Many bacterial pathogens use a type III secretion system (T3SS) to manipulate host cells by translocating molecular toxins, called effector proteins. It resembles a molecular syringe, which establishes a cytosolic connection between bacteria and host cells. While the structure of the injectisome is well-defined, little is known about its molecular function and regulation. To investigate those, we focused on the adaptation of the injectisome to local pH as well as on the dynamics interactions of the cytosolic components with the effector proteins. Protein secretion by the T3SS injectisome is activated upon contact to any host cell, and it has been unclear how premature secretion is prevented during infection. We found that in the gastrointestinal pathogens Yersinia enterocolitica and Shigella flexneri, cytosolic injectisome components are temporarily released from the proximal interface of the injectisome at low external pH, preventing protein secretion in acidic environments, such as the stomach. In Y. enterocolitica, low external pH is detected in the periplasm and leads to a partial dissociation of the inner membrane injectisome component SctD, which in turn causes the dissociation of the cytosolic injectisome components. This effect is reversed upon restoration of neutral pH, allowing a fast activation of the injectisome at the native target regions within the host. These findings indicate that the cytosolic components form an adaptive regulatory interface, which regulates injectisome activity in response to environmental conditions. In a next step, we study the binding of effector proteins to those dynamics of the cytosolic components, which also exchange between a free diffusing cytoplasmic and a injectisome bound state. An attempt to identify novel interaction partners of SctQ by co-IP did not yield in significantly new candidates and recent publications showed that protein dynamics are linked to the function of the injectisome. We analyzed the diffusion behavior of the cytosolic protein SctQ with single particle tracking photoactivated localization microscopy (sptPALM) in different strain backgrounds. Our data shows that SctQ diffuses in two populations and that the presence of effector proteins slows down that speed. This suggests that the cytosolic components are not only essential for secretion but participate actively in effector shuttling and recruitment to the injectisome., Viele bakterielle Pathogene nutzen ein Typ-III-Sekretionssystem (T3SS), um ihre Wirtszellen zu manipulieren, indem sie molekulare Toxine, sogenannte Effektor Proteine, translozieren. Es ähnelt einer molekularen Spritze, die eine direkte zytosolische Verbindung zwischen Bakterien und Wirtszellen herstellt. Während die Struktur des Injektisoms gut definiert ist, ist über seine molekulare Funktion und Regulation wenig bekannt. Um diese zu untersuchen, konzentrierten wir uns auf die Anpassung des Injektisoms an den lokalen pH-Wert sowie auf die dynamischen Interaktionen der zytosolischen Komponenten mit den Effektor Proteinen. Die Protein Sekretion durch das T3SS-Injektisom wird bei Kontakt mit einer beliebigen Wirtszelle aktiviert, und es war bisher unklar, wie eine vorzeitige Sekretion von Effektoren während einer Infektion verhindert wird. Wir fanden heraus, dass in den gastrointestinalen Pathogenen Y. enterocolitica und S. flexneri zytosolische Injektisome Komponenten bei niedrigem externem pH-Wert vorübergehend von der proximalen Schnittstelle des Injektisome dissoziieren, wodurch die Proteinsekretion in sauren Umgebungen, wie dem Magen, verhindert wird. In Yersinia enterocolitica führt ein niedriger externer pH-Wert im Periplasma zu einer teilweisen Dissoziation des inneren Membrane Ring des Injectisomes SctD, die wiederum hat die Dissoziation der zytosolischen Injektisom-Komponenten zufolge. Dieser Effekt wird bei der Wiederherstellung des neutralen pH-Wertes rückgängig gemacht, was eine schnelle Aktivierung des Injectisomes an den nativen Zielregionen im Wirt ermöglicht. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die zytosolischen Komponenten eine adaptive regulatorische Schnittstelle bilden, welche die Injectisome Aktivität in Abhängigkeit von den Umweltbedingungen reguliert. In einem nächsten Schritt untersuchen wir die Bindung von Effektorproteinen an die Dynamik der zytosolischen Komponenten. Diese wechseln zwischen einem frei diffundierenden zytoplasmatischen und einem an das Injektisom gebundenen Zustand. Der Versuch, neue Interaktionspartner von SctQ durch Co-IP zu identifizieren, ergab keine signifikant neuen Kandidaten, und neuere Publikationen zeigten, dass die Dynamik des Proteins mit der Funktion des Injektisoms verknüpft ist. Wir analysierten das Diffusionsverhalten des zytosolischen Proteins SctQ haben könnten, haben wir das Diffusionsverhalten des zytosolischen Proteins SctQ mit Single Particle Tracking Photoactivated Localization Microscopy (sptPALM) in verschiedenen Stammhintergründen analysiert. Unsere Daten zeigen, dass SctQ in zwei Populationen diffundiert und dass die Anwesenheit von Effektorproteinen diese Geschwindigkeit verlangsamt. Dies deutet darauf hin, dass die zytosolischen Komponenten nicht nur für die Sekretion essentiell sind, sondern auch aktiv am Effektor Transport und der Rekrutierung zum Injectisome teilnehmen. Insgesamt tragen unsere gesammelten Daten zum Wissen darüber bei, wie der Effektor Transport zum Injectisome und in die Wirtszelle reguliert wird und wie dieser überhaupt erst ermöglicht werden kann.