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Data collection and processing statistics for the datasets collected at wavelengths of 1.27 Å and 1.30 Å for both crystal forms 1 and 2. Values for the outer shell are given in parentheses. All datasets were processed with XDS [45] with the Friedel pairs kept separated. (DOCX 24 kb)

Close-up view on the His-Zn binding motif of several S100 proteins. (a) Crystallographic structure of hS100A7 in the presence of both zinc and calcium [31]. (b) Crystallographic structure of hS100A12 in the presence of zinc and in the absence of calcium [34]. (c) Crystallographic structure of hS100A15 in the presence of both zinc and calcium [33]. (d) Crystallographic structure of hS100B in the presence of both zinc and calcium [32]. (PDF 2784 kb)

Identification of the new Zn-sites in the Zn2+/Ca2+-hS100A8 structure derived from crystal form 2 (C2221). (a) Experimental map containing anomalous data obtained after SAD-phasing in PHENIX.AUTOSOLVE [37] displayed as magenta mesh and contoured at 3.5 σ. The final refined model is superimposed for comparison. 12 anomalous sites were identified, including the 8 Zn2+ sites and 4 of the 8 Ca2+ sites (Ca2, Ca3, Ca6 and Ca8). (b) Anomalous difference Fourier map calculated using phases and weight from the best refined atomic model (without ions) obtained with the native dataset (crystal form 2) and anomalous differences from the datasets collected at a wavelength of 1.27 Å (magenta mesh, contour at 3.5 σ). (c) Anomalous difference Fourier map calculated using phases and weight from the best refined atomic model (without ions) obtained with the native dataset (crystal form 2) and anomalous differences from the datasets collected at a wavelength of 1.30 Å (red mesh, contour at 3.5 σ). The anomalous signal disappears for all Zn2+ ions but remains for the Ca2+ ions. (PDF 1749 kb)

Calibration of the Size Exclusion Chromatography (SEC) column and composition of the two oligomeric forms obtained by SEC for hS100A8. (a) Theoretical molecular weights and measured elution volumes of the different protein standards used for calibration of the 24 ml SEC column (Superdex 75, GE Healthcare Lifesciences). The calibration was performed in 20 mM HEPES pH 7.5, 200 mM NaCl and 5 mM CaCl2. (b) Calibration curve derived from the SEC runs with the different protein standards. (c) Elution profile of hS100A8 on the SEC column equilibrated in 20 mM HEPES pH 7.5, 200 mM NaCl and 5 mM CaCl2. In the sole presence of calcium, hS100A8 elutes as two peaks with elution volumes of 11.15 (Peak 1) and 12.80 (Peak 2), respectively. (d) Molecular weights for the two hS100A8 species and corresponding molecular composition extrapolated from the calibration curve. The equation used to calculate the molecular weights is indicated above the table. (PDF 107 kb)

Eukaryotic and archaeal initiation factors 2 (e/aIF2) are heterotrimeric proteins (αβγ) that supply the small ribosomal subunit with methionylated initiator tRNA, therefore insuring specific recognition of the start codon on mRNA. The structure of aIF2γfrom the archaeon P. abyssi was previously solved in our laboratory. The γsubunit, which forms the core of the heterotrimer, is a close structural homologue of bacterial elongation factor EF1A. However, it displays specific features that could account for its specific role in translation initiation. One of the main goals of this work has been to design an in vitro assay to follow the association between aIF2 and Met-tRNAi Met. This test enabled us to identify determinants of Met-tRNAi Met important for its recognition by aIF2 and to investigate the role of each subunit of aIF2 in tRNA binding. On the one hand, the methionine moiety of initiator tRNA is a crucial determinant for Met-tRNAi Met recognition by aIF2 while the other nucleotidic determinants have only a minor role. On the other hand, the γsubunit alone is able to bind Met-tRNAi Met in a manner similar to that of EF1A. But its affinity for the tRNA molecule is strongly reduced in comparison to the affinity of the intact heterotrimer. Therefore, at least one other subunit must play a role in this interaction. Indeed, the αsubunit is required to have a full tRNA binding while βhas no role in this interaction. Within the αsubunit, domain 3 binds the γsubunit via an idiosyncratic loop located in domain 2 of aIF2γ. Moreover, the αD3γ heterodimer is necessary and sufficient to have an optimal affinity for Met-tRNAi Met. In a second step, we obtained crystals of the intact aIF2αand of a truncated version of αformed of only domains 2 and 3. The structures ofαD2-3 and αwere solved at 2.26 and 3.37 Å resolution, respectively. The three-domain organisation of αis conserved in Eukarya and Archaea. Domains 1 and 2 form a rigid body which is linked to a third mobile domain. Sequence comparisons established that the most conserved regions in aIF2αlie at opposite sides of the protein, within domain 1 and domain 3. Both domains show general RNA binding properties. Thereby, domain 1 could interact with either rRNA or mRNA on the ribosome. Finally, crystals of aIF2αγfrom Sulfolobus solftaricus were obtained and the structure of the heterodimer was solved and refined to 3.0 Å resolution. This structure confirmed biochemical data previously obtained: αD3 connects domain 2 of the γsubunit via the L1 loop of γ. For the first time in an aIF2γstructure, conformation of the two switch regions of γ involved in GTP binding are similar to those encountered in the EF1A:GTP:Phe-tRNAPhe complex. Comparison with the EF1A structure suggests that only the γsubunit of the aIF2αγ heterodimer contacts tRNA. Because the αsubunit markedly reinforces the affinity of the γ subunit for tRNA, a contribution of αto the switch movements observed in the γstructure is considered., Le facteur hétérotrimérique e/aIF2 joue un rôle central dans le démarrage de la traduction chez les Eucaryotes et chez les Archées. Il conduit l'ARNt initiateur méthionylé jusqu'au ribosome et assure la spécificité de sélection du codon de démarrage sur l'ARNm. La structure cristallographique d'aIF2de l'archée Pyrococcus abyssi, précédemment résolue au laboratoire, a révélé une très forte homologie entre aIF2γ, qui constitue le coeur de l'hétérotrimère, et le facteur d'élongation bactérien EF1A. Cependant, possède des caractéristiques structurales propres qui pourraient être responsables de sa spécificité d'action dans le démarrage de la traduction. Une étape cruciale de ce travail a consisté à développer un test de suivi in vitro de l'association d'aIF2 au Met-ARNti Met. Ce test a permis d'évaluer l'importance des caractéristiques du Met-ARNti Met et la contribution de chacune des sous-unités de l'hétérotrimère dans la formation du complexe aIF2:Met-ARNti Met. Ainsi, il a été montré que le résidu méthionine constitue un déterminant majeur dans la reconnaissance du Met-ARNti Met par aIF2. D'autre part, il apparaît que la sous-unité seule est effectivement capable de lier l'ARNt selon un mode similaire à celui observé pour EF1A mais avec une affinité considérablement réduite par rapport à celle de l'hétérotrimère. Nous avons montré que la présence de la sous-unité αétait nécessaire pour retrouver une affinité optimale vis-à-vis de l'ARNt tandis que la sous-unité βne semble pas jouer de rôle dans cette liaison. L'utilisation d'une stratégie de découpage d'en domaines séparés a montré que c'est le domaine 3 d'aIF2qui lie la sous-unité par l'intermédiaire d'une boucle du domaine 2 de . De plus, le dimère D3semble nécessaire et suffisant pour retrouver une affinité pour l'ARNt comparable à celle du facteur natif. Dans un second temps, des cristaux de la sous-unité entière et d'une forme tronquée correspondant aux domaines 2 et 3 ont été obtenus. Les structures d'D2-3 et d'complet ont été résolues à respectivement 2.26 et 3.37 Å de résolution. L'analyse du modèle structural a révélé une mobilité du domaine 3 d'αpar rapport au bloc rigide formé par les domaines 1 et 2. La comparaison de séquences d'e/aIF2a montré que les zones de conservation d'se situaient principalement dans le domaine 1 et dans le domaine 3 de la protéine, qui possèdent tous les deux des propriétés générales de liaison des ARNs. Le domaine 1 d'αpourrait ainsi interagir avec un autre partenaire de type ARN du démarrage de la traduction, tel que l'ARNm ou l'ARN ribosomal. Finalement, des cristaux d'aIF2de Sulfolobus solfataricus ont été obtenus et la structure de l'hétérodimère a été résolue à 3.0 Å. Cette structure a confirmé les données biochimiques précédemment obtenues : le domaine 3 de la sous-unité interagit avec le domaine 2 de , au niveau de la boucle L1 précédemment caractérisée. L'analyse de cette structure a révélé pour la première fois une conformation des régions Switch de similaire à celle observée au sein du complexe EF1A:GDPNP:ARNt, ce qui permet d'expliquer la GTPdépendance de la fixation du Met-ARNti Met par aIF2. La comparaison de cette structure à celle d'EF1A suggère que seule γpourrait être en contact avec l'ARNt au sein de l'hétérodimère αγ. Le renforcement de l'affinité pour l'ARNt observé en présence d'αnous a conduit à envisager un rôle possible d'αdans l'établissement des conformations observées pour les régions Switch dans la structure d'aIF2γ.