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Leptospira é um gênero de bactérias espiroquetas que inclui espécies saprofíticas ou não patogênicas de vida livre encontradas em água ou solo, e espécies patogênicas, que são os agentes etiológicos da leptospirose. Esta doença é uma zoonose de incidência global, ocorrendo principalmente em países tropicais e subtropicais. A leptospirose pode ser assintomática ou sintomática com quadros clínicos variáveis nos seres humanos. Os determinantes de virulência e patogenicidade das leptospiras ainda permanecem pouco compreendidos. Em vista disso, foi realizada uma análise global das proteínas expressas na espécie saprofítica, L. biflexa, para comparar com o proteoma da espécie patogênica, L. interrogans, disponível na literatura. A partir desta análise comparativa, o objetivo principal seria reconhecer os potenciais alvos envolvidos na virulência e patogênese da L. interrogans. Foram identificadas 2.327 proteínas por espectrometria de massas na L. biflexa representando 64% das proteínas preditas no genoma desta bactéria. As proteínas identificadas nas duas espécies apresentaram uniformidade funcional pelo software COG. Aproximadamente 80% das proteínas tiveram localizações subcelulares definidas pelo software PSORTb, e 21% das proteínas apresentaram peptídeos sinais de exportação pelos softwares SignalP e LipoP. As vias metabólicas do complexo B (B1, B2, B6, B7 e B9) foram identificadas nas duas espécies de leptospiras, já as vias B12 e do ácido siálico apenas na espécie patogênica. Também foram identificadas as proteínas ortólogas e exclusivas nas duas espécies de leptospiras pelo software Get Homologues. As proteínas ortólogas foram posteriormente classificadas como pouco conservadas e conservadas. Destas análises, selecionaram-se apenas as proteínas pouco conservadas e as proteínas exclusivas da L. interrogans para serem melhor investigadas conforme os resultados obtidos sobre função biológica (COG), localização subcelular (PSORTb e CELLO) e peptídeo sinal de exportação (SignalP e LipoP), juntamente das análises de domínios estruturais pelos softwares Pfam e SMART. Um total de 1.109 proteínas foi previamente selecionado na L. interrogans. Deste total, selecionamos 738 proteínas com domínios estruturais (108 pouco conservadas e 93 exclusivas) e 123 proteínas sem domínios estruturais (59 pouco conservadas e 64 exclusivas). Estas últimas foram baseadas exclusivamente em suas localizações como proteínas de membrana externa, extracelulares e proteínas sem localização definida. Segundo esses critérios, temos 861 proteínas selecionadas como potencias alvos envolvidos na virulência das leptospiras patogênicas. Leptospira is a genus of spirochete bacteria that includes free-living saprophytic or non-pathogenic species found in water or soil, and pathogenic species, which are the etiologic agents of leptospirosis. This disease is a zoonosis of global incidence, occurring mainly in tropical and subtropical countries. Leptospirosis can be asymptomatic or symptomatic with variable clinical conditions in humans. The virulence and pathogenicity determinants of leptospires still remain poorly understood. In view of this, we performed a global analysis of the proteins expressed in the saprophytic species, L. biflexa, to compare with the proteome of the pathogenic species, L. interrogans, available in the literature. From this comparative analysis, the main objective is to recognize the potential targets involved in virulence and pathogenesis of L. interrogans. A total of 2,327 proteins were identified by mass spectrometry in L. biflexa representing 64% of the predicted proteins in the genome of this saprophytic species. The proteins identified in both species showed some functional uniformity by the COG software. Approximately 80% of the proteins had subcellular locations defined by the PSORTb software, and 21% of the proteins showed signal peptides predicted by SignalP and LipoP softwares. The vitamin B complex metabolic pathways (B1, B2, B6, B7 and B9) were identified in both species of leptospires, whereas the B12 and sialic acid pathways were identified only in the pathogenic species. The orthologous and exclusive proteins in the two species of leptospires were also identified by the software Get Homologues. The orthologous proteins were later classified as low conserved and conserved. From these analyses, only low conserved and exclusive proteins to L. interrogans were selected to be better investigated according to the results obtained on biological function (COG), subcellular localization (PSORTb and CELLO) and export signal peptide (SignalP and LipoP), together with the analysis of structural domains by Pfam and SMART softwares. A total of 1,109 proteins were previously selected in L. interrogans. From this total, we selected 738 proteins with structural domains (108 low conserved and 93 unique) and 123 proteins without structural domains (59 low conserved and 64 unique). The latter were based exclusively on their locations as outer membrane proteins, extracellular proteins and proteins with no defined location. According to these criteria, we have 861 proteins selected as potential targets involved in the virulence of pathogenic leptospires.

Diabetes mellitus (DM) compreende um conjunto de doenças metabólicas de grande importância e incidência mundial. Nele, o DM do tipo 1 é caracterizado pela destruição de células pancreáticas produtoras de insulina, e dentre seus sintomas, a disfunção imunológica relacionada à falta de insulina foi observada por diversos estudos, descrevendo pacientes diabéticos como mais susceptíveis a infecções e complicações decorrentes destas. Paracoccidioidomicose (PCM) é uma enfermidade sistêmica causada por fungos da espécie Paracoccidioides sp., bastante importante no Brasil e endêmica em toda a América Latina. Este trabalho utiliza um modelo de carência relativa de insulina (DM experimental) para estudar a intervenção da insulina em um modelo de micose pulmonar causada por P. brasiliensis, analisando o processo de migração celular (expressão de moléculas de adesão por imunohistoquímica e fenótipo dos leucócitos do pulmão por citometria de fluxo), os mecanismos moleculares (produção/liberação de citocinas por cytometric bead array), intracelulares (vias de sinalização por Western blot), e a atividade fagocítica e microbicida dos macrófagos alveolares. Em resultados observamos que, comparados aos não-diabéticos, camundongos tornados diabéticos apresentam maior susceptibilidade evidenciada por menor atividade fagocítica e reduzidas secreções de interferon-γ e de interleucina-12 na fase inicial da inflamação, que leva a uma resposta menos efetiva com menor expressão de molécula de adesão de células vasculares, reduzidas populações de linfócitos TCD4+, TCD8+, células natural killer, culminando em inflamação crônica resultante da proliferação aumentada do fungo nos pulmões (aumento de interferon-γ e fator necrótico tumoral-β). Vemos ainda que o tratamento de insulina em animais diabéticos restaurou as secreções de citocinas pró-inflamatórias e a atividade fagocítica de macrófagos em 24 horas de infecção, e aumentou a celularidade, a expressão de moléculas de adesão de células vasculares-1 e restaurou as populações de linfócitos B, de células natural killer e de células coestimuladas por CD80, além de reduzir a inflamação crônica no pulmão. Estes dados em conjunto nos permitem inferir que a insulina modulou o ambiente inflamatório de animais tornados diabéticos de formas diferentes em estágios iniciais e tardios da infecção pelo isolado Pb18 do Paracoccidioides brasiliensis Diabetes mellitus comprehends a group of metabolic diseases of great importance and incidence worldwide. Type 1 diabetes mellitus is characterized by destruction of insulin producing-pancreatic cells and, among its symptoms, an impaired immunological function has been observed in many studies having diabetic patients described as more susceptible to infections and complications resulted of them. Paracoccidioidomycosis is a systemic disease caused by fungi of Paracoccidioides spp. , also of great importance in Brazil and endemic in the whole Latin America. This work uses a model of experimental T1DM to investigate the intervention of insulin in a model of murine PCM induced by Paracoccidioides brasiliensis, analyzing the process of cell migration (adhesion molecules expression, leukocyte phenotyping), molecular mechanisms (production and secretion of cytokines), intracellular mechanisms (signaling pathways) and phagocytic and microbicidal activities in alveolar macrophages. In results, compared to controls, we observed higher susceptibility in diabetic mice to PCM, evidenced by reduced phagocytic activity and reduced levels of interferon-γ and interleukin-12 on initial stages of infection, and a less effective inflammation with lesser expression of adhesion molecules, reduced migration of TCD4+, TCD8+, NK cells and B lymphocytes, resulting in chronic inflammation caused by higher fungal proliferation in lungs (higher interferon-γ and tumours necrosis factor-α levels). In addition, we saw treatment with insulin in diabetic animals restored secretion of pro-inflammatory cytokines and phagocytic activity on early stages and allowed higher cellularity, higher expression of vascular cells adhesion molecule-1 and restored populations of B lymphocytes, NK cells and the expression of costimularoty molecule CD80, also reducing the chronic inflammation in lungs. Taken together, these data lead us to suggest insulin modulated the inflammatory microenvironment in lungs of mice rendered diabetic, in different forms on earlier and later stages of an infection by Pb18 isolate

A leptospirose é uma zoonose de distribuição global causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. A doença possui um quadro de manifestações clínicas muito variadas em humanos, que pode apresentar febre, dores de cabeça e muscular, até um quadro clínico mais severo, conhecido como síndrome de Weil, caracterizado por hemorragias, icterícia, falência renal e hepática. Até o presente momento, os mecanismos de patogenicidade da leptospira não são totalmente claros e não existe uma vacina eficaz contra a doença. O sequenciamento de genomas de leptospiras patogênicas possibilitou a identificação de proteínas da membrana externa conservadas entre cepas patogênicas, que são os principais alvos de pesquisa para elucidar os mecanismos de patogenicidade e possivelmente o desenvolvimento de uma vacina. Nesse sentido, foram selecionados por bioinformática os genes LIC11711 e LIC12587 a partir do genoma sequenciado de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni, os quais codificam para duas preditas lipoproteínas hipotéticas de funções desconhecidas. Os genes foram amplificados por PCR a partir do DNA genômico da bactéria e clonados no vetor de expressão pAE. As proteínas recombinantes foram expressas em E. coli BL21 DE3 Star pLysS e purificadas por cromatografia de afinidade a metal. As proteínas recombinantes foram inoculadas em camundongos para avaliação da sua atividade imunogênica e obtenção de soros imunes. Ambas as proteínas recombinantes se mostraram reativas com anticorpos em soros de pacientes diagnosticados com a doença, apresentando uma sensibilidade maior em relação ao teste de aglutinação microscópica (MAT), e alta especificidade, diferenciando anticorpos presentes em soros de pacientes diagnosticados com outras doenças não relacionadas. Os resultados de ELISA de bactéria intacta, proteólise por proteinase K e imunofluorescência sugerem que ambas as proteínas estão localizadas na membrana externa bactéria. Com base no ensaio de conservação por western blotting, as proteínas nativas estão presentes em diferentes cepas patogênicas de Leptospira, e ausentes na espécie saprófita L. biflexa. Em ensaios de adesão in vitro, as proteínas recombinantes interagiram com os componentes humanos laminina, e-caderina, plasminogênio, fibrinogênio, fibronectina plasmática, vitronectina, C7, C8 e C9 de forma dose-dependentes, porém com valores de afinidade baixos. Estes resultados sugerem que as proteínas codificadas pelos genes LIC11711 e LIC12587 são expressas durante a patogênese e podem desempenhar múltiplas funções a partir da interação com diferentes componentes, e deste modo auxiliam nas etapas de invasão, disseminação e evasão do sistema imune, auxiliando as leptospiras no processo de infecção. Leptospirosis is a zoonosis of global distribution caused by pathogenic bacteria of the genus Leptospira. The disease has a wide range of clinical manifestations in humans, which can present with fever, headaches and muscular pain, to a more severe clinical condition, known as Weil\'s syndrome, characterized by hemorrhages, jaundice, renal and hepatic failure. So far, the pathogenicity mechanisms of leptospira are not entirely clear and there is no effective vaccine against a disease. Sequencing of pathogenic leptospires genomes has enabled the identification of conserved outer membrane proteins among pathogenic strains, which are the main research focus to understand the mechanism of pathogenicity and possibly identify a vaccine candidate. In this sense, the genes LIC11711 and LIC12587 were selected from the genome sequence of Leptospira interrogans serovar Copenhageni by bioinformatics, which encode two hypothetical predicted lipoproteins of unknown functions. The genes were amplified by PCR from the genomic DNA of the bacteria and cloned into pAE expression vector. The recombinant proteins were expressed in E. coli BL21 DE3 Star pLysS and purified by metal affinity chromatography. Recombinant proteins were inoculated in mice to evaluate their immunogenic activity and to obtain immune sera. Both recombinant proteins are reactive with antibodies in sera from patients diagnosed with a disease, presenting higher sensitivity than the microscopic agglutination test (MAT), high specificity, differentiating antibodies present in sera from patients diagnosed with other non-specific diseases related. The results of intact bacterial ELISA, proteinase K proteolysis and Immunofluorescence suggest that both proteins are located in the surface of the bacteria. Based on western blotting conservation assay, the coding sequences are present in different pathogenic strains of Leptospira, and absent in the nom-pathogenic L. biflexa. In in vitro adhesion assays, recombinant proteins showed interaction with the human components laminina, e-cadherin, plasminogen, fibrinogen, plasma fibronectina, vitronectin, C7, C8 and C9, in dose-dependent manner, but with low affinity values. These results suggest that the proteins encoded by the genes LIC11711 and LIC12587 are expressed during the infection and may perform multiple tasks and thus assist in the steps of invasion, dissemination and evasion of the immune system, helping leptospires during the establishment of the disease.

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica de natureza profunda e granulomatosa, que afeta preferencialmente o tecido pulmonar causada pelo Paracoccidioides brasiliensis, um fungo que exibe dimorfismo térmico. O P. brasiliensis interage com células apresentadoras de antígenos (APCs), alterando suas principais funções biológicas. Entre as APCs, os macrófagos são células que desempenham um papel importante na indução e regulação da resposta imune e/ou inflamatória. São células do sistema fagocítico mononuclear que podem discriminar entre o que é próprio do organismo e os patógenos, através da expressão de receptores de reconhecimento padrão (PRR) que reconhecem padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs), sendo células importantes no processo de fagocitose controlando o crescimento destes patógenos. Recentemente tem sido demonstrada a importância dos receptores Notch na regulação da atividade de macrófagos e do sistema imune. Os ligantes de Notch estão envolvidos nas locais inflamatórios de infecção devido ao aumento da expressão dos mesmos na superfície de células envolvidas neste processo. Considerando que a sinalização Notch pode estar envolvida na modulação da função de macrófagos, nós avaliamos se P. brasiliensis tem a capacidade de modular a ativação desta via e interferir na produção de citocinas pró-inflamatórias. Para isso, macrófagos J774, pré-estimulados com LPS ou não, foram interagidos com leveduras do fungo, seguido por análise de PCR em tempo real e citometria de fluxo, dosagem de citocinas e índice de fagocitose. Nossos dados revelaram que na presença do fungo existe aumento dos níveis de transcrição do receptor Notch 1 e diminuição da transcrição do ligante Delta 4 em macrófagos pré-estimulados com LPS. Entretanto, verificamos que o fungo sozinho não é capaz de induzir a transcrição de NF-κB, nem na presença do LPS, mas quando os macrófagos são estimulados com LPS e sofrem inibição da via de Notch existe aumento dos níveis de transcritos após interação com o fungo, sugerindo que esse fator é ativado na ausência de Notch. Nesse contexto de inibição de Notch, evidenciamos que a fagocitose de leveduras do fungo por macrófagos tornou-se mais eficiente, visto que houve aumento do índice de fagocitose na ausência de Notch. Foi possível verificar que o fungo tem a capacidade de promover a produção de IL-6 via TLR-Notch, fazendo-nos supor que essa citocina seja importante para o estabelecimento da doença ao ser benéfica para o fungo e prejudicar o hospedeiro. E concomitantemente ao aumento de IL-6 existe diminuição da produção de TNF-α. Com base nesses resultados, podemos sugerir que o P. brasiliensis utiliza a via de sinalização Notch como um mecanismo de escape. A interação entre as leveduras do fungo e os macrófagos promove a ativação dessa via, através do receptor Notch 1, induzindo maior produção de IL-6, citocina importante para o crescimento do fungo no hospedeiro, conjuntamente com a diminuição de TNF-α prejudicando a atividade fungicida dos macrófagos. Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis and deep granulomatous in nature, which affects mainly the lung tissue caused by Paracoccidioides brasiliensis, a fungus that exhibits thermal dimorphism. The P. brasiliensis interacts with antigen presenting cells (APCs), changing its main biological functions. Among the APCs, macrophages are cells that play an important role in the induction and regulation of the immune response and/or inflammatory response. They are cells of the mononuclear phagocytic system that can discriminate between what is characteristic of the organisms and pathogens, by expression of pattern recognition receptors (PRR) that recognizes the pathogen-associated molecular pattern (PAMPs), and are considered cells important in phagocytosis for controlling the growth of these pathogens. It has been recently demonstrated the importance of the Notch receptor in regulating the activity of macrophages and of the immune system. The ligands of Notch are involved in inflammatory sites of infection because there are increased expression of these ligands on cell surface involved in this process. Whereas the Notch signaling may be involved in modulating macrophage function, we evaluated whether P. brasiliensis has the ability to modulate the activation of this pathway and interfere with the production of pro-inflammatory cytokines. For this, J774 macrophages, pre-stimulated with LPS or not, are interacted with yeast fungus, followed by Real Time PCR analysis and flow cytometry, cytokine and phagocytosis index. Our data showed that the presence of the fungus exists increased levels of transcription of the Notch 1 receptor, and a decrease in ligand Delta 4 transcription on macrophages pre-stimulated with LPS. However, we found that the fungus itself is not able to induce transcription NF-κB, even in the presence of LPS, but when macrophages are stimulated with LPS and suffer inhibition of the Notch signaling, exists increased levels of transcripts after interaction with the fungus, suggesting that this factor is activated in the absence of Notch. Within the context of inhibition of Notch, we found that phagocytosis of yeasts by macrophages become more efficient, since the increased rate of phagocytosis in the absence of Notch. It was verified that the fungus has the ability to promote the production of IL-6 via TLR-Notch, making us suppose that this cytokine is important for the establishment of the disease to be beneficial for the fungus and damage the host. And concurrently with increased IL-6 there is decreased production of TNF-α. Based on these results, we suggest that P. brasiliensis uses the Notch signaling pathway as an escape mechanism. The interaction between the yeasts with macrophages promotes the activation of this pathway, by means of a Notch 1 receptor, inducing increased production of IL-6 cytokine important for the growth of fungus on host, together with a reduction of TNF-α, contributing with a damaging fungicidal activity of macrophages.

A paracoccidioidomicose (PCM) é a micose sistêmica mais frequente no Brasil. Na última década, foi demonstrado que é possível enviar antígenos diretamente para as células dendríticas utilizando o anticorpo αDEC205 e na presença de um estímulo de maturação, o resultado é a indução de uma resposta imunológica. Verificamos que o anticorpo αDEC fusionado ao peptídeo P10 induziu uma resposta por células produtoras de IFN-γ após uma única dose em relação à administração de P10, mesmo tendo sido administrado em uma concentração menor. Entretanto, essa resposta não se manteve após segunda dose do anticorpo. Após desafio dos animais com P. brasiliensis, imunizados com duas doses do anticorpo quimérico, detectamos níveis de IFN-γ e IL-4 no tecido pulmonar estatisticamente maiores no grupo αDEC/P10 e ISO/P10 em relação à administração de P10, todos em presença de Poly I:C. Em ensaios de terapia, verificamos no pulmão de camundongos tratados com o anticorpo quimérico, principal órgão envolvido em modelo animal de PCM, baixa concentração de IFN-γ e IL-10 em relação aos controles. Em adição, ficou evidente que nos animais tratados com o anticorpo αDEC/P10 o tecido pulmonar está compatível com o tecido de animais não infectados, enquanto que na ausência de tratamento adequado encontramos aglomerados de leveduras e um tecido com aumento no infiltrado celular. Esses achados indicam uma boa evolução clínica em animais tratados e indicam que o direcionamento do P10 através do anticorpo quimérico αDEC/P10, na presença de Poly I:C, é uma estratégia promissora para terapia contra P. brasiliensis. Paracoccidioidomycosis (PCM) is the most common systemic mycosis in Brazil. In the last decade, it was demonstrated that antigens can be directly target to the dendritic cells using the antibody αDEC205 in the presence of a maturation stimulus, resulting in the induction of a strong immune response. We found that αDEC205 antibody fused to peptide P10 induced great response by IFN-γ producing cells after a single dose in relation to the administration of P10, although it has been administered in a lower concentration. However, this response was not maintained after second dose of antibody. Animals challenge with P. brasiliensis, after immunization with two doses of the chimeric antibody, produced high levels IFN-γ and IL-4 in lung tissue significantly higher in αDEC/P10 group in relation to the administration of P10, all in the presence of Poly I:C. In therapy assays, we found in the lungs of mice treated with the chimeric antibody, the main organ involved in an animal model of PCM, low concentration of IFN-γ and IL-10 compared to controls. In addition, it became evident that animals treated with αDEC/P10 antibody have a lung tissue much closer to that of non-infected tissue, while in the absence of suitable treatment we find clusters of yeasts and tissue filled with cellular infiltrates. Altogether, these findings show a clinical improvement in treated animals and indicate that targeting of P10 through the chimeric antibody αDEC/P10 in the presence of Poly I:C, is a promising strategy for therapy against P. brasiliensis.

A paracoccidioidomicose (PCM) é um a micose profunda de natureza granulomatosa, causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis) e que compromete preferencialmente o tecido pulmonar. O P. brasiliensis sintetiza várias substâncias, dentre estas, destaca-se a glicoproteína de 43 kDa (gp43), a qual é considerada o principal componente antigênico do fungo. Dada a importância da gp43, anticorpos monoclonais (Mabs) contra esta glicoproteína foram obtidos e posteriormente caracterizados. Baseado na hipótese da rede idiotípica, Jerne (1974) propôs que cada anticorpo, quando produzido em resposta a um antígeno, induz a formação de outros anticorpos dirigidos contra sua região variável, na qual é única. Anticorpos anti-idiotípicos, que reconhecem o paratopo, contendo a imagem interna do antígeno, são denominados de Ab2-β e seu potencial terapêutico tem sido explorado em diferentes sistemas. Apesar da molécula de anticorpo ser complexa estruturalmente, sabemos que a região Fab, é a responsável pelo mimetismo do antígeno. Então, nosso grupo de pesquisa construiu uma nova molécula de anticorpo à partir do Mab anti-idiotípico Ab2-β, que mimetiza o antígeno gp43 de P. brasiliensis, denominada de fragmento variável de cadeia única (scFv). A transfecção dessa molécula em células dendríticas (DCs) mostrou ser promissora na PCM experimental, visto que estes transfectomas foram eficientes em apresentar a proteína scFv às células dos linfonodos, induzindo linfoproliferação, além de diminuírem a carga fúngica pulmonar. Visto que a molécula de scFv que possui a região de reconhecimento e ativação de linfócitos T mostrou eficiência no modelo de terapia na PCM experimental, o principal objetivo deste trabalho foi analisar os mecanismos pelos quais os transfectomas de DCs ativam a resposta imune em camundongos infectados com o fungo, para que possamos entender melhor a capacidade destas células em modular a resposta imune na PCM experimental. Dessa maneira, avaliamos a capacidade das DCs trasfectadas com pMAC/PS-scFv em migrar para os linfonodos regionais e induzirem uma resposta protetora com produção de IgG, bem como, analisamos o fenótipo destas células e produção de citocinas. Nosso modelo de terapia com pMAC/PS-scFv mostrou-se eficiente, uma vez que observamos diminuição de células T regulatórias nos linfonodos regionais, bem como aumento da produção de citocinas como IFN-γ e IL-12. Ainda, observamos aumento do isotipo IgG2b, sugerindo a modulação de resposta imune para o tipo Th1, importante na proteção da PCM. The paracoccidioidomycosis (PCM) is the nature of granulomatous mycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis) and preferentially compromises lung tissue. The P. brasiliensis synthesizes various substances, among these, there is a 43 kDa glycoprotein (gp43), which is considered a major antigenic component of the fungus. Given the importance of gp43 monoclonal antibodies (Mabs) against this glycoprotein were obtained and further characterized. Based on the idiotypic network hypothesis, Jerne (1974) proposed that each antibody, when produced in response to an antigen, induces the several of other antibodies production against its variable region, which is unique. Anti-idiotypic antibodies that recognize the paratope containing the internal image of the antigen are called Ab2 β and their therapeutic potential has been explored in different systems. Although the antibody molecule is structurally complex, we know that the Fab region, is responsible for antigen mimicking. Therefore, our research group has engineered a new molecule from the antibody Mab-anti-idiotypic Ab2 β that mimics the antigen gp43 of P. brasiliensis, known as single chain variable fragment (scFv). Transfection of this molecule on dendritic cells (DCs) has shown promise in experimental PCM, since these transfection were effective scFv protein present in the cells of the lymph nodes, inducing lymphoproliferation, in addition to reducing fungal burden in the lung. Since the scFv molecule that has the region recognition and activation of T lymphocytes showed efficiency in therapy model in experimental PCM, the main objective of this study was to analyze the mechanisms by which transfected DCs activate the immune response in infected mice with the fungus, so that we can better understand the ability of these cells to modulate the immune response in experimental PCM. Thus, the capacity of transfected DCs with pMAC / PS-scFv to migrate to regional lymph nodes and induce a protective response with IgG production, as well as analyze the phenotype of these cells and cytokine production. Our therapy model with pMAC / PS-scFv was efficient, since we observed decrease of regulatory T cells in regional lymph nodes, as well as increased production of cytokines such as IFN-γ and IL-12. Furthermore, we observed increased IgG2b isotype, suggesting modulation of the immune response to a Th1 response, the protect model of experimental PCM.

A migração de células musculares lisas (VSMC) da camada média do vaso para a íntima é essencial para vasculogênese e contribui para o processo de aterosclerose e estenose após lesão por cateter-balão, caracterizando-se como um importante alvo terapêutico. Diversos trabalhos já demonstraram que fatores de crescimento (como PDGF e FGF) estimulam a migração de VSMC, inclusive, muitos desses fatores de crescimento induzem sinalização redox associadas à geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) (ex. Nox1 NADPH oxidase). Nosso grupo já descreveu interações físicas e regulação funcional da NADPH oxidase por uma chaperona redox do retículo endoplasmático, a Dissulfeto Isomerase Protéica (PDI). Contudo, tanto a relevância fisiológica como os mecanismos desta interação ainda não estão claros. O objetivo geral do presente trabalho é investigar por meio de experimentos de perda e ganho de função da PDI, a importância da PDI na migração celular associada à ativação do complexo NADPH oxidase, bem como possíveis mecanismos envolvidos na interação entre a PDI e esse complexo enzimático durante a migração celular. Os objetivos específicos são: i) avaliar o efeito do silenciamento da PDI, bem como da expressão forçada de PDI wild type na migração de VSMC in vitro; ii) analisar o efeito da transfecção de siRNA da PDI atividade e expressão de distintas isoformas da NADPH oxidase vascular e produção de ROS induzida por PDGF; iii) investigar o envolvimento de RhoGTPases na regulação do complexo NADPH oxidase pela PDI. No presente trabalho, mostramos que o PDGF induz redistribuição da PDI e aumento da produção de ROS. O silenciamento da PDI inibe a produção de ROS e a expressão do mRNA da Nox1, sem alterar a expressão do mRNA da Nox4. Mais ainda, o silenciamento da PDI reduz a migração celular induzida por PDGF, em diferentes modelos de migração, enquanto a super-expressão da PDI induz aumento espontâneo da migração na condição basal. Análise utilizando métodos de Biologia de Sistemas de redes de interação física proteína-proteína em bancos de dados e técnicas de análise de centralidade, topologia e ontologia gênica indicou forte convergência entre PDI e proteínas da família das pequenas RhoGTPases e seus reguladores. Em VSMC com silenciamento da PDI, a presença do PDGF induziu uma redução na atividade de Rac1 e RhoA, sem alterar a expressão total destas proteínas. Estudos mostraram que a PDI colocaliza com Rac1 na região perinuclear e co-imunoprecipita com Rac1 e RhoA, tanto na presença como na ausência de PDGF. Além disso, ocorreu a interação entre PDI e o regulador de GTPases RhoGDI (inibidor da dissociação da guanina) na condição basal (por microscopia confocal e co-imunoprecipitação), diminuída após estimulo com PDGF. O silenciamento da PDI induziu ainda alterações em estrutura de citoesqueleto: desorganização das fibras de estresse, e redução no número e tamanho de adesões focais e vesículas de adesão marcadas por RhoGDI e Rac1. Assim, os dados apresentados no presente trabalho sugerem que a PDI sustenta a migração de VSMC dependente de sinalização redox e RhoGTPases. Além disso, RhoGTPases podem ser um alvo proximal importante mediando a convergência entre PDI e o complexo NADPH oxidase Vascular Smooth Muscle Cell (VSMC) migration into vessel neointima is a therapeutic target for atherosclerosis and post-injury restenosis. NADPH oxidase-derived oxidants synergize with growth factors to support VSMC migration. We described interaction between NADPH oxidases and the endoplasmic reticulum redox chaperone Protein Disulfide Isomerase (PDI) in many cell types. However, physiological implications as well as mechanisms of such association are yet unclear. The aim of the present work was to investigate, througth experiments of gain or loss of PDI function, the importance of PDI in VSMC migration associated to NADPH oxidase. The specific aims were: i) to evaluate effects of PDI silencing or PDI overexpression in VSMC migration in vitro; ii) to evaluate effects of PDI silencing on PDGF-induced NADPH oxidase isoform expression and ROS production; iii) to evaluate the involvement of RhoGTPases on NADPH oxidase regulation by PDI. We show here that PDGF promoted subcellular redistribution of PDI concomitant to ROS production and that siRNA-mediated PDI silencing inhibited such ROS production, while near-totally suppressing the increase in Nox1 expression, with no change in Nox4. Furthermore, PDI silencing inhibited PDGF-induced VSMC migration assessed by distinct methods, while PDI overexpression increased spontaneous basal VSMC migration. To address possible mechanisms of PDI effects, we searched for PDI interactome by PPPI networks, which indicated convergence with small GTPases and their regulator RhoGDI. PDI silencing decreased PDGF-induced Rac1 and RhoA activities, without change in their expression. PDI displayed small detectable points of perinuclear co-localization with Rac1 and co-immunoprecipitated with Rac1 and RhoA in a PDGF-independent way. Moreover, there was PDI association with RhoGDI at baseline (confocal and co-immunoprecipitation), decreased after PDGF. Of note, PDI silencing promoted strong cytoskeletal changes: branched stress fiber disorganization, markedly decreased number of focal adhesions and reduced number of RhoGDI-containing vesicular recycling adhesion structures. Overall, these data suggest that PDI is required to support redox and GTPase-dependent VSMC migration. Moreover, RhoGTPases are a potential upstream target mediating the convergence between PDI and NADPH oxidase