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Tese (livre-docencia) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Tecnologia de Alimentos Resumo: Foi investigada a variação dos parâmetros de penetração de calor em produtos alimentícios de aquecimento por condução, colocados eis latas cilíndricas. Os ensaies foram feitos com 4 lotes de 10 latas de suspensão de bentonita a 10% e 6 lotes de 15 latas de purê do ervilha. Os resultados mostraram que a distribuição dos parâmetros (índice de declive e coeficiente do intersecção) era aproximadamente normal, tanto para a curvo de aquecimento como para a de esfriamento. A análise da variância desses dados mostrou que o uso de ensaio com um lote apenas (de 6 a 8 recipientes ou mais) não fornecia informações, suficientemente precisas para prever a esterilização desejada dos lotes comerciais, devido a grande variação dos valores de parâmetros existente entre os diferentes lotes. A aplicação dos parâmetros de maior índice de declive em ensaios com 2 a 3 latas de 4 a 6 lotes parece dar resultados bem mais consistentes do tempo de esterilização, mostrando ser mais segure para prever o tempo de esterilização necessário na pratica industrial. Foi desenvolvido um método baseado na media e no desvio padrão dos parâmetros experimentais. Os resultados calculados por esse método forneceram, nas condições idênticas , os valores do tempo de esterilização de cerca cie 2% mais curto e de 2 a 3 vezes mais consistente que o método baleado no maior valor do índice de declive. As vantagens deste método seriam, portanto, (i) de estar baseado em conceitos cientificamente superiores e (ii) de fornecer os resultados mais consistentes Abstract: The variation of heat penetration parameters was investigated on conductive foods placed in cylindrical cans. The experiments were carried out on 10% bentonite suspension (4 batches of 10 cans) and heavy pea puree (6 batches of 15 cans). The results showed that the distribution of experimental parameters were close to normal distributions both for heating and cooling curves. The analysis of variance of data showed that the experiment with 6 to 8 cans or jars in a single run is unsuitable for predicting proper commercial sterilization owing to the great variation of the results between different batches. The use of largest slope index value of heating curve obtained among the data from 4 to 6 batches with 2 to 3 cans each gives more consistent sterilizing time, showing that the result is more suitable to predict proper sterilization. A method for calculating processing time was developed based on mean value and standard deviation of the heat penetration parameters. The process period calculated by the proposed method was about 2% shorter and 2 to 3 times more consistent than the method based on highest slope index. The advantages of the method are two folds: (i) to be based on scientifically superior concept and (ii) to give more precise results Livre Docência Livre-Docente em Tecnologia de Alimentos

Orientador : Fumio Yoskoya Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: O trabalho consta da caracterização de diferentes linhagens de Acetobacter e de estudos da influência da temperatura e do teor de etanol nos valores das constantes de crescimento e produção de biomassa. Com os valores das constantes de crescimento foram traçados gráficos de Arrhenius. Os valores das características de temperatura obtidos variaram entre 8,6 kcal/mol (A. lovaniense 48) a 11,4 kcal/mol (A. suboxydans 52) para microrganismos crescendo em meio basal. A adição de etanol ao meio basal acarretou um aumento no valor da característica de temperatura para A. lovaniense 48 (de 8,6 kcal/mol para 0% de etanol a 15,4 kcal/mol para 6% de etanol). Os valores do máximo de biomassa produzida pelas espécies a diferentes temperaturas, em 48 horas de incubação, variaram entre 0,08 mg/ml (A. suboxydans 52) a 0,83 mg/ml (A. lovaniense 48). Abstract: The characterization of Acetobacter species and the effect of temperature and ethanol concentration on the growth constants and cell mass production were studied. Arrhenius plots were drawn using growth constants. Temperature characteristics values between 8.6 kcal/mol (A. lovaniense 48) and 11.4 kcal/mol (A. suboxydans 52) were obtained for growth in basal medium. The addition of ethanol to the basal medium increased the temperature char acteristic of A. lovaniense 48 (from 8.6 kcal/mol for 0% ethanol to 15.4 kcal/mol for 6% ethanol). The maximum cell mass obtained after 48 hours of incubation at different temperatures varied from 0.u8 mg/ml (A. suboxydans 52) to 0.83 mg/ml (A. lovaniense 48). Mestrado Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Fumio Yokoya Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Tecnologia de Alimentos Resumo: O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito sinergístico na esterilização de pimenta do reino (Piper nigrum) preta, utilizando-se os gases óxido de etileno e brometo de metila. Foram feitos vários tratamentos na pimenta em função das seguintes variáveis: umidade relativa, temperatura de esterilização, concentração dos gases e tempo de exposição aos gases. Antes dos tratamentos, as amostras foram. condicionadas aproximadamente 17 horas em dessecadores, mantidos à umidades relativas de 30, 50 e 70 %. Para cada esterilização, efetuaram-se contagens microbiológicas total e de termofílicos a 32 e 55 ºC respectivamente, para os gases misturados e separados. O tempo de esterilização foi de 4, 8 e 17 horas. Os resultados mostraram que o tratamento com óxido de etileno na concentração de 360 mg/l não é suficiente para destruir às bactérias da pimenta preta. O tratamento com 2540 mg/l de brometo de metila foi eficiente na esterilização. A eficiência desses agentes cresceu com o aumento da umidade relativa e da temperatura. A proporção dos gases misturados mais eficiente na esterilização foi 1 de óxido de etileno para 10 de brometo de metila, sendo o tratamento mais interessante sob o ponto de vista prático o que constou de 58 mg/l de óxido de etileno, misturado com 540 mg/l de brometo de metila, por 17 horas de exposição Abstract: The purpose of the present work was to study the synergistic effect of gaseous ethylene oxide and methyl bromide on the sterilization of black pepper (Piper nigrum). Various treatments of the pepper were carried out employing following variables: relative humidity, sterilization temperature, concentration of gases and exposure time to gases. Before the treatments, the samples were conditioned for approximately 17 hours in desiccators maintained at relative humidities of 30, 50 and 70 %. For each sterilization microbiological total counts and thermophylic bacteria counts at 32 and 55 ºC respectively were carried out, employing individual gases and their mixtures. Sterilization times were 4, 8 and 17 hours. The results showed that the treatment with ethylene oxide at a concentration of 360 mg/l was not efficient in destroying the bacteria of black pepper. The treatment with 2540 mg/l of methyl bromide was efficient in the sterilization. The efficiency of these agents improved with the increase of the relative humidity and temperature. The most efficient proportion of the mixed gases for sterilization was 1 part of ethylene oxide to 10 parts of methyl bromide, the most interesting treatment from the practical point of view being that with a mixture containing 58 mg/l of ethylene oxide and 540 mg/l of methyl bromide with 17 hours of exposure Mestrado Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador : Fumio Yokoya Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Tecnologia de Alimentos Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: The abstract is available with the full electronic document Mestrado Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Fumio Yokoya Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agrícola Resumo: As contagens de microrganismos totais e de psicrotróficos foram comparadas com as estimativas das contaminações obtidas por meio de incremento na absorbância de meio de cultura inoculado com a flora contaminante de carcaças de frango logo após o processamento e após a estocagem a 4 - 5 °C por 48, 96 e 144 horas. Para a estimativa da flora contaminante, as sus pensões microbianas obtidas da superfície da carcaça foram inoculadas em BHI e incubadas com agitação a diversas temperaturas na faixa de 26,5 °C até 43,0 °C, acompanhando-se o crescimento microbiano pelo aumento de absorbância. Gráficos de logaritmo da absorbância contra tempo foram construídos para as temperaturas de incubação estudadas e das curvas traçadas foram calculados os valores de k (velocidade de crescimento, h-1 ) e R, definido pela equação: R = ln(Ap/Ao) onde: Ao é a absorbância lida no tempo zero da incubação, e Ap é a absorbância obtida pelo prolongamento da tangente da curva de crescimento até tempo zero. Através do gráfico padrão construído com dados de absorbância contra número de microrganismos, foram calculadas as absorbâncias (Aop) correspondentes as contagens totais e de psicrotróficos nas carcaças após 0, 48, 96 e 144 horas de estocagem. Valores de Rl (R1 = ln(Ao/Ap)) foram calculados para as absorbâncias corrigidas pelo gráfico padrão. Baseando-se na equação de crescimento microbianoe na equação da constante R1, foi desenvolvida uma relação matemática para se avaliar a contaminação das carcaças, utilizando-se dos dados de crescimento a 28 °C e do gráfico padrão. Os valores obtidos pelo método proposto, quando comparados com aqueles do plagueamento em meio solido para contagem total ou de psicrotróficos, proporcionaram coeficientes de correlação linear de 0,94; 0,91; 0,83 e 0,64 para contagem total após 0, 48, 96 e 144 horas de estocagem e valores de 0,94; 0,83; 0,82 e 0,86 para contagem de psicrotróficos após 0, 48, 96 e 144 horas de estocagem das carcaças. O método proposto no presente trabalho permite avaliar as contagens microbianas num tempo máximo de 11 horas, o qual abre promissoras perspectivas para a aplicação industrial do método Abstract: Total plate counts and psychrotrophies counts we re compared with estimation of microbial load on chickens, obtained by increase of the absorbance of culture medium inoculated -with the contaminant microflora of the carcasses immediatly after processing and after 48, 96 and 144 h of storage at 4 - 5 °C. For estimating the contaminant microflora on the carcasses, microbial suspensions obtained by sampling the skin were inoculated in BHI and incubated with agitation at different temperatures in the range of 26,5 ° to 43,5 °C, measuring the microbial growth through absorbance (A) increase. Growth curves were constructed plotting ln A vs. time for each incubation temperature and from the curves drawn there were calculated the k values (growth rate, h-1) and R values which is definided by the equation R = ln(Ap/Ao) where, Ao is the absorbance at time zero of incubation, and Ap is the absorbance obtained by extending the tangent of the growth curve to zero time. Using a standard curve constructed with absorbance readings vs number of microorganisms, corrected absorbances (Aop) were calculated for the total plate counts and psychrotrophies counts obtained on the carcasses after 0, 48, 96 and 144 h of storing. Values of R1 (R1 = ln(Ap/Aop)) were calculated - for the corrected absorbances using the standard curve. For evaluation of microbial load on the carcasses, a mathematical relation was developed using the growth and R1 equations with growth data at 28 °C and the standard curve. The values obtained by this method, when compared with those of plating,- give correlation coefficients of 0.94, 0.91, 0.88 and 0.64 for total plate counts after 0, 48, 96 and 144 h storing and 0.94, 0.83, 0.82 and 0.86 for psychrotrophics counts after 0, 48, 96 and 144 h of cold storage. The proposed method in the present work allows the evaluation of microbial load in no more than 11 h, which is very promissing for industrial applications Doutorado Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador : Fumio Yokoya Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agricola Resumo: Dentro da linha de pesquisa de identificação e enumeração rápida de microrganismos, o presente trabaiho foi realizado no sentido de verificar a viabilidade do emprego da membrana filtrante na recuperação de Escherichia cali e Salmanella trphimurium, inoculadas experimentalmente em ovo de galinha (clara, gema e ovo liquido). Após ó tratamento com a protease bacteriana "Alcalase", viabilizou-se a filtragem de 5,0 g de clara, 2,5 g de ovo liquido e l,O g de gema, através da membrana HAWG 47 mm da marca Millipore. A recuperaçao de E..ca}i em clara foi realizada através do emprego siImultâneo da técnica de plaqueamento em profundidade e de um método por nós desenvolvido, utilizando a membrana filtrante. Os resultados obtidos com a técnica do plaqueamento foram próximos aos conseguidos com a técnica proposta. Colocando os dois resultados em gráfico, foi obtida uma reta de regressão com coeficiente de correlação de 0;95 e coeficiente angular de 0,99. Os resultados da experiência de inoculação de ovo liquido com E. cali, obtidos com o emprego das duas técnicas, forneceram uma reta com coeficiente de correlação de 0,98. O coeficiente angular"foi baixo, 0,39 .havendo necessidade da introdução de um fator de correção multiplicativo de 2,6, para compensar a menor recuperação obtida com o uso da técnica da membrana filtrante. O isolamento de E. coli da gema foi insatisfatório, com o emprego da técnica da membrana filtrante. A S. typhimurium, previamente .inoculada em clara e em ovo liquido, foi recuperada como emprego da técnica clássica de enriquecimento e isolamento em meios seletivos e com o método por nós desenvolvido. Os resultados demonstraram que mesmo em concentrações tão baixas como 0,3 microrganismo por grama de clara, é possivel recuperar a s. typhimurium através da técnica da membrana filtrante. A recuperação deste microrganismo do ovo liquido foi insatisfatória Abstract: In the line of research for the identification and rapid enumeration of micro-organisms, the present work was carried out with the object of verifying the viabili ty of the use of a membrane filter in the recuperation of Escherichia coli and Salmonella typhimurium, inoculated experimentally into the hen'g egg (white, yolk, and whole liquid egg). After treatment wi th bacterian protease "Alcala se", 5.0 g of egg white, 2.5 g of whole liquid egg, and 1,0 g of egg yolk were filtered through the 47 mm HAWG filter (Millipore). The recuperation of E. coli from the egg white was done by means of the simultaneous use of pour plate method and a method developed by us, using a membrane filter. The results obtained using the pour plate technique were very similar to those developed by the authors of this research. When both results were plotted on a graph, a line of regression with a correlation coefficient of 0,95 and an angular coefficient of 0,99 was obtained. The results of the experiment involving the inoculationof the whole liquid egg with E. coli, using both techniques, showed a line with a correlation coeficient of 0.98. The angular coefficient of 0.39 was low, making the introduction of a manipulative correction factor of 2,6 necessary in order to compensate for a lesser recuperation obtained using the membrane filter technique. The isolation of E. coli from the yolk was not satisfactory using the membrane filter technique. The S.typhimurium, previously inoculated into the white and whole liquid egg, was recuperated us1ng the classic technique of enrichment and isolation in selective media and als,oby methods developed by USe The results show that even in concentrations as low as 0.3 micro-organisms per gram of egg white, it is possible to recuperate the S. typhimurium by use of the membrane filter technique. The recuperation of this microorganism from the who1e 1iquid egg was insatisfactory Doutorado Ciência de Alimentos Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Fumio Yokoya Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: A literatura cientifica é bastante limitada no que diz respeito ao processo rápido de fabricação de vinagre (gerador de vinagre). Espera-se que os dados obtidos contribuam não apenas para o desenvolvimento da tecnologia como também na ampliação do uso de vinagre no Brasil através do barateamento e diversificação dos tipos (como vinagre de diferentes tipos de frutas tropicais) para melhor atender os requisitos do consumidor. Este trabalho teve como objetivo: 1-desenvolver um gerador piloto, 2- analisar o desempenho deste gerador com algumas matérias primas: a-) solução alcóolica enriquecida com minerais (meio artificial para comparação) b-) vinhos obtidos pela fermentação alcóolica de caju e laranja. Utilizou-se para a construção cilindros de vidro que são sustentados por discos de nylon (os geradores são três, independentes entre si). Também foram utilizadas bombas pulsadoras com capacidade média de 1 a 6 litros/hora. Foram utilizadas para análise mosto contendo concentrações alcóolicas de 10% (v/v); 12% (v/v) e 14% (v/v) e volume adicionado de 1, 2 e 3 litros. Os geradores foram testados com soluções alcóolicas diluídas acrescidas de nutrientes ...Observação: O resumo, na íntegra poderá ser visualizado no texto completo da tese digital. Abstract: Actual data about rapid process for vinegar production (vinegar generator) is limited. It is expected the obtained results to contribute both to technological development and ampliation of vinegar use in Brazil, by the production of cheap and diverse types (tropical, fruits vinegar, e.g.) in order to satisfy consumers. This paper had the following objectives: 1. to develop a vinegar generator 2. to analyse this generator performance with some raw materiais: a) alcoholic solution added with minerals artificial medium for comparation b) wine obtained by alcoholic fermentation of orange and cashew nut. For the generator construction it was utilized glass cylinder sustained by nylon discs (there are three independent generators). It was utilised puslsating pumps with capacity on average from 1 to 6 I/h ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations. Mestrado Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador : Fumio Yokoya Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agricola Resumo: O presente trabalho consta da obtenção de parâmetros em curvas de crescimento bacteriano e sua utilização para avaliação da sua população em alimentos. Utilizou-se amostras de pescada foguete (Macrodon ancylodon), por ser esta espécie de grande valor para a economia pesqueira do Brasil e também pela informação que se pode obter de trabalhos anteriores neste laboratório. Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital. Abstract: This work attempts to obtain parameters for bacterial growth curves and to utilize were ¿pescada foguete¿ (Macrodon ancylodon), due to the fact that it is a species of great value in the Brasilian fishing economy and also because of the information that was available from previous work in this laboratory. Note: The complete abstract is available with the full electronic document Mestrado Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador : Fumio Yokoya Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agrícola Resumo: O presente trabalho teve por finalidade detectar a presença de Clostridium botulinum em produtos cárneos embalados a vácuo e testar mediante inoculação experimental se os produtos analisados permitiriam ou não o desenvolvimento de C.botulinum e a produção de sua toxina. Os testes empregados demonstraram a ausência de C.botulinum, porem foi detectada a presença de Clostridium tetani em dezessete amostras. Na inoculação experimental os resultados demonstraram que o C. botulinum cresceu em quase todas as amostras armazenadas a temperaturas acima de 3°C. Também foi demonstrado que os teores de cloreto de sódio, nitrito e nitrato determinados nas amostras, não inibem a germinação de esporos de Clostridium botulinum e sim as baixas temperaturas Abstract: The present work has as its objective the detection of Clostridium botulinum in vaccum-packed meat products and to test experimentally if these kinds of products will suport or not the development of C.botulinum and the production of its toxins. The tests used, showed the absence of C.botulinum, however the presence of Clostridium tetani was detected in seventeen samples. In the experimental inhicuiaLi on the results demonstrated that C. botulinum grew in almost all the samples stored at temperatures above 3°C. Also, it was proved that the concentrations of sodium chloride, nitrite and nitrate detected in the samples, was not sufficient to inhibit the germination of Clostridium botulinum spores. Rather, this was accomplished by the storage at low temperatures Doutorado Doutor em Engenharia de Alimentos

Orientador: Fumio Yokoya Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: O mecanismo, da floculacão de leveduras Sacch. cerevisiae causada por algumas linhagens de Lactobacillus fermentum foi investigada através da avaliação do efeito da presença de íons metálicos e de carboidratos e dos tratamentos térmico, enzimático e ácido, realizados em suspensões aquosas com aqueles microrganismos. A adição de íons cálcio intensifica a ocorrência da floculacão. Os íons manganês e magnésio foram capazes de promover a floculacão, porém em concentrações maiores do que cálcio. Na presença dos íons potássio, sódio, cobre e bário, as células de leveduras não foram floculadas. O valor de pH 4,5 favoreceu a ocorrência da floculacão, quando não havia adição de íons cálcio. Ao contrário, em pH 3,0 e 6,2 não houve floculação na ausência de cálcio. Em pH 4,5, com a adição de íons magnésio e manganês em concentrações superiores a 2 X 10-²M e 10-²M respectivamente, foi observada a inibição da floculação. O carboidrato manose mostrou-se um agente desfloculante efetivo em concentrações superiores a 7 X 10-²M. Frutose apresentou um efeito inibidor menor, enquanto glicose, sacarose, maltose não mostraram nenhum efeito. O tratamento térmico das células bacterianas eliminou a sua ação floculadora; o efeito do calor mostrou-se dependente do pH, sendo mais eficiente em valor de pH mais baixo(4,5). O tratamento térmico das células de levedura não alterou suas propriedades floculativas. O tratamento com pronase E (protease de Streptomyces griseus) sobre as células de bactéria destruiu a sua habilidade floculante. O mesmo efeito não foi observado com este tratamento sobre as células de leveduras ou sobre a material floculado. Outras enzimas como lisozima e zimoliase não afetaram as propriedades floculadoras das células. Estes resultados mostraram que uma proteína bacteriana com atividade semelhante à lectina, capaz de interagir com a parede celular das células de leveduras, está envolvida na floculação. O possível mecanismo da floculacão é discutido Abstract: The flocculation of yeast cells by some strains of Lactobacillus fermentum has been presently elucidated. The effect of metal ions, carboydrates, pH, heat and enzymes treatments, was investigated. Calcium ions were required for flocculation. Manganese and magnesium ions were able to replace calcium but large amount was required. Potassium, sodium, copper and barium ions were not effective. The value of pH 4,5 favored flocculation compared to pH 3,0 or 6,0 when calcium ion was absent. With excess of magnesium (2 x 10-¹M)) or manganese ion (10-²M), apparent flocculation inhibition was observed. Mannose was effective deflocculant at concentration above 7 X 10-²M. Fructose showed little effect but glucose, sucrose and maltose had any effect. Heat tretment of bacterial cells destroyed flocculating ability. It was pH dependent and more effective at lower pH. Heat treatment of yeast cells did not affested flocculation properties. Pronase E (protease of Streptomyces griseus) treatment of bacterial cells destroyed flocculation ability. The same effect was not observed if treatment was carried out on yeast cells or on flocculated system. Other enzymes, such lysosyme and zymoliase did not affected flocculation of cells These results showed that yeast flocculation is involved with a lectin-like structure bacterial protein. The possible mechanism of flocculation is discussed Mestrado Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Fumio Yokoya Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Os microrganismos contaminantes das domas de fermentação alcoólica causam grandes prejuízos econômicos à indústria do álcool. Entre estes contaminantes, sabe-se que o Lactobacillus fermentum provoca a floculação de leveduras Saccharomyces cerevisiae, diminuindo o contato destas com o substrato e reduzindo o rendimento, além do aumentar o tempo de fermentação. A capacidade de flocular leveduras não é encontrada em todas as linhagens de L. fermentum, e quando presente pode ser perdida após seguidos subcultivos. Este trabalho procurou estudar o fator responsável pela capacidade de floculação através da caracterização genética, fisiológica e molecular de linhagens e isolados de L.fermentum FTPT 1405, 1405 NF1, 1405 NFIM, FTPT 1407, 1407 P2 e 1407 F3, floculadoras e não-floculadoras de leveduras. Foi observada grande instabilidade do fator na população de L. fermentum FTPT 1405, na proporção 598:1 colônias floculadoras:colônias não floculadoras. Utilizando os métodos de extração de DNA plasmidial descritos por ANDERSON & McKAY (1983) e PORTNOY (1981) não foi possível a detecção de plasmídios. As culturas floculadoras e não-floculadoras assimilaram os mesmos açúcares (galactose, trealose, frutose rafinose, maltose , manose e ribose), foramcatalase e benzidina negativas, produtoras de gás com crescimento positivo à 45°C e negativo à 15°C. A caracterização molecular realizada através de perfis de ácidos graxos e proteínas não apresentou diferenças marcantes entre as culturas floculadoras e não-floculadoras. A dificuldade de lise dos lactobacilos foi superada utilizando-se 10 mg/ml de lisozima à 37°C por 1h para posterior extração de DNA plasmidial e 5 mg/ml de lisozima à 37°C por uma noite para extração de proteínas. Não se observou remoção de proteínas superficiais em tratamentos com intensa agitação ou temperatura, indicando que tais proteínas devem estar intrinsecamente ligadas à parede bacteriana Abstract: The microbial contaminants of fermentation vats are responsible for considerable economical loss in fuel alcohol industry. Among these contaminants, Lactobacilus fermentum is known to cause flocculation of yeasts cells with reduction on yield and productivity of fermentation process. The flocculation ability is found only in some strains of L. fermentum, and it may be lost by consecutive subculture. This work is carried out to investigate the factor responsible of flocculation ability by genetical, molecular and physiological characterization of flocculating and non-flocculating strains of L. fermentum. It was observed that flocculating ability was quite instable but the plasmids were not detected by methods of Anderson and Mckay (1983) or Portnoy (1981). No difference in biochemical and physiological properties was found between flocculant and non-flocculant strains of L. fermentum. Also there was no detectable difference in fatty acids and protein composition between these strains. Surface protein could not be removed by vigorous shaking or temperature treatment indicating that it is firmly bound to cell envelope Mestrado Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Fumio Yokoya Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Frutose é o açúcar natural mais doce, sendo uma alternativa segura para substituir a sacarose. A inulinase tem um importante papel na produção de frutose através da hidrólise enzimática da inulina, que pode ser realizada em uma única etapa e render até 95% de conversão. Este trabalho teve como objetivo estudar a produção da inulinase por Kluyveromyces marxianus varo bulgaricus ATCC 16045 utilizando diferentes fontes de carbono e nitrogênio, visando obter um meio viável comercialmente, nos mesmos níveis de produção do meio convencional. Técnicas de planejamento experimental e análise de superfície de resposta foram utilizadas para otimizar o meio de cultivo para produção da enzima. Foram estudadas as variáveis concentração de melaço, água de maceração de milho e extrato de levedura. Para este estudo utilizou-se quatro planejamentos fatoriais completos, sendo alcançada uma atividade enzimática máxima de 138U/mL. Após foi possível reduzir ainda mais o custo do meio, com a substituição do extrato de levedura pelo Prodexlac, extrato de levedura produzido pela indústria Prodesa que contém 44% de proteína, e retirando-se K2HPO4 do meio, atingido-se uma atividade enzimática de 113U/mL. Verificou-se que o primeiro e segundo meios otimizados representam 13% e 1,93% do custo do meio sintético otimizado, respectivamente. Assim neste trabalho foi possível a otimização na produção da enzima, utilizando meios alternativos, sem reduzir os níveis de produção obtidos com meio sintético, tomando ainda, o meio economicamente mais viável. Abstract: Fructose is the sweetest sugar, being a safe altemative for sucrose. Inulinase may play an important role in fructose production by enzymatic hidrolysis of inulin. The reaction occurs in a single step and it is possible to obtain up to 95% of conversion. In this work the optimization of the conditions of inulinase production by Kluyveromyces marxianus varo bulgaricus ATCC 16045 using different carbon and nitrogen sources is carried out in order to obtain more suitable culture conditions for comercial exploration, with a similar production leveI to conventional culture conditions. Factorial design and surface response analysis were used to optimize the culture conditions for inulinase production and the enzymatic reaction parameters. In the enzyme production the following variables were studied: melass, AMM and yeast extract. The use of the technique of complete factorial design, resulted in a enzymatic activity of 138U/mL After that, it was possible to minimize the cost, changing the yeast extract by Prodexlac, produced by Prodesa Inc. wich contains 44% protein and removing K2HPO4 from the medium formulation, and with this medium the activity reached 113U/mL. It has been show that the first and second medium formulation represented 13% and 1,93% ofthe cost ofthe previous synthetic optimized medium, respectively. Finally, this work made possible the enzymatic production optimization, using low cost altemative medium, without reducing the production leveI achieved with the synthetic medium, tuming this process economically more interesting. Doutorado Doutor em Ciência de Alimentos

Orientadores : Fumio Yokoya, Luiz Carlos Basso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: O resumo podera ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: The abstract is available with the full electronic digital document Doutorado Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador : Fumio Yokoya Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdadde de Engenharia de Alimentos Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: The abstract is available with the full electronic document Doutorado Doutor em Ciência de Alimentos

Orientadores: Fumio Yokoya, Wilma Aparecida Spinosa Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: As bacterias aceticas sao utilizadas na producao de vinagre. O requerimento nutricional das bacterias aceticas e pouco conhecido e a reproducao desses microrganismos e muito dificil. Os reatores de fermentacao acetica submersa promovem condicoes de estresse fisiologico: acidez (acima de 10% p/v), teor alcoolico (2% p/v) e oxigenacao (0,4 vvm). Esses parametros sao considerados extremos e indicam a necessidade de ativacao de rotas metabolicas especificas, para a manutencao da capacidade de conversao alcool-acido acetico e divisao celular. Este estudo tem como objetivo contribuir na avaliacao qualitativa e quantitativa do efeito de minerais sobre a produtividade de acido acetico, que e definida como a porcentagem de acido acetico produzido em 24 horas. Os experimentos foram conduzidos com linhagem de Acetobacter sp., proveniente de industria produtora de vinagre. As etapas do trabalho foram: ativacao do reator com nutriente padrao; teste de efeitos dos minerais, empregando como ferramenta estatistica um delineamento fatorial incompleto (2(5-1)), isolamento e identificação dos microrganismos, utilizando provas bioquimicas classicas e analise molecular da expressao de RNA mensageiro, por meio da tecnica do DDRT/PCR, com utilizacao de primers da enzima alcool desidrogenase (ADH). Com os resultados obtidos a partir de um ensaio fatorial incompleto para a linhagem estudada, foram selecionados como minerais que aumentam a produtividade, sao eles: o ferro, o molibdenio e o manganes e, ainda, como minerais que diminuem a produtividade, o zinco e o boro. A linhagem isolada do reator apresentou todas as características bioquimicas do genero Acetobacter e a analise molecular evidenciou a expressão do gene para a enzima alcool desidrogenase em todos os experimentos Abstract: The acetical bacteria are used in vinegar production. The nutritional requirement of acetical bacteria is poorly known, and the maintenance of these microorganisms is too difficult. The reactors of submerged acetical fermentation promote conditions of physiologic stress: acidity (up to 10% p/v), alcohol (2%p/v) and oxygenation (0,4 vvm).These parameters are considerate extremes and indicate the necessity of the activation of specifics metabolic to the maintenance of alcohol-acetic acid transformation capacity and cell division. This research has in view to contribute to the qualitatively and quantitatively evaluation of minerals effects on the productivity of acetic acid, which is defined as the acetic acid percentage produced until 24 hours. These experiments were conducted with of Acetobacter sp. strain, proceeding from vinegar industries. The work steps were: activation of the reactor with standard nutrient; minerals effects tests using the fractional factorial design (25-1) as statistic tool; isolation and identification of the microorganisms, employing classical biochemistry proofs and molecular analysis of the RNA messenger expression, through DDRT/PCR techniques, applying alcohol dehydrogenase enzyme primers. With the results obtained from the fractional factorial design for the strains studied, were selected minerals as the iron, the molybdenum and the manganese that increase productivity and, yet, minerals as zinc and boron that decrease it. The reactor isolated strain presented all biochemical characteristics of Acetobacter genus and the molecular analysis evidenced the expression of the gene for the enzyme alcohol dehidrogenase in all experiments Doutorado Doutor em Ciência de Alimentos

Orientadores: Fumio Yokota, Tasi Siu Mui Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Doutorado Doutor em Ciência de Alimentos

Orientadores: Fumio Yokoya, Pedro de Oliva Neto Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: O grande desafio para a produção de etanol de segunda geração consiste em determinar a melhor opção de disponibilizar a glicose a partir da hidrólise do amido em termos de custo global, rendimento glicosídico e fermentabilidade. O farelo de mandioca produzido durante o processamento da fécula foi usado como fonte econômica para a biomassa e produção de bioetanol por Saccharomyces cerevisiae M-26. A suspensão de farelo de mandioca e água 5 % (p/v) foi hidrolisada utilizando como catalisador os ácidos sulfúrico (H2SO4) e fosfórico (H3PO4) em diferentes faixas de pH (0,5, 1,0 e 1,5), a uma temperatura 120 ºC por 30, 60 e 90 minutos de reação. Os resultados demonstraram que o emprego do H2SO4 foi suficiente para hidrolisar o amido, obtendo uma concentração de 2,93 % de açúcares redutores e 2,62 % de glicose, com rendimento de 96,48 % de açúcares redutores, em pH 0,5 e tempo de reação 90 minutos. Nas mesmas condições, o tratamento com H3PO4 obteve 2,52 % de açúcares redutores e 1,99 % de glicose, com um rendimento de 82,87 % de açúcares redutores, concluindo que a hidrolise é tanto mais rápida quando maior o poder ionizante do ácido e que o pH 1,5 é fracamente glucogênico enquanto que a acidicidade mais drástica (pH 0,5) já é mais glucogênica. Concentrações baixas do furfural subproduto hidroximetil (HMF) foram gerados durante a hidrólise do amido quando usou H2SO4 em comparação ao H3PO4. Os tratamentos com H2SO4 produziram 0,17 g/L e 0,02 g/L de HMF após 90 minutos de reação em pH 0,5 e 1,5, respectivamente. Já os tratamentos utilizando o catalisador H3PO4 não geraram concentrações detectáveis de HMF. As amostras obtidas dos tratamentos em pH 0,5 apresentaram menor quantidade de farelo residual em relação as amostras provenientes dos tratamentos em pH 1,0 e 1,5. A linhagem de S. cerevisiae M-26 foi capaz de utilizar e fermentar o hidrolisado e o rendimento teórico de etanol (50,59 %) foi alcançado a 32 ºC após 12 horas Abstract: The great challenge for the production of second generation ethanol is to determine the best option available bagasse produced during processing of starch was used as an economical source for biomass and bioethanol production by Saccharomyces cerevisiae M-26. The suspension of cassava bagasse and water 5% (w/v) was hydrolyzed using sulfuric acid as the catalyst (H2SO4) and phosphoric acid (H3PO4) in different pH ranges (0.5, 1.0 and 1.5), at a temperature 120 °C for 30, 60 and 90 minutes of reaction. The results showed that the use of H2SO4 was sufficient to hydrolyze the starch, giving a concentration of 2.93 % of reducing sugars and 2.62 % glucose, with a yield of 96.48 % of the reducing sugars at pH 0.5 and 90 minutes reaction time. Under the same conditions, treatment with H3PO4 received 2.52 % of reducing sugars and 1.99 % glucose, with a yield of 82.87 % of reducing sugars, concluding that the hydrolysis is much faster when the more powerful acid, and ionizing pH 1.5 that is weakly acidic glycogen while the most drastic (pH 0.5) is already more glycogen. Low concentrations of byproduct 5-hydroxymethylfurfural (5-HMF) were generated during the hydrolysis of starch when used H2SO4 in relation the H3PO4. The treatments with H2SO4 produced 0.17 g/L and 0.02 g/L of 5-HMF after 90 minutes of reaction at pH 0.5 and 1.5, respectively. Since the treatments using the catalyst H3PO4 did not generate detectable concentrations of 5-HMF. The samples of the treatments at pH 0.5 had a lower amount of bran remaining on the samples from the treatments at pH 1.0 and 1.5. The strain of S. cerevisiae M-26 were able to utilize and ferment the hydrolyzate and the theoretical yield of ethanol (50.59 %) was achieved at 32 °C after 12 hours Doutorado Ciência de Alimentos Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Fumio Yokoya Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: O Alicyclobacillus acidoterrestris, é uma bactéria acidotermofílica, não patogênica, de origem ambiental. Este organismo é um potencial agente deteriorante em polpas e sucos de frutas ácidos. Devido à presença de endosporos de elevada resistência térmica, torna-se difícil sua inativação pelos tratamentos térmicos convencionais de pasteutização. Esta pesquisa visou extrair e processar termicamente o suco de seis tipos de frutas tropicais, de caráter ácido (abacaxi, acerola, caju, goiaba, manga e maracujá), e avaliar se estes apresentam condições para que o A. acidoterrestris se desenvolva em sua temperatura ótima (45°C) e também em temperatura de abuso de processamento (35°C), temperatura que favorece o crescimento de microrganismos mesófilos. Além disso, foi analisada a concentração mínima inicial, do microrganismo em estudo, capaz de sobreviver e se desenvolver no suco de manga, aquele que apresentou melhores condições de desenvolvimento na primeira fase do estudo. Neste estudo foi também incluída a análise qualitativa de guaiacol como indicador de deterioração. Foi preparada uma suspensão com a mistura de esporos de quatro cepas de A. acidoterrestris em mesma concentração, padronizada e inoculada nos sucos, previamente extraídos e tratados termicamente, apresentando carga inicial no suco de 102 UFC/mL. O desenvolvimento do microrganismo foi acompanhado através de plaqueamentos em meio de cultura próprio, por até 30 dias, ou até que atingissem uma contagem constante. Ao final, foram avaliados o desenvolvimento máximo da bactéria, em cada suco, na respectiva condição de cultivo, e o período que levou para atingir estes determinados valores. Apenas no suco de caju o pool de bactérias não apresentou desenvolvimento, no prazo máximo estipulado do ensaio (30 dias). O microrganismo apresentou desenvolvimento em todos os demais sucos, alcançando índices de produção de guaiacol e outros subprodutos Abstract: Alicyclobacillus acidoterrestris is an acidophilic bacterium, nonpathogenic, of environmental origin. This organism is a potential spoiler acid frutits, pulps and juices. Due to the presence of endospores of high heat resistance, it becomes difficult to inactivate it by pasteurization conventional thermal treatment. This research aimed to extract and process thermally the juice of six kinds of tropical fruit, acid character (pineapple, acerola, cashew, guava, mango and passion fruit) and to evaluate if these have conditions for Alicyclobacillus acidoterrestris to develop in optimum temperature (45°C) and also in processing abuse temperature (35°C). Besides, it was analyzed the minimum initial concentration of the microorganism under study, which is able to survive and develop in the mango juice, which presented better conditions of development, according to the first phase of the study. A suspension was prepared with the spores mixture of four strains of A. acidoterrestris in the same concentration, because in preliminary studies it was possible to verify that some strains did not develop in all types of juice. The suspension was standardized and inoculated into the previously extracted and heart treated juices, showing initial concentration of 102 CFU/mL in the juice. The development of the microorganism was accompanied through plating in specific culture medium, for around 30 days or until it reached a constant counting. In the end, bacterium maximum growth was evaluated in each juice, in its respective growing condition and the time it took to achieve these values. The pool of bacteria didn't grow only in the cashew juice. All other juices showed development of the microorganism, reaching production rates of guaiacol and other byproducts, in accordaner with to previous studies Mestrado Ciência de Alimentos Mestra em Ciência de Alimentos

Orientadores: Fumio Yokoya, Wilma Aparecida Spinosa Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Os vinagres de frutas popularizam-se cada vez mais no planeta, sendo produzidos a partir de diversos cultivares ou de seus resíduos, com o uso de técnicas clássicas ou modernas. Esses produtos apresentam grande variedade de ácidos orgânicos, vitaminas, minerais, compostos fenólicos e outros elementos com importantes funções fisiológicas. O vinagre de maior qualidade depende mais dos seus compostos secundários do que do ácido acético, embora a realidade brasileira aponte situação diversa: a cultura geral não preza pela qualidade dos vinagres consumidos, o que determina os baixos preços do produto no mercado, pois além de matérias-primas pouco nobres, os processos acabam por priorizar tão somente o ácido acético. O objetivo desta pesquisa foi estudar a agregação de compostos de valor sensorial e funcional em vinagres produzidos a partir de diferentes matérias-primas. Os vinagres estudados foram os de arroz, cana, milho, mel, carambola, kiwi, laranja, maçã, maracujá, toranja e uva. Os vinagres de arroz, milho e cana foram preparados a partir de destilados etanólicos e cachaça. Os mostos de frutas foram obtidos por maceração ou despolpamento, adicionando-se o preparado enzimático Pectinex® Ultra SPL em quantidade suficiente e o teor de açúcar foi corrigido com sacarose para atingir 18-20° Brix. Na sequência, efetuou-se a fermentação alcoólica, utilizando a levedura liofilizada Saccharomyces cerevisiae ?Y904?. A partir do vinho obtido, procedeu-se a fermentação acética rápida e determinou-se as seguintes características dos vinagres: a) acidez total; b) acidez volátil; c) acidez fixa; d) pH; e) extrato seco; f) minerais; g) açúcares totais; h) grau alcoólico; i) metanol; j) dióxido de enxofre; k) sulfato; l) cloreto total; m) compostos voláteis (acetaldeído, acetato de etila, metanol, diacetil, acetato de butila, isobutanol, hexanol, octanol); n) capacidade antioxidante (% de sequestro do Radical DPPH) e conteúdo fenólico (Folin-Ciocalteau). Os vinagres produzidos encontraram-se dentro dos padrões estabelecidos pela legislação e adequados aos parâmetros preconizados na literatura científica. Houve grande variação nos teores de compostos voláteis dos produtos, sendo o acetato de etila o único presente em todas as amostras. Os fermentados acéticos de destilados etanólicos apresentaram valores menores de compostos fenólicos totais e de sequestro do DPPH quando comparados com os produzidos a partir das frutas, no entanto, tais compostos estavam ausentes nas matérias-primas utilizadas (cachaça, etanol de arroz e etanol de milho). Na produção de vinagres de frutas, a composição de cada cultivar mostrou ter grande influência no conteúdo fenólico e na capacidade antioxidante dos fermentados alcoólicos e dos vinagres. O mosto, o fermentado alcoólico e o vinagre de uva apresentaram os valores mais altos de sequestro relativo do radical DPPH em comparação com as outras amostras, apesar de não possuírem os maiores teores de compostos fenólicos. Porém, quando os vinagres foram diluídos para atingirem 4% (p/v) em acidez total, o produzido a partir de toranja superou os demais no que se refere às características funcionais estudadas. A partir de estatística multivariada em relação aos resultados de dezenove variáveis foi possível separar os vinagres produzidos em quatro grupos: (1) os feitos com matérias-primas destiladas (arroz, milho e cachaça), (2) o produzido com mel, (3) o fermentado da uva e (4) os obtidos a partir de carambola, kiwi, laranja, maçã, maracujá e toranja Abstract: The fruit vinegars increasingly become popular on the planet, being produced from various crops or their residues, using classical and modern techniques. These products have great variety of organic acids, vitamins, minerals, phenolic compounds and other elements with important physiological functions. Vinegar higher quality depends more on their secondary compounds than acetic acid, although the Brazilian reality shows another situation: the general culture does not value the quality of vinegar consumed, which determines the low prices of the product on the market, as well as ignoble raw materials, processes end up as only prioritize the acetic acid. The objective of this research is to study the aggregation of sensory and functional compounds in vinegars produced from different raw materials. The vinegars studied were produced from rice, sugarcane, corn, honey, starfruit, kiwi, orange, apple, passion fruit, grapefruit and grapes. The vinegars of rice, corn and sugar cane were derived from ethanol and ?cachaça?. The musts were obtained by macerating fruit, adding sufficient quantity of enzyme preparation with correction of sugar contents by the use of sacarose. Then we performed the alcoholic fermentation using yeast lyophilized "Y904". From the resulting wine, was proceeded to acetic fermentation by German method and determined the following characteristics: a) total acidity, b) volatile acidity; c) fixed acidity; d) pH; e) dry stratum f) minerals g) total sugars; h) alcohol content; i) methanol; j) sulfur dioxide; k) sulfate; l) total chloride m) volatile compounds (acetaldehyde, ethyl acetate, methanol, diacetyl, butyl acetate, isobutanol , hexanol), n) phenolic content (Folin-Ciocalteau) and antioxidant capacity (DPPH radical scavenging). The vinegars were in accordance with standards established by law and appropriate to the parameters recommended in the scientific literature. There was wide variation in levels of volatile compounds and ethyl acetate was the only one present in all samples. In vinegars made with distilled raw materials, lower values were observed for total phenolic compounds and DPPH radical scavenging compared with those produced from fruit, however, these compounds were absent in the raw materials used (cachaça, ethanol from rice and ethanol from corn). In the production of fruit vinegars, the composition of each cultivar have great influence on the phenolic content and antioxidant capacity of wines and vinegars. Juice, wine and vinegar produced from grapes showed the highest values of DPPH radical scavenging in comparison with other samples, despite not having the highest levels of phenolic compounds. But when the vinegars was diluted to reach 4% (w / v) total acidity, the product from grapefruit topped the other with regard to functional characteristics studied. The vinegars produced were separated into four groups by multivariate analysis: (1) those made with distilled raw materials (rice, corn and cachaça), (2) the vinegar made from honey, (3) grape vinegar and (4) obtained from the star fruit, kiwi, orange, apple, passion fruit and grapefruit Doutorado Ciência de Alimentos Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Fumio Yokoya Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Doutorado Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Fumio Yokoya Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Doutorado

Orientadores: Fumio Yokoya, Pedro de Oliva Neto Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Esta pesquisa objetivou estudar e padronizar procedimentos de isolamento de linhagens em fermentadores de alta produção de vinagre, seleção das culturas com características importantes para a produção de vinagre, além da identificação, manutenção dessas linhagens, contagem de bactérias acéticas e estudo de parâmetros cinéticos de produção. Observou-se, por um lado, o fato de a produção industrial ter sido pouco beneficiada com os estudos sobre as bactérias acéticas e, por outro, o estado de manufatura em que se encontra a fermentação acética nas unidades produtoras. O trabalho iniciou-se a partir do isolamento de microrganismos em unidades produtoras de vinagre no Estado de São Paulo. Ao todo foram isoladas 98 linhagens, das quais 74 foram selecionadas, em rápida identificação fenotípica, como pertencentes à família Acetobacteraceae, e, destas, 70 linhagens identificadas como pertencentes ao gênero Acetobacter, também por rápida identificação fenotípica. Com a técnica do ágar em dupla camada e a inoculação por espalhamento, verificou-se que 94,6% das linhagens isoladas foram identificadas como Acetobacter e cresceram em atmosfera com umidade relativa de 93 a 97%, e temperatura de 30:t0,5°C, em tempo máximo de 96 horas. Dos meios de cultura testados, os dois principais, em termos de recuperação de colônias, foram o meio MYP, que recuperou 44,3%, e o Suomalainem, que recuperou 25,7% do total de Acetobacter sp. isoladas. As coletas de microrganismos foram executadas entre 1998 e 2001, em três indústrias vinagreiras e três laboratórios de pesquisa. O material coletado foi preservado em condições tais que ao final de dois anos a recuperação celular média foi de 75% para linhagens armazenadas em extrato de malte 20% a -80°C. Já para outro crioprotetor estudado, o glicerol 10%, com linhagens também mantidas a -80°C, a recuperação média foi de 68%. No desenvolvimento desse processo também se chegou a uma técnica de contagem de células viáveis de bactérias acéticas e testes rápidos para contagem usando membrana filtrante ¿Observação: O resumo, na íntegra poderá ser visualizado no texto completo da tese digital. Abstract: The industrial production of vinegar has so far only insufficiently benefited from research on acetic bacteria. Hence, in spite of being highly qualified in terms of equipment, it is microbiologically deficient. The aims of the present work are (1) to study and standardize the isolation of strains used in the production of highly acid fermented vinegar, (2) to select, identify, and maintain cultures with the relevant characteristics for vinegar production, (3) to count acetic bacteria, and (4) to investigate the kinetic parameters of vinegar production. 98 strains of microorganisms were collected in vinegar producing units from São Paulo State. Rapid phenotypic identification revealed that 74 belonged to the family Acetobacteraceae and 70 to the genus Acetobacter. Using the double-Iayer agar plate technique and inoculation by spreading, the Acetobacter strains were obtained and grew in up to 96 hours under 93 to 97% of relative humidity and 30:t0,5°C. Colony recovering was best in two media; 44,3% of the Acetobacter species were recovered in MYP and 25,7%. in Suomalainen. The microorganisms were collected from 1998 through 2001 in three factories and three research laboratories. Afier two years, the average cell recovering was 75% for strains preserved in 20% malt extract at -80°C and 68% in 10% glycerol at -80°C. A technique for counting viable cells of acetic bacteria and rapid counting tests with filtration membranes were developed ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations. Doutorado Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Fumio Yokoya Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: A contaminação bacteriana na fermentação alcoólica é um dos problemas que afeta o rendimento do processo de produção de álcool. A floculação de leveduras é uma das consequências desta contaminação, sendo linhagens de Lactobaci/lusftrmentum a primeira bactéria citada como responsável por este fenômeno. Muitos fatores exercem influência na floculação de leveduras como os componentes genéticos, proteínas, temperatura, pH, produtos da fermentação como o etanol e necessidadede íons metálicos, especialmente o cálcio. Este trabalho teve por objetivo verificar as condições de ocorrência da floculação de leveduras causada por algumas espécies bacterianas contaminantes do processo de produção de álcool, avaliando o nível de contaminação bacteriana necessário para desencadear o processo de floculação, o efeito do teor alcoólico e da temperatura sobre a capacidade floculante destas bactérias. Além disto procurou contribuir para o esclarecimento do mecanismo de floculação de leveduras industriais provocada por espécies e cepas de bactérias contaminantes do processo, através da avaliação do efeito da modificação química de proteínas e carboidratos nas paredes celulares de bactérias e leveduras e do tratamento enzimático sobre a capacidade floculante destes microrganismos. Os resultados obtidos indicaram que as espécies de Lactobacjffus:L. fermentum , L. plantarum, L. fructivorans, L. fructosus e L. buchneri podem ser responsabilizados pela floculação da levedura Saccharomyces cerevisiae, porém há necessidade de uma certa relação levedura:bactériapara que OCOITflaoculação,e esta relação é diferentepara as espécies de Lactobacillus. O teor alcoólico (O a 10%) e as temperaturas (25°C a 65°C) afetaram significativamente a capacidade floculante das bactériasfrente às levedurasestudadas. Componentes protéicos da parede celular de L. plantarum, L. ftrmentum e L.buchneri devem participar do processo de floculação, uma vez que modificadores químicos que reagem com os grupos funcionais fenol e indol da cadeia lateral de aminoácidos (anidrido maleico e anidrido acético) inibiram a capacidade floculante dessas bactérias, sugerindo o envolvimento destes grupamentos no processo de floculação. Já para as espécies L. fructivorans e L. fructosus o tratamento com estes modificadores químicos não afetaram o processo de floculação. Células de S. cerevisiae submetidas a tratamento com modificadoresquímicos de carboidratosda parede celular (NaIO40,01M) apresentaraminibição em sua capacidade de serem floculadas por bactérias, indicando que carboidratos são essenciais no processo de floculação. De acordo com estes resultados sugere-se que a floculação de Saccharomyces cerevisiae causada por bactérias do gênero Lactobacillus deve apresentar um mecanismo intercelular a nível da parede celular destes microrganismos. Este processo envolve componentes protéicos da superficie celular das bactérias L. plantarum, L. ftrmentum e L. buchneri e carboidratos da parede celular das leveduras. Já para as espécies L.fructivorans e L. fructosus a presença de outros componentes celulares devem também estar envolvida no processo de floculação. Abstract: The bacterial contamination in the alcoholic fermentation is one of the problems in the process of alcohol production. Yeast flocculation is one of the consequences of this contamination that strains of actobacillus fermentum are the first one microorganism quoted as responsible by this fenomen. Many factors may influence the yeast flocculation such as, genetic coumponds, proteins, temperature, pH, fermentation products like ethanol and necessity of metalicions, especifically calcium. This research was carried out to examine the conditions of yeast flocculation ccurency caused by some bacterial species which contaminate the process of alcohol production, evaluating the effect of the population of contamlnant bacteria needed to occur the flocculation process, effect of alcohol amount and temperature in the flocculency capacity of these bacterias. Moreover,this research tried to contribute to the flocculation mecanisms elucidation of industrial yeasts provoked by strains and cepa of contaminant bacteria of alcohol fermentation process, throught the chemistIy modification effect evaluation of proteins and carbohidrates from the wall of cell and the enzimic treatment on the flocculant capacity of these microorganisms. The resulties obteined indicated that L fermentum, L. plantarum, L. fructtvorans, L. fructosus and L. buchneri can be responsablesby the S cerevisiae flocculation,but it is necessary a ratio of yeast:bacteria for flocculation to occur flocculation, and this ratio is different for some species of Lactobacillus. The ethanol amount (O to 10%) and the temperature (25°C to 65°C) affected significantly the bacterial flocculence capacity on the studied yeasts. Proteic compounds in the cell wall of L. plantarum, L. fermentum and L. buchneri may participate in the flocculation process, because chemical changers which react with fenol and indol funcional groups in the lateral chain of aminoacids (maleic anidride and acetic anidride) inhibited the bacterial flocculency capacity, suggesting that these groups are responsible for the flocculation processo For L. fructivorans and L. fructosus species the treatment with these chemical changers did not afIect the flocculation process. Cells of S. cerevisiae submited to carbohidrate chemical changers treatment (NaIO4 0,01M) showed some inhibitions in their flocculant capacity promoted by bacteria, that indicates that carbohidrates are essential for flocculation process. According of these results, it suggest that S. cerevisiae flocculation caused by Lactobacillus bacteria genus may show up a intercelular mechanisms at cell wall of these microorganisms.This process involves proteic compounds of the celular stnÍace of L.plantarum, L. fermentum and L. buchneri and carbohidrates of the cell wall of the yeasts. On the other hand for L. fructivorans and L. fructosus strains, others compounds of the cell wall may also be envolved in the flocculation process. Doutorado Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Fumio Yokoya Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Um material polimérico insolúvel em água, conhecido no meio industrial como "canjica", foi coletado em nove usinas de açúcar e álcool durante as safras de 1993 e 1994. Análises químicas mostraram que o material era similar em termos de umidade, com variação no conteúdo de cinzas. Análise elementar determinou tratar-se predominantemente de carboidratos. Traços de nitrogênio e enxofre presentes foram atribuídos a presença de material proteico provenientes dos organismos contaminantes. Cromatografia descendente em papel e cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas mostraram que o polímero era formado por unidades repetidas de glicose unidas predominantemente por ligações do tipo 1,6. Análise dos material por espectrofotometria de infravermelho evidenciou tratar-se de dextrana, enquanto análises por fluorescência de raios X determinaram a presença de íons metálicos associados ao polímero (Ca, Al, Fe, K, Cl, Mn, e traços de Si e Ti) que variaram entre as amostras. Difração de raios X mostrou bandas na "canjica" que não estão presentes em dextrana pura. Em microscopia óptica foi evidenciada a presença de bacilos e leveduras associados ao polímero. A partir de caldo de cana-de-açúcar recém colhida e moída foram isoladas linhagens de bactérias, classificadas como pertencentes ao gênero Lactobacillus e que produziam gomas a partir de sacarose. Foram selecionadas linhagens que produziam alta quantidade de gomas e produziam aumento de viscosidade aparente na solução. As gomas apresentavam predominância de massa molecular maior que 2.000.000 Da, precipitavam somente em concentrações alcoólicas maiores que 20% e eram formadas por monômeros de glicose. Dentre os fatores possivelmente relacionados a formação de "canjica" a partir de dextrana, estudou-se a influência de fatores climáticos, mostrando que houve diferença entre temperatura média máxima entre os anos de estudo. A presença de cátions isolados ou misturados, nas soluções gomosas, em conjunto com choque térmico não foram suficientes para promover a formação da "canjica". A modificação do pH da solução com adição de óxido de cálcio até 12,0 e com ácido fosfórico até 4,0, juntamente com tratamento térmico brando e extremo também não foram suficientes para modificação visual das gomas Abstract: A polymeric material insoluble in water, so called "canjica" because of its physical characteristics are similar to those of a typical food made from corn, was collected in nine Brazilian sugar and alcohol plants. It was found that all the samples were very similar to each other regarding to moisture and variable in ash content. It was determined by CHNS analysis that they were carbohydrates. There were also traces of nitrogen and sulphur compounds wich were attributed to proteinaceus material from sugar cane juice contaminants. Paper chromatography and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analyses showed that the polymers were formed by repeated glucose moiety bound by 1,6 linkages. Sample analyses by infrared spectroscopy showed to be dextran, while X-ray fluorescence determined that there were metallic ions (Ca, Al, Fe, K, CI, Mn, P and traces of Si and Ti) associated to the polymer. Their contents varied from sample to sample. X-ray diffraction analysis identified another kind of material incorporated to "canjica". Optical microscopy experimentation showed that bacilli and yeast were associated with the polymeric material. From fresh sugar cane syrup, strains of bacteria were isolated and classified as belonging to the gen. Lactobacillus, and they were able to produce gum from sucrose. Strains were selected according to the amount of gum produced and its viscosity in solution. All of the gums showed molecular mass higher than 2,000,000 Da, precipitated with alcohol concentrations higher than 20% and composed solely by glucose moieties. Among possible factors related to "canjica" production from dextran, the weather conditions were investigated and a difference was shown between maximal mean temperatures from 1992 to 1997. The cation added (alone or in combined form) to gum solution plus thermal shock were not enough to cause "canjica" formation. The pH changes with calcium oxide to 12.0 or with phosphoric acid to 4.0, plus mild and severe thermal treatments also were also unable to cause a detectable modification of the gum Doutorado Doutor em Ciência de Alimentos

Orientadores: Fumio Yokoya, Michael William Peck Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Um método popular de se prolongar a vida-de-prateleira de alimentos minimamente processados é através da utilização de tratamentos térmicos brandos e embalagem com atmosfera modificada (com baixas concentrações de oxigênio). Tradicionalmente, a eficácia dos tratamentos térmicos aplicados a estes alimentos é medida através da contagem em aerobiose das células injuriadas pelo calor. Contudo, no caso da bactéria Escheríchia coli 0157:H7, obtém-se uma melhor recuperação das células subletalmente injuriadas quando se utiliza técnicas estritamente anaeróbias. Estudou-se o efeito do tratamento térmico brando em células de E. Coli 0157H7 e as condições de recuperação da sua sensibilidade ao oxigênio em meio de cultura e em meio a base de alimentos. Células de E. Coli 0157:H7 em fase estacionária de crescimento, cultivadas em meio triptona de soja acrescido de 0,3% de extrato de levedura e 1% de glicose (TSYGB) a 30°C durante 24 horas, e submetidas a tratamento térmico a 59°C durante 5 minutos sob condições anaeróbias, recuperaram sua habilidade de crescer em presença de oxigênio em 6 horas. Similarmente, quando as células foram submetidas a tratamento térmico e mantidas em presença de 20% de oxigênio, estas apresentaram maior sensibilidade ao oxigênio, necessitando de um período maior de tempo para se recuperar do que as células mantidas em condições de anaerobiose (9 horas comparado a 6 horas). Células de E. coli 0157:H7 foram submetidas a tratamentos térmicos de letalidade equivalente a 55, 59 e 61 °C. Após tratamento térmico a 55°C por 100 minutos, as células necessitaram de mais de 20 horas para recuperar sua tolerância ao oxigênio, comparativamente a 6 e 2 horas para as células tratadas termicamente a 59°C por 5 minutos e a 61 °C por 1 minuto, respectivamente. Isto indica, que as células deste microrganismo recuperam sua sensibilidade ao oxigênio mais rapidamente após tratamentos térmicos mais curtos com temperaturas mais altas. Células de E. coli 0157:H7 submetidas a tratamento térmico a 59°C durante 5 minutos e incubadas a 10, 20 e 30°C, recuperaram sua tolerância ao oxigênio após aproximadamente 130, 50 e 6 horas, respectivamente. Contudo, quando mantidas a 5°C, estas células não recuperaram sua tolerância, sobrevivendo no mesmo nível durante o período de observação de 34 dias. A inclusão de 50% de dióxido de carbono ao meio de contagem, não apresentou efeito na recuperação das células sensíveis ao oxigênio, porém o aumento da concentração de oxigênio afetou a recuperação das células injuriadas. O choque térmico a 42°C durante 5 minutos, seguido de tratamento térmico a 59°C durante 5 minutos não influenciou a resistência térmica ou o reparo celular de E. coli 0157:H7. Entretanto, células deste microrganismo submetidas a choque térmico a 45°C durante 5 minutos, apresentaram um aumento em sua resistência térmica de cerca de 10 vezes, tanto em condições aeróbias como anaeróbias, não afetando porém, sua sensibilidade ao oxigênio. E. coli 0157:H7 foi inoculada em tubos contendo meios a base de alimentos, preparados em condições aeróbias e anaeróbias. Estes foram submetidos a tratamentos térmicos e incubados a 30°C. Foi verificada uma grande diferença na resistência térmica das células nos diferentes alimentos testados. Os valores Dsg-c nos tubos preparados em anaerobiose foram, para carne bovina 5,3 minutos, cogumelo 4 minutos, frango 3,7 minutos e de apenas 1,9 minutos para leite. Os valores D nos meios preparados em aerobiose foram similares aos obtidos no meio anaeróbio. Isto ocorreu porque os meios preparados em condições aeróbias apresentam potenciais de óxido-redução reduzidos, similares aos meios preparados em anaerobiose. Não se detectou crescimento de E. coli 0157:H7 em meios preparados a base de batata, brócolis e cenoura. Abstract: A popular method of extending the shelf life of minimally processed foods is to subject the food to a mild heat treatment and package under a modified atmosphere (low level of oxygen). The effectiveness of the heat treatment is measured by aerobic enumeration of heat damaged cells. However, for Escherichia coli 0157:H7, the greatest recovery of sublethally damaged cells was obtained using strictly anaerobic techniques The effect of a mild heat treatment and the recovery conditions on oxygen sensitivity of E coli 0157:H7 cells was studied in media and foods. Stationary phase cells grown in tryptone soy agar with 0.3% yeast extract and 1 % glucose (TSYGB) at 30°C for 24 hours and heat treated at 59°C for 5 minutes recovered their ability to grow in oxygen in 6 hours when held in anaerobic conditions. Similarly when cells were heat treated and held in the presence of 20% oxygen, the cells were more sensitive to oxygen and took longer to recover than cells held in anaerobic conditions (9 hours compared with 6 hours). Cells of E coli 0157.H7 were subjected to heat treatments of equivalent lethality at 55, 59 and 61 °C. Following a heat treatment of 100 minutes at 55°C, cells took 20 hours to recover their tolerance to oxygen compared to 6 and 2 hours for cells heat treated for 5 minutes at 59°C and 1 minute at 61 °C, respectively. This shows that injured cells recover their oxygen tolerance faster after a short heat treatment at a higher temperature. Cells heat treated at 59°C for 5 minutes and held at 10, 20 and 30°C, recovered their oxygen tolerance after 130, 50 and 6 hours respectively. However, when held at 5°C, the cells did not recover their oxygen tolerance in 34 days. The inclusion of 50% carbon dioxide in the enumeration medium had no effect on the recovery of oxygen sensitive cells but oxygen concentration affected the recovery of injured cells A heat shock of 5 minutes at 42°C had no effect on heat resistance or recovery of damaged cells. However, 5 minutes at 45°C before a heat treatment of 5 minutes at 59°C increased the heat resistance of E. coli 0157:H7 by 10 fold but had no effect on its oxygen sensitivity. E. coli 0157:H7 was inoculated into tubes of food media prepared aerobically and anaerobicallly and given a heat treatment before incubating at 30°C. There was a large difference in heat resistance of cells in the different foods tested. Dsg-c in anaerobically prepared beef was 5.3 minutes, in mushroom, 4.0 minutes, in chicken, 3.7 minutes and in milk only 1.9 minutes. D values in aerobically prepared media were similar to those in anaerobic media. This was because aerobically prepared media had very low redox potentials, similar to those of the anaerobically prepared media. Growth of E. coli 0157:H7 was not detected in broccoli, carrot or potato media. Doutorado Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador : Fumio Yokoya Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: A floculação da levedura Saccharomyces cerevisiae provocada pela bactéria Lactobacil/us fermentum causa sérios prejuízos à fermentação alcoólica, uma vez que reduz o número de células utilizado durante o processo e propicia a proliferação de contaminantes. O mecanismo de floculação foi estudado através do efeito de modificadores químicos de proteínas e de carboidratos da parede celular, da ação de íons, e da lectina concanavalina A. Determinou-se uma relação entre as concentrações de células da bactéria e da levedura, a qual resulta na condição de máxima floculação, compreendendo, respectivamente, valores de 0,16 g/l e de 3,39 g/l (massa seca). Dentre os íons analisados, verificou-se: que os íons Ba+2, Ca+2, Sr+2, Mg+2, K+, Na+ (8 X 10-4 M) promoveram a floculação, sendo que, os íons divalentes apresentaram efeitos promotores mais intensos que os monovalentes, enquanto que os íons trivalentes (Al+3 e Fe+3) praticamente não apresentaram efeito promotor; a concentração mínima de cálcio requerida para a promoção da floculação compreendeu valores iguais ou maiores a 2 X 10-4 M; os íons sódio em concentração de 4,0 M em presença de cálcio 8 X 10-4 M, apresentaram efeito sinergístico na inibição da floculação, enquanto que, os íons magnésio em concentrações entre 0,8 e 4,0 M causaram progressiva inibição do processo, independentemente da presença de cálcio. Foi verificada a presença de sítios receptores para a lectina concanavalina A nas superfícies celulares de Sacch. cerevisiae e de L. fermentum, sendo que, para a ocorrência da agregação de cada célula de levedura e de bactéria foram necessárias, respectivamente, 4,04 X 106 e 1,46 X 106 moléculas de concanavalina A. Testes com modificadores químicos de proteínas mostraram que os grupos funcionais fenol e indol de aminoácidos, presentes na superfície celular de L. fermentum, devem participar do processo de floculação. Contudo, não foi verificada a participação, neste fenômeno, de grupos funcionais de aminoácidos da parede celular de Sacch. cerevisiae. A presença de uréia 7,5 ou 8,0 M, em reações de modificações químicas de proteínas, não tornou os grupos funcionais de aminoácidos mais acessíveis a ação dos reagentes. Constatou-se que carboidratos da superfície celular de Sacch. cerevisiae devem estar envolvidos nessa interação, uma vez que houve inibição da floculação após o tratamento da levedura com periodato de sódio (0,01 M). Por outro lado, não se verificou a participação de carboidratos no fator floculante de L. fermentum. Abstract: The flocculation of yeast, Saccharomyces cerevisiae, by bacterium, Lactobacillus fermentum, causes serious loss in alcoholic fermentation due to reduction in yeast cell numbers in suspension and increase in growth of contaminants. The mechanism of flocculation was studied with protein and carbohydrate modifying chemicals, action of cations and concanavalin A. The optimum ratio between bacterial and yeast cells for maximum flocculation was 0.16 g/L and 3.39 g/L (d.w.) respectively. Among cations, barium, calcium, strontium, magnesium, potassium and sodium (8 X 10-4 M) estimulated flocculation, but trivalent ions (Al+3 and Fe+3) had no effect. The minimum calcium concentration for flocculation was 2 X 10-4 M. Sodium ion showed sinergistic effect when added at high concentration (4.0 M) in solution with 8 X 10-4 M calcium ions. Magnesi4m ions showed progressive inhibition between 0.8 to 4.0 M when added to cell suspension with or without added calcium ions (8 X 10-4 M). Treatment with concanavalin A showed receptor site of lectins in yeast and bacterial cells. Sacch. cerevisiae required 4.04 X 106 molecules of concanavalin A per cell and L. fermentum 1.46 X 106 molecules. Tests with protein modifying chemicals showed that the functional groups phenol and indol of amino acids on cell surface of L. fermentum were essential for flocculation. Urea (7.5 or 8.0 M ) did not change functional groups of cell surface. Carbohydrate of Sacch. cerevisiae is important for flocculation because treatment of its cells with sodium periodate (0.01 M) inhibited the flocculation. Same treatment on L. fermentum had no effect, which showed that carbohydrate from bacterial cell surface did not participate in flocculation. Mestrado Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador : Fumio Yokoya Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo:Foi acompanhado o comportamento de vinte linhagens de Aspergillus niger na produção de ácido cítrico, quando cultivadas em diferentes formas e meios de fermentação. Observou-se que as exigências nutricionais de Aspergillus niger para a produção de ácido cítrico dependem da linhagem e do processo do cultivo. Dentre as linhagens estudadas e nas condições experimentais - fermentação em superfície e submersa em meio natural, escolheram-se as cepas FTPT 906 para a fermentação em superfície, FTPT 488 para fermentação submersa e FTPT 1762 como cepa aleatória, porque demonstraram maior capacidade de produção de ácido cítrico. Verificou-se a necessidade de tratamento do melaço de cana-de-açúcar com óxido de cálcio (CaO) e ferrocianeto de potássio (FCN), visando a remoção e precipitação de íons que contaminam os substratos evitando, assim, sua ação inibidora na fermentação cítrica. Observou-se que a quantidade de FCN requerida em excesso é determinado principalmente pela linhagem do fungo e qualidade do substrato. Aspergillus niger FTPT 906 demonstrou, nas condições de fermentação em superfície em meio natural, maior capacidade de produção de ácido cítrico. A adição de íons ferro e cobre em conjunto ao meio de cultura não favorece a produção de ácido; o mesmo aconteceu quando adicionou-se íon cobre no processo. 0 crescimento celular não foi influenciado pela adição de íons metálicos no meio de cultura. Abstract: Twenty citric acid producing strains of Aspergillus niger were tested regarding their capacity to produce citric acid in various media composition under surface and submerged growth conditions. Nutritional requeriment for their growth and acid production varied from strain to strain. Strain FTPT 906 was selected for further studies by surface culture method because of its hability to produce highest amount of acid. Strain FTPT 488 produced highest amount of acid in submerged culture and strain FTPT 1762 produced reazonable amounts of acid in both cultivation methods. The treatment with calcium oxide and potassium ferrocianate (FCN) was requered for the precipitation of metallic ions from molasses media to reduce inhibition of citric acid production. The excess of FCN required for highest citric acid production varied according to the fungus strain and qualites of substrate. Addition of iron and copper ions to the media did not enhance acid production. The growth of fungus was not affected by those metallic ions. Mestrado Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador : Fumio Yokoya Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Levando-se em consideração os poucos conhecimentos sobre a incidência de bactériófagos de bactérias láticas mesofíliças, na indústria de leite do Estado de São Paulo, e a sua influência sobre a capacidade acidificante dos fermentos licticos disponíveis em nosso mercado, o presente trabalho foi conduzido com o intuito de esclarecer a real situação dos laticínios no Estado foram coletadas 33 amostras de soro de queijo em 17 laticínios, que foram submetidas ao teste de inibição da producão de ácido lático, como medida prévia para avaliar a presença de bacteriófagos. Os soros resultantes desses experimentos quando submetidos ao teste de placa de lise. indicaram, que uma diminuição de 10% na acidez na presença de amostra suspeita ao contrário do estabelecido na literatura, não reflete a veracidade da presença de bacteriófagos em uma amostra.Nossos resultados mostraram que 74% das amostras foram falso positivas e 1% delas, falso negativa. Dentre os 16 bacteriófagos isolados, 12 foram específicos para L. lactis, 3 para L. diacetylactis e 1 capaz de lisar ambos microrganismos, evidenciando atividade fágica em 65% das indústrias avaliadas.Utilizando uma mistura dos bacteriófagos isolados, procedeu-se aos testes com os fermentos lácticos comerciais (4 do tipo BD, 2 do tipo D, 5 do tipo O e 1 simples - Lactococcus diacetylactis). Em testes de acidificacão dos fermentos. em 8 horas, somente 2 do tipo O mostraram diferença na capacidade de acidificação. Verificou-se que os fermentos submetidos à repicagem diária, mantiveram os bacteriófagos após 2O subcultivos em 2 fermentos ( tipos BD e D), com variação na capacidade acidificante somente para o tipo BD. A partir dos fermentos, foram obtidas bactérias componentes, que foram testadas individualmente quanto à resistência aos bacteriófagos, mostrando que o nível de sensibilidade varia consideravelmente: 23% do fermento BD1 e 40% do fermento D2. O fermento O3 composto de 5 cepas, 1 mostrou sensibilidade e o fermento O4, constituído de 4 cepas, 2 foram sensíveis. 5 bacteriófagos de nossa coleção não se mostraram infectivos a nenhum dos isolados. Um dos bacteriófagos mostrou-se infectivo para a quase totalidade dos isolados Abstract: Since the knowledge of phage on mesophilic acid bacteria in milk processing industry of the State of São Paulo, and its effect on acidification performance of commercially avaliable lactic acid starter, this work was designed to elucidate the real situation of milk industry in this State. A total of 33 samples of whey were collecd in 17 cheese factories and tested on hability to inhibity acid production by selected starter as a mean to detect the presence of bacteriophage. These tests have shown that a decrease of 10% or more in the amount of acid produced in the presence of suspected sample, was not good indicative of presence of phage as it has bean assumed in the literature. Our results showed that 74% of samples were false positive and 1 % were false negative. Amongst 16 phages isolated 12 were specific for L. Lactis, 3 for L. diacetylactis and one was capable to cause lyses of both species, which indicates contamination in 65% of the industries analyzed. Commercially available starters (4 type BD; 2 type D; 5 type O and one simple starter) were tested with mixture of isolated phages. With acidification test for 8 hours, only 2 type O showed positive results. Daily transfer of cultured retained phages even after 20 subcultures in both types (BD and D), with acidification difference only on type BD. Pure cultures isolated from commercial starters were tested for phage resistance. Among isolated from BD1 23% were sensitive; from Dz 40% were sensitive. The starter 03 were composed of 5 strains, and one were sensitive; starter 04 with 4 strains, 2 were sensitive. Five of isolated phages were not infective on any of the isolates but one of them were infective for most of them Mestrado Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Fumio Yokoya Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Foi conduzido um estudo sobre métodos e condições de fermentação de melaço de cana-de-açúcar por Zymomonas mobilis CP4 e seu efeito sobre os parâmetros cinéticos de fermentação. Avaliou-se o efeito da temperatura, controle de pH e efeito de íons Ca++, K+ , Cl- e Mg ++ em meio de fermentação com sacarose. Em melaço de cana-de-açúcar foi estudado o efeito da clarificação e suplementação com nutrientes. Determinaram-se os parâmetros cinéticos de fermentação do melaço em processo descontínuo, descontínuo alimentado e contínuo em escala de laboratório; e descontínuo e descontínuo alimentado em fermentador piloto. Foram também realizados ensaios de fermentação em processo descontínuo, em escala de laboratório, utilizando caldo de cana-de-açúcar e HTM como substratos da fermentação. Determinou-se que a temperatura de 34°C é a mais apropriada para o crescimento e produção de álcool por Zymomonas mobilis CP4 em meio com sacarose e melaço; a produção de levana diminui com o aumento da temperatura e com o controle de pH durante a fermentação. Os tratamentos de clarificação do melaço, removeram Ca++ e K+, mas são aumentaram os rendimentos fermentativos. Ca ++, K+ e Cl- são inibidores do crescimento e fermentação de Zymomonas mobilis CP4, mas o Mg++ são apresentou efeito inibitório em nenhuma das condições. estudadas. A suplementação do melaço é necessária para aumentar os rendimentos fermentativos. Em processo descontínuo os melhores resultados foram em concentração de melaço de 108 g/l. A produtividade em processo contínuo foi superior a dos processos descontínuo e descontínua-alimentado. Em fermentador piloto os rendimentos fermentativos em processo descontínuo foram superiores aos do fermentado de laboratório, mas a produtividade foi menor. Em descontínuo alimentado os rendimentos foram superiores aos do ensaio em fermentador de laboratório. O melaço de cana-de-açúcar e o caldo de cana de açúcar são matérias-primas apropriadas para a fermentação, mas devem ser suplementadas para obter rendimentos fermentativos altos. Abstract: This study was carried out to characterize the methods and parameters affecting the fermentation of Zymomonas mobilis CP4 on sugar cane molasses as sustrate. Temperature, pH, Ca++, K+, Mg++ and Cl- were the experimental variables using on a saccharose culture medium. Besides, the effects of clarification and nutrients suplementation of sugar cane molasses was studied. Kinetics parameters on sugar cane molasses were analyzed under different experimental conditions: a prototype lab fermenter was used in batch, fed-batch and continuous fermentations, and a pilot prototype scale was used for batch and fed-batch fermentations. At the same time, fermentation assays in a discontinuous process under laboratory scale procedures were carried out using sugar cane medium and HTM as the sustrate of the fermentation. Growth rate and ethanol production by Zymomonas mobilis CP4 in saccharose and molasses culture medium were optimum at 34 °C. Levan output decreased with increasing temperature and pH control during the fermentation. Clarification treatments in molasses decreased the amount of Ca++ and K+ but not better results in fermentation rate were observed, despite the fact that both ions and chlorides ions exert and inhibitory effect in growing and fermentation activities of Zymomonas mobilis CP4. No negative effect was observed concerning Mg ++. Besides, molasses suplementation with nutrients was necessary to increase yields. In' batch process better -kinetics results were obtained with molasses concentrations of 108 g/l. The productivity was higher in continuous process compared with batch and fed-batch processes. The fermentation output obtained with batch process were higher under pilot plant operation in contrait with laboratory scale models. Sugar cane molasses and. sugar cane culture medium were better nutritional products for fermentation purposes but most be supplemented to get better results. Doutorado Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador : Fumio Yokoya Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Foi conduzido um estudo sobre o efeito do brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) em células de Acetobacter acetit A. pasistirianiis, Escheri chia colí, Klebsiella terrigena, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus fermentuitij Alcaligenes faecalis, Pseudomonas aeruçinosa. Ps. cepacia, Ps. mendocina, Ps. acidovoravs e Saccharomyces cersvisiae, com o intuito de esclarecer os mecanismos através cos quais este agente atua como substância antimicrobiana. Avaliou-se seu efeito no crescimento e metabolismo celular, bem como a influência da forma química do composto no seu modo de ação. A concentração micelar critica (c.m.c.) do CTAB em meio de cultura é menor do que em água, e em concentrações abaixo da c.m.c. o CTAB interage coro as proteínas do meio de cultura. Verificou-se que tanto a forma micelar como a monomérica apresentam ação antibacteriana. A formulação de meio de cultura mostrou que altas concentrações de magnésio são responsáveis pela longa duração da fase de latência e que Klebsiella terrigena, representante da família Enterobacteriacea mostrou-se pouco exigente quanto aos requerimentos nutricionais, porém, as espécies de Acetobacter não apresentaram comportamento semelhante. A concentração de CTAB necessária para causar inibição do crescimento varia de microrganismo para microrganismo, bem como com o meio de cultura empregado. No caso dos membros do gênero Acetobacter f independente do meio de cultura, a inibição do crescimento ocorreu em concentrações abaixo da c.m.c.. Para os membros da família Enterobacteriaceae a inibição do crescimento em meio CANA 11 ocorreu acima da c.m.c., enquanto que em Caldo Nutriente ocorreu abaixo desta. Pseudomonas aeruginosa, Ps. cepacia e Ps, mendocina apresentaram-se muito resistentes ao CTAB, o que não ocorreu com Ps, acidovorans. O CTAB inibiu o metabolismo: glícólise, respiração e fermentação esr. concentrações menores do que as necessárias para a inibição do crescimento. Inibiu também a atividade da. lactato desidrogenase e da álcool desidrogenase intracelular de todos os microrganismos testados, embora nas células resistentes, as enzimas tenham sido inibidas somente após lise celular. A lise de protop 1 astos induzida por CT AB é a fase terminal da uma série de eventos que se inicia pela desorganização da membrana, porém não foi verificada solubilizaçâo da membrana. A parede celular protege a. célula de lise, uma vez que células intactas não sofreram lise com as concentrações que causaram lise de protoplastos. As células resistentes ao CTAB, Pseudomonas aeruginosa, Ps. cepacia e Ps, mendocina apresentaram perfil de proteínas de membrana e de proteínas do citosol idêntico, quando cultivadas na presença e na ausência de CTAB. Por outro lado, as células de Escherichia coli, Klebsiella terrígena e Pseudomonas acidovorans apresentaram diferenças tanto no perfil de proteínas de membrana, como no perfil de proteínas do citosol. Observações microscópicas revelaram cue as células de Escherichia coli cultivadas na presença de CTAB, apresentam diferenças morfológicas marcantes: as células são menores, apresentam superfície rugosa e formam aglomerados de células Abstract: The effect of cetyltrimethyiammonium bromide (CTAB) on ceils of Acetobacter aceti, A. pasteurianus, Escherichia co 11, Klebsiella terrigena, Leuconostoc mesenteraides, Lactobacillus fermentum, Alcaligenes f aecalisJ Pseudomonas aeruginosa, Ps. cepacia, Ps. mendocina, Ps acidovorans and Saccharomyces cerevisiae was investigated, in order to elucidate the mechanism of CTAB action. Its effect on cell growth and metabolism, and action of chemical forms of agent were studied. The critical micelar concentration (c.m.c.) of CTAB in medium was lower than in water and its concentration lower than c.m.c. interact with medium protein. Both free and micelar form of agent were active against microbes. The formulations of medium has shown that magnesium concentration is responsible for delayed growth. Klebsiella terrigena did not have many nutricional requirements but Jcetobacter spp. were quite fastidious. The CTAB concentration required for growth inhibition was dependent on microbes as well as on medium composition. Acetobacter was inhibited at concentrations below c.m.c. in all tested media. With Enterobacteriaceae the inhibition occurred above c.m.c. in CANA 11 media and below c.m.c. in nutrient broth. Pseudomonas aeruginosa, Ps. cepacia and Ps. mendocina were very resistant to CTAB but Ps. acidovorans was not. Glicolysis, respiration and fermentation were inhibited by CTAB at concentration lower than growth inhibition. Lactate dehydrogenase and alcohol dehydrogenase were also inhibited at low concentration of CTAB. Enzymes from cells resistant to CTAB were sensitive to the agent only after cell disruption. CTAB caused lysis of protoplast which was a terminal phases of a series of events starting with membrane desorder. No solubilization of membrane was detected. Intact cells were not lysed with CTAB indicating that cell wall protected from lysis. Bacteria resistant to CTAB, Pseudomanas aeruginosa, Ps. cepacia and Ps, mendocina, showed identical protein pattern in membrane and citosol when cultivated with agents as compared to control media. Escherichia coli, Klebsiella terrigena and Ps. acidovorans showed different protein pattern in similar circunstances. Microscopic observation of E. coli cells cultivated in medium with CTAB showed different morphology. They were smaller with rough surface and they had tendency to aggregate Doutorado Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Fumio Yokoya Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Este trabalho foi realizado em duas etapas: uma envolvendo isolamento, taxonomia e testes de resistência ao etanol e floculação do fermento comercial, no intuito de selecionar bactérias táticas, natura!mente contaminantes de dornas de fermentação. Na segunda etapa, foi montado um sistema piloto de Saneada para realização dos ensaios de fermentação. Inoculando com uma bactéria selecionada na primeira etapa - o LactobaclIIus fermentum nº 28 , simulando-se a infecção bacteriana das dornas de fermentação nas usinas, através do processo cíclico de batelada alimentada. Para a primeira etapa, a amostragem foi feita tícleite de leyeduras", sem tratamento ácido, obtido de duas destilarias anexas no mes de agosto de 1988. A primeira - Usina Santa Adélia (Jabotícabal-SP) - apresentava problemas microbiológicos e a segunda Usina Modelo - operava normalmente. Os resultados da taxonomia demonstraram que e bactéria predominantemente encontrada foi Lactobaci!Ius fermentum (62%), seguida de LactobaciIIua murinus (9%), Lactobacillus vaccInostercus (9%), LactobaciIlus piantarum (2%) e Leuconostoc (2%). Dentre os lactobacilos houve um predomínio do tipo heterofermentativo obrigatório (85%). As cepas testadas apresentaram-se resistentes a 7% (v/v) de etanol e 63% resistiram a 10%, demonstrando adaptação ao ambiente alcoólico. A característica de floculação do fermento foi manifestada em 67% das cepas testadas. Quanto às usinas, confirmou-se que a Usina Santa Adélia apresentava maior índice de contam inação, de cepas resistentes ao etanol e de floculação do fermento comercial. Os resultados dos ensaios de fermentação demonstraram que acima Ce 4,8 g/l de acidez, expressa em ácido látlco, e a relação levedura/bactéria inferior a 0,9, as características vitais e o crescimento da levedura foram seriamente comprometidos. A produtividade de etanol (Pe) e a taxa de consumo de açúcar (Ps) sofreram queda semelhante (em torno de 54%), entre a média dos primeiros 9 cicios e o 16° cicio, onde a acidez e a contaminação foram máximas. Isso causou a diminuição na velocidade de consumo de açúcar pela levedura, e a consequente queda na produção de etanol, devido ao excesso de acidez proveniente da contaminação bacteriana. Os parâmetros de rendimento de álcool , Yp/so e porcentagem de ART consumido, também apresentaram uma queda acentuada nos ciclos finais, servindo também como índices para avaliação da infecção na produção de etanol. O fator de conversão de açúcar consumido em etanol produzido - Yp/s não demonstrou o efeito da acidez sobre a produção de etanol, isso, foi distribuição o cálculo baseando-se no açúcar consumido pela levedura e não no disponível no sistema Abstract: This research was carried out in 2 stages. The first stage involved isolation, taxonomy, tests of resistance to ethanol and commercial yeast flocculation tests, all aimed at selecting lactic bacteria which were natural contaminants of fermentation vats. In the second stage, a pilot system was set up to carry out fermentation assays simulating distillery conditions and using one of the bacteria's selected in the first stage. Under these conditions Lactobacillus fermentum isolated n 28 was tested, reproducing the bacterial infection of the distillery fermentation vats by way of a fed-batch process. For the first stage of experiment, concentrated yeast samples from two distilleries were obtained, without cid treatment, during August , 1388. The first distillery (Santa AdeIla - Jaboticabal, S.P.) was presenting microbiological problems, while the second (Modelo - Piracicaba, SP) was operating formally. The results of the taxonomic study showed that the predominant bacterium present woo Lactobacillus fermentum (Bet), followed by Lactobacilus murinus (9%), Lactobacillus vacclnostercus (9%), Lactobacillus plantarun (2%) and Leuconostoc (2%). Among the lactobaciIIus, the obligate he terofermentatiue types were predominant Í8BX). The strains tested were all resistant to 7% (v/u) ethanol, and 64% were resistant to 10%, demonstrating adaptation to the alcoholic environment. Flocculation of the yeast was a characteristic of 67% of the strains tested. Regarding the distilleries, the expected results were confirmed. The Santa fidélla showed a higher level of contamination, with strains more resistant to alcohol and floculation of the commercial yeast. The results of the fermentation assays, showed that both the vital characteristics and growth of the yeast were seriously undermined when the acid concentration exceeded 4,8 g/f (expressed as lactic acid) and yeast/bacteria ratio of about 0,9. The alcohol productivity (Pern) and sugar consumption ratios (Ps> suffered similar decrease (about 54%) between the average of the first 9 cycles and that of the sixteenth cycle, when the acidity and contamination were maximum. This indicated a loss in the velocity of sugar consumption by yeast, and a consequent fail in the production of ethanol, due to the excess of acidity caused by the bacteria! contamination. The parameters alcohol yield, Yp/so and the percentage of total sugars consumed also showed accentuated fails during the final cycles, and therefore could also serve as index for the evaluate some of infection in the ethanol production. The conversion factor Yp/s was not affected by the acidity. This was related to the fact that the calculations were based on the sugar consumed by the yeast, and not that available within the system Mestrado Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Fumio Yokoya Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Tecnologia de Alimentos Resumo: Este estudo foi conduzido em seis lotes de pescada foguete, conservadas em gelo e coletados na secção de comercialização do Entreposto de Pesca de Santos, SP, durante o período de março a junho de 1975. Foram estudados os aspectos bacteriológicos, químicos e organolépticos das amostras constituídas por 5 a 6 peixes, durante 12 dias. Para o aspecto organoléptico, foram considerados os dados subjetivos das tabelas recomendadas pela Torry Research Station, referentes ao pescado cru obtidos. Para efeito de comparação entre os demais dados foi considerada a soma total das características organolépticas que variaram entre 24,7 ao valor mínimo correspondente a 1.Com relação aos dados químicos, foram determinados no músculo da espécie em estudo; a tirosina, que variou de 4,8 a12,8mg por 100g de músculo, a trimetilamina, cuja variação foi de 1,92 a 6,12mg de nitrogênio de trimetilamina por 100g de músculo, o nitrogênio da base volátil total com uma variação de 11,90 a 32,30mg por 100g de músculo e a hipoxantina com dados que"variaram de 0,11 a O,33mg por 100g de músculo. As contagens bacterianas para guelras e músculo, foram efetuadas em diferentes meios e incubados às de 20 °C e 30 °C temperaturas Para as guelras, a contagem bacteriana, expressa em logaritmo, variou de 5,43 a 9,61 por grama de guelras e 5,51 a 9,30 por grama de guelras as temperaturas de incubação de 20 °C e 30°C, respectivamente. Com relação ao músculo, a contagem bacteriana expressa em logaritmo, variou de 2,93 a 6,74 por grama de músculo e 2,85 a 6,85 por grama de músculo às temperaturas de incubação de 20°C e 30°C, respectivamente. A soma total das características organolépticas incubação deu resultados coerentes, quando relacionados com os dados da tirosina, hipoxantina e contagem bacteriana no músculo, nos diferentes graus de deterioração da pescada foguete. Nas relações acima, foram obtidos resultados que delimitam as faixas de aceitabilidade e inaceitabilidade. Não foram obtidas relações coerentes para os dados de nitrogênio de bases voláteis totais e nitrogênio de trimetilamina e contagem bacteriana nas guelras, quando relacionadas com a soma total das características organolépticas Abstract: Studies were carried out on six samples Df "pescada foguete", Macrodon ancylodon, taken from a "Entreposto de Pesca" of Santos, SP, during the period of March through June, 1975. The fish were stored in ice immediately prepared for market, they were than transported to the laboratory for analyses. Bacteriological, chemical and organoleptic changes were determined daily on each sample during storage in ice for 12 days. The organoleptic changes were measured according to the method of The Torry Research Station and sum of points rangede between 24,7 to 1. The following chemical analysis were carried out: tyrosine, trimethylamine, volatile bases and hypoxanthine. The tyrosine content ranged from 4,8 to 12,8mg per 100g of muscle, trimethylamine (N-TMA) ranged from1,92 to 6,12mg of TMA-nitrogen per 100g of muscle, volatile nitrogen ranged from 11,90 to 32,30 per 10Dg of muscle and hypoxanthine content ranged between 0,11 and 0,33mg per 100g of muscle. The bacterial counts on muscle and gills were determined on three diferent solid media (Nutrient Agar, Nutrient Agar + 1,5% and Marine Agar). The plates were incubated at 20°C and 30°C. For the muscle, the log of counts per gram ranged between 2,93 and 6,74 if plates were incubated at 200C and 2,85 and 6,85 if incubate at 300C. On gills, the log of counts per gram were 5,43 to 9,61 and 5,51 to 9,30 respectively at 20 °C and 30 °C. The organoleptic characteristic were correlated with the content of tyrosine, hypoxanthine and microbioal counts in muscle as deterioration of the product progressed during storage with the above proprieties, it was possible to establish a line of acceptability. The was no stable correlation between organoleptic proprieties and the contents of volatile bases, trimethylamine or microbial counts of gills Mestrado Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Fumio Yokoya Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agricola Resumo: Foi efetuado um estudo microbiológico das condições de processamento industrial de files de Castanha (Umbrina canosai) e Corvina (Micropogon furnieri) eviscerada congelados. As amostras foram coletadas numa das indústrias de Rio Grande (RS), seguindo-se o fluxograma, desde o pescado o produto congelado. A indústria, como as demais opera com mesas metálicas com tampos de madeira, no barco ate deste ramo, cuja higienização é feita por imersão em água contendo 50 ppm de cloro livre. Foram verificadas as variaçoes de carga bacteriana do processo, mediante contagem total de bacterias,nu provável (NMP) de coliformes totais, coliformes fecais e de enterococos nos pescados. Visando reduzir a contaminação do produto final efetuamos a higienização dos tampos das mesas com solução de iodofor a 46 e 160 ppm de iodo livre, bem como substituimos as superficies de madeira por chapas de aço inoxidável. Apos inrtroduzidas as alterações citadas, realizamos análises microbiologicas de controle. O tratamento com iodofor a 46 ppm de iodo livre apresentou maior eficiência do que o realizado com hipoclorito a 50 ppm de cloro livre, mas no que se refere a espécies bacterianas de interesse a saúde pública não houve variações sensíveis entre as duas soluções saneantes. O sistema tradicional, mesas de madeira e higienização com água a 50 ppm de cloro livre, pode ser substituido vantajosamente, sob o ponto de vista bacteriológico, pelo uso de mesas revestidas com chapa de aço inoxidável, porem resta superar os problemas técnicos advindos desta substituição Abstract: Microbiological studies were carried out on the industrial processing conditions of Castanha (Umbrina canosai) fillets and eviscerated Corvina (Micropogon furnieri), both frozen. Samples were collected in an industry of Rio Grande (RS), following the flow diagram from the raw fish onboard the vessel to the final frozen product. The indusny, like others of same kind, operates with cutting tables ,of hard wood surface sanitized with immersion in water contain 50 ppm of availabe chlorine. Variations in the bacterial load were measured along the processing through the total bacterial count coliforms count, fecal coliforms and enterococci in products. The reduction in microbial load of the final product was attempted by sanitizing table's surface with iodophor solution of 46 and 160 ppm of residual iodine, as well as by replacing wood cover by stainless steel plate. The treatment with iodophor solution of 46 ppm of residual iodine was more effective on total microbial counts than 50 ppm of available chlorine of hypochlorite, but no sensible difference was shown on species of public health interest. The replacement of the traditional system, v.g., wooden table and sanitation with 50 ppm of residual chlorine, with stainless steel table can be advantageous on bacteriological point of view, but the technical problems involved in stainless steel table are extremely hard to overcome Mestrado Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Fumio Yokoya Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Bacilus cereus foram isolados em MYP-ágar, a partir de alimentos envolvidos ou não em casos de intoxicação alimentar, sendo as colônias presuntivas identificadas pela determinação das seguintes propriedades; características morfológicas da célula vegetativa e esporângio; não formação de cristal de toxina para-esporal; motilidade; crescimento não-risóide, e atividade hemolítica, importantes na diferenciação entre os membros do grupo I dos Bacillus. Os testes bioquímicos, que apresentaram maior porcentagem de variação: fermentação de salicina (70,6%), hidrolise de ami do (76,5%), e outras propriedades (como produção de amilases e proteases), não mostraram correlação direta com os resultados dos ensaios de toxicidade, como inoculação intraperitoníal em camundongos e inoculação intradérmica em coelhos e camundongos. Na superfície das células da cepa 4/1 foram encontradas estruturas finas filamentosas, presentes em grande quantidade, como urna rede, que pareceram desempenhar algum papel na ativi dade biológica dessa cepa Abstract: Bacillus cereus were isolated in MYP-agar medium, from food products, some of them suspected to be implicated in food borne intoxication cases, and the presumptive colonies identified by the following properties: morphological characteristics of vegetative and sporulating cells; absence of intracellular protein crystal; motility; absence of rhizoid growth, and ' hemolitic activity, important in the differentiation between members of Group I Bacillus. Biochemical tests such as-salicin fermentation and starch hidrolysis, with percentagem variation of 70,6% and 76.5% respective, as well as another properties like amilase and protease activities, did not show a direct correlation with the results of the toxicity tests: intraperitonial injection of mice and intradermic injection in rabbits and mices. Filamentous structures were found on the cell surface of strain 4/1, that may contribute to the biological activity of this strain Mestrado Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Fumio Yokoya Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Tecnologia de Alimentos Resumo: O método de temperatura programada para avaliar a resistência de fatores termicamente vulneráveis, desenvolvido por Hayakawa et al. (1969), foi testado para verificar a possibilidade do seu uso na medição da resistência ao calor das células de Staphylococcus aureus. Os resultados indicam que o método é aplicável para a determinação da resistência de células microbianas ao calor, com a vantagem de se necessitar menos equipamento e ser mais rápido que qualquer dos métodos descritos anteriormente Abstract: The method of programmed heating to evaluate the resistance of thermally vulnerable factors, developed by Hayakawa et al. (1969), was tested to verify the possibility of its use in the measurement of the resistance to heat of cells of Staphylococcus aureus. The results indicate that the method is applicable to the determination of the resistance of microbial cells to heat, with the advantage that it requires less equipment and is quicker than any of the methods described previously Mestrado Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Fumio Yokoya Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agricola Resumo: Foi estudada a produção de penicílinainidahidrolase (PAH) por fermentação com Escherichia coli ATCC 3637, em fermentadores de laboratório, banco e piloto. No meio de fermentação empregado, baseado em água de maceração de milho, a cinética de crescimento apresenta duas fases exponenciais sucessivas. A mudança de uma a outra é provocada pela limitação de oxigênio dissolvido, A programação do incremento da taxa de transferência de oxigênio em função do tempo controla a duração relativa de ambas as fases. A velocidade específica de crescimento no primeiro período (µI) foi bem maior que no segundo (µII) - A produção de PAH segue uma cinética exponencial, ficando associada ao crescimento celular e sendo maior quanto menor o valor de µII. Quando µ tende a ymax. não se tem o acumulo de enzima. São condições necessárias para a produção de PAH a adição de ácido fenilacético como indutor e a manutenção da concentração de oxigênio dissolvida a valores muito baixos. Foi desenvolvido ura modelo cinético para a produção de PAH, baseado nas variáveis mencionadas. A fermentação foi ampliada de escala de um fermentador banco com 10 litros de meio até um fermentador piloto com 15 a 20 vezes este volume de meio de fermentação. Entre ambas unidades não se manteve similaridade geométrica. O critério seguido na ampliação da escala foi a de manter as velocidades tangenciais no agitador na mesma ordem para o modelo e o protótipo, a porcentagem da tensão de oxigênio dissolvido próxima de zero, ajustando a taxa de transferência de oxigênio máxima e o coeficiente volumétrico de transferência de massa (k1a) mediante a taxa de aeração. De uma análise dos resultados obtidos experimentalmente concluiu-se que (k1a) ou a área interfacial (a) podem ser descritos mediante as correlações de Yoshida para k1a ou de Calderbank para a, desde que seja substituído nas mesmas a velocidade de aeração associada com a secção transversal do fermentador (Vs) pela velocidade de aeração associada com a secção total dos orifícios do distribuidor. Os rendimentos de PAH foram da mesma ordem em escala banco e piloto Abstract: Penicillinamidohiydrolase (PAH) production by Escherichia coli ATCC 9637 was studied in laboratory, bench and pilot scale fermentors. Using a culture medium based on corn steep liquor, it was shown that kinetics of growth has two succesive exponential phases. The shift from one to the other is caused by limitation of dissolved oxygen. The relative length of those phases can be controlled by programming the increment of oxygen transfer rate with time. The specific growth rate during the first period is larger than the second period. PAH production follows .exponential kinetics and it is associated with cell growth being larger if the second growth phase shows the slower rate (µII). When the value approaches the µmax no enzyme accumulation was observed. The conditions required for PAH production were the addition of phenylacetic acid as inducer and the maintenance of dissolved oxygen concentration at very low level. A kinetic model for the production of PAH was developed based on the variables above mentioned. Fermentation was scaled-up from a bench fermentor with ten liters of medium to a fermentor with 15-20 times larger volume. Geometric similarity was not maintained between those units. The criteria followed for scaling-up were to maintain a similar peripheral velocity at the tip of the impeller between model and prototype, and the percent of dissolved oxygen tension near zero. Adjustment of the maximum oxygen transfer rate and volumetric mass transfer coefficient (k1a) was acomplished by changing air rate. It was concluded, from experimental data, that (k1a)or the interfacial area (a) can be described by the correlation of Yoshida for k1a or Calderbank for a, if the surface air velocity at the cross section of the fermentor (Vs) is replaced by air velocity at the total area of holes in the sparger. Yield of PAH obtained in bench and pilot scale fermentor was the same Doutorado Doutor em Ciências e Tecnologia de Alimentos

Orientador : Fumio Yokoya Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Tecnologia de Alimentos Resumo: Foram comparadas as técnicas de contagem da microflora total de mesófilas (30ºC por 48 horas), psicrófilas (20ºC por 48 horas) e psicrotraficas (7ºC por 10 dias) da superfície e no total de sardinha (Sardinella aurita) e de camarão sete barbas (Xiphopenaeus kroyeri). As avaliações do grau de contaminação bacteriana das amostras conduzidas às três temperaturas de incubação mostraram contagens próximas, variando ligeiramente com a amostra de pescado e a temperatura de incubação das placas semeadas. Pela análise das 607 culturas isoladas, constatou-se a predominância de bactérias em bastonetes Gram negativos, possivelmente Pseudomonas, Achromobacter e Flavobacterium, nas amostras de sardinha nas três temperaturas de incubação, e nas amostras de camarão houve predominância de bactérias em cocos Gram negativos nas temperaturas de incubação de 30ºC e 20ºC e de bastonetes Gram negativos a 7ºC, Constatou-se, também, que 55,8% das cepas isoladas apresentavam propriedades lipolítica e/ou proteolítica, Observou-se que somente 29,3% de microrganismos isolados a 30ºC (contagem de mesófilos) possuíam atividades proteolítica e/ou lipolítíca a 7ºC. Dentre os microrganismos isolados a 20ºC (contagem de psicrófilos), 39,4% apresentaram essas propriedades a 7ºC e daqueles isolados a 7ºC (contagem de psicrotróficos), 49%. Isso vem mostrar que o método para a contagem de psicrotróficos é cerca de duas vezes mais preciso para enumeração das bactérias de importância à deterioração de pescados refrigerados, do que o método de contagem de mesofilos. A diferença de precisão entre os métodos para contagens de psicrófilos e de psicrotróficos é de cerca de 20% em favor do último Abstract: The techniques for the determination of mesophilic (48 hours at 30ºC) psychrophilic (48 hours at 20ºC) and psychrotrophic (10 days at 7ºC) counts on the surface and in the total were compared with the samples of sardine (Sardinella aurita) and shrimp (Xiphopenaeus kroyeri). The results obtained with those three different incubation temperatures showed equivalent counts varying slightly among the samples and with the incubation temperatures of plates.The morphological and physiological characteristics were studied on 607 strains isolated from these samples. The predominance of Gram negative bacilli, possibly Pseudomonas, Achromobacter and Flavobacterium, occurred in the sardine samples at all three temperatures of incubation. In the shrimp samples there was a predominance of Gram negative cocci among the colony formed at the incubation temperatures of 30ºC and 20ºC, and of Gram negative bacilli among those formed at 7ºC. Also, 55.8% of the strains were proteolytic and/or lipolytic types. It was found that only'29.3% of the microbes isolated at 30ºC (mesophilic count) showed proteolytic and/or lipolytic properties at 7ºC. Amongst those isolated at 20ºC (psychrophilic count), 39.4% showed these properties at 7ºC and those isolated at 7ºC (psychrotrophic count) 49% of positive strains. These results show hat the method for psychrotrophic count is nearly twice as accurate as the method for mesophilic count for the detection and enumeration of the bacteria implicated in spoilage of fish and marine products stored under refrigeration. The difference in accuracy between the method of psychrophilic count and psychrotrophic count was about 20% in favor of the last technique Mestrado Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Fumio Yokoya Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agrícola Resumo: Estudou-se a influência do tempo de conservação em gelo, congelação e posterior armazenagem em alguns parâmetro de quali¬dade da pescada foguete (Macrodon ancylodon). Após a avaliação sensorial do grau de deterioração da matéria prima através do siste¬ma recomendado pela Torry Research Station, procedeu-se o fileteamento e embalagem dos filés em folhas de papel alumínio e fez-se o controle da concentração de hipoxantina e do número total de bactérias por grama de músculo. A congelação dos filés foi feita através de dois métodos: em placas a -40ºC e em ambiente com ar em repouso a -22ºC. Em seguida à congelação e depois de uma, quatro e oito semanas de armazenamento a -22ºC, foram repetidas as determinações. Os resultados obtidos na avaliação sensorial permitiram verificar que o peixe ao ser desembarcado já sofreu considerável per da em sua qualidade, mantendo-se aceitável para consumo in natura até o quinto dia de conservação em gelo quando a soma de seus atributos sensoriais atingia cerca de 15 pontos. Em se tratando de peixes para obtenção de filés para congelação, achou-se recomendável utilizar apenas os que conseguiam obter 20 ou mais pontos na avaliação sensorial. Os resultados da determinação da hipoxantina no peixe man¬tido em gelo por sete dias mostraram um aumento gradativo na sua concentração com valores entre 0,09 e 0,27 mg/g de músculo, o. que indica a possibilidade de uso do teste como uma medida do tempo de armazenagem em gelo para esta espécie. Quando se comparou es¬tas concentrações com a soma dos pontos.obtidos na avaliação sen¬sorial, encontrou-se uma relação coerente, ou seja, na faixa de aceitabilidade (25 a 15 pontos) tivemos valores entre 0,09 e 0,18 mg/g e na faixa onde começa a haver rejeição (menos de 15 pontos) estes valores situaram-se de 0,19. mg/g para cima. A mesma determinação realizada nos filés após os dois méto¬dos de congelação e durante o armazenamento a -22ºC, mostrou que não houve variações significativas na concentração de hipoxantina. Estes resultados indicam que é possível aplicar o teste, nesta es¬pécie, como um índice de sua qualidade antes da congelação nas condições já descritas. As contagens totais, realizadas nos filés obtidos sob boas praticas de elaboração, mostraram um aumento a medida que a matéria prima diminuua de qualidade; quando o peixe utilizado para a filetagem obtinha entre 20 e 21 pontos na avaliaaço sensorial o nnmero de bacttrias no produto final situava-se em torno de 106/g. As porcentagens de bacttrias sobreviventes aos dois mmtodos de congelaaço foram similares, 42% no mmtodo de placas e 38% no que utiliza ar em repouso. Durante a armazenagem dos fills con gelados em placas esta porcentagem decresceu a 19,7% na primeira semana, 11,5% na quarta e 9% na oitava; nos congelados em ar em repouso ficou em 23% na primeira semana, 15% na quarta e 11% na oitava. Estes resultados permitiram tecer consideraaçes relatiivas ao emprego das contagens totais para avaliar a qualidade dos fills congelados. Abstract: The effect of storage in ice, freezing and further storage on quality caracteristics of freshness of pescada foguete (Macrodon ancylodon) was carried out. The quality of raw fish was established basing upon sensory evaluation index proposed by Torry Reserch Station. For freezing experiment, the fish was previously filleted and wrapped in an aluminium foil and frozen by two methods: quick freezing with direct surface contact at -40º C, and slow freezing with still air at -22ºC. The quality of product was controled by two methods: total plate count and content of hypoxanthine. The results of sensory evaluation indicated that the fish was acceptable until the fifth day of storage in ice when the sum of points became about 15 points. For processing purposes it was recommended that they should not be used if the sum of points was below 20. The content of hypoxanthine in muscle increased gradually from 0,09 to 0,27 mg/g during the storage in ice, indicating that it can be used for evaluation of its freshness. Product with 25 to 15 points in sensory evaluation gave 0,09 to 0,18 mg/g of hypoxanthine content. After freezing, there was no detectable change in hypoxanthine content, whithever method was used. Also there was no chan¬ge in its content during the storage at ¿ 22ºC. These results indicated that the method is quite adequate for evaluating freshness of fish used for preparation of frozen filets. The microbial counts of raw fish increased as freshness quality of fish reduced. Usually, in sample which received 20 to 21 points on sensorial evaluation, the microbial counts of final product was about 106/g. The survival of microbes during freezing operation was 42% and 38% respectively for quick and slow freezing. Gradual decrease in microbial load was observed during storage at -22ºC reaching 9 to 11% of inicial count after eight weeks of storage. These results indicated that the microbial count could also be used for evaluating quality of fileted fish. Mestrado Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Fumio Yokoya Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Tecnologia de Alimentos Resumo: Este estudo efetuou-se com esporos de bactérias anaeróbias putrefativas isoladas de fontes naturais (carne, sardinha, camarão, solo e almôndega) do Estado de São Paulo e Clostridium botulinum tipos A, B, E e P.A. 3679. Estes esporos isolados de fontes naturais apresentavam muito em comum com Clostridium botulinum conhecidos. O trabalho analisou 113 caracteres no total, morfológicos, fisiológicos e bioquímicos com o fim da obter uma ampla informação. Os dados obtidos foram posteriormente comparados entre si e com os Clostridium conhecidos em um computador digital utilizando o método de Lockhart e Liston para determinar o seu grau de similaridade. Os resultados demonstraram que das bactérias isoladas, 86% tinham uma similaridade de 95% com as Clostridium botulinum tipo A, linhagem 69A e 109 A, e 57% das bactérias tinham 97% de similaridade com o Clostridium botulinum tipo A, linhagens 240A e 68A. Só duas bactérias, as de número 30 e 32 juntamente com a P.A. 3679, apresentavam uma similaridade de 93% com o Clostridium botulinum tipo B. A cultura número 15 com o Clostridium botulinum tipo E apresentaram somente 91% de similaridade com o rasto dos Clostridium. A classificação baseada em um número pequeno de caracteres não fornece uma boa base a respeito da similaridade de uma bactéria com outras Abstract: This study was performed with spores of putrefactive anaerobic bacteria isolated from natural sources (neat, pilchards, shrimp, earth and moat balls) from the stats of Sao Paulo and Clostridium botulinum types A, B, E and P.A. 3679. The spores isolated from natural sources exhibited great similarity to those of Clostridium botulinum already known. This work involved 113 morphological, physiological and biochemical characteristics in order to obtain complete information. Finally, the results on the spores were compared with each other and with those from the Clostridium types on a digital computer using Lockhart and Liston's tecniques to determine the degree or similarity. The results showed that, or the bacteria isolated, 86% had 95% similarity with the Clostridium botulinum type A lineage 69A and 109A and 57% had 97% of similarity with Clostridium botulinum type A lineage 240A and 68A. Only two bacteria, numbers 37 and 32 together with P.A. 3679, showed a similarity of 93% to the Clostridium botulinum type B. One culture, number 15, and the Clostridium botulinum type E presented only 91% of similarity with the rest of Clostridium. The classification based on a small number of characterisitics does not give a good basis for relatin the similarity of one bacterium to another Mestrado Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador : Fumio Yokoya Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agricola Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: The abstract is available with the full electronic document Mestrado Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador : Fumio Yokoya Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agricola Resumo: Foram realizados ensaios para a determinação do numero mais provável de 43 linhagens de Staphylococcus aureus. Após uma série de ensaios preliminares, usando diferentes meios de cultura e modificando-lhes em alguns componentes ou mesmo acrescentando outros, foi finalmente escolhido o meio BHI como meio basal para os estudos. As alterações efetivadas nesse meio proporcionaram u ma recuperação altamente satisfatória para os estafilococos ensaiados. Basicamente essas alterações constaram do acréscimo de NaCl a 10% e vermelho neutro a 0,01 e 0,001 % . Além das linhagens caracterizadas como coagulase e DNA'se positivas, foram também utilizadas, nos ensaios com o meio proposto para a determinação do NMP, linhagens negativas para esses testes, bem como linhagens reconhecidamente entero-toxigênicas. Foi testado também com esse meio, uma linhagem de Micrococcus (Micrococcus glutamicus) para ser determinado o pó der inibidor do corante em relação ao crescimento desse microorganismo. Esse procedimento foi adotado tendo em vista que o Micrococcus sp. apresenta condições de desenvolvimento nos substratos contendo alta percentagem de NaCl. Pelo menos para a linhagem testada, não houve crescimento algum; nem após 72 horas de incubação. Uma das principais vantagens desse meio é que poderão ser feitos, após a leitura dos tubos para o número mais provável, os testes respectivos de coagulase e DNA'se. Esses testes mostraram ser bastante efetivos, tendo em vista que logo nas primeiras horas de incubação já foram evidenciados os resultados positivos. Para a verificação de falsos resultados positivos, foram usadas duas linhagens coagulase e DNA'se negativa se os resultados não foram diferentes Abstract: The most probable number (MPN) technique is frequently used in food microbiology. However, many individuals are not able to understand the real meant of the method, because the statistics involved on it. To overcome these difficulties, a review about it was introduced in this work. Certain theoretical and mathematical considerations in regard to the dilution method for estimating bacterial densities were presented. About 43 Staphylococcus aureus strains were used , some of them are enterotoxins producer (food-poisoning staphy-lococci); the last were obtained from the "Food Research Institute", University of Wisconsin, Madison. The basal BHI broth was used as proposed medium, added of 10% NaCl and neutral red at 0,01 and/or 0,001% final concentration. This modified medium has presented a good per- formance to Staphylococcus aureus recovering. About 70% of strains presented more then 100% of recovering, compared to control medium (BHI agar). Furthermore, it was possbile to perform the DNA'se and coagulase tests using the MPN proposed medium. Thus, becoming easier and more practical the enumeration and characterization of Staphylococcus aureus Mestrado Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador : Fumio Yokoya Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agrícola Resumo: Os parâmetros da resistência térmica, D e z, de 21 linhagens de Salmonella foram determinados em gema de ovo, clara com pH ajustado a 7,0 e na clara natural com 0,05% de agua oxigenada. Tais de terminações foram feitas pelo método do tubo TDT nao selado e pelo método do frasco, usando temperaturas de 57, 53 e 50°C. Células de Salmonella, semeadas em TSB+2% YE e incubadas a 37°C durante 48 horas, foram inoculadas artificialmente nos produtos de ovo para dar uma contagem inicial de aproximadamente 10 células por grama de produto. Foi estudado, também, o efeito da concentração de água oxigenada, adicionada na clara de ovo, sobre a resistência térmica de Salmonella. Este experimento foi conduzido com 4 espécies de Salmonella (S. Anatum, S. Derby, S. Enteriditis e S. Typhirium Tm-1) e a concentrações de agua oxigenada de 0,01, 0,03, 0,05, 0,07,e 0,1%. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a clara de ovo pode ser pasteurizada a baixas temperaturas, de modo que não afetem as suas propriedades funcionais, quando a H2O2 é usada como auxiliar desse procesro. Condições de tempo-temperatura de pasteurização da clara de ovo são apresentadas, as quais foram calculadas de modo a proporcionar um tratamento letal suficiente para produzir 99,99% de destruição da Salmonella presente Abstract: The heat resistance parameters of 21 strains of Salmonella were measured in egg yolk, egg white pH adjusted to 7,0 and in natural egg white with 0.05% of hydrogen peroxide. These measure¬ments were carried out by unsealed TDT tube method and flask method, using temperatures of 57, 53 and 50°C. Salmonella cells, which were grown in TSB-YE medium and incubated at 37°C during 48 hours, were inoculated artificially in egg products giving an initial count of approximately 10 cells per gram of the product. The effect of hydrogen peroxide concentration added egg white on heat resistance of Salmonella species (S. anatum, S. derby, S. enteridittis and S. typhirium Tm-1) were determined by adding hydrogen peroxide at the concentrations of .0.01, 0.03, 0.05, 0.07 and 0.l%. The results obtained indicated that egg white may be pasteurized at low temperatures to minimize the effect on functional pro¬perties, when hydrogen peroxide was added as an auxiliary in this process. Temperature-time relationship of egg white pasteurization were determined and they were calculated to provide a sufficiently lethal effect to cause a 99.99% destruction of the Salmonella in the product Mestrado Mestre em Tecnologia de Alimentos