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Brazil has experienced some of the highest numbers of COVID-19 infections and deaths globally and made Latin America a pandemic epicenter from May 2021. Although SARS-CoV-2 established sustained transmission in Brazil early in the pandemic, important gaps remain in our understanding of local virus transmission dynamics. Here, we describe the genomic epidemiology of SARS-CoV-2 using near-full genomes sampled from 27 Brazilian states and an adjacent country - Paraguay. We show that the early stage of the pandemic in Brazil was characterised by the co-circulation of multiple viral lineages, linked to multiple importations predominantly from Europe, and subsequently characterized by large local transmission clusters. As the epidemic progressed, the absence of effective restriction measures led to the local emergence and international spread of Variants of Concern (VOC) and under monitoring (VUM), including the Gamma (P.1) and Zeta (P.2) variants. In addition, we provide a preliminary genomic overview of the epidemic in Paraguay, showing evidence of importation from Brazil. These data reinforce the need for the implementation of widespread genomic surveillance in South America as a toolkit for pandemic monitoring and providing a means to follow the real-time spread of emerging SARS-CoV-2 variants with possible implications for public health and immunization strategies.

Introduction: In early 2015, several patients presenting with dengue-like symptoms were described in Brazil′s northeast region. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) results from patients′ sera revealed the Zika virus (ZIKV) infection. In parallel, an unusually high incidence of microcephaly in newborns was observed in the same region. Zika virus infection can induce microcephaly and congenital abnormalities. Case Report: A male newborn (9 months of gestation, cesarean delivery) died within 20 hours. The mother had a confirmed viral infection in the third month of pregnancy. This report describes a case of ZIKV intrauterine infection associated with histologic alterations in the newborn kidney tissue. Immunohistochemistry, RNA extraction, and real-time RT-PCR were performed for the confirmation of ZIKV infection in tissues. Kidney samples were stained using conventional hematoxylin-eosin (H&E), methenamine silver, and periodic acid-Schiff with diastase digestion techniques. Analysis of brain tissue revealed severely affected gray and white matter sites of neuronophagy, gliosis, and calcium microdeposits. Immunohistochemistry (4G2 and specific anti-ZIKV monoclonal antibodies) showed diffusely distributed immunopositivity in glial cells. Aspects compatible with a focal segmental glomerular capillary tuft collapse associated with podocytopathic features with pseudo-crescent formation were observed in the kidney tissue. Conclusion: This case suggests the ability of congenitally acquired ZIKV to produce alterations in renal cells and describes histological details of kidney involvement.

Orientadora : Drª. Claudia Nunes Duarte dos Santos Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 09/02/2015 Inclui referências Área de concentração : Biologia Celular e Molecular Resumo: Os flavivírus e alfavírus são vírus transmitidos por artrópodes (arbovírus) e representam um problema de saúde pública em vários países. A emergência e re-emergência dos arbovírus são fenômenos naturais relacionados à evolução e adaptação desses vírus. O Brasil, por ter grandes áreas recobertas por florestas tropicais, possui condições ideais para a ocorrência e manutenção do ciclo silvestre de diversas arboviroses. A crescente urbanização, o fluxo migratório, a destruição de habitats naturais e a presença de mosquitos dos gêneros Culex e Aedes favorecem a rápida disseminação desses vírus. Além disso, os sintomas iniciais das infecções causadas por esses vírus são semelhantes a outras infecções que ocorrem em diversas regiões do Brasil e não existe tratamento específico para essas viroses, nem vacina licenciada para uso humano. O diagnóstico laboratorial diferencial, portanto, é fundamental para o correto manejo clínico dos pacientes. Assim, este trabalho teve por objetivo padronizar ensaios imunoenzimáticos para o diagnóstico sorológico do vírus Chikungunya (CHIKV), pertencente ao gênero Alphavirus, e dos vírus da dengue (DENV), da encefalite de Saint Louis (SLEV) e do oeste do Nilo (WNV), pertencentes ao gênero Flavivirus. Para tanto, as proteínas E1 e E2 do CHIKV foram expressas em células S2 de Drosophila melanogaster e purificadas por cromatografia de afinidade. A proteína E2 (denominada rE2-CHIKV) apresentou melhores resultados durante sua expressão e purificação e foi selecionada para dar prosseguimento ao trabalho. Foram então gerados três hibridomas secretores de anticorpos monoclonais (AcM) contra esta proteína, os quais foram caracterizados como sendo do isotipo IgG1k. Nenhum dos AcM reconheceu os vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV), SLEV, WNV e DENV sorotipos 1 a 4. Foi padronizado um ensaio do tipo ELISA indireto utilizando a rE2-CHIKV como antígeno para a detecção de IgM anti-CHIKV, o qual apresentou sensibilidade de 70% e especificidade de 97% para o painel de amostras utilizado. Apesar da baixa sensibilidade, esses valores são comparáveis aos dos testes disponíveis comercialmente. O segundo vírus abordado nesse trabalho foi o vírus da dengue. Foram obtidos 22 AcM produzidos contra isolados brasileiros de DENV-1, -2 e -3. Os AcM são dos isotipos IgG2bk, IgG2ak e IgG1k, a maioria com especificidade para as proteínas de envelope ou pré-membrana do DENV. Quando testados contra os quatro sorotipos de DENV, diferentes padrões de reatividade foram identificados: grupo-específico, subcomplexo-específico (DENV-1, -3 e -4 ou DENV-2 e -3) e sorotipo-específico (DENV-2 ou -3). Além disso, alguns AcM apresentaram reatividade cruzada com vírus da febre amarela, WNV e SLEV, mas nenhum deles reconheceu o alfavírus VEEV. De acordo com nossos conhecimentos, esses são os primeiros AcM produzidos contra isolados brasileiros de DENV. O AcM denominado D3 424/8G, que apresentou reatividade com todos os flavivírus testados, foi conjugado com peroxidase e utilizado no desenvolvimento de um ensaio do tipo MAC-ELISA para detecção de IgM anti-DENV no soro de pacientes com infecção aguda por DENV. Como antígeno, foi utilizada uma mistura de DENV dos quatro sorotipos, produzidos em cultivo celular, purificados por colchão de sacarose e inativados por radiação gama. O ensaio apresentou sensibilidade de 91% e especificidade de 95% com as amostras testadas. No caso do SLEV, foram produzidas partículas-tipo vírus (VLP) em células HEK 293T. As SLE_VLPs, juntamente com o AcM D3 424/8G-HRP, foram utilizadas em um ensaio do tipo MAC-ELISA para diagnóstico de infecção aguda causada por SLEV. O teste desenvolvido apresentou sensibilidade de 95% e especificidade de 98% com o painel de amostras utilizado. Por fim, foram produzidas VLPs de WNV em células HEK 293T, as quais foram utilizadas na padronização de um ensaio do tipo MAC-ELISA para diagnóstico de infecção por WNV. Como conjugado, também foi utilizado o AcM D3 424/8G-HRP. No decorrer do trabalho, no entanto, foi obtida apenas uma amostra de soro de indivíduo com infecção aguda por WNV. Por isso, não foi possível calcular os valores de sensibilidade e especificidade do teste desenvolvido. Os insumos produzidos neste trabalho e os testes padronizados mostraram-se importantes ferramentas para serem utilizadas no diagnóstico dos vírus CHIKV, DENV, SLEV e WNV, além de poderem ser utilizados em pesquisa básica. Palavras-chave: Vírus Chikungunya. Vírus da dengue. Vírus da encefalite de Saint Louis. Vírus do oeste do Nilo. Proteínas recombinantes. Partículas-tipo vírus. Anticorpos monoclonais. Ensaio imunoenzimático. Diagnóstico. Abstract: The flavivirus and alphavirus are viruses transmitted by arthropods (arboviruses), which constitute a public health problem in many countries. The emergence and reemergence of arboviruses are natural phenomena related to species evolution and adaptation. Brazil has large areas covered by tropical forests, which provide ideal conditions for the existence and maintenance of the sylvatic cycle of many arboviruses. Increasing urbanization, migration, the destruction of natural habitats and the wide distribution of Culex and Aedes mosquitoes favor the rapid spread of these viruses. Furthermore, the initial symptoms of infections caused by these viruses are similar to other infections that occur in different regions of Brazil and there is no specific treatment for these viruses, nor licensed vaccine for human use. Laboratory differential diagnosis is therefore essential for the correct clinical management of patients. Therefore, this study aimed to develop enzyme immunoassays for the diagnosis of Chikungunya virus (CHIKV), belonging to the genus Alphavirus, and for the diagnosis of dengue virus (DENV), Saint Louis encephalitis virus (SLEV) and West Nile virus (WNV), belonging to the genus Flavivirus. For this, CHIKV E1 and E2 proteins were expressed in Drosophila melanogaster S2 cells and were purified by affinity chromatography. The E2 protein (named rE2-CHIKV) showed better results of expression and purification and was selected to continue the work. Three hybridomas secreting monoclonal antibodies (MAbs) against rE2-CHIKV were obtained. The MAbs were characterized as IgG1k isotype. None of the MAbs recognized the Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV), SLEV, WNV and DENV serotypes 1 to 4. It was standardized an indirect ELISA for the detection of IgM anti-CHIKV using rE2-CHIKV as antigen, which had a sensitivity of 70% and specificity of 97%. Despite the low sensitivity, these values are comparable to those of commercially available tests. The second virus in this work was the dengue virus. Twenty two MAbs against Brazilian isolates of DENV-1, -2 and -3 were obtained. The MAbs include IgG2bk, IgG2ak and IgG1k isotypes, and most were raised against the envelope or the pre-membrane proteins of DENV. When the antibodies were tested against the four DENV serotypes, different reactivity patterns were identified: group-specific, subcomplex specific (DENV-1, -3 and -4 and DENV-2 and -3) and dengue serotype-specific (DENV-2 or -3). Additionally, some MAbs cross-reacted with yellow fever virus, WNV and SLEV. None of the MAbs recognized the alphavirus VEEV. To our knowledge, these are the first MAbs raised against Brazilian DENV isolates. The MAb D3 424/8G, which cross-reacted with all the flaviviruses tested, was conjugated to peroxidase and used to the development of a MAC-ELISA for detection of anti-DENV IgM in sera from patients with acute dengue. As antigen, we used a mixture of DENV particles serotypes 1 to 4, produced in cell culture, purified by sucrose cushion and inactivated by gamma radiation. The test had a sensitivity of 91% and a specificity of 95%. For SLEV, virus-like particles (VLPs) were produced in HEK 293T cells. The SLE_VLP together with the MAb D3 424/8G-HRP were used in the development of a MAC-ELISA for the diagnosis of acute infection caused by SLEV. The assay showed sensitivity of 95% and specificity of 98%. Finally, WNV VLP were produced in HEK 293T cells, and were used for standardizing a MAC-ELISA for the diagnosis of WNV infection. As conjugate it was also used MAb D3 424/8G-HRP. During the study, however, only one serum sample from patient with acute WNV infection was obtained. Therefore, it was not possible to calculate the sensitivity and the specificity of the test developed. The reagents produced and the diagnostic assays developed here have proved to be important tools to be used in the diagnosis of CHIKV, DENV, SLEV and WNV, and can be used for basic research. Keywords: Chikungunya virus. Dengue virus. Saint Louis encephalitis virus. West Nile virus. Recombinant proteins. Virus like particles. Monoclonal antibodies. Enzyme immunoassays. Diagnosis.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 Os primeiros anticorpos monoclonais (AcM) contra o vírus rábico foram produzidos por Wiktor e Koprowski em 1978 e, desde então, diversos outros foram produzidos e descritos. No entanto, apesar do grande número de AcM antirrábicos descritos na literatura, eles nem sempre são facilmente obtidos, principalmente porque a produção de AcM no Brasil é bastante limitada. Ademais, devido à grande diversidade de variantes de vírus rábico existentes no Brasil, torna-se importante produzir novos AcM que possam atender a interesses mais específicos. Assim, o objetivo do presente trabalho foi a produção e caracterização de AcM contra o vírus rábico. Para tanto, foram realizados cinco protocolos de imunização, nos quais camundongos Balb/c foram imunizados com os seguintes antígenos: (1) vacina antirrábica (VeroRab®, Aventis-Pasteur) para uso em humanos; (2) suspensão inativada de tecido de sistema nervoso central de camundongos infectados com vírus rábico selvagem isolado de um bovino naturalmente infectado por morcego hematófago em Passos de Torres/SC; (3) fragmento recombinante da glicoproteína do vírus rábico cepa ERA compreendendo os aminoácidos 179 a 281 (denominado rGERA179-281) seguido da inoculação de vírus rábico cepa PV na pata; (4) rGERA179-281 seguida por um reforço com a mesma proteína ou com vírus rábico cepa PV; (5) rGERA179-281 e vacina VeroRab®. Esplenócitos dos camundongos imunizados foram fusionados com células de mieloma da linhagem P3X63Ag8.653 utilizando polietilenoglicol 4000 e os hibridomas secretores de anticorpos antirrábicos foram triados por imunofluorescência indireta em células BHK-21 infectadas com vírus rábico. Diluições limitantes foram realizadas e sete clones estáveis foram obtidos, sendo denominados LIA 02 (fusão 1), 6H8 e 7B7 (fusão 2) e 3E6, 8D11, 9C7 e 8B6 (fusão 3). Nos dois últimos protocolos, não foram obtidos hibridomas secretores de anticorpos antirrábicos estáveis. Dentre os AcM, três foram caracterizados como IgG2a (6H8, 8D11 e 8B6), dois como IgM (7B7 e 9C7), um como IgG2b (LIA 02) e um como IgG3 (3E6), todos com cadeia leve kappa. Por ensaio de neutralização, foi verificado que o AcM 8D11 foi capaz de neutralizar o vírus rábico cepa PV in vitro. Além disso, o 7B7 reconheceu a rGERA179-281 e apenas o 8D11 não reconheceu o vírus presente na vacina VeroRab®, conforme demonstrado por ELISA. Os AcM também foram testados contra vírus rábico selvagem isolado de diferentes animais (bovinos, equinos, morcegos, cães e canídeos silvestres) e de humano (uma amostra) oriundas de diferentes regiões do Brasil. O AcM 6H8 reconheceu todas as amostras testadas. Os AcM LIA 02, 3E6 e 9C7 juntos também reconheceram todas elas. Assim, a partir dos resultados obtidos neste trabalho, novos estudos utilizando esses AcM como ferramentas biotecnológicas poderão ser desenvolvidos.

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The emergence and reemergence of mosquito-borne diseases in Brazil such as Yellow Fever, Zika, Chikungunya, and Dengue have had serious impacts on public health. Concerns have been raised due to the rapid dissemination of the chikungunya virus (CHIKV) across the country since its first detection in 2014 in Northeast Brazil. Faced with this scenario, on-site training activities in genomic surveillance carried out in partnership with the National Network of Public Health Laboratories have led to the generation of 422 CHIKV genomes from 12 Brazilian states over the past two years (2021-2022), a period that has seen more than 312 thousand chikungunya fever cases reported in the country. These new genomes increased the amount of available data and allowed a more comprehensive characterization of the dispersion dynamics of the CHIKV East-Central-South-African (ECSA) lineage in Brazil. Tree branching patterns revealed the emergence and expansion of two distinct subclades. Phylogeographic analysis indicated that the northeast region has been the leading hub of virus spread towards other regions. Increased frequency of C>T transitions among the new genomes suggested that host restriction factors from the immune system such as ADAR and AID/APOBEC deaminases might be driving CHIKV ECSA lineage genetic diversity in Brazil.

Brazil has experienced some of the highest numbers of COVID-19 cases and deaths globally and from May 2021 made Latin America a pandemic epicenter. Although SARS-CoV-2 established sustained transmission in Brazil early in the pandemic, important gaps remain in our understanding of virus transmission dynamics at the national scale. Here, we describe the genomic epidemiology of SARS-CoV-2 using near-full genomes sampled from 27 Brazilian states and a bordering country - Paraguay. We show that the early stage of the pandemic in Brazil was characterised by the co-circulation of multiple viral lineages, linked to multiple importations predominantly from Europe, and subsequently characterized by large local transmission clusters. As the epidemic progressed under an absence of effective restriction measures, there was a local emergence and onward international spread of Variants of Concern (VOC) and Variants Under Monitoring (VUM), including Gamma (P.1) and Zeta (P.2). In addition, we provide a preliminary genomic overview of the epidemic in Paraguay, showing evidence of importation from Brazil. These data reinforce the usefulness and need for the implementation of widespread genomic surveillance in South America as a toolkit for pandemic monitoring that provides a means to follow the real-time spread of emerging SARS-CoV-2 variants with possible implications for public health and immunization strategies.