sich hauptsächlich auf das D-Loop-C-Terminus-Interface an der Oberfläche des Filaments. Auf diese Weise wird der Nukleotidzustand wahrscheinlich an Interaktionspartner übermittelt, wodurch ein gerichteter Umbau des Zytoskelettsermöglicht wird. Diese Arbeit zeigt außerdem, wie kleine Sequenzänderungen die Filamentinstabilität des Aktin 1 vom Malariaparasiten Plasmodium falciparum verursachen. Schließlich wird die strukturelle Grundlage der aktinstabilisierenden natürlichen Toxine Jasplakinolid und Phalloidin entschlüsselt und ihre Wirkung auf den Strukturwandel von F-Aktin beschrieben. Während diese Moleküle bereits wertvolle Werkzeuge für die Grundlagenforschung darstellen, werden die hier vorgestellten Strukturen eines photo-schaltbaren Jasplakinolids wahrscheinlich das strukturbasierte Design neuartiger, funk-tionalisierter Derivate mit noch größerem Potenzial vorantreiben. Insgesamt haben die in dieser Arbeit gelösten Strukturen wertvolle Einblicke in den strukturellen Wandel von Aktin und Myosin gebracht und werden dadurch letztendlich zueinem verbesserten Verständnis aller auf Aktin und Myosin beruhender Prozesse führen.

Actin is a structural protein that is a major component of the eukaryotic cytoskeleton. It is not only important for morphology and stability of cells, but also for dynamic processes such as cell migration, adhesion, growth or contraction. In muscle cells, the highly structured complex of myosin and actin filaments is essential for the coordinated contraction of muscle fibers, which ultimately generates muscle strength. In order to achieve this function, actin filaments have to build up and rebuilt dynamically during muscle development. However, the molecular mechanisms involved are still largely unknown. The need to elucidate these mechanisms arises from the finding that a large number of human myopathies are associated with defects in the actin cytoskeleton. Previous studies identified the transcription factor SRF (serum response factor) as a major regulator of skeletal muscle development in humans and mice. In a feedback mechanism, SRF is activated in an actin-dependent manner and in turn controls the expression of actin and actin-regulatory proteins. One of the main activators of SRF is MRTF (myocardin related transcription factor), which can be sequestered by actin monomers, thus preventing translocation and subsequent activation of SRF in the nucleus. This cumulative dissertation presents two studies that aim to elucidate the underlying processes of myopathies during skeletal muscle development. In the first publication, "CAP2 deficiency delays myofibril actin cytoskeleton differentiation and disturbs skeletal muscle architecture and function", we identified a previously unknown function for the actin-regulatory protein CAP2 (cyclase-associated protein 2) during skeletal muscle development in mammals. We showed that CAP2 controls the remodeling of actin filaments in developing skeletal muscle and is therefore essential for the differentiation of muscle fibers. As a consequence of CAP2 loss, mouse mutants developed structural changes in skeletal muscles, characterized by a frequent occurrence of ring fibers, internalized nuclei and disturbed mitochondrial distribution, as well as deficits in motor functions and moderate muscle weakness. These changes reflect symptoms of human myopathies. In the second manuscript, "Cyclase-associated protein 2 (CAP2) controls MRTF-A localization and SRF activity in mouse embryonic fibroblasts", we reported that loss of CAP2 in mouse embryonic fibroblasts lead to disturbed SRF activity. Specifically, we found that CAP2 controls subcellular distribution of the SRF trans-activator MRTF in an actin-dependent mechanism. CAP2 inactivation was associated with reduced nuclear MRTF levels and impaired SRF-mediated gene expression. This suggests that CAP2-dependent actin dynamics may also control SRF activity during skeletal muscle development and that dysregulation of SRF may cause or at least contribute to the myopathy in CAP2 mutant mice., Das Strukturprotein Aktin stellt einen Hauptbestandteil des Zytoskeletts aller eukaryotischen Zellen dar. Als solches ist es nicht nur für die Morphologie und Stabilität von Zellen wichtig, sondern auch für dynamische Prozesse wie Zellmigration, Adhäsion, Wachstum oder Kontraktion. In Muskelzellen ist der hoch strukturierte Komplex aus Myosin- und Aktin-Filamenten essentiell für die koordinierte Kontraktion der Muskelfasern, welche letztendlich Muskelkraft erzeugen. Um diese Funktion zu bewerkstelligen, müssen Aktin-Filamente während der Muskelentwicklung dynamisch auf- und auch umgebaut werden. Die daran beteiligten molekularen Mechanismen sind allerdings noch weitestgehend unbekannt. Gleichzeitig existiert der Befund, dass eine Vielzahl humaner Muskelerkrankungen mit Defekten im Aktin-Zytoskelett assoziiert ist. Die daraus resultierende Notwendigkeit zur Aufklärung dieser Mechanismen bildet die Grundlage und das Ziel der vorliegenden Dissertation. Frühere Arbeiten anderer Arbeitsgruppen haben den Transkriptionsfaktor SRF (serum response factor) als einen wichtigen Regulator der Skelettmuskelentwicklung in Menschen und Mäusen identifiziert. In einem Rückkopplungsmechanismus wird SRF Aktin-abhängig aktiviert und kontrolliert wiederum die Expression von Aktin und Aktin-regulierenden Proteinen. Einer der Hauptaktivatoren von SRF ist MRTF (myocardin related transcription factor), welcher zumeist im Zytoplasma an Aktin-Monomere gebunden werden kann, wodurch seine Translokalisation in den Zellkern und die Aktivierung von SRF unterbunden werden. Die vorliegende kumulative Dissertation präsentiert zwei Studien, die sich mit der Aufklärung von Prozessen beschäftigen, die Skelettmuskelentwicklungsdefekten zugrunde liegen. In der ersten Publikation „CAP2 deficiency delays myofibril actin cytoskeleton differentiation and disturbs skeletal muscle architecture and function” wurde für das Aktin-regulierende Protein CAP2 (cyclase-associated protein 2) eine bislang unbekannte Funktion während der Entwicklung der Skelettmuskulatur in Säugetieren gezeigt. Die Daten ergaben, dass CAP2 den Umbau von Aktin-Filamenten im sich entwickelnden Skelettmuskel kontrolliert und somit essentiell für die Differenzierung von Muskelfasern ist. Als Konsequenz eines CAP2-Funktionsverlusts entwickeln Mausmutanten strukturelle Veränderungen im Skelettmuskel, welche durch das gehäufte Auftreten von Ringbinden, internalisierten Zellkernen und durch eine gestörte Mitochondrien-Verteilung gekennzeichnet sind. Diese gehen mit Defiziten in motorischen Funktionen und einer moderaten Muskelschwäche einher. Diese Veränderungen spiegeln Symptome humaner Muskelerkrankungen wider. Im zweiten Manuskript „Cyclase-associated protein 2 (CAP2) controls MRTF-A localization and SRF activity in mouse embryonic fibroblasts“ konnte gezeigt werden, dass der Verlust von CAP2 in embryonalen Maus-Fibroblasten zu einer gestörten SRF-Aktivität führt. Insbesondere wurde festgestellt, dass CAP2 die subzelluläre Verteilung des SRF-Transaktivators MRTF in einem Aktin-abhängigen Mechanismus steuert. Die Inaktivierung von CAP2 war mit reduzierter MRTF-Lokalisation im Kern und einer Beeinträchtigung der SRF-vermittelten Genexpression verbunden. Dies lässt uns vermuten, dass CAP2-abhängige Aktin-Dynamik die SRF-Aktivität auch während der Entwicklung der Skelettmuskulatur kontrollieren kann und dass eine Dysregulation von SRF die Myopathie bei CAP2-Mutanten verursachen oder zumindest zu ihr beitragen kann.

To what extent nuclear actin polymerization is involved in tumor cell inva-sion is not yet known and this doctoral thesis aimed to study that question. Furthermore a possible mechanosensitive function for the Linker of Nu-cleoskeleton and Cytoskeleton (LINC)-Complex at the nuclear membrane and a specific involvement of Myocardin Related Transcription Factor A (MRTF-A) were investigated in this context. A postulated pathway be-tween cell membrane anchored Integrins and the nuclear actin fraction was of special interest, as an integration of extracellular signaling might be possible that way. In order to assess these questions a number of cell biological methods were used. The invasive behaviour of human fibrosarcoma cells (HT1080) was studied in a novel invasion assay which was established to quantitively and qualitatively study invading cells and their subcellular structures in realtime. Different means of disrupting nuclear actin polymerization and the integrity of the LINC complex were used to investigate their possible functional implications in invasion. Studying nuclear actin filaments was made possible by using methods of endogenous nuclear actin colorization, allowing for differential visualization of live and endogenous filaments un-der various conditions in active tumor cell invasion. For the first time nuclear actin filaments and the shuttling of MRTF-A-GFP were observed in invading HT1080 cells and in stationary cells using Fi-bronectin stimulation. Through use of quantitative studies a significant im-portance was shown for nuclear actin polymerization and the LINC-complex in efficient collagen matrix invasion. Putting together these ob-servations, the description of an Integrin-LINC-nuclear-actin-MRTF-A pathway in tumor cell invasion can be proposed. This signaling pathway possibly integrates extracellular information and mechanical signals. It in-teracts with the actin cytoskeleton and is of importance for an efficient collagen matrix invasion. The description of this pathway opens up new possibilites in researching the interaction of invading tumor cells with the extracellular matrix and allows further investigations for possible new pharmacological targets in cancer therapy., Die Bedeutung nukleärer Aktinfilament-Polymerisation für die Invasion von humanen Tumorzellen ist nicht geklärt und sollte in dieser Doktorar-beit erfasst werden. Es sollte zudem näher untersucht werden, welche Funktion in diesem Zusammenhang der Linker of Nucleoskeleton and Cy-toskeleton (LINC)-Komplex an der Kernmembran als mögliche mechano-sensitive Komponente einnimmt und ob der Myocardin Related Transcrip-tion Factor A (MRTF-A) eine spezifische Involvierung zeigt. Insbesondere von Interesse war hierbei ein möglicher Signalweg zwischen den zell-membranständigen Integrinen, welche in Kontakt mit der extrazellulären Matrix stehen, und der nukleären Aktinfraktion. Zur Untersuchung der Fragestellung wurde auf verschiedene Methoden der molekularen Zellbiologie zurückgegriffen. Dabei wurden Möglichkei-ten genutzt, um die Polymerisation der kernständigen Aktinfraktion zu unterbinden bzw. den LINC-Komplex zu stören und das Verhalten der Tu-morzellen in humanen Fibrosarkomzellen (HT1080) anhand von Invasion-sassays untersucht. Es wurde zu diesem Zweck ein Live-Invasionsassay etabliert, der eine qualitative Untersuchung der Zellen und ihrer subzellu-lären Strukturen während der Invasion in eine Kollagenmatrix in Echtzeit ermöglicht. Es wurden Methoden der endogenen Aktin-Anfärbung ge-nutzt, mit denen eine differenzierte Darstellung der nukleären Aktinfila-mente ermöglicht werden konnte, um die Dynamik der nukleären Aktin-polymerisation unter verschiedenen Bedingungen und in der aktiven Tu-morzellinvasion zu studieren. Es wurde unter anderem erstmalig beobachtet, wie sich während der In-vasion und unter Fibronectin-Stimulierung nukleäre Aktinfilamente bilden und MRTF-A-GFP aktiv zwischen Zytosol und Zellkern wechselt. Durch quantitative Untersuchungen und den damit einhergehenden Nachweis, dass gestörte Aktin-Polymerisation und ein gestörter LINC-Komplex mit einer weniger gerichteten Tumorzellinvasion in eine Kollagenmatrix korre-lieren, ließ sich ein umfassendes und funktionelles Bild eines postulierten Integrin-LINC-Kernaktin-MRTF-A Signalweges zeichnen. Der Signalweg in-tegriert somit mutmaßlich extrazelluläre Informationen und mechanische Signale, interagiert mit dem Aktinzytoskelett und ist wichtig für eine ge-richtete, effiziente Invasion in eine Kollagen-Matrix. Die Beschreibung dieses neuen Signalweges ermöglicht weitergehende Untersuchungen zum tieferen Verständnis der Interaktion von Tumorzel-len mit der Extrazellulärmatrix und der Suche nach neuen Möglichkeiten der pharmakologischen Therapie onkologischer Erkrankungen.

As an essential component of the cytoskeleton in eukaryotic cells, actin filaments participate in various important cellular processes. Many of these relate to dynamic processes within cells (vesicle transport) as well as the motility of cells themselves (migration, adhesion). However, a much more far-reaching task of actin filaments is being discussed: Their possible contribution to the regulation of gene expression. So far, there are no conclusive explanations as to the exact nature of the dynamic process, which leads to the approach of silencers, promoters and enhancers, separated by thousands of base-pairs. It has been repeatedly described that actin filaments (F-actin) seem to play a significant role in this process. However, such evidence has not yet been provided with certainty, especially as it has long been assumed that only actin monomers (G-actin) are present in the cell nucleus. For some years, however, this fact has been refuted, actin filaments could be detected in the cell nucleus of various cell lines. Here again the question arose, how these actin filaments are involved in gene expression and what might influence this interaction. In the context of this work it was shown that the human breast cancer cell line MCF-7 known to possess estrogen receptors not only has nuclear actin filaments but that the amount of nuclear actin filaments forming after serum stimulation seems to be dependent on a previously applied concentration of estrogen. In this work, as a possible explanation for the increased formation of nuclear F-actin after estrogen pretreatment an estrogen concentration-dependent decreased expression of the protein cofilin was shown. Estrogen leads in the mentioned cell line via the estrogen receptor ERα known to proliferation, which could be confirmed in this work by various growth assays. It is also known that after estrogen binding to the ERα this becomes active as a transcription factor for various genes. These genes include, but are not limited to, BRCA1, FOXA1 or TP53. Genes exert diverse influences on cells. In this work, it was investigated to what extent nuclear actin filaments in interaction with estrogen are involved in the expression of known estrogen-responsive genes. Here, estrogen-pretreated MCF-7 cells were compared directly, one of which had a wild-type variant of actin, whereas the other expressed a dysfunctional actin variant (R62D actin, lack of actin polymerization). In summary of the preliminary results obtained, there was no simple cause-and-effect relationship between estrogen, nuclear F-actin, and certain genes. However, a variety of new questions regarding the probably extremely complex function of F-actin in the expression of different genes in human tumor cells, as well as their influence by steroid hormones as external factors opened up., Als essenzieller Bestandteil des Zytoskeletts in eukaryoten Zellen haben Aktinfilamente Anteil an verschiedensten wichtigen zellulären Prozessen. Viele davon beziehen sich auf dynamische Prozesse innerhalb von Zellen (Vesikeltransport) als auch auf die Motilität von Zellen an sich (Migration, Adhäsion). Immer häufiger wird jedoch noch eine viel weitreichendere Aufgabe von Aktinfilamenten diskutiert: Ihr möglicher Anteil an der Regulation der Genexpression. Bisher gibt es noch keine abschließenden Erklärungen dafür, wie genau der dynamische Prozess funktioniert, bei dem sich über tausende Basenpaare entfernte Promotoren und Enhancer oder Silencer räumlich aneinander annähern. Mehrfach ist beschrieben, dass Aktinfilamente (F-Aktin) hierbei eine maßgebliche Rolle zu spielen scheinen. Ein entsprechender Nachweis konnte jedoch noch nicht sicher erbracht werden, zumal lange Zeit davon ausgegangen wurde, dass im Zellkern lediglich Aktinmonomere (G-Aktin) vorhanden ist. Seit einigen Jahren ist dieser Umstand jedoch widerlegt, Aktinfilamente konnten im Zellkern von diversen Zelllinien nachgewiesen werden. Hierbei stellte sich nun erneut die Frage, wie diese Aktinfilamente an der Genexpression beteiligt sein und was diese Interaktion beeinflussen könnte. Im Rahmen dieser Arbeit zeigte sich, dass die bekanntermaßen mit Östrogenrezeptoren ausgestattete humane Mammakarzinomzelllinie MCF-7 nicht nur nukleäre Aktinfilamente aufweist, sondern dass das Maß an sich bildenden nukleären Aktinfilamenten nach Serumstimulation abhängig von einer zuvor applizierten Konzentration an Östrogen zu sein scheint. In dieser Arbeit wurde als möglicher Erklärungsansatz zur vermehrten Bildung von nukleärem F-Aktin nach Östrogenvorbehandlung eine von der Östrogenkonzentration abhängige verminderte Expression des Proteins Cofilin dargestellt. Östrogen führt bei der erwähnten Zelllinie über den Östrogenrezeptor ERα bekanntermaßen zur Proliferation, was auch in dieser Arbeit durch diverse Wachstumsassays bestätigt werden konnte. Bekannt ist ebenfalls, dass nach Östrogenbindung an den ERα dieser als Transkriptionsfaktor für diverse Gene tätig wird. Zu diesen Genen zählen unter anderem BRCA1, FOXA1 oder auch TP53. Genannte Gene üben vielfältige Einflüsse auf Zellen aus. In dieser Arbeit wurde untersucht inwieweit nukleäre Aktinfilamente im Zusammenwirken mit Östrogen an der Expression von bekanntermaßen Östrogen-responsiven Genen beteiligt sind. Direkt verglichen wurden hierbei mit Östrogen vorbehandelte MCF-7 Zellen, wovon die einen eine Wildtyp-Variante des Aktins aufwiesen, wohingegen die anderen eine dysfunktionale Aktinvariante (R62D-Aktin, fehlende Aktinpolymerisierung) exprimierten.In Zusammenschau der gewonnenen präliminären Ergebnisse zeigte sich keine einfache Ursache-Wirkungs-Beziehung zwischen Östrogen, nukleärem F-Aktin und bestimmten Genen. Es eröffneten sich jedoch vielfältige neue Fragestellungen hinsichtlich der wohl äußerst komplexen Funktion von F-Aktin bei der Expression unterschiedlicher Gene in humanen Tumorzellen, sowie deren Beeinflussung durch Steroidhormonen als äußere Faktoren.

During embryonal development, axons of newly differentiated neurons need to properly interconnect and create a functional neuronal network. To achieve this, the cell requires a growth cone. The growth cone is a highly dynamic structure at the end of growing axons that serves both as the navigator and the propeller. Crosstalk between actin and microtubules is vital for proper axonal pathfinding. But the exact mechanism of this cooperation remains unknown. This diploma thesis investigates the possible role of a candidate scaffolding protein called anillin in this process. Anillin has been studied in two human cell lines. SH-SY5Y neuroblastoma cell line was used for overexpression and siRNA knock-down experiments. Anillin overexpression led to perturbed neurite morphology and growth cone dynamics in SH-SY5Y cells, whereas cells with lower anillin expression had fewer neurites. Next, neurons differentiated from human iPSC (induced pluripotent stem cells) expressing endogenous fluorescently tagged anillin were studied. Local dynamic high concentration spots of anillin have been observed at the base of cell protrusions of differentiating neurons. These anillin flares appeared during cell migration, early neurite initiation, and in newly created growth cones. These results suggest that anillin plays a...

The eukaryotic actin cytoskeleton is required for numerous cellular processes, including cell shape, development and movement, gene expression and signal transduction, and response to biotic and abiotic stress. Actin constitutes a wide family of proteins that are major components of the cytoskeleton. Actin is one of the most abundant proteins in living organisms. Actin has essential functions both in the cytoplasm and in the nucleus, where it has been linked to key nuclear processes. Recent studies have shown that actin is actively transported from the cytoplasm to the nucleus, where it regulates transcriptional aktivity, regulates RNA polymerases, is involved in chromatin remodeling and repair damaged DNA. The presence of typical actin filaments in the nucleus has not been demonstrated directly.but nuclear actin occurs in many forms such as actin rods, short actin polymers, actin monomers, or actin complexes with profilin or cofilin. Most eukaryotic cells also contain at least eleven actin-related proteins (ARPs). Although many ARPs are cytoskeletal, recent biochemical and genetic work has demonstrated that some ARPs function largely or entirely in the nucleus. Nuclear ARPs are recognized as novel key regulators of genome function, and affect not only the remodeling of chromatin but also the...

Mit dieser Arbeit konnte das Hitzeschockprotein (Hsp) 70 als ein Wirtszellfaktor identifiziert werden, der an der Aufnahme von binären clostridialen Aktin-Adenosindiphosphat (ADP)-ribosylierenden Toxinen in Säugetierzellen beteiligt ist. Die binären clostridialen Toxine C2 von Clostridium (C.) botulinum, Iota von C. perfringens und C. difficile-Toxin (CDT) von C. difficile bestehen aus einer enzymatisch aktiven A-Komponente und einer Bindungs- und Transportkomponente, der B-Komponente. Mittels der B-Komponenten wird die rezeptorvermittelte Endozytose der Toxine in Säugetierzellen sowie die Translokation der A-Komponente aus den Endosomen in das Zytosol vermittelt. Die A-Komponente besitzt die enzymatische Funktion einer ADP-Ribosyltransferase, durch welche globuläres Aktin (G-Aktin) ADP-ribosyliert wird. Die ADP-Ribosylierung von G-Aktin führt zu einer Zellabrundung bei Zusammenbruch des Zytoskeletts und hat letztendlich den Zelltod zur Folge. So werden die für das jeweilige Toxin typischen enterotoxischen Symptome verursacht. Für die Translokation der A-Komponenten C2I, Ia und CDTa über die endosomale Membran ins Zytosol sind bereits das Chaperon Hsp90 und die Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen bekannt. Nun ist neben diesen auch Hsp70 als ein Wirtszellfaktor identifiziert worden, der ebenfalls spezifisch an der pH-abhängigen Membrantranslokation beteiligt ist. Dies trägt zum besseren Verständnis des Aufnahmemechanismus dieser Toxine bei und ist von therapeutischer Bedeutung. So stellt Hsp70 eine weitere Möglichkeit dar, um neue Therapieansätze zur Behandlung von Infektionskrankheiten, die durch die clostridialen Aktin-ADP-ribosylierenden Toxine verursacht werden, zu entwickeln.

In order to fertilize the egg, sperm cell undergoes several subsequent maturation processes. The final one called acrosome reaction is an exocytosis of acrosome vesicle, which is filled with lytic enzymes. Acrosome reaction is crucial for penetration of the sperm cell through the egg surroundings, especially zona pellucida, as well as for reorganization of a membrane protein composition on its surface. This rearrangement leads to the exposure of proteins essential for fertilization, mainly for gamete recognition, binding and fusion in specific compartments of the sperm head. One of such protein is CD46, which is located in the acrosomal membrane of an intact sperm and after acosomal exocytosis it relocates to the equatorial segment of a sperm head, which is known to be the initial site of interaction of sperm with the egg plasma membrane. The relocation of CD46 is disrupted by inhibition of actin, which reorganization within sperm head is known to play a role in onset of acrosome reaction, however, the precise mechanism of CD46 interaction with actin in sperm is unknown. In this thesis, ezrin - a crosslinker of membrane proteins and actin - has been studied in context of CD46 and its relocation across the sperm head. Analysis of the immunofluorescent detection of ezrin revealed its mutual...

This thesis is focused on the role of host cytoskeleton, primarily microtubules and microfilaments, during tick-borne encephalitis virus infection in human neuroblastoma cell line SK-N-SH and tick cell line IRE/CTVM19. The importance of cytoskeletal integrity and dynamics to the viral replication cycle were examined using specific chemical inhibitors showing the virus utilizes studied structures in both cell lines. Immunofluorescence microscopy revealed structural changes in the actin cytoskeleton during late infection in SK-N-SH cells. Moreover, differences in expression of cytoskeleton-associated genes in both cell lines were compared. Several genes with up-regulated expression in SK-N-SH cells were identified during late infection.

The filament-forming protein actin is abundant in eukaryotic cells and its rapid dy- namics as well as versatile protein interactions result in a diverse array of functions to form important cytoskeletal structures. These influence among others shape, mi- gration and organelle-associated processes, i.e. vesicle movement or mitochondrial fission. The study of such structures in the nuclear compartment was first successful in germline cells of non-mammalian model organisms with high nuclear actin con- centrations. Somatic, mammalian cell nuclei show substantially lower actin levels and faithful visualization of nuclear actin assembly could only be achieved by actin- binding probes fused to nuclear localization sequences circumventing the otherwise saturated cytoplasmic signal. Although high expression levels can lead to artificially induced filaments, careful titrations allowed the discovery of two different types of nuclear actin assembly by live-cell imaging of mammalian cells, regulated either by extracellular signals or the cell cycle. Extracellular signals for nuclear actin assembly can be induced by integrins and mechanotransduction, activation of other cell surface receptors or DNA damage and subsequent repair mechanisms. Mechanistic evaluation revealed that integrin- mediated nuclear actin filaments depend on the actin assembly factors mDia1 and 2 as well as the linker of nucleoskeleton and cytoskeleton complex positively influenc- ing myocardin-related transcription factor A/serum response factor-dependent gene expression. Integrin-mediated nuclear actin assembly was also observed during can- cer cell invasion trough collagen matrices. In contrast, cell cycle-regulated nuclear actin assembly occurs together with the re-assembly of daughter nuclei after mitosis. Due to the breakdown of the nuclear envelope for open mitosis, daughter cells have to re-assemble this compartment at mitotic exit. However, the complex organization of interphase nuclei originating from mitotic chromosomes is not fully understood. Our data indicate an important role for nuclear actin dynamics in nuclear volume expansion and chromatin decondensation, which are necessary for a functional interphase nucleus and physiological cellular behavior as well as early embryonic development. We could visualize single and bundled actin filaments in inter-chromosomal spaces and at the nuclear envelope, which were negatively regulated by the actin-depolymerizing factor Cofilin. However, multidisciplinary approaches are further required to study the pre- cise influence of nuclear actin assembly on chromatin dynamics in more detail. Ex- ploring this phenomenon by a combination of proteomics, Hi-C, super-resolution live- cell imaging and novel labeling methods for genomic loci and nucleosomes will aid our understanding of the complex and dynamic nuclear architecture. Further mech- anistic studies into the upstream regulation and the influence of other actin-binding proteins are required to model nuclear actin assembly at mitotic exit., Die Abundanz von Aktin und der schnelle, regulierte Auf- und Abbau von Aktinfila- menten einhergehend mit einer Vielzahl von Proteininteraktionen resultiert in einer großen Bandbreite Aktin-abhängiger Funktionen, meist als wichtiger Bestandteil des Zytoskeletts. Dies beeinflusst unter anderem die Form und Migration von Zellen, aber auch intrazelluläre, Organell-assoziierte Prozesse, wie Vesikelbewegung oder das Verhalten von Mitochondrien. Die Untersuchung von Aktinfilamenten im Nukleus gelang zuerst in Oozyten von Wirbellosen, welche sehr hohe Aktinkonzentrationen in diesem Kompartiment aufweisen. Somatische, Säugertier-Zellkerne beinhalten substantiell geringere Mengen an Aktin, was die Visualisierung von Aktinfilamenten erschwerte. Die Fusion von Nukleus-Lokalisierungs-Signalen mit Aktin-bindenden Domänen und fluoreszierenden Proteinen ermöglichte die Beobachtung von dyna- mischen, nukleären Aktinfilament durch Vermeidung des ansonsten überexponier- ten, zytoplasmatischen Fluoreszenzsignals. Obwohl zu hohe Expressionslevel in ei- nigen Fällen zur artifiziellen Induktion von Filamenten führen können, erlaubte die sorgfältige Titration dieser nukleären Aktinproben die Entdeckung von zwei unter- schiedlichen Formen der Aktinassemblierung im Säugetierzellkern, welche zum ei- nen über extrazelluläre Signale, zum anderen über den Zellzyklus reguliert werden. Extrazelluläre Signale für nukleäre Aktinassemblierung sind Integrine sowie Mechanotransduktion, die Aktivierung weiterer Oberflächenrezeptoren oder DNA- Schäden und nachfolgende Reparaturmechanismen. Mechanistische Analysen zeigten, dass Integrin-vermittelte Aktinfilamente im Zellkern von den Aktinassemb- lierungsfaktoren mDia 1 und 2 sowie von dem linker of nucleoskeleton and cytoske- leton-Komplex abhängig sind. Dieser Prozess wirkt sich auch positiv auf die myocar- din-related transcription factor A/serum response factor-abhängige Genexpression aus. Weiterhin wurden ähnliche Formen von nukleärer Aktinassemblierung bei der Krebszellinvasion beobachtet. Zellzyklus-abhängige nukleäre Aktinfilamente treten im Gegensatz dazu zeit- gleich mit dem Wiederaufbau der Tochterzellkerne nach der Mitose auf. Aufgrund des Abbaus der Zellkernmembran für die offene Form der Mitose müssen Tochter- zellen dieses Kompartiment am Ende des Teilungsprozesses wiederaufbauen. Wie sich die komplexe Organisation von Interphasezellkernen aus mitotischen Chromo- somen entwickelt, ist bisher nicht ausreichend verstanden. Unsere Daten weisen auf eine wichtige Rolle für nukleäre Aktindynamik bei der Expansion des Tochterzell- kernvolumens und der Chromatindekondensation hin, was nachfolgend die Funktio- nen eines Interphasezellkern und physiologisches Zellverhalten bestimmt. Wir konn- ten einzelne und gebündelte Aktinfilamente in Chromosomzwischenräumen sowie an der Zellkernmembran visualisieren und einen negativen Einfluss des Aktin-depo- lymerisierenden Faktors Cofilin herausstellen. Nichtsdestotrotz sind multidisziplinäre Ansätze notwendig, um den Einfluss dieser nukleären Aktinfilamente auf die Chromatindynamik detaillierter festzustellen. Eine Untersuchung dieses Phänomens mithilfe von proteomischen Methoden, Hi-C, super-auflösender Lebendzellmikroskopie und neuartigen Verfahren zur Markierung genomischer Bereiche ist hierbei notwendig, um die komplexe, dynamische Archi- tektur des Zellkerns aufzuschlüsseln. Weitere mechanistische Arbeiten in Hinblick auf vorgeschaltete Signalwegen sowie andere Aktin-bindenden Proteine sind für ein vollständiges Modell dieses Prozesses ebenfalls unabdingbar.

Actin filaments and microtubules are involved in cell development and morphogenesis. Plant Class II formins regulate both cytoskeletal polymers. However their function has not yet been fully described. This study examines effects of LOF mutations in Arabidopsis thaliana FH13 (AT5G58160) and FH14 (AT1G31810) genes on early root system development using a pharmacological approach. Since measuring root length of numerous mutant lines in multiple conditions is laborious and time consuming, this thesis also involves optimization of this process with the aim to establish a reliable method of fast visualisation and measurement of Arabidopsis seedlings in a time series in the laboratory. Furthermore, statistical analysis for a large amount of data gathered in multiple conditions had to be optimized. While no significant phenotype in terms of root length was found in fh13, fh14 and double fh13 fh14 LOF mutants under standard conditions, treatment with cytoskeletal drugs revealed possible changes in lateral root branching in an fh14 mutant. Nevertheless, specific function of FH13 and FH14 remains a question.

Phagozytose ist ein essentieller Teil des Immunsystems und ein hochkomplexer, aktiver, durch Aktin-Remodellierung mediierter Prozess. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der zellmechanischen Untersuchung der Phagozytose mit Fokus auf der Rolle des Strukturproteins Aktin. Hierfür wird im ersten Teil eine - im Rahmen dieser Arbeit erstellte - Arbeitsstation zur Beobachtung von lebenden Zellen und zur zellmechanischen Untersuchung mittels holografischer optischer Fallen vorgestellt und diskutiert. Im zweiten Teil wird der biophysikalischen Fragestellung nachgegangen, inwieweit sich die Rolle von Aktin in den Phasen der Partikelinternalisierung und des nachfolgenden Phagosomtransports experimentell nachweisen und quantifizieren lässt. Aktinremodellierung ist ein wesentlicher Bestandteil der Phagozytose, die Längen- und Zeitskalen der Aktinremodellierung während der Phagozytose wurden bisher jedoch noch nicht eindeutig identifiziert. Ein besseres Verständnis dieser zellmechanischen Vorgänge der Phagozytose kann zur Bekämpfung von Autoimmunerkrankungen beitragen und ist Ziel dieser Arbeit. Zur Beantwortung dieser Fragen werden Techniken der Mikromanipulation und Mikroskopie verwendet. Eine Abnahme der globalen Phagozytose-Effizienz mit steigendem Grad der Inhibierung der Aktin-Polymerisierung in J-774A.1-Zellen wird durch Nachweis erfolgreicher Partikelinternalisierung mittels Fluoreszenz-Mikroskopie gemessen. Mit Hilfe von holografischen optischen Fallen wird der Einfluss von Aktin auf die zellmechanischen Eigenschaften während der Partikelinternalisierung untersucht. Im Rahmen der Experiment-Limitierungen kann in J-774A.1-Zellen mit einem intakten Aktin-Netzwerk eine Zunahme der lokalen Zellsteifigkeit mit fortschreitender Partikelinternalisierung nachgewiesen werden, eine Änderung der Viskoelastizität der phagozytierenden Zellen ist in den Experimenten nicht feststellbar. Die Quantifizierung der Rolle von Aktin während des Partikeltransports erfolgt mit Hilfe von magnetischen Pinzetten. Die Inhibierung der Aktin-Polymerisierung hat hierbei eine Reduktion der Transportgeschwindigkeiten und eine Zunahme der Transportpausen zur Folge. Mit einer experimentellen Technik zur Beobachtung der Phagozytose im Zellprofil und einer experimentellen Anwendung der Kombination von Echtzeit-Partikeltracking mit rückgekoppelter Probenpositionierung werden zusätzliche Ansätze präsentiert, mit denen sich das Fortschreiten der Membranumhüllung während der Partikelinternalisierung detailliert beobachten und spezifizieren lässt. Die präsentierten Ergebnisse weisen den direkten Einfluss von Aktin auf die Partikelinternalisierung und den Phagosomtransport zellmechanisch nach. Für eine hohe Phagozytose-Wahrscheinlichkeit und eine charakteristische Partikelauslenkung in Folge der Phagozytose ist eine intakte Aktin-Struktur notwendig. Die gemessenen Zeitskalen einer Zunahme der Zellsteifigkeit während der Partikelinternalisierung liegen in der Größenordnung von 100 s.

Der epitheliale Natrium Kanal (ENaC) wurde im Endothel nachgewiesen und als EnNaC bezeichnet. Er beeinflusst die mechanischen Eigenschaften der Endothelzellen und damit deren Funktion. Eine erhöhte Anzahl von EnNaC in der endothelialen Plasmamembran führt zur Versteifung des Zellkortex und damit zu endothelialer Dysfunktion. Im Gegensatz dazu wird durch Blockade des EnNaC die kortikale Steifigkeit der Endothelzellen verringert. Der zugrundeliegende Mechanismus wurde mittels Atomic Force Microscopy in dieser Arbeit untersucht. Die Reduktion der kortikalen Steifigkeit durch die Blockade des EnNaC beruht auf einem schnellen, nicht-genomischen Mechanismus. Dieser Effekt konnte durch Blockade der Aktin-Depolymerisation verhindert werden. Daher postulieren wir, dass der Einfluss des EnNaC auf die mechanischen Eigenschaften über die Interaktion mit dem kortikalen Aktin-Skelett abläuft.

Das humane Papillomavirus Typ 16 ist die Hauptursache von Gebärmutterhalskrebs. Für die Aufnahme von HPV16 in Zellen wurde ein neuartiger Mechanismus der Endozytose identifiziert. Der neue Endozytoseweg ist unabhängig von Clathrin, Caveolin, Dynamin und Lipid Rafts. Die zelluläre Funktion ist bisher nicht bekannt, jedoch scheint er auch für die Aufnahme anderer Viren eine Rolle zu spielen. Die Arbeit strebt an die Regulation der einzelnen Schritte in der Entstehung des primären endozytischen Vesikels zu verstehen. Es zeigte sich, dass der Endozytoseweg ein allgemein verwendeter Mechanismus für die Aufnahme von Hochrisiko-Papillomaviren ist. Die Signale des EGF-Rezeptors initiierten die Entstehung der Vesikel. Proteine mit einer BAR-Domäne stabilisierten dann möglicherweise die Membrankrümmung. Die Reifung des Vesikels benötigte Signale von Serin-Threonin-Kinasen und Abl2. Der letzte Schritt der Vesikelabschnürung war angewiesen auf Aktinpolymerisierung, reguliert von Arp2/3 und WASH.

Total 262 samples of different Chiropterans originating from 27 localities in the Czech Republic were collected. Occurrence and prevalence of Cryptosporidium infection in bats were screened using staining method and molecular tools. While no Cryptosporidium oocyst was detected by microscopy, PCR analyses revealed presence of three positive specimens from three common pipistrelle (Pipistrellus pipistrellus). Zoonotic C. parvum was detected in one case and novel Cryptosporidium bat genotype III was found in other two samples.

Cytoskeleton plays a key role in endocytic process. Vesicules move along microtubules to target membranes. Microtubules also partake in the formation of endosomal tubules, from which recyclated vesicules are splitted off. Actin network has in endocytosis multi-ple effect as well. In the case of membrane fusion is its role both, positive and negative, for it creates mechanical force which facilitates the fusion in last stage. By contrast, in the first stage, it acts as a physical barrier, which needs to be removed. Actin also actively participates in fission of vesicules. Actin network and microtubules are thus interconnected with endocytic pathway in time and space. Right functional connection of the cytoskeleton with dynamics of endocytic vesicles is driven by many regulatory proteins. Among important regulators of actin network belong for example proteins of Arp2/3, WASH complex, WASP or Rab and Rho proteins. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

The ability of cells to migrate through tissue barriers plays an important role in physiological and pathological processes including immune response or invasiveness of cancer cells. The cells generate cytoplasmic protrusions called podosomes and invadopodia, collectively known as invadosomes or podosome-type adhesions (PTA), which are thought to be the key structures of cell invasion, especially of cancer cells during metastasis. Invadosomes are F-actin rich cell-matrix contacts with capability to degrade extracellular matrix components and are observed both in normal cells (such as monocytic cells, endothelial cells and smooth muscle cells) and in cancer cells. This bachelor thesis is focused on those in cancer cells, their initiation, regulation, function and morphology in 3D and in vivo and their requirement for tumor metastasis.

eIF5A seems to be involved in both, translation initiation and elongation. It was also reported to affect assembly of P-bodies. Given similarities of P-bodies with stress granules (SGs) we decided to test the role of eIF5A in dynamics of heat-induced SGs and its implications for the cell recovery. For the evaluation of eIF5A function in SGs formation was used the temperature- sensitive (ts) mutant eIF5A-3 (C39Y/G118D) cultivated under permissive temperature 25řC and Rpg1-GFP fusion protein as a marker of SGs. The cells were exposed to robust heat shock at 46řC for 10 minutes. The ability of the mutant cells to recover was tested by propidium iodine staining and colony forming units plating. We found that the eIF5A-3 mutant forms heat-induced SGs more loosely aggregated, indicating that the fully functional eIF5A is necessary for SGs assembly. However, it does not seem to affect the rate of SGs dissolution. Survival tests indicate that eIF5A-3 mutant cells are susceptible to dying in a similar way as WT cells; nevertheless, their ability to resume proliferation is significantly better. We also observed a loss of the ts phenotype of the eIF5A-3 mutant. This loss cannot be explained by reversion of mutated eIF5A sequence into normal. Probable cause lies in the adaptive evolution. Our results indicate role of...

(English) Both paxillin and PIP2 are well known components of the cell, although of a distinct origin. Focal adhesion protein paxillin spreads the signals from extracellular matrix via integrins and growth factor receptors to affect cellular motility and migration (Schaller, 2001). PIP2, a major structural component of cytoplasmic membrane, is utilized by phospholipase C to generate second messenger molecules (Hokin and Hokin 1953; Streb et al. 1983). Both molecules were recently shown to be localized in the nucleus. Their original functions have been well established, but together with other research colleagues we are now shedding more light on completely different functions of these biological molecules and moreover, in the different compartments than they were primarily believed to function in. Here, we introduce paxillin as an important factor of the cell nucleus, where it regulates transcription of two important growth-related genes, IGF2 and H19. It does not affect the allelic expression of these imprinted genes, it rather regulates long-range chromosomal interactions between H19 or IGF2 promoter, and the shared distal enhacer on an active allele. In detail, paxillin stimulates the interaction between the enhancer and the IGF2 promoter, activating IGF2 gene transcription, while it restrains...

Das Kriechen von Zellen über Oberflächen spielt eine entscheidende Rolle bei lebenswichtigen Prozessen wie der Embryonalentwicklung, der Immunantwort und der Wundheilung, aber auch bei der Metastasenbildung. Die Zellbewegung erfolgt über die Bildung einer flachen Ausstülpung der Zellmembran, des Lamellipodiums. In dieser Arbeit wird ein mathematisches Modell entwickelt, das die Bildung, Stabilität und Stärke des Lamellipodiums, sowie die Dynamik der Zellvorderkante beschreibt. Dabei werden zwei Bereiche innerhalb des Lamellipodiums unterschieden. Im Hauptteil besteht es aus einem dichten Netzwerk von Aktinfilamenten, dem sogenannten Aktingel. An der Vorderkante wachsen die Enden der Aktinfilamente durch Polymerisation und bilden einen dynamischen Grenzbereich, die semiflexible Region. Das Gleichgewicht zwischen den Filamentkräften in der semiflexiblen Region und den viskosen sowie den äußeren Kräften bestimmt die Geschwindigkeit der Zellvorderkante. Eine Stabilitätsanalyse liefert Bedingungen für die Existenz stabiler Lamellipodien. Im Parameterbereich mit Filamentdichte Null können keine stabilen Lamellipodien existieren, aber aufgrund von Anregbarkeit trotzdem vorrübergehend gebildet werden. Hier beschreibt das Modell sehr gut das in Epithelzellen gemessene aufeinanderfolgende Vorschieben und Zurückziehen von Lamellipodien. Es zeigt, dass für die Zyklen prinzipiell keine Änderung in der Konzentration von Signalmolekülen innerhalb der Zelle notwendig ist. Das Modell wird auch auf die gemessene Kraft-Geschwindigkeits-Beziehung von Fischkeratozyten angewandt. Aufgrund der guten Übereinstimmung zwischen Experiment und Simulationen wird ein Mechanismus vorgeschlagen, der die charakteristischen Merkmale der Beziehung erklärt. Es wird gezeigt, dass die gemessene Kraft-Geschwindigkeits-Beziehung ein dynamisches Phänomen ist. Eine stationäre Beziehung, die unter der Bedingung gilt, dass die Zellen einer konstanten Kraft ausgesetzt sind, wird vorhergesagt. Many cells move over surfaces during embryonic development, immune response, wound healing or cancer metastasis by protruding flat lamellipodia into the direction of migration. In this thesis, a mathematical model is developed that describes the formation of lamellipodia, their stability, strength and leading edge dynamics. Two regions inside the lamellipodium are distinguished in the model. The bulk contains a dense cross-linked actin filament network called actin gel. The newly polymerized tips of the actin filaments form a highly dynamic boundary layer at the leading edge called semiflexible region. The balance of filament forces on the membrane in the semiflexible region with viscous and external forces determines the velocity of the leading edge. A stability analysis defines criteria for the existence of stable lamellipodia. No stable lamellipodium can exist in the parameter regime with a filament density of zero. However, due to excitability, lamellipodia can still form transiently. The measured subsequent protrusions and retractions of lamellipodia in epithelial cells are very well reproduced by the excitable behavior. The modeling results show that in principle no signaling is necessary for cycles of protrusion and retraction. Furthermore, they are fitted to the force-velocity relation of keratocytes, which has been measured by placing a flexible cantilever into the cell''s path of migration. Due to the good agreement between experiment and simulations, a mechanism leading to the characteristic features of the force-velocity relation is suggested. Moreover, properties of the structure of the stable keratocyte lamellipodium, like the length of actin filaments and the branch point density, can be concluded. It is shown that the force-velocity relation measured with the cantilever is a dynamic phenomenon. A stationary force-velocity relation is predicted that should apply if cells experience a constant force, e.g. exerted by surrounding tissue.