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Chromobacterium violaceumis one of millions of species of free-living microorganisms that populate the soil and water in the extant areas of tropical biodiversity around the world. Its complete genome sequence reveals (i) extensive alternative pathways for energy generation, (ii) ≈500 ORFs for transport-related proteins, (iii) complex and extensive systems for stress adaptation and motility, and (iv) widespread utilization of quorum sensing for control of inducible systems, all of which underpin the versatility and adaptability of the organism. The genome also contains extensive but incomplete arrays of ORFs coding for proteins associated with mammalian pathogenicity, possibly involved in the occasional but often fatal cases of humanC. violaceuminfection. There is, in addition, a series of previously unknown but important enzymes and secondary metabolites including paraquat-inducible proteins, drug and heavy-metal-resistance proteins, multiple chitinases, and proteins for the detoxification of xenobiotics that may have biotechnological applications.

Orientadora: Profª. Drª. Ana Claudia Bonatto Coorientadora: Profª. Drª. Roseli Wassem Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 28/11/2019 Inclui referências Resumo: A fixação biológica de nitrogênio é o processo onde ocorre a conversão de nitrogênio gasoso em amônia através da atividade do complexo enzimático da nitrogenase presente em bactérias diazotróficas. Sinorhizobium fredii NGR234 é uma bactéria capaz de fixar nitrogênio no interior de estruturas conhecidas como nódulos, e apresenta um sistema de secreção tipo III que secreta cinco proteínas efetoras (NopM, NopJ, NopT, NopP e NopL). Estas proteínas provocam modificações na célula vegetal e determinam a eficiência de nodulação de diferentes maneiras dependendo da planta hospedeira. Phaseolus vulgaris (feijão comum) é uma leguminosa com grande importância na alimentação nos países da América Latina e África. O feijão pode se associar a S. fredii NGR234 e formar nódulos na raiz, onde ocorre a fixação de nitrogênio. Nesta associação, o sistema de secreção de S. fredii NGR234 tem efeito negativo na nodulação de P. vulgaris. O processo de nodulação depende do reconhecimento planta-bactéria e envolve uma cascata com várias etapas, incluindo a secreção de flavonóides pelas raízes da planta e a produção de fatores Nod, polissacarídeos e proteínas efetoras (Nops) pela bactéria. Pouco se conhece sobre os aspectos moleculares do reconhecimento das proteínas Nops pela da planta. Assim, este trabalho teve como objetivo identificar os genes de P. vulgaris diferencialmente expressos em resposta aos Nops de S. fredii NGR234, como também as vias metabólicas em que eles estão envolvidos. Para tanto, o transcriptoma de P. vulgaris inoculado com as estirpes selvagem NGR234 e mutantes nopM-, nopJ- e rhcN- foi analisado. As amostras de RNA foram obtidas em duas fases de desenvolvimento do nódulo, com 10 dias (primórdio) e 21 dias (nódulo). As bibliotecas de cDNA foram sequenciadas, os reads gerados foram mapeados no genoma de P. vulgaris e os genes foram comparados entre as condições testadas (NGR234 vs nopJ-, NGR234 vs nopM-, NGR234 vs rhcN, rhcN- vs nopJ-, rhcNvs nopM- e nopJ- vs nopM-) para primórdio e nódulo. Os genes considerados diferencialmente expressos entre as condições (valor de p ? 0.05 e fold-change ? 2) foram categorizados quanto a função no programa Mapman v 3.5.1. Os resultados sugerem que os Nops translocados pelo sistema de secreção tipo III de NGR234 no citoplasma de P. vulgaris ativam a transcrição de vários genes envolvidos na defesa da planta e resposta ao estresse. Abstract: Biological nitrogen fixation is the process of dinitrogen conversion into ammonia through the activity of the nitrogenase enzyme complex present in diazotrophic bacteria. Sinorhizobium fredii NGR234 is a bacterium capable of fixing nitrogen inside structures known as nodules, and presents a type III secretion system that secretes five effector proteins (NopM, NopJ, NopT, NopP and NopL). These proteins cause modifications in the plant cell physiology and determine nodulation efficiency in different ways depending on the host plant. Phaseolus vulgaris (common bean) is a legume of great importance for food in Latin America and Africa countries. Beans can associate with S. fredii NGR234 and form nodules in the root where nitrogen fixation occurs. In this association, the S. fredii NGR234 secretion system has a negative effect on P. vulgaris nodulation. The nodulation process depends on the plant-bacteria recognition and involves a cascade of many steps, including flavonoids secretion by plant roots and the production of Nod factors, polysaccharides and effector proteins (Nops) by the bacteria. The molecular aspects of Nops recognition by the host are poorly known. Thus, this work aimed to identify the P. vulgaris genes differentially expressed in response to S. fredii NGR234 Nops, as well as the metabolic pathways in which they are involved. For this, the P. vulgaris transcriptome after inoculation with NGR234 wild-type strain and nopM-, nopJ- and rhcN- mutants was analysed. RNA samples were obtained in two phases of nodule development, 10 days (primordia) and 21 days (nodule). cDNA libraries were sequenced and the reads obtained were mapped into the P. vulgaris genome. The genes were compared between the conditions tested (NGR234 vs nopJ-, NGR234 vs nopM-, NGR234 vs rhcN-, rhcN- vs nopJ-, rhcN - vs nopM- and nopJvs nopM-) for primordia and nodule samples. Genes differentially expressed between conditions (p value ? 0.05 and fold change ? 2) were categorized by function in the Mapman v 3.5.1 program. The results suggest that Nops translocated by the NGR234 type III secretion system in the P. vulgaris cytoplasm activate the transcription of several genes involved in plant defense and stress response.

Orientador: Prof. Dr. Emanuel Maltempi Souza Coorientadora: Prof. Dra. Roseli Wassem Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Defesa : Curitiba, 28/03/2018 Inclui referências: p.68-76 Resumo: O nitrogênio é um elemento macro essencial para os organismos vivos. O gás nitrogênio (N2), presente em grandes quantidades na atmosfera, é uma forma biologicamente indisponível para a maioria dos organismos. As bactérias diazotróficas, como Azospirillum brasilense, podem converter N2 em formas prontamente disponíveis, como o amônio, através da fixação de nitrogênio. O amônio produzido é usado para a síntese de glutamina em uma reação catalisada pela glutamina sintetase (GS), esse produto é convertido em outros compostos de nitrogênio. O gene glnA de Azospirillum brasilense HM053 tem uma mutação pontual (citosina para timina na posição 1040) que codifica uma glutamina sintetase com atividade muito baixa. Acredita-se que, devido à baixa atividade desta enzima, o amônio produzido pela nitrogenase não é totalmente assimilado e, como consequência, HM053 excreta parte do amônio produzido. Este trabalho caracteriza a GS mutante do Azospirillum brasilense HM053. Os genes glnA da estirpe mutante e da estirpe selvagem foram clonados em pET28a. Os plasmídeos recombinantes foram utilizados para superexpressar GS em E. coli e as proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade em coluna HiTrap-Chellating. A GS também foi extraída e purificada diretamente da bactéria do tipo selvagem de A. brasilense. As proteínas purificadas foram caracterizadas por SDS PAGE/western blot e MALDI-TOF espectrometria de massa. Os resultados mostraram que a GS do HM053 (P347L) tem baixa atividade e é indiferente à adenililação, se mantendo desadenililada. A mutação P347L localizada distante do sítio ativo e do sítio de adenililação pode ter causado mudanças estruturais na GS, afetando sua atividade e adenililação. Palavras-chave: Fixação de nitrogênio. Glutamina sintetase. Azospirillum brasilense. Gene glnA Abstract: Nitrogen is an essential macro element for living organisms. Nitrogen gas (N2), present in vast quantities in the atmosphere, is a form biologically unavailable for most organisms. Diazotrophic bacteria, such as Azospirillum brasilense, can convert N2 to readily available forms, such as ammonium, through nitrogen fixation. The ammonium produced is used for the synthesis of glutamine in a reaction catalyzed by glutamine synthetase (GS), the product is converted to other nitrogen compounds. The glnA gene of Azospirillum brasilense HM053 has a point mutation (cytosine to thymine at position 1040) encoding a glutamine synthetase with very low activity. It is believed that due to the low activity of this enzyme, the ammonium produced by the nitrogenase is not totally assimilated and, as a consequence, HM053 excretes part of the ammonium produced. This work characterizes the GS mutant of Azospirillum brasilense HM053. The glnA genes of the mutant strain and the wild strain were cloned into pET28a. The recombinant plasmids were used to overexpress GS in E. coli and the proteins were purified by affinity chromatography on HiTrap-Chellating column. The GS was also extracted and purified from A. brasilense wild type. The purified proteins were characterized by SDS PAGE/western blot and MALDI-TOF mass spectrometry. The results showed that the HM053GS (P347L) has low activity and insensitive to adenylylation, remaining disadenylated. The mutation P347L located distant from the active and adenylylation sites might caused structural change in GS affecting its activity and adenylylation. Keywords: Nitrogen fixation. Glutamine synthetase. Azospirillum brasilense. Gene glnA

Orientador : Prof. Fábio Oliveira Pedrosa Coorientador : Helisson Faoro Coorientador : Profª. Roseli Wassem Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 27/09/2016 Inclui referências : f. 24-27;71-75;78-88 Resumo: A descrição da penicilina revelou que microrganismos eram a fonte primária de muitos produtos naturais com aplicações farmacológicas. Sua bem-sucedida adoção medicamentosa foi seguida por um período prolífico de isolamento de novas drogas obtidas a partir de microrganismos encontrados no ambiente. Entretanto, a velocidade de novas descobertas diminuiu quando se observou que a grande maioria dos microrganismos não era prontamente cultivável em condições laboratoriais, ao mesmo tempo em que os organismos patogênicos alvo das drogas que vinham sendo usadas desenvolviam resistência. Logo ficou evidente que a empreitada deveria buscar novas estratégias. Pesquisadores passaram a estudar novas classes de metabólitos secundários, entre os quais chamou a atenção os produtos das sintetases de peptídeos não-ribossomais (NRPS) e sintases de policetídeos (PKS). Os módulos que compõem esses sistemas enzimáticos são formados por alguns domínios básicos e outros opcionais, que a partir de precursores simples - aminoácidos e acetato, respectivamente - são capazes de sintetizar moléculas com grande variedade estrutural, muitas com atividade biológica igualmente diversa. Outra frente de investigação se aproveitou dos avanços nas técnicas de isolamento e pesquisa independente de cultivo para explorar ambientes antes negligenciados, como o mar, que logo revelou hospedar uma nova gama de microrganismos e produtos derivados. Além de informações funcionais específicas, a exploração eficiente e sustentável desses ambientes exige uma melhor caracterização de suas comunidades microbianas; microrganismos são componentes essenciais de seu funcionamento, mas essa literatura ainda é escassa. Em virtude disso, esse trabalho propôs a investigação do microbioma de sedimentos de mangue da região da Baía de Paranaguá, Paraná, Brasil, através de metagenômica. No primeiro capítulo, usamos técnicas de sequenciamento de amplicons gerados a partir do gene de rRNA 16S para caracterizar a comunidade presente e determinar os fatores ambientais que moldam essa estrutura. Encontramos um predomínio dos filos Proteobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria, Chloroflexi e Acidobacteria, quase todos significativamente afetando as estruturas intralocais. As classes mais abundantes foram Deltaproteobacteria, Gammaproteobacteria e Alphaproteobacteria. Revelamos forte influência da composição química derivada da proximidade do mar, sendo os fatores pH (SMP), H++Al3+, Ca2+, Mg2+, Na+, T, P, Na% e Ca/Mg significativos, mas não encontramos efeito de presença de planta, possibilidade descrita na literatura. Comparamos essa comunidade com a de outros mangues e encontramos similaridades que apontam para um perfil característico dependente de bioma, dominado pelos mesmo filos abundantes encontrados no mangue paranaense. No segundo capítulo, realizamos o sequenciamento shotgun de duas amostras do mangue pertencentes a localizações quimicamente diversas para determinar seu perfil funcional. As funções prevalentes eram relacionadas a subsistemas baseados em formação de cluster, carboidratos, aminoácidos e derivados, e funções variadas. Em níveis hierárquicos mais baixos, a abundância relativa de funções é geralmente balanceada. As diferenças funcionais também se mostraram dependentes de fatores ambientais, mas essa influência é menor do que no perfil taxonômico, o que indica resiliência funcional frente a alterações externas. As similaridades do mangue frente a outros biomas se mostraram mais dependentes de tipo de matriz (onde solo > água) do que de composição química (onde salina > não-salina); as dissimilaridades funcionais também foram menores que as taxonômicas, mas sua intensidade manteve relação com o grau de diferença de ambiente. No terceiro capítulo, o sequenciamento e processamento de amplicons provindos dos domínios A e C de enzimas NRPS, e KS de enzimas PKS, confirmou o mangue estudado como fonte potencial de metabólitos secundários. As medidas de diversidade não mostraram um padrão entre domínios enzimáticos, mas sugerem os melhores grupos para prospecção: verão | localização B para domínios A, inverno | localização B para domínios C, e inverno | localização A para domínios KS. Apesar de muitas sequências encontradas terem sido taxonomicamente afiliadas a gêneros reportadamente envolvidos na síntese desses metabólitos secundários, a descoberta de novos produtores é esperada dado o número de OTUs reportados e a presença de muitas sequências relacionadas a bactérias não caracterizadas. Os resultados apresentados devem servir de base para futuros estudos de prospecção direcionada. Abstract: The description of penicillin revealed that microorganisms were the primary source of many natural products with pharmacological application. Its successful adoption as a medicament was followed by a prolific period in the isolation of new drugs obtained from microorganisms found in the environment. However, the pace of new discoveries decreased when it was noticed that the vast majority of microorganisms was not readily cultivable in laboratorial conditions, while the pathogenic organisms targeted by drugs in use developed resistance. It soon became evident that the enterprise should try new strategies. Researchers started studying new classes of secondary metabolites, among which much attention was given to the products of non-ribosomal peptide synthetases (NRPS) and polyketide synthases (PKS). The modules building these enzymatic systems are formed by some basic and optional domains, which, from simple precursors - amino acids and acetate, respectively - are able to synthetize molecules with an incredible structural variety, many with equality diverse biological activity. Another front of investigation took advantage of the advances in isolation and cultivation-independent research techniques to explore environments previously neglected, like the ocean, which soon revealed to host a whole new range of microorganisms and derived products. Besides specific functional information, the efficient and sustainable exploration of such environments demands a better characterization of their microbial communities; microorganisms are essential components of their functioning, yet this literature is scarce. Following from these, this work proposed investigating the microbiome of mangrove sediments from the region of Paranaguá Bay, Paraná, Brazil, through metagenomics. In the first chapter, we used 16S rRNA gene-amplicon sequencing to characterize the community present and to determine the environmental factors shaping this structure. We found a predominance of phyla Proteobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria, Chloroflexi and Acidobacteria, almost all significantly affecting the intralocal structures. The most abundant classes were Deltaproteobacteria, Gammaproteobacteria and Alphaproteobacteria. We revealed a strong influence of the chemical composition derived from the proximity to sea, being significant the factors pH (SMP), H++Al3+, Ca2+, Mg2+, Na+, T, P, Na% and Ca/Mg, but we found no plant effect, a possibility described in the literature. We compared this community with those of other mangroves and found similarities that point to a biome-dependent characteristic profile, dominated by the same abundant phyla found in the mangrove from Paraná. In the second chapter, we performed the shotgun sequencing of two mangrove samples from different environments to determine their functional profile. Prevailing functions were related to clustering-based subsystems, carbohydrates, amino acids and derivatives, and miscellaneous functions. In lowest hierarchy levels, the relative abundance of functions is generally balanced. The functional differences were also dependent on environmental factors, but this influence was smaller than in the taxonomic profile, which indicates functional resilience in front of external changes. The similarities of mangroves to other biomes were more dependent on matrix type (where soil > water) than on chemical composition (where saline > nonsaline); the functional dissimilarities were also smaller than the taxonomical, but the intensity kept its relation to the degree of environmental difference. In the third chapter, sequencing and processing of amplicons derived from A and C domains from NRPS, and KS from PKS, confirmed the studied mangrove as a potential source of secondary metabolites. The diversity measures showed no pattern among the enzymatic domains, but suggest the most suitable groups for prospection: summer | location B for A domains, winter | location B for C domains, and winter | location A for KS domains. Even though many sequences were taxonomically affiliated to genera reportedly involved in the production of such secondary metabolites, the discovery of new producers is expected given the number of OTUs reported and the presence of many sequences affiliated to uncharacterized bacteria. The results presented will be the basis for future studies of directed prospection.

Orientadora : Profª Drª Roseli Wassem Co-orientadora : Profª Drª Ana Claudia Bonatto Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 30/03/2016 Inclui referências : f. 95-111 Área de concentração Resumo: Sinorhizobium fredii NGR234 é um microrganismo capaz de fixar nitrogênio e é considerado um organismo modelo para estudos envolvendo interação simbiótica, devido a diversos trabalhos realizados com essa estirpe e ao conhecimento que se tem acerca de seu genoma. As interações planta-bactéria são consequência da troca de sinais moleculares específicos entre as espécies, de forma coordenada e integrada. Conhecer, a nível molecular e genético, as mudanças que ocorrem no metabolismo desses organismos, além da regulação de sinais e a expressão diferencial de genes quando o rizóbio se encontra sob diferentes condições é de grande importância para o processo de simbiose. Com o intuito de identificar diferenças no processo de interação entre S. fredii NGR234 e Phaseolus vulgaris, Tephrosia vogelii e Vigna unguiculata, foi analisado o transcriptoma de NGR234 através de RNA-Seq buscando os genes diferencialmente expressos. A confirmação de alguns genes que se mostraram diferenciais foi realizada através de RT-qPCR e de fusão transcricional a gene repórter (gfp) para observação de fluorescência em cortes de nódulos utilizando microscopia confocal. Além disso, esses genes foram analisados, com a finalidade de indicar as vias metabólicas e processos celulares de S. fredii NGR234 que esses genes pertencem, e assim, discutir a nível gênico as causas e consequências dessas diferenças. Como resultado, um pequeno número de genes diferencialmente expressos foi associado com o tipo de nódulo (determinado ou indeterminado), e várias evidências confirmaram que uma melhor fixação de nitrogênio ocorre em T. vogelii e em V. unguiculata. Os genes que compõem os operons do sistema de secreção tipo três (TTSS) e de síntese de lipopolissacarídeos ricos em ramnose foram mais expressos nos bacteroides de P. vulgaris e T. vogelii, em relação aos de V. unguiculata. Além das análises de genes diferencialmente expressos, uma análise preliminar de identificação de ncRNAs também foi realizada, já que nessa espécie não existe um amplo conhecimento acerca dos ncRNAs presentes em seu genoma. De um modo geral, esse trabalho gerou um conjunto de dados que poderá ser utilizado como referência para futuras investigações e estudos de vias e sistemas envolvidos na simbiose. Esses estudos serão importantes para um entendimento mais específico do processo de nodulação. Abstract: Sinorhizobium fredii NGR234 is a microorganism that is able to fix nitrogen. It is considered a model organism in studies involving symbiotic interaction due to extensive research with this strain and what is known about its genome. Plant-bacteria interactions are a result of the exchange of specific molecular signals between species, in a coordinated and integrated way. The information about molecular and genetic changes that occur in the metabolism of these organisms, the signaling regulation, and the differential expression when the Rhizobium is under different conditions is of great importance in the process of symbiosis. In order to identify differences in the interaction process between S. fredii NGR234 and Phaseolus vulgaris, Tephrosia vogelii and Vigna unguiculata, the NGR234 transcriptome was analyzed using RNA-Seq, seeking differentially expressed genes. Confirmation of genes that seemed differential was performed by RT-qPCR and by confocal microscopy with transcriptional fusion with gfp as reporter gene. In addition, these genes were analyzed in order to recognize the S. fredii NGR234 metabolic pathways and cellular processes in which they take part, and thus discuss the causes and consequences of these differences. As a result, a small number of differentially expressed genes was associated with the type of nodule (determinate or indeterminate), and multiple lines of evidence confirmed that better nitrogen fixation occurs in T. vogelii and V. unguiculata. The genes present in the operons of the Type Three Secretion System (TTSS) and the synthesis of lipopolysaccharides rich in rhamnose were more expressed in P. vulgaris and T. vogelii bacteroids when compared to V. unguiculata. ncRNAs preliminary analysis was also performed, since there is no extensive knowledge about the ncRNAs that are present in the S. fredii NGR234 genome. Overall, this study has generated a data set which can be used as reference for future research and studies of the pathways and systems involved in symbiosis. These studies will be important for a more specific understanding of the nodulation process.