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Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) It has been described that intermittent hypoxia (IH, periods of hypoxia followed by normoxia), as observed in some pathological situations, promotes, acutely, a sustained increase in respiratory motor activity, dependent on the release of serotonin in areas of the central nervous system (brainstem and spinal cord). This effect has been demonstrated mostly in vagotomized and anesthetized animal preparations, which exhibited a potentiation of inspiratory and expiratory motor activities in response to acute IH (AIH). Evidence about the effects of AIH on respiratory activity in non-anesthetized conditions is scarce, especially considering the possible changes in the partial pressure of blood gases and body temperature that might follow such respiratory changes. In the present study, we found that pulmonary ventilation of unanesthetized Holtzman rats (80-150g, n = 9) submitted to 10 cycles of AIH (6% O2 for 30-40 s, every 5 minutes) was elevated compared to control animals (maintained in normoxia, n = 13), due to a long-lasting increase in tidal volume (P

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) During hypercapnia, chemosensory cells located in the brainstem are stimulated and send excitatory inputs to the respiratory network to promote an increase pulmonary ventilation. Among the candidates responsible for central chemoreception are the raphe serotonergic neurons, which widely send projections to distinct respiratory compartments. In spite of the anatomical evidence, there are few functional studies demonstrating how the raphe serotonergic neurons interact with the respiratory network, specially other chemosensitive sites. Herein, we explored the hypothesis that the ventilatory response to hypercapnia depends, at least in part, on the stimulation of the raphe serotonergic neurons that send projections to the retrotrapezoid nucleus (RTN) - an important respiratory region of the ventromedullary surface that contains CO2/pH sensitive cells. To reach this goal, the pulmonary ventilation was evaluated under baseline conditions and during the exposure to hypercapnia in unanesthetized juvenile Holtzman rats (60 - 90 g) that received bilateral microinjections of the toxin anti-SERT-SAP (0.1 mM) in the RTN to selectively lesion serotonergic neurons that send projections to this region. Fifteen days after microinjections of anti-SERT-SAP in the RTN (n = 8), baseline respiratory frequency (f) and tidal volume (VT) were not different from control animals that received vehicle microinjections (n = 9). On the other hand, the specific ablation of RTN-projecting serotonergic neurons markedly attenuated the response of increase in the f, but not in the VT, observed during the exposure to 7% CO2. The impaired tachypneic response to hypercapnia induced by anti-SERT-SAP microinjections in the RTN was associated with reduced number of serotonergic neurons in the raphe obscurus and magnus, but not in the raphe pallidus. Our data support the idea that, in the absence of anesthesia, the activation of part of medullary raphe serotonergic neurons that send projection to the RTN are necessary for the processing of ventilatory reflex responses during the exposure to high CO2. Durante condições de hipercapnia, células quimiossensíveis localizadas no tronco cerebral são estimuladas e enviam estímulos excitatórios à rede respiratória para promover um aumento da ventilação pulmonar. Entre os candidatos responsáveis pela quimiorrecepção central estão os neurônios serotoninérgicos da rafe bulbar, que enviam projeções para vários grupamentos respiratórios distintos. Apesar das evidências anatômicas, poucos são os estudos que demonstram, funcionalmente, como os neurônios serotoninérgicos da rafe interagem com a rede respiratória, especialmente com outras regiões quimiossensíveis. Aqui, exploramos a hipótese de que a resposta ventilatória à hipercapnia depende, pelo menos em parte, da estimulação dos neurônios serotoninérgicos da rafe que enviam projeções para o núcleo retrotrapezóide (RTN) - região localizada na superfície ventral do bulbo que contém células sensíveis ao CO2/pH. Para atingir esse objetivo, a ventilação pulmonar foi avaliada sob condições basais e durante exposição à hipercapnia em ratos Holtzman jovens não anestesiados (60-90 g) que receberam microinjeções bilaterais da toxina anti-SERT-SAP (0,1 mM) no RTN, a fim de causar lesão seletiva de neurônios serotoninérgicos que enviam projeções para essa região. Quinze dias após as microinjeções de anti-SERT-SAP no RTN (n = 8), a frequência respiratória basal (f) e o volume corrente (VT) não foram diferentes dos animais controle que receberam microinjeções de veículo (n = 9). Por outro lado, a lesão específica de neurônios serotoninérgicos que se projetam para o RTN atenuou significativamente a resposta de aumento da f, mas não do VT, observada durante toda exposição a 7% de CO2. A resposta de taquipnéia prejudicada durante hipercapnia induzida por microinjeções de anti-SERT-SAP no RTN foi associada à redução no número de neurônios serotoninérgicos na região da rafe obscurus e rafe magnus, mas não na rafe pallidus. Nossos dados indicam que, em condições não anestesiadas, a ativação de parte dos neurônios serotoninérgicos da rafe bulbar que enviam projeções para o RTN é necessária para o processamento de respostas reflexas ventilatórias durante a exposição à níveis elevados de CO2. FAPESP: 2018/04439-0

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) During the postnatal period, the respiratory network undergoes through developmental and maturational processes that are critical for the proper functioning of central mechanisms that controls breathing. Periods of apnea are commonly observed in preterm infants and it is suggested to be an important risk factor for the development of cardiorespiratory diseases in adults. In this study, we investigated the changes in pulmonary ventilation and respiratory motor outputs of juvenile and adult rats exposed to post-natal intermittent chronic hypoxia (pCIH), as well as the participation of DNA methylation processes in the induction of these alterations. To reach these goals, newborn rats (P1) were exposed to pCIH [6% O2 for 30 s every 10 min, 8 hours per day (9:30 - 5:30)] during the first 10 days of life, whereas control animals were maintained in normoxia. Injections of decitabine (DNA methylation inhibitor, 1 mg/kg, i.p.) or vehicle were performed on days P1, P4, P7 and P10. After this period, the animals were kept in normoxia until the day of the experiments. When young, pCIH animals presented, under basal conditions, increased tidal volume and minute ventilation, associated with irregularities in the respiratory frequency. Decerebrated, artificially perfused in situ preparations of pCIH rats exhibited, at resting conditions, an increase in phrenic burst amplitude associated with reduced vagal efferent activity. No significant differences were observed in HN activity. The in situ preparations of pCIH animals also presented higher apneic threshold and lower sensitivity to hypercapnia at 7% CO2, but not at 10% CO2. The respiratory responses to stimulation of carotid body chemoreceptors with KCN in the pCIH in situ preparations were similar to controls. In adulthood, pCIH rats also exhibited increased tidal volume and irregularities in the respiratory frequency. Inhibition of DNA methylation during pCIH prevented the changes in pulmonary ventilation and respiratory motor activity of juvenile rats, as well as the modifications in pulmonary ventilation of adult rats. We therefore conclude that the exposure to intermittent hypoxia during the postnatal period modifies the functioning of the respiratory network and promotes persistent changes in respiratory pattern and pulmonary ventilation. Intermittent hypoxia, observed in the apnea of prematurity, may be a relevant factor predisposing to respiratory pathologies in adults, such as obstructive sleep apnea. We conclude that epigenetic mechanisms, such as DNA methylation, actively promote and sustain the changes induced by pCIH. Durante o período pós-natal, há um período importante de desenvolvimento e amadurecimento da rede respiratória, o qual é crítico para o funcionamento completo de mecanismos neurais da geração do padrão e ritmo respiratório. Períodos de apneias são comumente observados em prematuros, e sugere-se tais eventos sejam um importante fator de risco para o desenvolvimento de doenças cardiorrespiratórias em adultos. Neste estudo, investigamos alterações respiratórias de ratos jovens e adultos previamente expostos a hipóxia crônica intermitente pós-natal (pCIH), bem como a participação da metilação de DNA na indução destas alterações. Para isso, ratos recém-nascidos (P1) foram submetidos à pCIH (6% O2 por 30 s a cada 10 min, 8 horas por dia) durante os dez primeiros dias de vida, enquanto que animais controle foram mantidos em normóxia. Foram realizadas injeções de decitabina (inibidor da metilação de DNA, 1 mg/kg, i.p.) ou veículo nos dias P1, P4, P7 e P10. Após este período, os animais foram mantidos em normóxia até o dia dos experimentos de pletismografia de corpo inteiro e registro da atividade motora. Os animais pCIH apresentaram quando jovens e adultos, em condições basais durante a pletismografia, aumento do volume corrente e da ventilação minuto, associado a presença de irregularidades na frequência respiratória. As preparações in situ descerebradas e perfundidas artificialmente de ratos pCIH apresentaram, em condições basais, aumento da atividade do nervo frênico associado a redução da atividade eferente vagal. Além disso, as preparações de animais pCIH apresentam maior limiar apnêico e menor sensibilidade à hipercapnia de 7% de CO2, mas não 10% CO2. As respostas respiratórias à estimulação dos quimiorreceptores periféricos com KCN nas preparações in situ de ratos pCIH foram similares às respostas do grupo controle. A inibição da metilação do DNA foi capaz de prevenir as alterações na ventilação pulmonar e no padrão motor respiratório em ratos jovens, bem como as alterações ventilatórias em ratos adultos que foram submetidos à pCIH. Diante desses resultados, concluímos que a exposição a hipóxia intermitente durante o período pós-natal modifica o funcionamento do sistema respiratório e promove alterações persistentes na ventilação pulmonar. A hipóxia intermitente, presente em apneias da prematuridade, pode ser um fator que predispõe a patologias respiratórias em adultos, como a apneia obstrutiva do sono. Concluímos também que mecanismos epigenéticos, como a metilação do DNA participam a ativamente das alterações promovidas pela pCIH. CNPq: 131443/2017-2

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Late-expiratory neurons (late-E) located in the parafacial respiratory group (pFRG), a critical region for the emergence of active expiratory pattern, are conditional and remain silent at baseline conditions. In situations of metabolic challenges, these neurons become active and contribute to increase the abdominal motor activity during the late expiratory phase. It was found that late-E neurons are silent at rest due to inhibitory inputs. Interestingly, in conditions of sustained hypoxia (SH), commonly observed in people moving to high altitudes, this inhibitory drive is reduced and generates the active expiratory pattern. In the present study we hypothesized that the Bötzinger complex (BötC), located in the ventral respiratory column, plays an important inhibitory role on the emergence of active expiration. We also explored the possibility that BötC inhibitory mechanism is reduced after SH and the activation of this mechanism is able to normalize the expiratory pattern of SH rats. The aim of the present study was to explore the contribution of the BötC neurons in the generation of the active expiratory pattern in control and SH (10% O2, 24 h) rats. To reach this goal, we recorded the pulmonary ventilation (in vivo) and respiratory motor activity in in situ preparations of juvenile rats (60-80 g) to evaluate, under normocapnic and hypercapnic (8-10% CO2) conditions: i) activity patterns of BötC post-I (n=5) and aug-E (n=9) neurons of control rats; ii) changes in the respiratory pattern after BötC pharmacological disinhibition of control rats with gabazine (GABAA receptor antagonist, 250 μM, n=7) or strychnine (glycine receptor antagonist, 10 μM, n=7); iii) the respiratory pattern of SH rats in situ (n=7) and in vivo (n=12); iv) effects on the respiratory motor activity of control (n=7) and SH rats (n=7) after microinjections of L-glutamate in BötC (10 mM); v) changes in respiratory pattern of SH rats (n=8) promoted by the pharmacological disinhibition of the BötC with strychnine (10 μM). In control rats, post-I and aug-E neurons were recorded under hypercapnia (8% CO2). Hypercapnia evoked late-E activity in the abdominal nerve (AbN), in association with a decreased post-I activity and augmented aug-E activity. Regarding to the bilateral microinjections of gabazine in the BötC of control rats, we observed a decrease in baseline phrenic nerve (PN) bursts frequency and increases in the expiratory time and in the AbN activity, with the emergence of late-E bursts. On the other hand, bilateral microinjections of strychnine in the BötC of control rats diminished the PN, vagus (cVN) and AbN nerve amplitudes, but did not modify the 3-phase respiratory pattern; and attenuated the emergence of the active expiratory pattern under hypercapnia conditions. Concerning the basal ventilatory pattern of unanesthetized SH rats, we observed an increase in minute ventilation, associated with a higher respiratory frequency and tidal volume. These findings obtained in in vivo parallel with our data from in situ preparations, showing that SH evoked active expiratory pattern at baseline conditions. BötC stimulation of SH rats with L-glutamate was able to briefly abolish AbN late-E activity. In addition, BötC disinhibition of SH animals with strychnine eliminated the late-E AbN firing and restored the respiratory motor pattern, similarly to control animals. Taken together, our results indicate that BötC perform a relevant inhibitory role on the mechanisms of active expiratory pattern generation. In addition, short-term SH seems to change the activity of BötC neurons, reducing this inhibitory drive and contributing to the emergence late-E AbN activity at resting conditions in these animals. Neurônios expiratórios tardios (late-E), localizados no grupamento respiratório parafacial (pFRG), região crítica para o padrão expiratório ativo, são condicionais, permanecendo silentes em condições basais, mas em situações de desafios metabólicos, tornam-se ativos e contribuem para o aumento da atividade motora abdominal durante a fase final da expiração (expiração ativa). Foi verificado que a inibição dos neurônios late-E, em condições basais, é mantida por um tônus inibitório. Interessante, a exposição à hipóxia sustentada (SH) parece reduzir esse drive inibitório, promovendo o surgimento da expiração ativa. No presente estudo, exploramos a possibilidade de que tal mecanismo inibitório do BötC esteja reduzido após a SH, e que a ativação desse mecanismo seria capaz de normalizar o padrão expiratório dos ratos SH. O objetivo do presente trabalho foi verificar a contribuição dos neurônios do BötC na geração do padrão de expiração ativa em ratos controle e SH (10% O2, 24 h). Para tanto, foram realizados registros da ventilação pulmonar (in vivo) e registros da atividade motora respiratória em preparações in situ de ratos jovens (60-80 g) para avaliar, em normocapnia e hipercapnia (8-10% CO2): i) o padrão de atividade dos neurônios post-I (n=5) e aug-E (n=9) do BötC de ratos controle; ii) as alterações no padrão respiratório após a desinibição farmacológica do BötC de ratos controle com gabazina (n=7) ou estriquinina (n=7); iii) o padrão respiratório de animais SH in situ (n=7) e in vivo (n=12); iv) os efeitos sobre a atividade motora respiratória de ratos controle (n=7) e SH (n=7) após microinjeções de L-glutamato no BötC; v) as alterações no padrão respiratório de ratos SH (n=8) promovidos pela desinibição farmacológica do BötC com estriquinina. Em hipercapnia, que evoca a atividade late-E no nervo abdominal (AbN), foi verificada redução no tempo de atividade dos neurônios post-I, enquanto que os neurônios aug-E apresentaram aumento no tempo em sua atividade. Em relação às microinjeções de gabazina no BötC de ratos controle foi verificada, em condições basais, redução na frequência dos bursts do nervo frênico (PN), e aumentos do tempo expiratório e da atividade AbN, com a presença de bursts late-E. Por outro lado, microinjeções de estriquinina no BötC de ratos controle promoveu redução modesta na amplitude dos nervos PN, vago (cVN) e AbN, sem modificar o padrão respiratório, e atenuou o surgimento do padrão de expiração ativa em hipercapnia. Em relação ao padrão ventilatório basal de ratos SH não anestesiados, verificamos um aumento da ventilação minuto, associado a maior frequência respiratória e volume corrente. A estimulação do BötC de animais SH foi capaz de abolir, momentaneamente, a atividade late-E AbN. Além disso, a desinibição do BötC de animais SH com estriquinina eliminou os disparos late-E AbN e restaurou o padrão motor respiratório. Em conjunto, nossos resultados indicam que o BötC exerce um papel inibitório relevante sobre os mecanismos de geração do padrão expiratório ativo. Além disso, a SH de curta duração parece modificar a atividade dos neurônios BötC, reduzindo esse drive inibitório e contribuindo para o surgimento da atividade late-E AbN, em condições basais nesses animai FAPESP 2013/17.251-6 FAPESP 2015/23.568-8 CNPq 302892/2014-1

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) The nucleus of the solitary tract (NTS) is the primary site of visceral afferents, such as baroreceptors and arterial chemoreceptors. Recent data from our laboratory have shown that the microinjection of acetylcholine (ACh) into the commissural moiety of the NTS (cNTS) of decorticated arterially-perfused in situ preparations of male juvenile rats did not change the sympathetic nerve activity (SNA), but increased the phrenic nerve activity (PNA). Furthermore, we demonstrated that the ACh-induced responses in cNTS involve the activation of both nicotinic and muscarinic receptors. However, nicotinic receptors seem to play a more relevant role in the control of breathing, especially considering that such receptor antagonism promotes a decrease in the KCN- activated peripheral chemoreflex tachypneic response. However, the effects of specific nicotinic and muscarinic agonists in the cNTS on respiratory and sympathetic responses have not been studied yet. Once established the involvement of nicotinic receptors in the cNTS on peripheral chemoreflex ventilatory responses activated by cytotoxic hypoxia (KCN), we also evaluated the involvement of the cholinergic system in the cNTS on respiratory and sympathetic responses induced by hypercapnia or 24 h sustained hypoxia. Therefore, this project proposed to study the effects of selective activation of distinct cholinergic receptors in the cNTS on respiratory and sympathetic activities and the role of the cholinergic system in cNTS on sympathetic and respiratory activities reflex changes in response to hypercapnia or sustained hypoxia. We observed that the injection of both nicotinic and muscarinic agonists in the cNTS induces an increase in SNA and changes in the respiratory modulation pattern. The nicotinic agonist induces a decrease in respiratory frequency, as well as the blockade of the enzyme acetylcholinesterase. It was also observed that the cholinergic agonists promote an increase in the amplitude and duration of the pre-inspiratory (pre-I) period of the hypoglossal nerve and also increased the amplitude of the vagus nerve. When it comes on the protocols involving hypoxia, we observed that the cholinergic antagonists injected into the cNTS of rats previously exposed to hypoxia promoted a decrease in sympathetic activity, increased respiratory frequency, decreased hypoglossal nerve amplitude, and decreased post-inspiratory peak amplitude of the vagus nerve, but only the muscarinic antagonist decreased phrenic nerve amplitude and hypoxia-induced hypoglossal nerve pre-I increase. Regarding to the experiments with hypercapnia, we verified that the nicotinic antagonist in the cNTS inhibited the hypercapnia-induced increase in pre-I of the hypoglossal nerve. In addition, the nicotinic antagonist injected into the cNTS also potentiated the recruitment of late-E activity from the abdominal nerve. Taken together, the responses observed with the cholinergic agonists and injected into the cNTS, as well as the antagonists upon hypoxia, suggest the involvement of cholinergic pathways in the cNTS in the modulation of sympathetic and respiratory responses to sustained hypoxia. On the other hand, it seems that only nicotinic receptors in the cNTS are involved in hypercapnia-induced increase in pre-inspiratory activity and active expiration. O núcleo do trato solitário (NTS) é o sítio primário de aferências viscerais, como barorreceptores e quimiorreceptores arteriais. Estudos recentes do nosso laboratório demonstraram que, em preparações in situ, decorticadas e perfundidas intra-arterialmente, a microinjeção de acetilcolina (ACh) na porção comissural do NTS (NTSc) não alterou a atividade simpática (SNA), mas promoveu aumento da atividade do nervo frênico (PNA). Além disso, evidenciamos que as respostas induzidas pela ACh no NTSc envolvem a ativação dos receptores nicotínicos e muscarínicos. Contudo, os receptores nicotínicos parecem desempenhar um papel mais relevante no controle da respiração, principalmente considerando que o antagonismo de tais receptores promove uma redução da resposta taquipneica do quimiorreflexo periférico ativado pelo KCN. Entretanto, os efeitos de agonistas específicos nicotínicos e muscarínicos, bem como a inibição da inibição da degradação de ACh no NTSc sobre as respostas respiratórias e sobre a atividade simpática ainda não foram estudados. Sabendo-se da participação dos receptores nicotínicos do NTSc sobre as respostas ventilatórias dos quimiorreceptores periféricos ativados por hipóxia citotóxica (KCN), avaliamos também a participação do sistema colinérgico do NTSc sobre as respostas simpática e respiratória induzidas por hipercapnia ou hipóxia sustentada por 24 h. Portanto, este projeto se propôs a estudar o efeito da ativação seletiva de diferentes receptores colinérgicos no NTSc sobre as atividades simpática e respiratória e o papel do sistema colinérgico no NTSc sobre as alterações reflexas nas atividades simpática e respiratória em resposta à hipercapnia ou hipóxia sustentada por 24 h. Observamos que a injeção de agonistas tanto nicotínico quanto muscarínico no NTSc promovem aumento da SNA e modifica o seu padrão de modulação respiratória. O agonista nicotínico induz uma diminuição da frequência respiratória, assim como o bloqueio da enzima acetilcolinesterase. Também foi observado que os agonistas colinérgicos promovem um aumento na amplitude e duração do período préinspiratório (pre-I) do nervo hipoglosso e também aumento na amplitude do nervo vago. Com relação aos protocolos envolvendo hipóxia, observamos os antagonistas colinérgicos injetados no NTSc de ratos previamente expostos à hipóxia, promoveu diminuição da atividade simpática, aumento da frequência respiratória, diminuição da amplitude do nervo hipoglosso e diminuição da amplitude do pico pós-inspiratório do nervo vago, mas somente o antagonista muscarínico diminuiu a amplitude do nervo frênico e o aumento do pre-I do nervo hipoglosso induzido pela hipóxia. Com relação aos experimentos com hipercapnia, verificamos que o antagonista nicotínico no NTSc inibiu o aumento do pre-I do nervo hipoglosso induzido pela hipercapnia. Além disso, o antagonista nicotínico injetado no NTSc também potencializou o recrutamento de atividade late-E do nervo abdominal. Tomados em conjunto, as respostas observadas com os agonistas colinérgicos injetados no NTSc, bem como com os antagonistas mediante a hipóxia, sugerem a participação de vias colinérgica do NTSc na modulação das respostas simpática e respiratória à hipóxia sustentada. Por outro lado, apenas os receptores nicotínicos do NTSc parecem estar envolvidos com o aumento da atividade pré-inspiratória e da expiração ativa induzidos por hipercapnia. FAPESP: 2013/22526-4

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) The exposure to periods of hypoxemia and reoxygenation, as observed in patients with obstructive sleep apnea (OSA), promotes compensatory increases in ventilation, sympathetic activity and blood pressure (BP), by mechanisms not fully understood. In the present study, we investigated the central mechanisms responsible for the cardiorespiratory changes induced by acute intermittent hypoxia (AIH; 10 episodes of 6-7% O2 for 45 sec, every 5 min hyperoxia) either in adult male rats (270-280 g) anesthetized with urethane (1.2 g / kg, ip) or in in situ working heart-brainstem preparations of juvenile male rats (65-75 g). In in situ preparations, the AIH promoted long-term facilitation (LTF), of at least 1 hour, in the phrenic nerve (PN), abdominal (AbN) and thoracic sympathetic (tSN) activities (n=9, P

Estudos têm demonstrado que os neurônios do núcleo pré-óptico mediano (MnPO) desempenham um importante papel na regulação cardiovascular e hidromineral, principalmente, por meio de suas projeções para o núcleo paraventricular (PVN) do hipotálamo. O PVN, por sua vez projeta-se para a região rostroventrolateral do bulbo (RVLM) um dos principais núcleos geradores da atividade simpática vascular, renal e cardíaca. Todavia, as respostas autonômicas frente a inibição do MnPO, bem como vias centrais e/ou mecanismos envolvidos nessas respostas permanecem desconhecidos. O presente estudo buscou determinar a participação do MnPO na regulação autonômica e cardiovascular em ratos wistar (WT) e espontaneamente hipertensos (SHR). Para tanto, ratos das linhagens WT e SHR, pesando entre 250 e 350g foram anestesiados com uretano (1,2 g/kg, iv.) após a indução com halotano (2% em O2 100%). A artéria e veia femorais direitas foram canuladas para o registro da pressão arterial média (PAM), e a infusão de drogas, respectivamente. A frequência cardíaca (FC) foi calculada como frequência instantânea do sinal de eletrocardiograma (ECG). Os animais foram posicionados em um aparelho estereotáxico e instrumentalizados para registro da atividade nervosa simpática renal (ANSR), e nanoinjeções (100nl) de soro fisiológico (NaCl; 150mM); ácido quinurênico (antagonista glutamatérgico; 50mM) e muscimol (agonista gabaérgico; 4mM) no MnPO. Como esperado, as nanoinjeções de soro não alteraram os valores da PAM (WT: 0,4 ± 0,2 mmHg; SHR: 0,2 ± 0,4 mmHg), FC (WT: 0,7 ± 0,9 bpm; SHR; 1,1 ± 1,4 bpm) e da ANSR (WT: 0,4 ± 0,2 %; SHR: -0,2 ± 1,3 %).Em ratos WT (n=6), o bloqueio farmacológico do MnPO com muscimol promoveu queda na PAM (-17,0 ± 1,2 mmHg), bradicardia (-55,4 ± 12,3 bpm) e redução na ANSR (-37,5 ± 3,9 %). As nanoinjeções de muscimol no MnPO dos SHR (n=6) promoveram hipotensão (-31,6 ± 5,0 mmHg), bradicardia (-18,3 ± 7,2 bpm), e simpatoinibição renal (-54,4 ± 6,2 %). As variações dos parâmetros autonômicos e cardiovasculares induzidas pela inibição do MnPO também foram avaliadas em ratos WT e SHR submetidos à desnervação dos aferentes sinoaórticos. Nos ratos normotensos, a inibição do MnPO com muscimol promoveu queda na PAM nos ratos inervados (n=6) e desnervados (-19,4 ± 1,9 vs. -20,9 ± 4,3 mmHg, respectivamente; 3min; n=6), sendo esta mantida por todo período experimental (-13,5 ± 2,0 vs. -22,5 ± 4,3 mmHg; 30min). Também não foram evidenciadas diferenças na redução da ANSR nos ratos WT inervados (-23,0 ± 1,5 %; 3min) e desnervados (-21,0 ± 4,9 %; 3min). Nos ratos hipertensos desnervados (n=5), o bloqueio do MnPO promoveu uma progressiva redução na PAM (-31,1 ± 6,7; -38,7 ± 9,7 e -44,7 ± 7,1 mmHg; respectivamente 3, 15 e 30 min após o bloqueio do MNPO). As alterações promovidas na FC (-1,3 ± 3,3; -21,5 ± 12,6 e -24,9 ± 12,2 bpm; respectivamente 3, 15 e 30 min após o bloqueio do MNPO) e ANSR (-16,4 ± 8,8; -37,3 ± 10,1 e -45,1 ± 8,7 %; respectivamente 3, 15 e 30 min após o bloqueio do MNPO) também seguiram esse padrão de resposta. Por fim para identificarmos a participação da neurotransmissão glutamatérgica no MnPO sobre o controle cardiovascular e autonômico, nanoinjeções de ácido quinurênico foram realizadas neste núcleo. O bloqueio glutamatérgico no MnPO promoveu queda na PAM (WT: -18,2 ± 4,1 mmHg vs. SHR: -21,0 ± 2,5 mmHg), bradicardia (WT: -7,1 ± 1,9 bpm vs. SHR: -9,0 ± 6,0 bpm e simpatoinibição renal (WT: -19,7 ± 2,4 % vs. SHR: -24,7 ± 2,4 %). Em conjunto, os resultados obtidos nesse estudo demonstraram que o bloqueio agudo do MnPO reduz a pressão arterial (PA), corroborando com dados recentes que indicam que esse núcleo participa do controle tônico da PA. Nossos dados sugerem o envolvimento do MnPO na regulação tônica da atividade simpática em WT e SHR. Ademais, sugerem a participação desse núcleo no aumento da atividade simpática e consequente hipertensão arterial observada em SHR. Os resultados evidenciaram ainda, que os aferentes aórticos e carotídeos participam na modulação das respostas autonômicas e cardiovasculares induzidas pelo bloqueio do MnPO em SHR. Além disso, nossos dados sugerem que a neurotransmissão glutamatérgica no MnPO é importante para a regulação tônica da PA, FC e ANSR trazendo assim novas evidências de que esse núcleo participa do controle autonômico e cardiovascular. Studies have demonstrated that neurons in the median pre-optic nucleus (MnPO) play a key role in the organization of cardiovascular responses induced by changes in circulating volume mostly through their projections to the paraventricular nucleus (PVN) of the hypothalamus. PVN in turn, projects to the rostroventrolateral medulla (RVLM) one of the main generators nucleus of vascular sympathetic, renal and cardiac activity. However, the autonomic response of blocked of the MnPO and central pathways and / or mechanisms involved in these responses remains unknown. The present study sought to determine the involvement of the MnPO in cardiovascular and autonomic regulation in Wistar (WT) and spontaneously hypertensive rats (SHR). For these, rats of the lineages WT (n = 6) and SHR (n = 6), weighing between 250 and 300g were anesthetized with urethane (1.2 g / kg, iv.) after induction with halothane (2% in O2 100%). The right femoral artery and vein were cannulated for recording of mean arterial pressure (MAP), and infusion of drugs, respectively. Heart rate (HR) was calculated as instantaneous frequency signal electrocardiogram (ECG). The animals were positioned in a stereotaxic apparatus, and instrumented for recording renal sympathetic nerve activity (RSNA). The nanoinjections of saline (NaCl; 150 mM), kynurenic acid (glutamate receptor antagonist; 50 mM) and muscimol (GABA agonist; 4 mM) were also performed. As expected, saline nanoinjections did not change the values of MAP (WT: 0.4 ± 0.2 mmHg; SHR: 0.2 ± 0.4 mmHg), HR (WT: 0.7 ± 0.9 bpm; SHR, 1.1 ± 1.4 bpm) and RSNA (WT: 0.4 ± 0.2%; SHR: 0.2 ± 1.3%). In WT (n=6) rats, the blockade of the MnPO with muscimol promoted fall in MAP (-17.0 ± 1.2 mmHg), bradycardia (-55,4 ± 12,3 bpm) and reduces in RSNA (-37.5 ± 3.9 %). The muscimol nanoinjections into the MnPO in SHR (n=6) promoted hypotension (-31.6 ± 5.0 mmHg), bradycardia (-18.3 ± 7.2 bpm), and renal sympathoinhibition (-54.4 ± 6.2 %). The changes in cardiovascular and autonomic parameters were evaluated in WT and SH rats submitted to sinoartic denervation. In normotensive rats, the inhibition of the MnPO by muscimol promoted decrease of MAP in innervated rats (n=6) and denervated (-19.4 ± 1.9 vs. 20.9 ± 4.3 mmHg, respectively; 3min; n=6), which was maintained throughout the experimental period (13.5 ± 2.0 vs. 22.5 ± 4.3 mmHg, 30 min). Also did not evidenced differences in RSNA in WT innervated (-23.0 ± 1.5%; 3min) and denervated (-21.0 ± 4.9%; 3min) rats. In denervated hypertensive rats (n=5), the blocked of MnPO resulted in progressive decrease in MAP (-31.1 ± 6.7, ± 9.7 and -38.7 ± 7.1 -44.7 mmHg, respectively 3, 15 and 30 min after MnPO blockade). The changes observed in the HR (-1.3 ± 3.3; -21.5 ± 12.6 and -24.9 ± 12.2 bpm, respectively 3, 15 and 30 min after MnPO blockade) and RSNA (-16.4 ± 8.8; -37.3 ± 10.1 and -45.1 ± 8.7%, respectively 3, 15 and 30 min after MnPO blockade) also followed this pattern of response. Finally to identify the involvement of glutamatergic neurotransmission in the MnPO on the cardiovascular and autonomic control, nanoinjections of kynurenic acid were performed in this nucleus. The glutamatergic blockade promoted decrease in MAP (WT: -18.2 ± 4.1 mmHg; SHR: -21.0 ± 2.5 mmHg), bradycardia (WT: -7.1 ± 1, 9 bpm; SHR: -9.0 ± 6.0 bpm) and renal simpathoinhibition (WT: -19.7 ± 2.4%; SHR: -24.7 ± 2.4%) in normotensive and hypertensive rats. In summary, the results obtained on this study demonstrated that acute blockade of MnPO reduces blood pressure (BP), confirming recent data that indicate that this nucleus participates of tonic control on BP. Our data suggest the involvement of MnPO the tonic regulation of sympathetic activity in WT and SHR. In addition, suggest the participation of this nucleus in increased sympathetic activity and consequent arterial blood pressure in SHR. The results demonstrated that aortic and carotid afferent participates in the modulation of autonomic and cardiovascular responses induced by blockade the MnPO in SHR. Furthermore, our data suggest that glutamatergic neurotransmission in the MnPO is important for the tonic regulation of BP, HR and RSNA thus, bringing new evidence that this nucleus participates of the autonomic and cardiovascular control. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação Multicêntrico em Ciências Fisiológicas, Florianópolis, 2014. A hipóxia intermitente (HI), condição comumente observada em situações patológicas, promove aumentos na atividade simpática e na pressão arterial (PA), bem como elevação persistente na ventilação, por mecanismos ainda não completamente elucidados. No presente estudo, mostramos com detalhes as alterações cardiorrespiratórias induzidas pela HI aguda (HIA; 10 episódios 6-7% O2 por 45 s, intercalados por 5 min de normóxia/hiperóxia) em ratos adultos (290-300 g) não anestesiados ou anestesiados com uretana (1,2 g/Kg, i.p.). Nos animais não anestesiados, a HIA promoveu uma elevação persistente da PA (n=9, P Abstract : Intermittent hypoxia (HI), a condition commonly observed in pathological conditions, promotes increases in sympathetic activity and arterial blood pressure (BP) as well as a persistent increase in ventilation, by mechanisms not yet fully elucidated. In the present study, we explored in details the cardiorespiratory changes elicited by acute HI (HIA; 10 episodes 6-7 % O2 for 45 s, interspersed by 5 min of normoxia/hyperoxia) in adult rats (290-300 g) unanesthetized or anesthetized with urethane (1.2 g/kg, ip). In unanesthetized animals, the HIA promoted a sustained raise in BP (n=9 , P

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) The nucleus of the solitary tract (NTS) is the primary synaptic site of the peripheral baroreceptors and chemoreceptors. It has been shown that acetylcholine (ACh) microinjected into the NTS of rats induces hypotension and bradycardia. However, the contribution of cholinergic mechanisms at different NTS subnuclei (intermediate and commissural) as well as the cholinergic receptors blockade on the control of sympathetic (SNA) and phrenic (PNA) nerve activities have not been studied yet. In this study we assessed the role of ACh and its cholinergic receptors at the intermediate NTS (iNTS) and commissural NTS (cNTS) on the control of SNA, PNA and electrophysiological properties of these subnuclei neurons, as well as on baro and chemoreflex responses. Decorticated arterially-perfused in situ preparations of male juvenile rats were used to record SNA and PNA. Microinjections of ACh and cholinergic antagonists were performed into the iNTS or cNTS. Coronal slices of the brainstem containing either cNTS or iNTS subnuclei were obtained from male juvenile rats and used in whole cell patch clamp – current clamp recordings. It was observed that ACh microinjected into the iNTS inhibited both SNA and PNA. These effects were reduced by the pre-treatment with atropine (muscarinic antagonist) or mecamylamine (nicotinic antagonist). The cholinergic antagonists into the iNTS did not change the effects on SNA and PNA induced by baro and chemoreflex activation. In contrast, microinjections of ACh into the cNTS did not induce changes in SNA, but increased PNA. Despite the absence of changes in SNA, ACh into the cNTS changed the pattern of respiratory-sympathetic coupling. Both atropine and mecamylamine into the cNTS inhibited the ACh-induced tachypnea, but only mecamylamine inhibited the chemoreflex-induced tachypnea and the ACh-induced change in respiratory-sympathetic coupling. In vitro studies demonstrated that ACh promotes depolarization in both iNTS and cNTS neurons. Both muscarinic and nicotinic antagonism in the iNTS inhibited the ACh-induced depolarization. However, only nicotinic antagonist was effective in diminishing this response in the cNTS. The results suggest that ACh plays an important role in the control of cardiovascular and respiratory activities, with distinct functions between iNTS and cNTS. This cholinergic control involves activation of both muscarinic and nicotinic receptors within NTS, but only nicotinic receptors are involved in the chemoreflex tachypneic response. O núcleo do trato solitário (NTS) é o sítio primário de aferências dos barorreceptores arteriais e quimiorreceptores. Sabe-se que a acetilcolina (ACh) injetada no NTS de ratos provoca hipotensão e bradicardia. Entretanto, não se sabe até o momento qual o papel do sistema colinérgico nos diferentes subnúcleos do NTS (intermediário ou comissural) ou o bloqueio de seus receptores na atividade simpática (SNA) ou na atividade do frênico (PNA). No presente estudo avaliamos os efeitos da ACh e seus receptores no NTS intermediário (NTSi) e comissural (NTSc) sobre a SNA, PNA e sobre as propriedades eletrofisiológicas dos neurônios desses subnúcleos, bem como nas respostas do baro e quimiorreflexos. Preparações in situ decorticadas de ratos jovens foram utilizadas para registro da SNA e PNA, e ACh e antagonistas colinérgicos foram microinjetados no NTSi ou NTSc. Cortes coronais bulbares contendo o NTSi ou NTSc foram obtidos de ratos jovens e utilizados para registro de neurônios através da técnica whole cell patch clamp – current clamp. Foi observado que a microinjeção de ACh no NTSi inibe tanto a SNA quanto a PNA, sendo que tais efeitos são inibidos pelo tratamento com atropina (antagonista muscarínico) ou mecamilamina (antagonista nicotínico). Os antagonistas colinérgicos no NTSi não alteraram os efeitos na SNA e PNA induzidos pela ativação do baro e quimiorreflexos. Por outro lado, microinjeções de ACh no NTSc não altera a SNA mas promove aumento da PNA. Apesar de não alterar a SNA, a ACh no NTSc promove alterações no acoplamento simpato-respiratório. Tanto a atropina quanto a mecamilamina microinjetadas no NTSc inibiram a taquipnéia induzida pela ACh, mas apenas a mecamilamina inibiu a taquipnéia resultante do quimiorreflexo e a alteração no acoplamento simpato-respiratório induzida pela ACh no NTSc. Nos estudos in vitro, observamos que a ACh promove respostas de despolarização em neurônios tanto do NTSi quanto do NTSc. O bloqueio de receptores tanto nicotínicos quanto muscarínicos no NTSi diminui a despolarização evocada pela ACh. No entanto, apenas o antagonista nicotínico foi capaz de diminuir essa resposta no NTSc. Os resultados sugerem que a ACh desempenha um importante papel no controle cardiorrespiratório, com funções distintas entre NTSi e NTSc. Esse controle colinérgico envolve a ativação de receptores tanto nicotínicos quanto muscarínicos no NTS, mas apenas receptores nicotínicos estão envolvidos na resposta de taquipnéia do quimiorreflexo. FAPESP: 2010/17218-0