This work presented the synthesis and characterization of a novel set of cyanine dyes potentially applicable for biomedical applications in the field of diagnostics and imaging. All dyes were modified at different positions in their chemical structure to suppress aggregation, optimize spectroscopic properties, establish responsiveness to external stimuli, and to incorporate specific moieties for highly specific labeling applications. In the first part of this thesis, cyanine dyes were synthesized with N-substituted generation 1 glycerol-based dendron building blocks [G1.0] to benefit from their water solubilizing properties and moreover to suppress aggregation due to steric repulsion.[112-113, 117] Glycerol-based dendron moieties were modified with three linker motifs and attached to an indolenine moiety via nucleophilic substitution. Condensation with a polymethine forming reagent yielded pentamethine dyes equipped with a total of eight hydroxyl groups. Spectroscopic characterization of dendronized dyes and an analog with classical sulfobutyl pattern revealed enhanced ϕf values of up to 0.15 for all synthesized derivatives. Moreover, a cyanine dye containing defined polyethylene glycol (PEG) substitution revealed similar results. Surprisingly, molar absorption coefficients were strongly influenced by the nature of linker connecting the dendron moieties with the indolenine unit. The classical sulfoalkyl dye, (G1.0)-pentyl- and PEG-10 substituted dyes revealed similar coefficients, which were strongly enhanced compared to the other dendronized dyes. Furthermore, the dyes were converted into their respective NHS esters and subsequently conjugated to the monoclonal antibody cetuximab, an antibody targeting the epidermal growth factor receptor (EGFR) on tumor cells, which is clinically established for the treatment of cancer and a well characterized tool for bioconjugation.[118] Upon conjugation, increased fluorescence quantum yields were obtained for dyes with ether linkage and exceeded the values of the free dyes even at high D/P ratios above 1. In contrast, conjugated dyes with alkyl-substitution pattern revealed decreased fluorescence quantum yields. Moreover, as opposed to cyanines with classical sulfobutyl pattern, the dendronized dyes showed less tendency to form aggregates when conjugated to cetuximab confirming their suitability as powerful labels for optical imaging techniques. The second part of this work was focused on the synthesis of responsive cyanine dyes for the investigation of cellular uptake pathways. By applying non-substituted indolenine precursors in asymmetric cyanine synthesis, dyes with pH-sensing properties were obtained. Based on this type of asymmetric pentamethines, derivatives with a total of three sulfonic acid groups were prepared showing excellent water solubility and less aggregation. The attachment of a benzene moiety to the heterocyclic system shifted absorption and fluorescence maximum close to the optical window which is favorable due to the maximum penetration depth of light.[119] Furthermore, pH- sensitive dyes with different meso-substitutions were prepared leading to tunable pH responsiveness with respect to the pKa values. The incorporation of an electron-withdrawing chlorine atom decreased the pKa value to a physiological relevant range. Spectroscopic characterization revealed good optical properties; a strong influence of the meso-substitution was observed as ϕf increased for non-substituted dyes. By conjugation to cetuximab, we yielded pH-sensitive antibody conjugates for the investigation of cellular uptake kinetics. Confocal laser scanning microscopy (cLSM) confirmed the conjugate functionality as a pronounced signal was observed inside the cells. The dyes with tunable pH dependency clearly demonstrated “turn-On” behavior upon intracellular drop of pH and even revealed differentiated results in cell studies. Whereas the chloro-substituted dye was only giving fluorescence signals inside the cell due to a decreased pKa value (7.1), the non- substituted dye with higher pKa already visualized the characteristic receptor binding of cetuximab on the cell membrane. Both pH-sensitive dyes revealed low background signal in cellular medium confirming their suitability as powerful labels with tunable pH dependence. In the third project, cyanine dyes were equipped with different functional groups for the application as fluorescent bifunctional linkers connecting two macromolecules. Information on polymer loading is a difficult but crucial analytical challenge when modifying antibodies with PEG to enhance their blood circulation time in vivo. An application of a fluorescent linker could for example permit to gain information on the polymer loading of antibodies when increasing their size by PEG attachment. The major challenge in this project was the synthesis of cyanine dyes with different functional groups directly attached to the aromatic system that is connected to the conjugated π-system. Amino and carboxyl indolenine precursors were condensed with electrophilic reagents (n = 1 or 2) to form tri- and pentamethine dyes. Moreover, the dyes were equipped with different N-substitution patterns: the classical sulfobutyl groups and, based on the success of the first project, a PEG-10 chain was incorporated to suppress aggregation. In order to obtain a heterobifunctional version of a cyanine dye, a maleimido functionality was introduced into the dye, whereas the other side was converted into an active ester. Subsequent conjugation with the well-studied cetuximab yielded bioconjugates for cellular uptake studies. As further conjugation with PEG5kDa thiols via Michael addition failed to succeed, the polymers were attached to the dyes before bioconjugation and revealed nearly full conversion. Subsequent conversion to active ester of the resulting dye-PEG conjugates and bioconjugation with cetuximab yielded polymer-labeled antibodies with incorporated fluorophore at optimal D/P ratios. Complete characterization of optical properties revealed good molar absorption coefficients and moderate fluorescence quantum yields that were suitable for optical imaging and microscopic detection. Gel electrophoresis confirmed the conjugation of antibodies with dye-labeled polymers by displaying a mass shift of about 5 kDa. Furthermore, cell studies demonstrated the typical receptor binding of the antibody on tumor cells as well as the cellular uptake by signal accumulation inside the cell. These results strengthen the use of heterobifunctional cyanine dyes as suitable fluorescent linkers with fluorescence emission properties., Die vorliegende Arbeit präsentiert die Synthese und Charakterisierung von neuen Cyaninfarbstoffen für die potentielle Anwendung in der diagnostischen Bildgebung. Durch gezielte Modifikation konnten die Farbstoffe hinsichtlich ihrer chemischen Eigenschaften wie Aggregationverminderung und spektroskopische Parameter optimiert werden. Weiterhin wurde ein System mit responsiven Eigenschaften auf externe Stimuli etabliert und spezielle Funktionalitäten für hochspezifische Markierungen eingeführt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Cyaninfarbstoffe hergestellt, die eine Stickstoffsubstitution mittels Glycerol-basierten Dendroneinheiten der ersten Generation [G1.0] aufwiesen, um von deren löslichkeitsvermittelnden und aggregationsvermindernden Eigenschaften durch sterische Hinderung zu profitieren.[112-113,117] Hierbei wurden drei verschiedene Linkerstrukturen zwischen den Dendroneinheiten und dem Indolenin eingeführt, um durch Kondensation mit elektrophilen Reagenzien symmetrische Pentamethine mit insgesamt acht Hydroxylgruppen herzustellen. Weiterhin wurde zum Vergleich ein Farbstoff mit einer Poly(ethylenglycol)kette (PEG) synthetisiert. Bei der spektroskopischen Charakterisierung wurden für alle synthetisierten Farbstoffe Fluoreszenzquantenausbeuten (ϕf) von 0.15 ermittelt. Vergleichend zeigte ein analoger Farbstoff mit klassischer Sulfobutyl-Substitution deutlich kleinere ϕf-Werte. Überraschenderweise wurden die molaren Absorptionskoeffizienten stark von der Natur des Linkers zwischen Indolenin- und Dendroneinheit beeinflusst und zeigten die höchsten Werte bei Farbstoffen ohne Heteroatome in der verbindenden Kette. Für weiterführende biologische Studien wurden die Farbstoffe an den monoklonalen Antikörper Cetuximab gekoppelt, der den „epidermal growth factor“ (EGF)-Rezeptor von Tumorzellen bindet und in der Klinik zur Behandlung von Krebs etabliert wurde. Nach der Biokonjugation konnte eine deutliche Erhöhung der Quantenausbeute für Farbstoffe mit Heteroatomen in der Alkylkette ermittelt werden, während der Vergleichsfarbstoff mit Sulfobutylkette niedrigere Quantenausbeuten aufwies. Die Einführung von Dendroneinheiten in Cyaninfarbstoffe führte zu einer deutlichen Verbesserung der optischen Eigenschaften und weniger Aggregation in Biokonjugaten. Die neuen Farbstoffe mit Dendroneinheiten bilden somit eine neue Klasse von Fluorophoren mit optimierten Eigenschaften für die optische Bildgebung. Der Fokus des zweiten Projektes lag auf der Synthese von responsiven Cyaninfarbstoffen für die Aufklärung von zellulären Aufnahmewegen. Als Ausgangsstoffe wurden Indolenine mit fehlender Alkylierung am Stickstoff gewählt um einen asymmetrischen Farbstoff mit pH-sensitiven Eigenschaften herzustellen. Basierend auf Pentamethinen, wurden asymmetrische Farbstoffe mit drei Sulfonsäuregruppen hergestellt, die eine hohe Wasserlöslichkeit und geringe Aggregation aufwiesen. Eine zusätzliche Benzoleinheit am Heterozyklus verschob die Absorptions- und Fluoreszenzmaxima näher an das optische Fenster, welches aufgrund der maximalen Eindringtiefe von Licht im Gewebe favorisiert ist. Weiterhin führte die Einführung eines elektronenziehenden Chloratoms an der meso-Position, dem zentralen Kohlenstoffatom der Polymethinkette, zu einer Verringerung des pKa-Wertes auf 7.1 unterhalb des physiologischen pH-Wertes von 7.5. Die neu hergestellten Farbstoffe mit guten optischen Eigenschaften wurden an Cetuximab gekoppelt und mittels konfokaler „Laser scanning“ Mikroskopie wurde die endozytotische Aufnahme bestätigt. Die Farbstoffkonjugate mit Sensoreigenschaften zeigten ein verstärktes Emissionssignal innerhalb der Zelle im Vergleich zu einem geringen Hintergrundsignal im Zellmedium aufgrund der nicht-fluoreszierenden, deprotonierten Form des Farbstoffs. Während der Chlor-substituierte Farbstoff nur innerhalb der Zelle aufgrund seines niedrigeren pKa-Wertes (7.1) fluoreszierte, konnte der nicht-substituierte Farbstoff mit höherem pKa-Wert sogar die charakteristische Rezeptorbindung von Cetuximab an die Zellmembran zeigen. Die beiden pH-sensitiven Farbstoffe mit schaltbarer pH-Abhängigkeit überzeugten als Marker für Biomoleküle und konnten den zellulären Aufnahmeweg durch Endozytose veranschaulichen. Im dritten Projekt, wurden Cyaninfarbstoffe mit verschiedenen funktionellen Gruppen ausgestattet um als fluoreszierende Zwischeneinheit bei der Vernetzung von Makromolekülen zu fungieren. Die Information über den Beladungsgrad an Makromolekülen ist eine schwierige aber wichtige analytische Herausforderung, wenn Antikörper mit PEG beladen werden, um ihre Größe zu erhöhen und damit die Ausscheidung über die Niere zu verhindern. Die heterobifunktionalen Cyaninfarbstoffe wurden ausgehend von Indoleninen mit unterschiedlicher Substitution direkt am aromatischen System hergestellt um einen möglichst rigiden Linker zu erhalten. Bei der Kondensation mit verschiedenen elektrophilen Reagenzien (n = 1 oder 2) wurden Tri- oder Pentamethine erhalten, die wiederum jeweils mit unterschiedlicher N-Substitution ausgestattet wurden, um die Wasserlöslichkeit zu erhöhen. Basierend auf den Erfolg des ersten Projektes wurde hier eine PEG-10-Kette eingebaut, um eine flexible Löslichkeit zu erzielen. In einer zweistufigen Synthese erfolgte die Modifizierung der terminalen Gruppen zu Maleimid- und NHS-Funktionen, um einen heterobifunktionalen Linker mit starker Reaktivität in biologischem Medium zu erhalten. Die weiterführende Kopplung von PEG5kDa- Thiolen mittels Michael-Addition und deren Kopplung an den gut studierten Antikörper Cetuximab ergab die gewünschten, mit einem Polymer markierten Antikörper mit optimalen Beladungsgraden. Die vollständige Charakterisierung der optischen Eigenschaften ergab gute molare Absorptionskoeffizienten und moderate Fluoreszenz-quantenausbeuten, die für die optische Bildgebung und mikroskopische Detektion ausreichend waren. Mittels Gelektrophorese konnte die kovalente Modifizierung der Antikörper durch eine Massenveränderung von 5 kDa bestätigt werden. Weiterhin bestätigten Zellstudien sowohl die typische Zellmembranbindung von Antikörpermolekülen an Tumorzellen als auch die endozytotische Aufnahme. Die Ergebnisse bekräftigen die Anwendung von Cyaninfarbstoffen als heterobifuntionale Linker mit guten Fluoreszenzeigenschaften.