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The aim of this thesis was the identification and analysis of candidate genes for stress response in silver fir (Abies alba Mill.). This ecologically and economically important forest tree species is native to many mountainous regions of Europe but little is known about its ecological characteristics. Silver fir populations were heavily transformed by human activity, which results in a mismatch between past and current distribution. Recent studies suggest that silver fir can occupy warmer and dryer climates than it currently does. However, the species also suffered considerably during the 1970s and 1980s, including foliar damage, radial growth depression and local diebacks in Germany. This is attributed mainly to the peak in air pollution during this period, especially sulfur dioxide (SO2), which seems to heavily increase drought sensitivity in silver fir. The combination of both stressors, SO2 and drought events, negatively affected silver fir even in regions where drought is usually not a problem. In the context of anthropogenic global climate change that will very likely lead to an increase in temperature in Europe and to more extreme events such as severe drought periods, the question arises, how silver fir will cope with these environmental changes. Given the speed of the predicted changes and the increasing landscape fragmentation, silver fir might not be able to evade it via seed dispersal. As a sessile organism, the only other option is adaptation, which will likely draw from standing genetic variation. To successfully predict the fate of silver fir, especially in the face of global climate change, and to potentially manage populations based on such predictions, the genetic architecture of silver fir in the context of such important stressors as drought and air pollution has to be understood. There exist, however, little genomic resources for silver fir and conifers in general. This is due to their large and complex genomes and the long generational cycle, which makes conifers typical nonmodel species. As such, methods for the identification of the genetic basis of stress response are effectively limited to a candidate gene approach. The candidate gene approach includes the identification of functional candidate genes by measuring differential gene expression between a stressed and a control group. In the context of this thesis, the water content of silver fir seedlings was monitored in a laboratory using a novel terahertz spectroscopy setup. One group of seedlings was regularly irrigated while the other group was drought stressed. Continually measuring the water content allowed to harvest needles from both groups at a time when the water status was comparable between the individuals within each group. A differential expression analysis between the needles from both groups then revealed 296 genes that were significantly up- or down-regulated in response to drought stress. Of those genes, approximately 45% have not been previously described in any organism and are potentially unique to silver fir or conifers in general. However, since only needles of seedlings were analyzed at a specific level of drought stress, the results are limited in scope to the source material and stress intensity and cannot be directly applied to silver fir or drought stress in general. Also, this approach implies a cause-effect relationship between gene expression and a specific level of drought stress. Thus, it is very important that confounding factors are excluded from the experiment. Chlorophyll content in the needles, for example, might change over the course of the monitoring period due to the drought treatment. To test if the chlorophyll content could potentially influence the terahertz signal, chlorophyll was extracted from silver fir needles, in the course of this thesis, and different concentrations were measured using terahertz spectroscopy, showing that chlorophyll content does not influence terahertz monitoring. Another aspect of the candidate gene approach involves the variation within a polymorphic gene and its potential association with the variation in a phenotypic trait. Since the growth depression period of silver fir in the 1970s and 1980s was mostly influenced by the combination of air pollution and drought, in the context of this thesis, genetic variation, in the form of single nucleotide polymorphims (SNPs) in pre-selected genes, was associated with tree-ring derived phenotypes for individual trees in the Bavarian Forest National Park. These so called ’dendrophenotypes’ were measures for resistance, resilience and recovery during the depression period, as well as the drought year 1976. Using general linear models and feature selection techniques based on the machine learning algorithm random forest, 15 out of 103 polymorphic candidate genes for trait variation could be identified. Since the associated dendrophenotyes are potentially adaptively relevant, the variation in this candidate genes could influence the stress coping capability of individual trees. However, this approach is of an observational nature and thus, cause-effect relationships cannot be derived from this type of experiment. The identified SNPs might be the causal variant or physically close to the true causal variant or it might just be a spurious correlation. Further, reliance on advanced statistical techniques can be troublesome, as could be demonstrated in the course of this thesis for a random forest based feature selection technique, developed for genetic association studies in conifers. Replicating this study and evaluating the algorithm, non-uniqueness of the results could be demonstrated, which not only hinders biological interpretation but can severely negatively influence downstream analyses, such as tests for interaction between SNPs. In conclusion, this thesis presents new techniques to add to the current methodology for candidate gene selection and analysis in the stress response of the non-model organism silver fir and other conifer species. Both approaches should be combined, for example by drawing polymorphic candidate genes for trait variation from the pool of functional candidate genes to ensure the involvement of the studied genes in the variation of the trait of interest. Further, the results of this thesis add to the growing molecular resources in silver fir and thereby, hopefully, contribute to the successful prediction and management of this important forest tree species in the face of rapidly changing environmental conditions., Das Ziel dieser Dissertation war die Identifizierung und Analyse von Kandidatengenen f¨ur Stressreaktion in der Weißtanne (Abies alba Mill.). Diese ¨okologisch und ¨okonomisch wichtige Waldbaumart ist nat¨urlich beheimatet in bergigen Regionen Europas aber es ist wenig bekannt ¨uber ihre ¨okologische Charakterisierung. Weißtannenpopulationen wurden durch menschlichen Einfluss deutlich transformiert, was zu einer Diskrepanz zwischen dem fr¨uheren und dem heutigen Verbreitungsgebiet gef¨uhrt hat. Aktuelle Studien legen nahe, dass die Weißtanne in w¨armeren und trockeneren Klimaten ans¨assig sein kann, als sie es derzeit ist. Die Art hat jedoch in den 1970ern und 1980ern deutlich gelitten und zeigte in Deutschland Blattsch¨aden, eine Abnahme im Dickenwachstum und ¨ortliches Waldsterben. Als Grund hierf¨ur wird meist der H¨ochststand der Luftverschmutzung w¨ahrend dieses Zeitraums genannt, insbesondere von Schwefeldioxid (SO2), das offenbar die Empfindlichkeit der Weißtanne gegen¨uber Trockenstress deutlich erh¨oht. Die Kombination dieser beiden Stressoren, SO2 und Trockenperioden, hat die Weißtanne sogar in Regionen in denen Trockenstress ¨ublicherweise kein Problem ist negativ beeinflusst. Im Kontext des anthropogenen globalen Klimawandels, der sehr wahrscheinlich zu einem Ansteigen der Temperatur in Europa und zu mehr Extremereignissen, wie heftigen Trockenperioden, f¨uhren wird, stellt sich die Frage, wie die Weißtanne mit diesen Umweltver¨anderungen umgehen wird. Bedenkt man die Geschwindigkeit der vorhergesagten Ver¨anderungen und die zunehmende Fragmentierung der Landschaft, besteht die M¨oglichkeit, dass die Weißtanne diesem nicht durch Samenausbreitung entgehen kann. Als sessiler Organismus bleibt als die einzig andere Option nur Adaptation, die sich wahrscheinlich aus der stehenden genetischen Variation speisen wird. Um das Schicksal der Weißtanne, insbesondere im Kontext des globalen Klimawandels, erfolgreich abzusch¨atzen und Populationen m¨oglicherweise aufgrund solcher Vorhersagen zu managen, bedarf es der Kenntnis der genetischen Architektur im Kontext solcher bedeutender Stressoren wie Trockenperioden und Luftverschmutzung. Es gibt jedoch sehr wenige genomische Ressourcen f¨ur die Weißtanne und Koniferen im Allgemeinen. Das liegt maßgeblich an der Gr¨oße und Komplexit¨at der Genome und am langen Generationszyklus, was Koniferen zu typischen nicht-Modell Organismen macht. Aus diesem Grund sind Methoden zur Identifizierung der genetischen Basis von Stressantwort effektiv auf einen Kandidatengenansatz beschr¨ankt. Der Kandidatengenansatz beinhaltet die Identifikation von funktionellen Kandidatengenen, indem die differentielle Genexpression zwischen einer gestressten und einer Kontrollgruppe gemessen wird. Im Kontext dieser Dissertation wurde der Wassergehalt von Weißtannens¨amlingen mit einem neuartigen Terahertz-Spektroskopie-Aufbau in einem Labor ¨uberwacht. Eine Gruppe von S¨amlingen wurde regelm¨aßig gegossen, w¨ahrend eine andere Gruppe Trockenstress ausgesetzt war. Durch die kontinuierliche Messung des Wassergehalts konnten Nadeln der S¨amlingen aus beiden Gruppen zu einem Zeitpunkt geerntet werden, zu dem der Wassergehalt zwischen den Individuen einer Gruppe jeweils vergleichbar war. Eine differentielle Expressionsanalyse zwischen den Nadeln der beiden Gruppen resultierte dann in 296 Genen die als Reaktion auf Trockenstress signifikant hochoder herunter-reguliert waren. Ungef¨ahr 45% dieser Gene sind zuvor noch nicht in anderen Organismen beschrieben worden und sind potentiell spezifisch f¨ur die Weißtanne oder Koniferen im Allgemeinen. Da jedoch nur Nadeln von S¨amlingen bei einem bestimmten Trockenstressniveau analysiert wurden, sind die Ergebnisse in ihrem Umfang auf das Ausgangsmaterial und das spez-ifische Stresslevel reduziert und k¨onnen nicht direkt auf die Weißtanne oder Trockenstress allgemein ¨ubertragen werden. Weiterhin impliziert dieser Ansatz einen Kausalzusammenhang zwischen Genexpression und einem spezifischen Maß an Trockenstress. Daher ist es sehr wichtig st¨orende Faktoren vom Experiment auszuschließen. So kann der Chlorophyllgehalt der Nadeln sich beispielsweise w¨ahrend des Messzeitraumes in Folge der Trockenstressbehandlung ver¨andern. Um zu testen ob der Chlorophyllgehalt m¨oglicherweise einen Einfluss auf das Terahertz-Signal hat, wurde im Rahmen dieser Dissertation Chlorophyll aus Weißtannennadeln extrahiert und unterschiedliche Konzentrationen mittels Terahertz-Spektroskopie gemessen. Dabei konnte gezeigt werden, dass der Chlorophyllgehalt keinen Einfluss auf das Terahertz-Monitoring hat. Ein anderer Aspekt des Kandidatengenansatzes beinhaltet die Variation innerhalb eines polymorphen Gens und die m¨ogliche Assoziation mit der Variation in einem ph¨anotypischen Merkmal. Da die Periode der Wachstumsdepression von Weißtannen in den 1970ern und 1980ern maßgeblich durch eine Kombination von Luftverschmutzung und Trockenperioden verursacht war, wurde im Rahmen dieser Dissertation genetische Variation, in Form von Einzelnukleotid-Polymorphismen (engl. single nucleotide polymorphisms (SNPs)) in vorausgew¨ahlten Genen, mit Ph¨anotypen assoziiert, die aus Jahresringen f¨ur individuelle B¨aume im Nationalpark Bayerischer Wald abgeleitet wurden. Diese so genannten ’Dendroph¨anotypen’ waren Maße f¨ur die Resistenz, Resilienz und Erholung in der Depressionsperiode und dem Trockenjahr 1976. Basierend auf allgemeinen linearen Modellen und Feature Selection Techniken, die auf dem maschinellen Lernalgorithmus Random Forest beruhen, konnten 15 aus insgesamt 103 polymorphen Kandidatengenen f¨ur Merkmalsvariationen identifiziert werden. Da die assoziierten Dendroph¨anotypen potentiell adaptiv relevant sind, k¨onnte die Variation in diesen Kandidatengenen die F¨ahigkeit der Stressbew¨altigung individueller B¨aume beeinflussen. Dieser Ansatz ist jedoch grunds¨atzlich beobachtender Natur und diese Art von Experiment erlaubt daher keine Ableitung von Kausalzusammenh¨angen. Die identifizierten SNPs k¨onnen die urs¨achliche Variation sein, sie k¨onnen aber auch physikalisch nah an der tats¨achlich urs¨achlichen Variation sein oder es kann sich lediglich um einen Scheinzusammenhang handeln. Weiterhin kann das Vertrauen in fortgeschrittene statistische Verfahren problematisch sein, was im Rahmen dieser Dissertation f¨ur eine auf Random Forest basierende Feature Selection Methode gezeigt werden konnte, die f¨ur genetische Assoziationsanalysen in Koniferen entwickelt wurde. Durch die Replikation dieser Studie und die Evaluierung des Algorithmus konnte die Multiplizit¨at der Ergebnisse demonstriert werden, die nicht nur die biologische Interpretation behindert, sondern auch nachgelagerte Analysen, wie Tests auf Interaktion zwischen SNPs, negativ beeinflusst. Schlussfolgernd beschreibt diese Dissertation neue Techniken der Auswahl und Analyse von Kandidatengenen f¨ur die Stressreaktion im nicht-Modell-Organismus Weißtanne und anderen Koniferenarten die der g¨angigen Methodik hinzuzuf¨ugen sind. Beide Ans¨atze sollten kombiniert werden, beispielsweise indem polymorphe Kandidatengene f¨ur Merkmalsvariation aus dem Pool von funktionellen Kandidatengenen gezogen werden um die Beteiligung der untersuchten Gene an der Variation des zu untersuchenden Merkmals sicher zu stellen. Weiterhin tragen die Ergebnisse dieser Dissertation zu den wachsenden molekularen Ressourcen f¨ur die Weißtanne bei und haben dadurch, hoffentlich, einen Anteil an der erfolgreichen Vorhersage und am Management dieser wichtigen Baumart im Kontext rasanter Umweltver¨anderungen.

Coniferous trees are of major economic and ecologic importance. Yet, they are genomically poorly studied, because their long generation times, their high levels of heterozygosity and their huge genomes impede the access to conifer genomic resources. The European silver fir (Abies alba MILL) is widely distributed across diverse habitats in mountainous areas of temperate Europe. The species is of high value for forestry due to its high quality timber and its ecosystem functions such as erosion control and landslide prevention. Using next-generation sequencing the first silver fir transcriptome was sequenced and annotated. The annotation protocol lead to the identification of 460 candidate genes that are putatively involved in environmental stress resistance. Additionally, the transcriptomes of twelve more individuals were sequenced. Subsequent SNP detection produced on average 24580 SNPs per individual. For the SNPs that lie on the annotated candidate genes, a KASP genotyping assay was designed that allows for the fast and cost efficient genotyping of many A. alba trees. In the Mediterranean Basin, A. alba occurs in isolated and comparatively small populations. Recently, strong die-off events were observed in these populations, likely as a result of severe droughts. In the course of climate change, droughts are predicted to increase further in frequency and severity endangering the persistence of Mediterranean A. alba populations. Particularly these populations may, however, be of special value for the adaptive potential of the whole species since they may harbor genetic resources preadapted to relatively xeric environments. There is an ongoing debate about assisted migration, i.e. the transplantation of Mediterranean A. alba populations to more northern population in order to use them as donors of drought adapted alleles. To elucidate the question whether the idea of assisted migration is practical, knowledge about the state of local adaptation, its molecular basis and its environmental drivers is needed. Here, 376 individuals from high and low elevational populations which are located along a 170 km eastwest transect across four mountains in the south-western Mediterranean pre-Alps of France were investigated at 267 SNP loci distributed across 175 candidate genes. The methodological framework of landscape genetics was applied. Results of Bayesian cluster analysis showed that the dominant genetic pattern coincides with an east-west isolation-by-distance genetic structure, likely a result of post-glacial recolonization movement. Fst-outlier tests revealed 16 SNPs under divergent selection. Significant associations of allele frequencies of eight SNPs and winter drought were detected suggesting that this variable is a strong driver of local adaptation. Correlations tests of genetic distance of a subset of outlier loci and environmental distance demonstrated that isolation-by-environment occurs along altitude. Reanalysis of published common garden phenotypic data using Qst-Fst comparisons revealed adaptive divergence of bud flush and growth rate at the coldest and most humid site. The thesis illustrates a complex pattern of genetic structure in ecologically marginal populations that is shaped by demography and natural selection. It highlights that local adaptation is site specific in terms of both the genes under selection and the environmental drivers. Hence, whether a population is suitable to be the subject of assisted migration would have to be answered individually. Since this is highly impractical, the thesis states that in-situ conservation of marginal populations is the best option to ensure the capacity of evolutionary change in A. alba and to support the species’ ability to cope with the challenges of a rapidly changing climate.

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