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Hintergrund: Die X-chromosomale Adrenoleukodystrophie (X-ALD) ist die häufigste monogenetisch vererbte Leukodystrophie. Die genetischen Grundlagen von X-ALD sind Mutationen im ABCD1-Gen, das für das peroxisomale Transmembranprotein, das ABCD1-Protein, kodiert. Dieses dient als Transporter von gesättigten sehr langkettigen Fettsäuren (VLCFA; ≥ C22:0) aus dem Zytosol in das Peroxisom zum Abbau mittels β-Oxidation. Ein Mangel an ABCD1-Protein führt zu einem gestörten Abbau von VLCFA und folglich zu einer Anhäufung dieser Fettsäuren in Körperflüssigkeiten und Geweben der Patient*innen. Die am meisten betroffenen CD34+-abgeleiteten Zelltypen bei X-ALD sind Monozyten/Makrophagen. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass bei CALD eine starke Verringerung der Mikroglia-Dichte in der perilesionalen weißen Substanz auftrat, die der Myelin-Degeneration vorausging. Bislang ist noch nicht bekannt, welcher Zelltod zur Verringerung der Mikroglia-Dichte führt. Forschungsfragen: Das Hauptziel der Forschung bestand darin, den Zusammenhang zwischen ABCD1-Defizienz und einer erhöhten Anfälligkeit für Nekroptose in angeborenen Immunzellen wie Makrophagen zu untersuchen. In diesem Kontext sollte beobachtet werden, inwieweit Nekroptose mit ABCD1-Defizienz in Makrophagen assoziiert ist. Des Weiteren, ob Nekroptose mit einer schweren Reduktion von angeborenen Immunzellen im Gehirn von CALD-Patient*innen in Verbindung gebracht werden kann. Methoden: Die Experimente wurden mit CD14+ Monozyten durchgeführt, die durch magnetisch-aktivierte Zellsortierung isoliert wurden. Dafür wurden die Zellen zuvor aus Leukozytenreduktionskammern von gesunden Spender*innen gewonnen. Nach der Isolierung wurden die Monozyten in vitro mit M-CSF zu Makrophagen differenziert. Vor den Experimenten wurde der Zelltod, Nekroptose, mithilfe von Poly I:C eingeleitet und die Zellen zu bestimmten Zeitpunkten entweder geerntet oder mit Propidiumjodid für die Incucyte Analyse gefärbt. Die Fluoreszenzfärbung mit Propidiumjodid wurde verwendet, um die mit der Nekroptose verbundene Permeabilisierung der Plasmamembran zu beobachten. Ein Western Blot wurde durchgeführt, um das Vorhandensein von pMLKL als Hinweis auf Nekroptose zu bewerten. Weiters wurde die RT-qPCR zur Untersuchung der mRNA-Expression von ABCD1, ACOX1, ELOVL1, ELOVL7 und FASN verwendet. Ergebnisse: Die Daten der Incucyte-Analyse belegen, dass die Makrophagen auf die Nekroptose-Behandlung angespochen haben, wobei die Mehrheit der Makrophagen zum 6-Stunden-Zeitpunkt PI-positiv war. Ab dem 9-Stunden-Zeitpunkt zeigten die Zellen eine runde Morphologie. Die Western-Blot-Analyse ergab, dass pMLKL nicht den Beginn der Nekroptose in Makrophagen widerspiegelt. Mit Hilfe von RT-qPCR konnte festgestellt werden, dass in der frühen Nekroptose die Biosynthese von VLCFAs aktiviert wird. Zudem wird zu Beginn der Nekroptose ABCD1 gehemmt und ACOX1 hochreguliert, welche beide wichtige Gene für den Abbau von VLCFAs sind. Diskussion: Obwohl die Propidiumjodid-Färbung auf den Zelltod der Makrophagen nach der Behandlung mit Poly I:C hinweist, konnte die Art des Zelltods nicht mit der Nekroptose in Verbindung gebracht werden. Daher sollten künftige Studien andere Marker, die auf Nekroptose hindeuten, in mit Poly I:C behandelten Makrophagen untersuchen. Darüber hinaus wäre es notwendig, die Experimente mit X-ALD-Makrophagen durchzuführen. Background: X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) is the most common monogenetically inherited leukodystrophy. The genetic bases of X-ALD are mutations in the ABCD1 gene encoding for the peroxisomal transmembrane protein, the ABCD1 protein, which functions as a transporter of saturated very long-chain fatty acids (VLCFA, ≥ C22:0) from the cytosol into the peroxisome for degradation via β-oxidation. A deficiency of ABCD1 protein results in impaired degradation of VLCFA and consequently in accumulation of these fatty acids in body fluids and tissues of patients. The most affected CD34+-derived cell types in X-ALD are monocytes/macrophages. In addition, it was observed that a severe reduction in microglia density in CALD occurred in perilesional white matter that preceded myelin degeneration. To date, it is still unknown, which cell death pathway leads to the reduction of the microglia density. Research questions: The major aim of the research was to evaluate the association of ABCD1 deficiency and increased VLCFA levels with an increased susceptibility for necroptosis in innate immune cells such as macrophages. In this context, the question raised to what extent is necroptosis associated with ABCD1 deficiency in macrophages. Lastly, if necroptosis can be associated with severe reduction of innate immune cells in the brain of CALD patients. Methods: The experiments were conducted with CD14+ monocytes isolated by magnetic-activated cell sorting. The cells were attained from leukocyte reduction chambers from healthy donors. After the isolation, the monocytes were differentiated in vitro with M-CSF to macrophages. Before the experiments, the cell death pathway, necroptosis, was induced by poly I:C treatment and the cells were either harvested at different time points or stained with propidium iodide for the Incucyte live-cell analysis. The fluorescence staining, propidium iodide, was used for indicating plasma membrane permeabilization associated with necroptosis. Further, western blot analysis was carried out to evaluate the presence of pMLKL as an indication for necroptosis. Moreover, the RT-qPCR was used to investigate the mRNA expression of genes involved in VLCFA import and peroxisomal degradation (ABCD1 and ACOX1) as well as enzymes involved in fatty acid synthesis and elongation (ELOVL1, ELOVL7 and FASN). Results: The data of the Incucyte analysis provides evidence that the macrophages responded to the necroptosis treatment with the majority of macrophages being PI-positive at the 6h time point. From the 9h time point the cells changed their morphology and appeared more round. The western blot analysis revealed that pMLKL did not reflect the onset of necroptosis in macrophages. By using RT-qPCR it was assessed that in early necroptosis the biosynthesis of VLCFA is activated. In addition, at the beginning of necroptosis one important gene for the degradation of VLCFAs, ABCD1 is inhibited and the other one, ACOX1 is upregulated. Discussion: Although propidium iodide staining indicated macrophages cell death upon poly I:C treatment, we were unable to link the mode of cell death to necroptosis. Therefore, future studies should address other necroptosis-indicative markers in poly I:C-treated macrophages. In addition, it would be necessary to carry out the experiments with X-ALD macrophages.

Vitamin D3 hat eine direkte Wirkung auf die Genregulation durch die Bindung des Metaboliten 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25(OH)2D3) an den Transkriptionsfaktor Vitamin D Rezeptor (VDR). Das Verhältnis von tausenden genomischen VDR Bindungsstellen zu hunderten primären 1,25(OH)2D3 Gene wirft viele Fragen auf. Wir untersuchten Chromatin-Domänen der Gene kodierend für die Adhäsionsmoleküle CD97 und LRRC8A, den Glucose Transporter SLC37A2 und den Co-Aktivator NRIP1. Diese Regionen unterscheiden sich erheblich in ihrer Größe (7,3 bis 956 Kilobasen (kb)) und enthalten jeweils eine dominante VDR Bindungsstelle. In Monozyten sind diese vier Domänen mit offenem Chromatin assoziiert und mit VDR besetzt. In Makrophagen sind nur die Gene LRRC8A, SLC37A2 und NRIP1 mit offenem Chromatin und VDR assoziiert. Die VDR Bindungsstelle von CD97 trägt, im Gegensatz zu den drei anderen Regionen, keine DR3 Sequenz. CD97, LRRC8A, SLC37A2 und NRIP1 reagieren in Monozyten schon früh auf eine 1,25(OH)2D3 Gabe, in Makrophagen jedoch ist die Reaktion schwächer ausgeprägt und teilweise verzögert. In primären humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) von 71 prädiabetischen Patienten einer Vitamin D3 Interventionsstudie (VitDmet) eignen sich CD97, LRRC8A, SLC37A2 und NRIP1 als Transkriptombiomarker für die Klassifizierung von Individuen die von einer Vitamin D3 Supplementierung profitieren. Insbesondere NRIP1 übertrifft das Potential des zuvor identifizierten Markers CD14 um mehr als 40% und scheint ein gut geeigneter molekularer Marker für den Vitamin D3 Status im hämatopoetischen System zu sein., Vitamin D3 belongs to the few nutritional compounds that has, via the binding of its metabolite 1α,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25(OH)2D3) to the transcription factor vitamin D receptor (VDR), a direct effect on gene regulation. The relation of thousands of genomic VDR binding sites to a few hundred primary 1,25(OH)2D3 target genes is still largely unresolved. We studied chromatin domains containing genes for the adhesion molecules CD97 and LRRC8A, the glucose transporter SLC37A2 and the co-activator NRIP1. These domains vary significantly in size (7.3 to 956 kilo bases (kb)) but contain each one major VDR binding site. In monocytic cells these four sites are associated with open chromatin and occupied by VDR, while in macrophage-like cells only the sites of LRRC8A, SLC37A2 and NRIP1 are accessible and receptor-bound. The VDR site of CD97 does, in contrast to the three other loci, not carry any direct repeat spaced by 3 nucleotides (DR3)-type binding sequence. CD97, LRRC8A, SLC37A2 and NRIP1 are early responding 1,25(OH)2D3 target genes in monocytic cells, while in macrophage-like cells they respond less and in part delayed. In primary human peripheral blood mononuclear (PBMC) cells from 71 pre-diabetic subjects of a vitamin D3 intervention study (VitDmet) CD97, LRRC8A, SLC37A2 and NRIP1 can be used as transcriptomic biomarkers for classifying human individuals for their possible benefit from vitamin D3 supplementation. In particular, NRIP1 exceeds the potential of the previously identified marker CD14 by more than 40% and seems to be a well-suited molecular marker for the vitamin D status in the hematopoietic system.