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Beeinträchtigungen der humanen Immunantwort durch primäre Immundefekte (PID) oder Immundysfunktionen können zu einer lebensbedrohlichen Anfälligkeit für Infektionen führen. Der erste Abschnitt dieser Arbeit umfasst die Charakterisierung einer unbekannten IKBKG-Mutation, die zu einer bisher unbeschriebenen NEMO-Defekt-Variante führt. NEMO-Defekte wurden bislang den Defekten der angeborenen Immunität zugeordnet. Die Mutation verursachte jedoch einen zusätzlichen schweren T-Zelldefekt, infolgedessen der Patient in seinem ersten Lebensjahr vermehrt an schweren bakteriellen Infektionen litt. Die Analyse der NEMO-kodierenden Sequenz ergab, dass die Mutation zu einem Exon-Verlust und somit zu einem verkürzten, funktionell-eingeschränkten Protein führte. Im Vergleich mit vorbeschriebenen NEMO-Defekten wurde deutlich, dass das Spektrum der Erkrankungen durch IKBKG-Mutationen breiter als bisher angenommen und die frühzeitige Charakterisierung der Immunantwort zur Abschätzung der individuellen Prognose essentiell ist. Der zweite Abschnitt umfasst die Charakterisierung von anti-Interleukin (IL)-6-Autoantikörpern (AAk) in Patienten, die an mindestens einer schweren bakteriellen Infektion erkrankt waren. 0,6 % dieser Patienten wiesen neutralisierende AAk gegen IL-6 auf, während 0,4 % einer Patientenkohorte mit Autoimmunerkrankungen, 0 % einer Patientenkohorte mit mykobakteriellen Infektionen und 0,1 % von Individuen ohne schwere bakterielle Infektionen anti-IL-6-AAk präsentierten. Des Weiteren wurden drei bislang gesunde Frauen mit neutralisierenden AAk identifiziert. Das Epitop-Mapping zeigte Bindungsstellen, die für die Bildung des IL-6-Rezeptorkomplexes notwendig sind. Die Verlaufsanalyse der Titer ergab, dass trotz persistentem bzw. abfallendem Titer keine weiteren Infektionen eintraten. Zusammenfassend führen anti-IL-6-AAk einerseits zu einer erhöhten Anfälligkeit für bakterielle Infektionen, andererseits ist diese Anfälligkeit nicht in dem Maße ausgeprägt wie bei einem PID. Disturbances of the human immune response in the form of primary immunodeficiencies (PID) or immune dysfunctions can lead to life-threatening infections. The first chapter of this work refers to the analysis of an unknown IKBKG mutation resulting in an undescribed variant of NEMO-deficiency. These defects have been previously assigned to immunodeficiencies of the innate immunity. However, the mutation additionally leads to a severe T-cell defect, whereupon the patient suffered from several severe bacterial infections in his first year of life. Analysis of the NEMO-coding sequence indicated that the mutation leads to an exon skipping and a shortened, functionally restricted protein. The range of diseases caused by IKBKG mutations is broader than previously presumed when compared to other NEMO-deficiencies. Therefore, the early characterization of the immune response is essential for the assessment of the individual prognosis. The second chapter comprises the characterization of anti-IL-6-autoantibodies in a cohort of patients who suffered from at least one severe bacterial infection. 0.6 % of these patients presented neutralizing autoantibodies against IL-6 whereas 0.4 % of patients with autoimmune diseases, 0 % of patients with mycobacterial infections and 0.1 % of individuals without severe infections demonstrated neutralizing autoantibodies against IL-6. In addition, three so far healthy women with neutralizing anti-IL-6-autoantibodies were identified. Analysis of the binding characteristics identified IL-6-binding sites that are essential for the formation of the IL-6 signaling complex. The examination over several years revealed that, despite persistent or decreasing antibody titers, no further or new infections occurred. In summary, anti-IL-6-autoantibodies seem to have an extenuated predisposition to severe infections, but this susceptibility is not as severe as in PID.

Die Ausbildung und der Schweregrad einer Anaphylaxie kann durch verschiedene Co-Faktoren beeinflusst werden. Zu diesen zählen die nichtsteroidalen Antiphlogistika (NSAIDs), die ihre Wirkung über die Inhibition der COX entfalten. Wie NSAIDs den Schweregrad der Anaphylaxie beeinflussen, ist bisher nicht genau bekannt. Interessanterweise zeigen Anaphylaxie-Patienten mit einer NSAID-Hypersensibilität niedrige Konzentrationen des regulatorischen Prostaglandins E2 (PGE2). Zudem zeigen ASA-tolerante und –intolerante Asthma-Patienten variable anaphylaktische Sensitivitäten. Anhand der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob sich eine PGE2-Dysregulation auf die Ausbildung und den Schweregrad der Anaphylaxie auswirkt und ob diese durch genetische Prädispositionen gefördert werden kann. Dazu wurden zunächst die PGE2 Konzentration im Serum von ANA-Patienten und gesunden Individuen gemessen. ANA-Patienten zeigten reduzierte PGE2 Level, die invers mit dem Schweregrad der ANA korrelierten. Unterstützend weisen zwei in der Allergieforschung häufig verwendete Mauslinien, Balb/c und C57BL/6, unterschiedliche PGE2 Level auf, die wiederum invers mit dem ANA-Schweregrad korrelierten. Eine Stabilisierung der PGE2 Konzentration mittels eines pharmakologischen Inhibitors der Hydroxyprostaglandin-Dehydrogenase (15-PGDH-I) in vivo führte zu einer Verbesserung des ANA Schweregrades. Um in diesem Zusammenhang den Einfluss von ASA und PGE2 besser zu verstehen, wurde das Model der systemisch passiven ANA im Mausmodel eingesetzt. ASA verschlimmerte den Schweregrad der ANA durch die Inhibition der COX1/2. PGE2 konnte diese Verschlimmerung über die EP Rezeptoren 2, 3 und 4 reduzieren. Um die zugrundeliegenden Mechanismen der Wirkweise von exogenem PGE2 und EP-Agonisten besser zu verstehen, wurden diese Zusammenhänge in murinen und humanen Mastzellen untersucht. PGE2 reduzierte die Schwere der ANA durch Inhibition der Mastzell-Aktivität in diesem System über die Rezeptoren EP2 und EP4. Anhand der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass bereits homöostatische PGE2 Konzentrationen die Aktivität der Mastzelle verändern und vor einer schweren ANA schützen. Zudem kann der Grad der ANA und der Einfluss des PGE2 auf die Mastzellantwort durch genetische Prädisposition beeinflusst werden. Die pharmakologische Stabilisierung des PGE2 könnte daher eine vielversprechende, therapeutische wie auch vorbeugende Strategie zur Behandlung risikoreicher ANA- Patienten sein., The clinical outcome of anaphylaxis (ANA) can be affected by several co-factors. Non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) are well-known co-factors of ANA acting via COX-inhibition. The NSAIDs-mediated mechanisms altering the severity of ANA are not well-defined. It is reported that patients of ASA (NSAID)-hypersensitivity show low levels of the regulatory prostaglandin E2 (PGE2). Moreover, the effectiveness of PGE2 administration in such patients suggests a critical role of PGE2 in ASA hypersensitivity. In addition, patients of ASA-tolerant and ASA-intolerant asthma show variable ANA sensitivities suggesting a role of genetic variation in susceptibility. The aim of this thesis was to study whether and how PGE2 dysregulation predisposes to ANA and whether genetic pre-dispositions affect the PGE2 system and therefore ANA susceptibility. First, sera from ANA patients and healthy individuals were analyzed for PGE2 levels. ANA patients were characterized by reduced PGE2 levels which inversely correlated with the severity of ANA. This disparity was confirmed by differential PGE2 levels between Balb/c and BL/6 strains, two genetic mouse strains frequently employed in allergy research. PGE2 levels in these mice were again inversely related with the severity of ANA. Results were confirmed by in vivo PGE2 stabilization using 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase inhibitor (15-PGDH-I). Pharmacological PGE2 stabilization ameliorated ANA severity in mice. A passive systemic ANA (PSA) model was applied to study the impact of ASA on ANA severity and the role of PGE2 in this context. ASA aggravated ANA by inhibiting COX-1/COX-2, while PGE2 reduced the aggravation through EP receptors 2, 3 and 4. To delineate the underlying mechanisms, murine and human mast cells were used to study the impact of exogenous PGE2 and EP agonists. PGE2 attenuated ANA severity by inhibiting MC activation through EP2 and EP4 receptors and interfering with MC signaling. In summary, this thesis demonstrates that homeostatic levels of PGE2 modulate MC activation and protect against ANA severity. The impact of PGE2 on MC responses and ANA susceptibility is governed by genetic variation. Pharmacological stabilization of PGE2 may prove to be a therapeutic or preventive strategy in the management of high-risk ANA patients.

Chronisches Nierenversagen kann zu einem endg��ltigen Funktionsverlust der Nieren f��hren. Nierenersatztherapien bleiben dabei die einzigen lebensrettenden Behandlungsma��nahmen. Der globale Bedarf an Nierenorganen ��bersteigt jedoch bei weitem die Anzahl verf��gbarer Spenderorgane. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSC) stellen eine vielversprechende Quelle f��r die Generierung funktioneller Nierenzellen dar. Die hiPSC-abgeleiteten Nierenzellen k��nnten zuk��nftig f��r zellul��re Ersatztherapien verwendet werden. Innerhalb dieser Arbeit sollten die aus hiPSC-abgeleiteten Nierenzellen auf ihre Immunogenit��t ��berpr��ft werden. Daf��r wurden hiPSC-Linien, reprogrammiert aus prim��ren Urinzellen gesunder Spender, generiert. Die hiPSC wurden daraufhin in renale Vorl��uferzellen (IM-Zellen) und proximale Tubuluszellen (PT-Zellen) differenziert. Die immunph��notypische Analyse ergab eine generell verminderte Expression immun-relevanter Gene verglichen zu adulten Urinzellen. F��r die Immunigenit��tsbestimmung wurden die Nierenzellen jeweils mit autologen oder allogenen Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) kokultiviert. Die IM- sowie PT-Zell-Kokulturen mit PBMC gesunder Spender sowie von Patienten mit diabetischer Nephropathie ergaben keine Proliferation autoreaktiver sowie allogener T-Zellen, im Vergleich zu prim��re Urinzellen mit gleichen HLA-Merkmalen. Des Weiteren wiesen IM- und PT-Zellen aktive immunsupprimierende Eigenschaften auf. Diese konnten in langzeit-kultivierten PT-Zellen nicht mehr beobachtet werden. Zus��tzlich zeigten die hiPSC-abgeleiteten Nierenzellen eine Anf��lligkeit gegen��ber autologe sowie allogene nat��rliche Killerzellen (NK-Zellen). Diese Studie ergab erstmalig Einblicke in die Dynamiken der T- und NK-Zell-Antworten renal differenzierter hiPSC. Die hier gewonnenen Erkenntnisse k��nnen f��r die Entwicklung zuk��nftiger Therapien beitragen, um eine sichere Transplantation von hiPSC-abgeleiteten Nierenzellen, selbst im allogenen System, zu erm��glichen., Kidneys are essential for numerous vital processes. Chronic damage can lead to end stage renal disease with the requirement of kidney replacement therapies. Kidneys are nowadays the most frequently transplanted human organs, however, the transplant demand is far exceeding the number of available donations. Human induced pluripotent stem cells (hiPSC) represent a promising alternative approach for the generation of functional renal differentiated cells suitable for autologous cell replacement therapies (CRT). Yet, the immunogenic potential of hiPSC and their progenies are among the major concerns. This study aimed to analyze immunogenic effects of hiPSC-derived renal cells in autologous and allogeneic settings in vitro. Therefor, primary urinary cells (pUC) from healthy donors were reprogrammed into hiPSC, which were differentiated into renal progenitors (IMC) and into proximal tubular cells (PTC). Immune-phenotypic characterization revealed overall reduced expression of immune-relevant genes in hiPSC and renal derivatives compared to pUC. Co-culture experiments of IMC or PTC with either autologous or allogeneic peripheral blood mononuclear cells of healthy donors or patients with diabetic nephropathy revealed no induction of T cell proliferation in comparison to pUC cells with the same HLA-types. IMC and PTC showed immunomodulatory effects on allogeneic T cell proliferation. These immunosuppressive capacities were lost in long-term cultivated PTC. hiPSC-derived renal cells showed to elicit autologous as well as for allogeneic natural killer cells (NK cells). This study provided insights about the immunogenic properties of hiPSC-derived renal cells. In vitro experiments revealed new hints about the dynamics of T- and NK cell responses dependent on the differentiation status of hiPSC-derived renal cells. These data show translational potential for the development of future CRT strategies aiming safe transplantation of hiPSC-derived renal cells across HLA barriers.

Differenzierungsentscheidungen von Zellen werden durch die Integration mehrerer Stimuli bestimmt. Die Differenzierung von Helfer-T-Zellen (Th-Zellen) ist hierfür ein gut untersuchtes Beispiel: reife Th-Zellen entwickeln sich beim Kontakt mit einem für sie spezifischen Antigen zu einem spezialisierten Subtyp, der von den in ihrer Umgebung vorhandenen Zytokinen abhängt und exprimieren dann einen spezifischen Mastertranskriptionsfaktor. Die häufigsten Th-Zell-Subtypen sind T-bet-exprimierende Th1-Zellen und GATA-3-exprimierende Th2-Zellen. Neuere Entdeckungen bezüglich der Plastizität von Th-Zell-Subtypen sowie die Existenz von T-bet+GATA-3+ Hybrid-Phänotypen haben die detaillierte Untersuchung vom Differenzierungsprozessen von Th-Zellen mit komplexer Zytokinsignale motiviert. Dazu haben wir systematisch die Zytokine IFN-g, IL-12 und IL-4 während der primären Differenzierung Th-Zellen titriert und Signaltransduktion und Zielgenexpression quantifiziert. Der Umfang und die Komplexität der Daten machten eine systematische Analyse notwendig, um involvierte Mechanismen genau zu identifizieren. Lineare Regressionsanalyse wurde verwendet, um die Netzwerktopologie zu extrahieren, wobei schon bekannte und zahlreiche neue Interaktionen vorausgesagt wurden. Die prognostizierte Netzwerktopologie wurde dann verwendet, um ein mechanistisches, mathematisches Modell der Zytokinsignalintegration zu entwickeln. Diese Methode hat ein hochgradig vernetztes regulatorisches Netzwerk inferiert. Bisher nicht beschriebene Funktionen von STAT-Proteine, die die Neuverkabelung des Netzwerkes während der Differenzierung vermitteln, wurden vorhergesagt. Ausgewählte neue Interaktionen wurden in gezielten genetischen Experimenten bestätigt. Während gegenseitige Inhibitionsmotive oft als kanonische digitale Schalter interpretiert werden, funktioniert das Th-Zell-Netwerk als ein Rheostat, der Variationen der Zytokinsignale in graduelle Expressionsänderungen der Mastertranskriptionsfaktoren übersetzt. Unsere Arbeit erklärt mechanistisch das beobachtete Kontinuum von Th-Zelldifferenzierungszuständen entlang der Th1-Th2-Achse und beschreibt eine quantitative Methode für die datenbasierte Inferenz zellulärer Netzwerke der Signalintegration. Cell-fate decisions are governed by the integration of multiple stimuli. Th cell differentiation is a well-studied example thereof: mature Th cells differentiate into a specialised subtype upon encounter with their cognate antigen depending on the polarising cytokines present in their environment and start expressing specific master transcription factors. The most common Th cell subtypes are T-bet-expressing Th1 cells and GATA-3-expressing Th2 cells. Recent discoveries concerning the plasticity of Th cell subtypes as well as the existence of stable T-bet+GATA-3+ hybrid Th1/2 phenotypes have stimulated the detailed study of the differentiation process under different assumptions than the hitherto valid paradigm of single master transcription factor expression by using complex cytokine signals as inputs. Here, we developed a data-based approach for inferring the molecular network underlying the differentiation of T-bet- and/or GATA-3 expressing lymphocytes. We performed systematic titrations of the polarising cytokines IFN-g, IL-12 and IL-4 during primary differentiation of Th cells and quantified signal transduction as well as target-gene expression. The size and complexity of the dataset made a systematic analysis necessary to identify the mechanisms involved. To extract the network topology, we used linear regression analysis, retrieving known regulatory mechanisms and predicting numerous novel ones. This network topology was used to develop a mechanistic mathematical model of cytokine signal integration. This approach inferred a highly connected regulatory network. Previously undescribed functions of STAT proteins mediating network rewiring during differentiation were predicted. Selected new interactions were confirmed by experiments using gene-deficient cells. Importantly, while mutual-inhibition motifs are often considered canonical digital switches, the inferred Th-cell network acts as a rheostat, generating a continuum of differentiated states along the Th1-Th2 axis. This work explains the observed Th1-Th2 cell fate continuum mechanistically and provides a quantitative framework for the data-based inference of cellular signal integration networks.

Angeborene lymphoide Zellen (ILCs) sind sich im Gewebe befindliche Zellen, die eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase spielen. ILCs wurden in verschiedenen Organen untersucht. Ob ILCs im zentralen Nervensystem (ZNS) vorhanden sind und wenn ja, welchen ​​Phänotyp und welche funktionellen Eigenschaften sie in diesem Organ aufweisen, sind Fragen, die bisher unbeantwortet blieben. NK-Zellen sind die seit langem bekannten ILC-Mitglieder, die viele Merkmale mit ILC1s teilen. Im Zusammenhang mit der Autoimmunität wurde gezeigt, dass NK-Zellen eine immunmodulatorische Rollen spielen. Anhand des Tiermodells von Multiple Sklerose, der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis, zeigte unsere Gruppe, dass reife NK-Zellen auf CX3CR1-abhängige Weise in das ZNS rekrutiert werden. Auf der Grundlage dieser Beobachtungen will ich in meinem PhD Projekt die Chemokinrezeptoren definieren, die die Rekrutierung der unreifen NK-Zellen in das entzündete ZNS vermitteln. Des Weiteren will ich herausfinden, ob die phänotypisch definierten NK-Zellen (CD3-NK1.1 + -Zellen) die im gesunden ZNS vorhanden sind, echte NK-Zellen sind, oder sie zu den ILC1s gezählt werden können. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die im gesunden ZNS vorhandenen CD3-NK1.1+ -Zellen verschiedene Typ-1-ILC-Subsets umfassen: NK-Zellen, ILC1s, Intermediat-ILC1s und Ex-ILC3s. CXCR3 wurde auf ILC1s und einer Fraktion von unreifen NK-Zellen exprimiert, trug jedoch nicht zur Rekrutierung von NK-Zellen in das ZNS im EAE-Modell bei. Die Expression von CD49a, CD69, CXCR6, DNAM-1high, TRAIL und CD200R und das Fehlen von Eomes unterschieden die ILC1 von den NK-Zellen im ZNS. Zusätzlich ILC1s sezernierten mehr TNF-α als NK-Zellen. ILC1s waren die dominante Typ-1-ILC Subgruppe im Plexus choroideus und im Gehirnparenchym und waren auch in den Meningen vorhanden. Zusammenfassend bietet die vorliegende Arbeit zum ersten Mal eine umfassende Charakterisierung von ILCs des Typs I im ZNS. Innate lymphoid cells (ILCs) are tissue resident cells that play important roles in the maintenance of tissue homeostasis. ILCs have been characterized in diverse organs like the gut and liver. However, whether ILCs are present in the central nervous system (CNS) and if so, what are their phenotype and function in this organ are questions that remain unanswered. NK cells are the longer-known ILC members that share many phenotypical and functional features with ILC1s. Using the animal model of MS, the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), our group showed that protective mature NK cells are recruited to the CNS on an CX3CR1-dependent manner. Based on that observations, my PhD project aimed to 1) define the chemokine receptors that mediate the recruitment of the immature NK cells into the inflamed CNS and to 2) determine whether the phenotypically defined NK cells (CD3-NK1.1+ cells) that are present in the CNS during steady state constitute bona fide NK cells or constitute also other group 1 ILC subsets. The results of this work indicate that the CD3-NK1.1+ cells present in the healthy CNS comprise diverse group 1 ILC subsets that include conventional NK cells, ILC1s, intermediate-ILC1s and ex-ILC3s. CXCR3 was expressed on ILC1s and a fraction of immature NK cells, but did not contributed to the recruitment of NK cells into the CNS in the EAE model. In addition, the phenotypic and functional characterization of the newly identified CNS-ILC1s is described. The exclusive expression of CD49a, CD69, CXCR6, DNAM-1high, TRAIL and CD200R, and lack of Eomes distinguished the ILC1s from the NK cells in the CNS. IILC1s secreted IFN-γ and more TNF-α than NK cells upon stimulation in the healthy and EAE mice and were the dominant group 1 ILC subset in the choroid plexus and brain parenchyma and were also present in the meninges. In sum, the present work provides for the first time a comprehensive characterization of group 1 ILCs in the CNS.

Neutrophile Granulozyten produzieren „Neutrophil Extracellular Traps“ (NETs), ein mit antimikrobiellen Molekülen bestücktes Netzwerk aus Chromatinfasern, das während eines Zelltodprogramms namens „NETosis“ von den sterbenden Neutrophilen ausgestoßen wird. Ihre netzartige Struktur erlaubt es ihnen, eine weitere Verbreitung des Infektionserregers zu verhindern; zudem erzeugen sie eine hohe lokale Konzentration an toxischen Molekülen, die Mikroorganismen töten können. Unter normalen Bedingungen werden NETs von Nukleasen zerkleinert und anschließend von Makrophagen entfernt. Wenn dieser Aufräummechanismus gestört ist, aktivieren NETs das Immunsystem und führen zur Produktion von Autoantikörpern oder entzündungsfördernden Zytokinen. NETs werden mit einer wachsenden Liste von inflammatorischen und Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht. Wie genau dabei NETs durch das Immunsystem erkannt werden, ist noch nicht bekannt. In der vorliegenden Arbeit zeige ich, dass NETs durch den zytosolischen DNA Sensor „cyclic GMP-AMP synthase“ (cGAS) detektiert werden können und dass dadurch die Expression von Typ I Interferonen (TIIFN) induziert wird. Zu Beginn demonstriere ich, dass NETs durch rekombinantes cGAS erkannt werden und dass mit isolierten NETs stimulierte Immunzellen cGAS-abhängig TIIFN produzieren. Des Weiteren zeige ich, dass Neutrophile, die NETosis begehen, in Nachbarzellen ebenfalls cGAS-anhängig TIIFN induzieren können. Abschließend konnte ich diese Ergebnisse in einem in vivo Mausmodel für systemische NET-Produktion bestätigen. Die vorliegende Arbeit zeigt einen Mechanismus, wie NETs durch das Immunsystem erkannt werden und dadurch sowohl zur Entstehung als auch zur Progression von Krankheiten beitragen kann. Sie ermöglicht dementsprechend die Entwicklung neuer Interventionsstrategien, welche zur Heilung oder Linderung einer Vielzahl von Erkrankungen beitragen können., The first line of cellular defense of the immune system are neutrophils. They are the most abundant white blood cell, which exert an array of antimicrobial effector functions. Neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), a composite of chromatin and antimicrobial molecules, into the extracellular space during a form of regulated cell death called NETosis. Their net-like structure prevent further dissemination of the invader and establishes a high local concentration of toxic molecules that mediate pathogen killing. NETs provide a platform for undesired immune activation and contribute to the production of autoantibodies and pro-inflammatory cytokines. NETs are implicated in a growing list of inflammatory and autoimmune diseases, but the exact mechanism how NETs are recognized by the immune system is not fully understood. In this study, I demonstrate that the cytosolic DNA sensor cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) senses NETs and induces the production of type I interferons (TIIFN). I first showed that NETs are recognized by recombinant cGAS and that cells treated with isolated NETs produce TIIFN in a cGAS dependent mechanism. Secondly, I demonstrate that neutrophils undergoing NETosis are taken up by neighboring immune cells and induce cGAS-dependent TIIFN expression. Lastly, I confirmed our in vitro results in a mouse model of systemic NET induction. Wildtype mice injected with Concanavalin A significantly upregulate the expression of interferon stimulated genes, while cGAS-/- mice and Cybb-/- mice, which are incapable of producing NETs, fail to induce this response.

Antikörper gegen Circumsporozoite protein (CSP), ein Oberflächenantigen von Plasmodium falciparum (Pf), können sterile Immunität hervorrufen und dadurch die Entwicklung von Malaria im Tierversuch verhindern. Im Menschen werden protektive B-Zell Gedächtnisantworten gegen CSP durch natürliche Malariaerkrankung bzw. Vakzinierung jedoch nur unzureichend erzeugt. - Für die Entwicklung von Gedächtnis-B-Zellen stellt die Affinitätsreifung, welche durch somatische Immungobulin Hypermutation sowie der nachfolgenden Selektion von B-Zellen mit verbesserter Antigenaffinität charakterisiert ist, eine Schlüsselfunktion in der Generierung von protektiven Immunantworten dar. Wie Affinitätsreifung gegen CSP im Menschen stattfindet ist jedoch nicht bekannt. In dieser Arbeit wird die Affinitätsreifung von CSP Gedächtnis B-Zellen auf Einzelzellebene im Menschen über drei kontrollierte Infektionen mit Pf Sporozoiten unter Chemoprophylaxe untersucht. Durch Hochdurchsatz-Einzelzell-Sequenzierung der Immunoglobulin (Ig) gene loci und der Produktion von rekombinanten monoklonalen Antikörpern gewährt diese Arbeit Einsicht in die Selektion und Affinitätsreifung von humanen Gedächtnis-B-Zell Antworten gegen komplexe Proteinantigene und identifiziert Keimbahn kodierte Immunglobulin Charakteristika, die mit hoher CSP-Affinität und Pf-Inhibition einhergehen. Überraschenderweise zeigen die Daten, dass initiale klonale Selektion von hochaffinen B Zellen eine weitaus wichtigere Rolle als Affinitätsreifung in dieser Infektion spielt. Diese Arbeit zeigt fundamentale Eigenschaften von humanen Gedächtnisantworten in einer komplexen Parasiteninfektion und liefert die Grundlage für ein mögliches Design von neuartigen Immunogenen um hoch-affine B-Zellen gegen CSP effizienter zu induzieren. Antibodies against the major Plasmodium falciparum (Pf) sporozoite surface protein, circumsporozoite protein (CSP), can mediate sterile immunity thereby preventing malaria disease symptoms as shown by passive transfer in animal models. However, protective anti- CSP memory antibody responses are not efficiently induced by natural Pf exposure or vaccination. Affinity maturation, i.e. the diversification of antigen-activated naïve precursor B cells by a somatic immunoglobulin (Ig) gene mutation process and the subsequent selection of B cells expressing antigen receptors with improved antigen affinity in germinal center reactions is considered key to the formation of protective memory B cell responses. However, how the anti-PfCSP memory B cell response matures in humans is not known. To address this question, the clonal evolution of the human anti-Pf CSP memory B cell response over three successive controlled Pf infections under chemoprophylaxis was assessed at single cell level by high throughput paired full-length Ig gene sequencing and recombinant monoclonal antibody production. The work provides basic insights in the longitudinal development of human memory B cell responses and identified germline-encoded Ig gene features that were associated with high anti-CSP affinity and Pf inhibitory antibody activity. The clonal selection of germline B cells expressing such antibodies, rather than affinity maturation, was associated with high quality anti-PfCSP memory B cell responses. The data provide insights into the evolution of antibody response to a complex protein antigen during infection and a strong rational for the design of novel CSP immunogens to target naïve B cell precursors expressing potent anti-CSP antibodies for the induction of protective memory B cell responses by vaccination.

T-Helfer-9-(Th9-)Zellen produzieren große Mengen Interleukin-(IL-)9 und lösen bei Wurm- und Tumorerkrankungen protektive Immunantworten aus. Sie sind aber auch maßgeblich an der Pathogenese chronisch entzündlicher Darmerkrankungen beteiligt. Im Widerspruch zu diesen entzündungsauslösenden Eigenschaften steht ihre Rolle bei der Erzeugung von Toleranz gegenüber allogenen Transplantaten. Diese gegensätzlichen inflammatorischen Eigenschaften deuten eine bisher nicht untersuchte funktionelle Heterogenität an. In vitro-differenzierte allo-reaktive Th9-Zellen zeigten sich in ihrer Gesamtheit pro-inflammatorisch. Dies äußerte sich nach Transfer in recombination activating gene-defiziente (Rag-/-) Mäuse durch einen akut einsetzenden Gewichtsverlust mit intestinaler Entzündung und durch die Abstoßung allogener Hauttransplantate. Mittels Einzelzell-Genexpressionsanalyse wurden zwei Th9-Subpopulationen identifiziert, die sich vor allem in ihrer CD96-Expression unterschieden (CD96low versus CD96high Th9-Zellen). Die differenzielle Expression von CD96 spiegelte sich auch im inflammatorischen Potenzial der Zellen wider. Während der Transfer von CD96low Th9-Zellen in Rag-/- Mäuse einen Gewichtsverlust mit Darmentzündung sowie die Transplantatzerstörung verursachte, zeigten CD96high-rekonstituierte Tiere kaum Entzündungsanzeichen im Transplantat bzw. im Darm. Dementsprechend verloren sie auch kein Gewicht. Es zeigte sich, dass CD96low Th9-Zellen ein höheres Potenzial zur Produktion von IL-4 und IL-9 sowie zur Expansion besaßen als CD96high Th9-Zellen. Eine Blockade von CD96 in vivo stellte die inflammatorischen Eigenschaften von CD96high Th9-Zellen wieder her, wodurch die funktionelle Relevanz der CD96-Expression unterstrichen wurde. Diese Daten belegen, dass es sich bei Th9-Zellen um eine funktionell heterogene Zellpopulation handelt. Weiterhin zeigen sie, dass CD96 – ein Molekül mit bislang unklarer Funktion in CD4+ T-Zellen – die Aktivität von Th9-Zellen negativ beeinflusst., T helper 9 (Th9) cells are potent producers of interleukin(IL-)9 driving host immunity against worm infections and tumors. Furthermore, they are predominantly involved in the pathogenesis of chronic inflammatory bowel diseases. However, they also induce tolerance in allogeneic transplantation, which contrasts with their pro-inflammatory properties. These observations indicate a functional heterogeneity of Th9 cells not examined so far. Total in vitro differentiated allo-reactive Th9 cells injected into recombination activating gene-deficient (Rag-/-) mice caused weight loss, intestinal inflammation and rejection of allogenic skin grafts which proofed their inflammatory character. However, using single cell profiling, two subsets of Th9 cells mainly differing in their CD96 expression were identified (CD96low versus CD96high Th9 cells). Transfer of CD96low Th9 cells into Rag-/- mice induced severe weight loss, intestinal inflammation and graft destruction. In contrast, transfer of CD96high Th9 cells did cause neither weight loss nor resulted in graft rejection. Transcriptional profiling revealed a higher IL-9 and IL-4 expression potential as well as an increased expansion capacity in CD96low Th9 cells compared to CD96high Th9 cells. Blockade of CD96 in vivo restored the inflammatory properties of CD96high Th9 cells demonstrating, that expression of CD96 controls effector functions in Th9 cells. Thus, Th9 cells are heterogeneous in function. Moreover, this study suggests an inhibitory role for the co-signaling receptor CD96 – a molecule with so far unknown function in CD4+ T cells – in Th9 cells.

Dendritische Zellen (DCs) und Makrophagen sind spezialisierte antigenpräsentierende Zellen, die eigene und fremde Antigene prozessieren und mittels Haupthistokompatibilitätsmoleküle, humane Leukozytenantige (HLA) im Menschen, T-Zellen präsentieren, um Toleranzen zu induzieren oder T-Zell-vermittelte Immunantworten zu initiieren. Abhängig von ihrer Differenzierung haben sie spezifische Phänotypen und Funktionen undunterschiedliche Interaktionen mit Pathogenen, in dieser Arbeit durch Leishmania donovani (LD) repräsentiert, welche in Phagolysosomen der Makrophagen propagieren. Der Einfluss der Differenzierungszustände und von intrazelluläre Infektionen auf die Antigenprozessierung und -präsentation waren weitgehend undefiniert. Um hier Einblick zu gewinnen, haben wir die HLA-I-präsentierten Selbstpeptidome von menschlichen unreifen und reifen DCs, die aus der MUTZ3-Zelllinie generiert wurden, und LD-infizierte bzw. nicht-infizierte aus der THP1-Zelllinie generierte Makrophagen mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS), sowie die Proteasom-Zusammensetzung per RT-PCR und die HLA-Expression und Aktivierungszustände der Zellen per Durchflusszytometrie analysiert und verglichen. Wir fanden, dass die HLA-I-Selbstpeptidome der Zellen heterogen und individualisiert waren, von Nonapeptiden dominiert wurden und ähnliche HLA-Bindungsaffinitäten und Ankerreste aufwiesen. Sie stammten aus Quellenproteinen aus fast allen subzellulären Lokalisationen und mit unterschiedlichen zellulären Funktionen in ähnlichen Anteilen und schlossen Tumor-assoziierter Antigene (TAAs) ein. Die Persistenz der LD hatte keinen Einfluß auf den Aktivierungszustand der Makrophagen, verursachte aber eine weitgehende Veränderungen des Peptidoms, der HLA-Bindungsaffinitäten und Ankerreste, der Quellproteine einschließlich TAAs und der HLA- und Proteasom-Expression. Dendritic cells (DCs) and macrophages are specialized antigen presenting cells that process self and foreign antigens and present them to T cells via major histocompatibility complex molecules, human leukocyte antigens (HLA) in humans, for induction of tolerance or initiation of T cell-mediated immune responses. Related to differentiation state, they have specific phenotypes and functions, and varied interactions with pathogens herein exemplified by Leishmania donovani (LD) that parasitize macrophages and propagate within their phagolysosomes. The impact of the differentiation state and intracellular infection on antigen processing and presentation by HLA class I remained undefined. To gain insight, we analyzed and compared the HLA-I self peptidomes of MUTZ3 cell line-derived human immature and mature DCs, and THP1 cell line-derived LD-infected and none-infected macrophages by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), as well as proteasome compositions by quantitative RT-PCR, and HLA expression and cell activation states by flow cytometry. We found that the HLA I-presented self-peptidomes of the cells in the different states were heterogeneous and individualized, dominated by nonapeptides with similar HLA binding affinities and anchor residues. They were sampled from source proteins of almost all subcellular locations and from proteins involved in various cellular functions in similar proportion including tumour-associated antigens (TAAs). The persistence of LD within the macrophage, did not affect macrophage activation. However, its impact was observed in self-peptidome heterogeneity, HLA binding affinities, anchor residue preferences, source protein peptide sampling (including TAAs) and HLA and proteasome expression.

T-Helfer(Th)-Lymphozyten spielen aufgrund ihrer Expression von Zytokinen eine zentrale Rolle in der Regulation von Immunantworten. Durch die Zytokine fördern die Th-Zellen die Rekrutierung und Aktivierung von Zellen des angeborenen Immunsystems, den Immunglobulin-Klassenwechsel von B-Zellen und ihre Differenzierung zu antikörper-sezernierenden Plasmazellen. Welche Zytokine eine aktivierte Th-Zelle exprimiert hängt von instruktiven Signalen ab, die sie in der Regel von antigen-präsentierenden Signalen bekommt. Mit den instruktiven Signalen wird ein ganzes Differenzierungsprogramm in den Th-Zellen initiiert, welches am Ende zu einer epigenetischen Prägung des Effektorprogramms führt, sodass die Th-Zelle auch bei nachfolgenden Aktivierungen die gleichen Funktionen ausführt. In dieser Arbeit wurde untersucht wie diese Differenzierungsprogramme zur Pathogenese von chronischen Entzündungen beitragen und wie eine chronische Entzündung wiederum die Differenzierung der Th-Zellen beeinflusst. Des Weiteren haben wir molekulare Adaptationen identifiziert, die selektiv in chronisch aktivierten entzündungsfördernden Th Typ 1 (Th1)-Zellen hochgeregelt werden. Diese Adaptationen, wie die Expression von Twist1 und Hopx, fördern das Überleben der Th1-Zellen am Ort der Entzündung und könnten zur Perpetuation der Entzündung entscheidend beitragen. Zusammengenommen zeigen unsere Daten, dass Th-Zellen durch ihre pro-inflammatorische Prägung zwar gut gerüstet sind uns gegen Pathogene zu schützen, im Falle einer Autoreaktivität aber auch Immunpathologie und chronische Entzündungen auslösen können. Allerdings weisen unsere Arbeiten auch daraufhin, dass selektive Anpassungen der Th-Zellen an eine chronische Entzündung auch gleichzeitig Ansatzpunkte für ein therapeutisches Eingreifen bei chronisch-entzündlichen Krankheiten darstellen., T helper (Th) lymhocytes play a central role in the regulation of immune responses. Through the expression of cytokines, Th cells orchestrate the recruitment and activation of cells of the innate immune system, and induce antibody class switch recombination in B lymphocytes and their differentiation into antibody-secreting plasma cells. Which cytokines an activated Th cell expresses is dependent on instructive signals, the Th cells receives from antigen-presenting cells. Such instructive signals initiate a differentiation program, which in the end leads to the epigenetic imprinting of the effector program, ensuring that the Th cell execute the same functions in subsequent activations. In this thesis, we investigated how such differentiation programs contribute to the pathogenesis of chronic inflammation and how chronic inflammation, in turn, affects the differentiation of the Th cells. Furthermore, we have identified molecular adaptations, which are selectively upregulated in chronically activated pro-inflammatory Th type 1 (Th1) cells. Such adaptations, like the upregulation of Twist1 and Hopx, promote the survival of Th1 cells in the inflamed tissue and could thereby contribute to the perpetuation of the inflammation. Taken together, our data show that Th cells with a pro-inflammatory imprint are well equipped to protect us against pathogens, in case of autoimmunity, however, cause immune pathology and chronic inflammation. At the same time, our work also shows that the selective adaptations of Th cells to chronic inflammation could also be promising targets for novel therapies for the treatment of chronic inflammatory diseases.

Mesenchymale Stromazellen (MSC) unterstützen die endogene Geweberegeneration und sind kaum immunogen. Die Mechanismen der Immunmodulation sind kaum bekannt. Diese Arbeit untersucht, ob MSC in die Interaktion von Dendritischen Zellen (DC), Natürlichen Killer (NK) und T Zellen eingreifen, indem sie die DC-Reifung beeinflussen. Das Netzwerk ist wichtig für die Differenzierung naïver T Zellen zu Typ 1 T Helferzellen (Th1). Abhängig vom DC-Subtyp und dem Zeitpunkt des Aufeinandertreffens, beeinflussten Knochenmark-MSC (BM-MSC) die in vitro DC-Reifung verschieden. Sie inhibierten die Differenzierung, aber nicht die Reifung humaner von Monozyten-abgeleiteter DC (moDC). BM MSC hatten keinen klaren Einfluss auf die Reifung plasmazytoider DC (pDC), während sie in aktivierten CD1c+ myeloiden DC (mDC) einen tolerogenen Phänotyp induzierten, charakterisiert durch eine geringere CCR7-abhängige Migration und ein tolerogenes Zytokinprofil. Daraus resultierend, wiesen BM-MSC-geprägte mDC aufgrund der veränderten IL 12/IL 10 Sekretion eine geringere Fähigkeit zur Stimulation der IFNγ Produktion in NK Zellen auf und induzierten weniger Th1 Differenzierung naïver T Zellen. Placenta-derived mesenchymal-like adherent stromal cells (PLX PAD) erzielten ähnliche Ergebnisse. Es konnte keine Alloimmunogenität in Patienten mit kritischer Ischämie der Extremitäten (CLI), die im Rahmen einer Phase I klinischen Studie allogene PLX PAD erhalten hatten, nachgewiesen werden. Keiner der Patienten entwickelte eine signifikante Gedächtnis T Zellantwort spezifisch für das Zellprodukt, was durch unsere in vitro Beobachtungen erklärbar sein könnte. Es ist schwierig MSC im Gewebe nachzuweisen, da Markerkombinationen notwendig sind. CD73+CD90+CD105+CD45-CD34-CD14-CD19- MSC konnten mithilfe einer neuen Multiplex-Immunhistologie-Technik (Chipzytometrie) in humanen Plazentaschnitten detektiert werden. Für die Zukunft könnte damit die Interaktion injizierter MSC mit Immunzellen in Biopsien untersucht werden. Mesenchymal stromal cells (MSC) support endogenous tissue regeneration and seem to be low immunogenic, allowing application across MHC barriers. But little is known about the mechanisms for their immunomodulation. Hence, the main goal of this study was to understand if MSC interfere with the crosstalk between dendritic cells (DC), natural killer (NK) and T cells by influencing DC maturation. This network is important for efficient priming of naïve T cells into type 1 helper T cells (Th1). Bone marrow-derived MSC (BM-MSC) had diverse effects on DC maturation in vitro, depending on the DC subset and the time of interaction. BM MSC inhibited differentiation but not maturation of monocyte-derived DC (moDC). They did not have a clear effect on maturation of plasmacytoid DC (pDC), whereas they induced a tolerogenic phenotype in activated CD1c+ myeloid DC (mDC), characterized by an impaired CCR7-dependent migration and a tolerogenic cytokine profile. Consequently, BM-MSC-licensed mDC displayed a reduced ability to induce IFNγ production in NK cells due to their altered IL 12/IL 10 secretion. BM MSC-licensed mDC also induced less efficiently Th1 lineage commitment of naïve T cells. Similar results were observed with placenta-derived mesenchymal-like adherent stromal cells (PLX PAD). Samples from critical limb ischemia (CLI) patients treated with MHC-unmatched PLX-PAD within a phase I clinical trial were analysed for alloimmunogenicity. None of the patients developed a significant memory T cell response specific to the allogeneic cells, which might be explainable by our in vitro observations. MSC are difficult to detect in tissues because a set of lineage markers is needed. Here, CD73+CD90+CD105+CD45-CD34-CD14-CD19- MSC could be identified in human placenta cryosections using a novel multiplex-immunohistology technique (chipcytometry), offering the possibility to investigate the crosstalk between injected MSC and attracted immune cells in patient biopsies in the future.

Toll-like Rezeptoren (TLR) und Nod-like Rezeptoren (NLR) sind Muster-erkennende Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, die bakterielle Zellwandbestandteile erkennen können. Interleukin (IL)-1beta ist ein streng reguliertes Zytokin. Durch eine erste Stimulation wird der TLR-Rezeptor ausgelöst und führt zur Expression des Vorläuferproteins proIL-1beta. Durch einen zweiten Stimulus wird ein zytoplasmatischer NLR-Rezeptor zur Caspase1-Aktivierung angeregt. Dies führt zur post-translationalen Reifung von proIL-1beta zu reifem IL-1beta und zur Aktivierung weiterer Mechanismen der Pathogen-Eliminierung während einer bakteriellen Meningitis. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die synergistische Beziehung zwischen TLRs und NOD2 in Bezug auf die IL-1beta-Sekretion in Astrozyten und Mikroglia untersucht. Primäre murine WT-Astrozyten und eine humane Zelllinie, die mit Lipopolysaccharid (LPS) oder Lipopeptid sowie Muramyldipeptid (MDP) stimuliert wurden, zeigten signfikant erhöhte IL-1beta-Werte. IL-1beta war in NOD2-/- Astrozyten nicht erhöht. NOD2 trägt demnach als MDP-ausgelöster Rezeptor in Astrozyten, vermutlich zusammen mit dem Inflammasom-Komplex, zur Caspase-1-Aktivierung bei. In Mikrogliazellen lässt sich der bei Astrozyten gezeigte Effekt nicht reproduzieren. Zum ersten Mal wurde gezeigt, dass die TLR-abhängige IL-1beta-Antwort durch NOD2-Beteiligung in murinen und humanen Astrozyten synergistisch erhöht wird. In einem weiteren Versuchsteil wurde in primären murinen Peritonealmakrophagen von adulten Mäusen der TLR/NLR-Synergismus untersucht. Es stellte sich überraschenderweise heraus, dass weibliche NOD2-/- Mäuse zu einer synergistisch erhöhten IL-1beta-Sekretion fähig waren. SiRNA-Versuche mit in Östrogen vorinkubierten RAW264.7-NOD2-/- Zellen zeigten eine eindeutige Synergie der TLR4- und NOD2-Rezeptoren in der IL-1beta-Ausschüttung. Östrogen scheint weiblichen Individuen einen protektiven Vorteil vor Infektionen bei NOD2-Defizienz zu verschaffen. Toll-like receptors (TLR) and nod-like receptors (NLR) are pattern-recognition receptors that recognize lipopolysaccharide (LPS), lipopeptides and myramyldipeptide (MDP) derived from bacterial cell wall. We focus our question on the regulation of the pro-inflammatory cytokine interleukin (IL)-1beta during bacterial meningitis in primary murine astrocytes and microglia as well as cell lines and the synergism of TLR4 or TLR2 and NOD2 to amplify IL-1beta-expression. ProIL-1beta is expressed by TLR-stimulation and activation of NF-kB signal transduction. Through the activation of Caspase-1, possibly through NOD2 and the inflammasome, proIL-1beta is cleaved on post-translational level and obtains its activated status, leading to pathogen elimination during bacterial meningitis. Primary murine WT-astrocytes and a human cell line primed with LPS or lipopeptide and stimulated with MDP show significantly increased IL-1beta levels in the supernatant. NOD2-/- astrocytes do not show elevated IL-1beta levels. After screening of cytoplasmic proCaspase-1 and activated Caspase-1 by Western blot it became clear, that stimulation of NOD2 with MDP led to Caspase-1 activation and thus to IL-1beta maturation in primary murine WT-astrocytes. We demonstrate for the first time that the synergism between TLR4 and NOD2 leads to significantly elevated IL-1beta levels and that NOD2 is capable of activating caspase-1 in primary murine astrocytes. Another part of the work was to test the TLR/NLR-synergism on primary peritoneal macrophages from adult mice. Surprisingly, female NOD2-/- mice showed significantly elevated IL-1beta levels. SiRNA- and stimulation-experiments with RAW264.7-NOD2-/- cells pre-incubated in estrogen show a clear synergy in IL-1beta secretion through TLR4 and NOD2 receptors. Estrogen seems to protect females from infection when having a NOD2 deficiency.

Wirtszellen verfügen über bisher unzureichend verstandene zellautonome Immunmechanismen zur Abwehr von intrazellulären Bakterien. In dieser Arbeit wurden zwei Abwehrmechanismen charakterisiert, die in Endothelzellen und Makrophagen Infektionen durch C. pneumoniae bekämpfen. Es konnte gezeigt werden, dass C. pneumoniae über einen MAVS-abhängigen Signalweg in humanen Endothelzellen erkannt wird. Diese Erkennung aktiviert die Transkriptionsfaktoren IRF3 und IRF7 und nachfolgend eine IRF3/7-abhängige Typ I-IFN-Produktion. Typ I-IFN bewirken auto- und parakrin eine Kontrolle der intrazellulären Infektion mit C. pneumoniae. Zum anderen wurde gezeigt, dass das mitochondriale Molekül NLRX1 eine zellautonome Abwehr gegen C. pneumoniae in Endothelzellen und in Makrophagen vermittelt. Diese NLRX1-abhängige intrazelluläre Abwehr ist unabhängig von verschiedenen, bisher mit NLRX1 in Verbindung gebrachten Signalwegen. Die Ergebnisse zeigen somit zum ersten Mal, dass NLRX1 eine zellautonome Abwehr gegen intrazelluläre Bakterien vermittelt. Daraus gewonnene Erkenntnisse sowie die Ergebnisse zukünftiger Arbeiten zur Klärung der NLRX1- und MAVS-aktivierenden chlamydialen Moleküle und den durch Typ-I-IFN-abhängigen intrazellulären Abwehrmechanismen könnten bei der Erforschung neuartiger antibakterieller Therapien hilfreich sein. Diese ist angesichts der weltweiten signifikanten Zunahme von mehrfach-resistenten Infektionserregern, unbedingt notwendig. The cell autonomous defense mechanisms against intracellular bacteria in host cells are so far insufficiently understood. In the present work two defense mechanisms involved in the elimination of C. pneumoniae in endothelial cells and in macrophages were characterized. It could be shown that C. pneumoniae is recognized by a MAVS-dependent signaling pathway in human endothelial cells. This recognition activates the transcription factors IRF3 and IRF7 and subsequently an IRF3/7-dependent type I-IFN production. Type-I-IFNs induce an auto- and paracrine control mechanism against the intracellular infection with C. pneumoniae. Additionally it could be shown for the first time that the mitochondrial NLR molecule NLRX1 mediates a cell autonomous defense mechanism against C. pneumoniae and most likely other intracellular bacteria in human endothelial cells and murine macrophages. This NLRX1-dependent intracellular defense mechanism is independent of the different mechanisms which were so far linked to NLRX1. The outcome of this work and future studies to identify chlamydial molecules responsible for the activation of the MAVS- and NLRX1-dependent signaling pathways as well as the effector mechanisms responsible for Type-I-IFN-dependent control of intracellular chlamydial replication could be very helpful in the development of novel antibacterial therapies.

Die Mechanismen der Mastzell(MZ)-Homöostase in peripheren Geweben sind weitgehend unbekannt. Die Regulation der MZ-Zahlen schließt wahrscheinlich die lokale Proliferation der Gewebe-MZ sowie die Rekrutierung und Differenzierung von MZ-Vorläuferzellen ein, wobei das Gewebe den MZ-Phänotyp beeinflusst. Fibroblasten (Fb) induzieren die Proliferation und Differenzierung unreifer Knochenmark-generierter MZ (BMCMC) zu Bindegewebs-MZ (CTMC). Da BMCMC an Fb adhärieren, wurde untersucht ob dieser direkte Zellkontakt für die Fb-induzierte Proliferation und die Differenzierung zu CTMC entscheidend ist. Cokultur-Experimente mit BMCMC und Fb zeigten, dass die verstärkte Proliferation, der erhöhte Histamingehalt und die Induktion der Expression der MZ Protease 4 (MCPT-4) mRNA (beides Marker der CTMC) vom direkten Zellkontakt abhängen. Adhäsionsversuche mit blockierenden Antikörpern demonstrierten, dass die Interaktion von alpha4beta7 Integrin auf den BMCMC mit Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1), auf den Fb, an der Adhäsion beteiligt ist, die Proliferation und Differenzierung der MZ selbst jedoch nicht auslöst. Interessanterweise zeigten BMCMC die Kit, den Rezeptor für den wichtigen MZ-Wachstumsfaktor Stammzellfaktor (SCF), nicht exprimieren, ebenfalls die kontaktabhängigen Fb-induzierte Veränderungen, wenngleich im geringeren Ausmaß. Eine genomweite Expressionsanalyse wies schließlich die kontaktabhängige Hochregulation der Expression weiterer Gene, die mit dem Phänotyp der CTMC assoziiert sind, nach. Des Weiteren konnte die Verringerung der Expression bestimmter Gene gezeigt werden, die von unreifen MZ oder MZ-Vorläufern exprimiert werden. Insgesamt zeigen die Daten der hier vorliegenden Arbeit, dass für die durch Fb ausgelöste umfassenden Differenzierung und Ausreifung von unreifen MZ zu CTMC, eine teilweise durch VCAM-1/alpha4beta7 vermittelte direkte Zell-Zell-Interaktion notwendig ist, bei der sowohl Kit-abhängige, als auch Kit-unabhängige Signalwege involviert sind. The precise mechanisms of mast cell (MC) homeostasis in peripheral tissues are largely unknown. Regulation of MC numbers is assumed to involve the proliferation of local MCs and the recruitment and subsequent differentiation of MC precursors, whereas the tissues determine the MC phenotype. Fibroblasts (Fb) induce proliferation and differentiation of bone marrow-derived cultured MCs (BMCMCs) towards connective tissue type MCs (CTMCs). Since BMCMCs exhibit adhesion to Fbs, it had been analyzed, whether this direct cell-to-cell crosstalk is mandatory for the differentiation towards CTMCs. It was found that Fb-cocultured immature MCs exhibit increased proliferation and histamine content and the induced expression of mast cell protease 4 (mcpt4) mRNA, both markers for mature CTMC, and that these changes required a directed cell-to-cell interaction. Adhesion Assays using blocking mAbs revealed that the interaction of alpha4beta7 integrin on BMCMCs with Fb-expressed Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) is largely responsible for the adhesion, which itself didn’t induce proliferation and differentiation of MCs. Most notably, MCs deficient for Kit, the receptor for the MC growth factor stem cell factor (SCF), also showed a significant Fb-induced increase in histamine content, mcpt4 expression, and proliferation, albeit to a lesser extent than wildtype BMCMCs. Whole genome expression analysis showed contact-dependently upregulated expression of several genes associated with CTMC phenotype and functions. Furthermore, downregulation of genes associated with MC progenitors had been shown. Collectively, the data show that the Fb-induced substantial differentiation of immature MCs towards CTMCs requires a partly VCAM-1/alpha4beta7-mediated cell-to-cell interaction and involves both Kit-dependent and -independent signaling pathways.

Toll-like Rezeptoren (TLRs) sind essentielle angeborene Rezeptoren, die konservierte Strukturen von Krankheitserregern oder Gefahrsignale, die von beschädigten Zellen freigesetzt werden, erkennen können. Genetische Variationen in TLRs wie Einzel-Nukleotid-Polymorphismus (SNP) können die Funktion von TLRs beeinträchtigen und erste Studien zeigen, dass dies zu einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber Virusinfektionen oder einem erhöhten Krebsrisiko führen kann. In dieser Studie haben wir einen Multicolor-Durchflußzytometrie-Test entwickelt, um die TLR-Funktionen in verschiedenen Subpopulationen unseparierter peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMCs) simultan analysieren zu können. Wir konnten beobachten, dass das Ausmaß der TLR-Antworten zwischen den Probanden stark variierte, jedoch über einen Zeitraum von einem Monat gut reproduzierbar war. Zunächst untersuchten wir TLR Reaktionen bei Patienten mit rezidivierenden Herpes labilalis (HL). Im Vergleich zu asymptomatischen Personen war eine HL- Anamnese mit einer signifikant verminderten TLR3-IFN-Gamma-Antwort nach Stimulation mit poly(I:C) in NK Zellen assoziiert. Weitere molekulare Untersuchungen zeigten eine mögliche Beteiligung von TLR3 L412F SNP, welcher die oberflächliche TLR3 Expression und die IFN-Gamma-Antworten in NK-Zellen reduzierte. Einige Studien zeigen, dassTLR1 I602S, ein weiterer sehr verbreiteter SNP, in der Lage ist die TNF-Alpah-Antworten von Monozyten gegen den TLR2/1-Agonisten (Pam3Cys) zu verringern. In der hier vorliegenden Arbeit konnten wir zudem nachweisen, dass TLR1 I602S SNP auch die Funktion von NK-Zellen und CD8+ T-Zellen beeinträchtigt. Wir konnten keine Assoziation zwischen TLR2/1-Defizienz und reaktivierendem HL feststellen. Jedoch konnten wir an einer großen Kohorte von über 326 Patienten zeigen, dass der TLR1 SNP sowohl ein Risikofaktor für Magenkarzinomentstehung als auch für die Metastasierung ist. Zusammenfassend weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass genetische Polymorphismen von TLRs die Funktion von NK-Zellen beeinträchtigen und zu einer erhöhten Anfälligkeit für HSV-1 Erkrankung und Magenkarzinom führen können. Toll-like Receptors (TLRs) are essential innate receptors which recognize conserved structures of pathogens, or danger signals released from damaged cells. Alterations of TLR responses might result in severe viral infections or a higher risk of cancer. Therefore, development of clinical assays to evaluate TLR functions could provide personalized information about susceptibility to these diseases. Since TLRs are differentially expressed on different subsets of human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), a multi-color flow cytometry-based assay was developed to detect TLR responses of individual cell types simultaneously. We observed that the magnitude of TLR responses largely varied between human subjects, but was highly reproducible over one month. To evaluate the potential role of differences in natural killer (NK) cell TLR response we studied the association of NK cell TLR function and TLR single nucleotide polymorphisms (SNPs) with susceptibility to recurrent herpes labialis (HL) and gastric cancer. Using our assay, impaired TLR3 response of NK cells was found in people with recurrent HL. In addition, we have identified enhanced levels of homozygous TLR3 L412F SNP in people with recurrent HL, which results in lower surface expression and reduced NK cell response to poly(I:C). TLR1 I602S, another common SNP, has been reported to decrease TNF-Alpha responses of monocytes toward TLR2/1 agonist, Pam3CSK4 (Pam3Cys), stimulation. In our study, we found that TLR1 I602S homozygosity also contributes to impaired IFN-Gamma responses of NK cells and CD8+T cells. Although we did not observe an association of TLR2/1 deficiency with recurrent HL, association of TLR1 I602S with risk for primary as well as metastatic gastric cancer was found in a cohort of 326 patients. To sum up, our results suggest that genetic polymorphisms of TLRs can impair TLR function of NK cells, which contribute to the increased susceptibility to HSV-1 diseases and gastric cancer.

Ein wesentliches Merkmal der Immundepression ist eine Monozytendeaktivierung mit verminderter Antigenpräsentation und Sekretion proinflammatorischer Zytokine. Infolge dessen sind Patienten mit Immundepression besonders anfällig gegenüber Infektionen. Als mögliche Mediatoren werden antiinflammatorische Zytokin wie IL10 und TGF-beta diskutiert, deren immunhemmende Wirkung allerdings nach Ihrem Entfernen schnell reversibel ist. An der Entwicklung einer langanhaltenden Immundepression müssen demnach weitere Mediatoren beteiligt sein. Eine Studie mit Patienten nach Herz-Operationen zeigte eine Korrelation zwischen einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber Infektionen und einer Überexpression des Hitzeschockproteins Hämoxygenase-1 (HO-1) in peripheren Blutleukozyten, dem in vielen Studien eine antiinflammatorische und cytoprotektive Wirkung zugeschrieben wird. Eine Porphyrin-induzierte HO-1 Überexpression in humanen Monozyten korreliert mit einer verminderten MHC-II Expression. Allerdings kann eine Hemmung der HO-1-Expression diesen Effekt nicht aufheben, so dass die verwendeten Porphyrine die Antigenpräsentation durch HO-1-unabhängige Mechanismen beeinflussen müssen. Während sich die Hemmung der IFN-Gamma-induzierten MHC-II Expression durch eine gleichzeitig verminderte STAT-1-Phosphorylierung erklären lässt, ist die Porphyrin-induzierte Hemmung der konstitutiven MHC-II-Expression unabhängig von STAT-1. Zudem konnte weder eine Abhängigkeit von STAT-3, noch von einer verstärkten Histonacetylierung oder PKA-Aktivierung gezeigt werden. Die Ergebnisse deuten zudem darauf hin, dass die Porphyrin-Effekte nicht über eine Interaktion mit dem Hämoglobin-Scavenger Rezeptor CD163 induziert werden. Eine Porphyrin-Behandlung von Monozyten in vitro resultiert in einem ähnlichen Phänotyp, wie er in Monozyten von immundepressiven Patienten beobachtet wird, so dass ein verbessertes Wissen über die beeinflussten Signalwege neue Ansätze zur frühzeitigen Behandlung einer Immundepression liefern kann., A long lasting immunodepression is characterised by a deactivation of the function of monocytes with decreased antigen presentation and decreased secretion of pro-inflammatory cytokines. This may predispose patients with immunodepression to infectious complications. Although anti-inflammatory cytokines as IL-10 and TGF-beta are discussed, the mechanism that induces and sustains this long lasting immunodepression is still incompletely understood. A previous study with patients after cardiac surgery could show a correlation between over expression of heme oxygenase-1 (HO-1) in peripheral blood leukocytes and an increased susceptibility to infection related complications. HO-1 is a stress-inducible heat shock protein with potent anti-inflammatory and cytoprotective properties. A porphyrin-induced HO-1 overexpression in human monocytes correlates with decreased MHC-II expression. However, inhibition of HO-1 expression does not abrogate this effect. According to this, porphyrins must affect the antigen presentation by HO-1-independent mechanisms. While the inhibition of IFN-Gamma-induced MHC-II expression could be explained by a simultaneously decreased STAT-1 phosphorylation, the porphyrin-induced inhibition of the constitutive MHC-II expression is independent of STAT-1. Moreover, neither STAT-3 activity, nor an increased histone acetylation or PKA activation is clearly involved in porphyrin mediated inhibition of MHC-II. The results further suggest that the porphyrin-effects are not induced by an interaction with the hemoglobin scavenger receptor CD163. Nevertheless a porphyrin-treatment of monocytes in vitro results in a similar phenotype, as observed in monocytes from patients with immunodepression. Therefore, better understanding of the involved pathways could reveal new approaches for the early treatment of patients with immunodepression.

Interaktionen zwischen Zellen sowie deren Aktivierung werden im Immunsystem durch verschiedene Zelloberflächenmoleküle reguliert. Inhalt dieser Arbeit war die Untersuchung des kürzlich identifizierten Rezeptor-Ligand-Paares BTLA und HVEM. Zunächst wurden diverse BTLA-spezifische monoklonale Antikörper generiert, mit deren Hilfe erstmals die Lokalisation BTLA-tragender Zellen im Gewebe gezeigt werden konnte. Bei umfassenden Expressionsanalysen fiel auf, dass BTLA auf nahezu allen Leukozytenpopulationen der lymphatischen Organe konstitutiv vorhanden ist, und mit seinem Liganden HVEM koexprimiert wird. Beide Moleküle werden auf verschiedenen Zellpopulationen differenziell exprimiert und aktivierungsabhängig reguliert. Funktionelle Analysen in vitro als auch in vivo ergaben, dass die BTLA-HVEM-Interaktion durch Suppression der T-Zellaktivierung und –proliferation wesentlich zur negativen Regulation der Immunantort beiträgt. Die negative Wirkung von BTLA zeigte sich sowohl bei der Initiation als auch bei bereits fortgeschrittener Aktivierung, unabhängig von der Beteiligung positiver kostimulatorischer Signalwege. Durch Stimulation von T Zellen mit unterschiedlicher BTLA-Oberflächenexpression (verschiedene Subpopulationen oder aus transgenen Mäusen) konnte die strikte Korrelation der negativen Funktion mit der BTLA-Menge auf den Zellen gezeigt werden. Es stellte sich heraus, dass BTLA essentiell für die HVEM-vermittelte Suppression ist und eine wesentliche Beteiligung weiterer HVEM-Interaktionspartner (z.B. CD160) nicht vorliegt. Die Beobachtung von veränderten Lymphozytenpopulationen in BTLA-transgenen Mäusen im Ruhezustand weist zudem auf einen zentralen Beitrag des negativen BTLA-Signals zur Aufrechterhaltung der Homöostase hin. Die ubiquitäre Expression von HVEM und BTLA in Kombination mit der gegenseitigen Modulation beider Interaktionspartner ermöglicht eine flexible Reaktion des Immunsystems auf äußere Einflüsse unter anderem über die negative Regulation durch BTLA Activation of immune cells is regulated by various cell surface molecules during cell-cell interactions. The aim of this work was the characterization of the recently identified receptor-ligand-pair BTLA and HVEM. Initially, several BTLA-specific monoclonal antibodies were generated. With these antibodies, the localization of BTLA expressing cells in the tissues has been determined for the first time. Further detailed flow cytometric analysis revealed a strong constitutive expression of BTLA on nearly all leukocytes in lymphoid organs. Interestingly, all BTLA-expressing cells co-expressed its ligand HVEM. However, both molecules were differentially expressed on different cell populations in the steady state, but were also regulated in an activation-dependent way. Functional analyses in vitro and in vivo (in an antigen-specific adoptive transfer system) revealed a substantial contribution of the BTLA-HVEM interaction for negative regulation of immune responses by suppressing T cell activation and proliferation. Inhibitory signals of BTLA affect the initial and ongoing activation, irrespective of simultaneous positive signals from other co¬stimulatory pathways. Using wildtype and BTLA-transgenic primary T cells, a strictly linear relationship between the inhibitory function of BTLA and its cell surface levels was observed. The data clearly demonstrate that BTLA expression determined the strength of HVEM-mediated suppression, but also that BTLA is essential for this negative co-stimulation, whereas other HVEM-interaction partners were apparently not involved. Finally, the observed changes in lymphoid cell populations of the BTLA-transgenic mice even in the resting state indicate a prominent role for negative BTLA signals to maintain homeostasis. The ubiquitous expression of HVEM and BTLA together with the reciprocal modulation of both interaction partners supports flexible reaction and regulation of the immune system particularly via the inhibitory function of BTLA.

MHC Klasse II Moleküle präsentieren Peptidantigene für die Überwachung durch CD4+ T Zellen an der Zelloberfläche. Um Sicherzustellen, dass diese Peptidliganden möglichst genau die intrazelluläre Proteinzusammensetzung widerspiegeln, hat sich im Verlauf der Evolution ein komplexer Prozessierungsweg entwickelt, welcher möglichst stabile Peptid/MHC Komplexe an die Zelloberfläche liefert. MHC Moleküle, welche ihren Liganden verloren haben, konvertieren zudem spontan in einen ‚nichtrezeptiven’ Zustand, was als zusätzlicher Sicherheitsmechanismus dient. Diese Studie zeigt jedoch, dass Aminosäureseitenketten kurzer Peptide diesen Sicherheitsmechanismus umgehen können indem sie katalytisch einen reversiblen Ligandenaustausch auslösen. Die katalytische Aktivität von Dipeptiden, wie z.B. Tyr-Arg (YR), war dabei stereospezifisch und konnte durch zusätzliche Modifikationen verstärkt werden, welche das konservierte H-Brückennetzwerk der so genannten P1-Tasche des MHC Moleküls adressierten. Die Dipeptide verstärkten dabei sowohl die Antigenbeladung als auch den Ligandenaustausch, wobei deren relative Aktivität genau mit den bekanten Ankerpräferenzen der P1 Tasche korrelierte. Letzteres weist somit auf eine direkte Interaktion der katalytischen Seitenkette des Dipeptides mit dieser Tasche hin. Der Verstärkungseffekt war auch in CD4+ T Zellassays zu beobachten, bei denen der alleleselektive Einfluss der Dipeptide direkt in eine deutliche Erhöhung der Sensitivität der antigenspezifischen T Zellantwort führte. Durch weitere molekulardynamische Berechnungen konnte die Hypothese unterstützt werden, dass die Besetzung der P1 Tasche durch Aminosäureseitenketten einen Kollaps der leeren Bindungstasche zum ‚nichtrezeptiven’ Zustand verhindert. Während der Antigenpräsentation könnte P1 somit unmittelbar als ‚Sensor’ für die Beladung mit Peptiden dienen. Diese Annahme konnte experimentell durch spektroskopische Untersuchungen unter Verwendung des ANS-Farbstoffes (8-Anilino-1-Naphtalensulfonsäure) sowie durch Messung der intrinsischen Tryptophanfluoreszenz bestätigt werden. Darüber hinaus konnten konformationsspezifische Antikörper, welche bislang lediglich mit unbeladenen MHC Molekülen in Verbindung gebracht wurden, hier als spezifische Sonden für den nichtrezeptiven Zustand definiert werden. Als mögliche Risikofaktoren könnten katalytische kurze Peptide eine Rolle bei der Auslösung von Autoimmunerkrankungen spielen. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass sie die Beladung von Glutenantigenen auf das Zöliakie-assozierte HLA-DQ2 Molekül verstärken können. Zumindest in vitro konnte ihre Anwesenheit deshalb auch die antigenspezifische Antwort von CD4+ T Zellen verstärken, welche zuvor von Zöliakiepatienten isoliert worden waren. Auf der einen Seite könnten diese Peptide als ‚MHC-loading enhancer’ (MLE) deshalb als mögliche Risikofaktoren die Ausbildung entzündlicher (Auto-) Immunerkrankungen beschleunigen. Auf der anderen Seite könnten sie jedoch auch als ‚drug-like’ Vakzinadditiv zur Verbesserung von Immuntherapien führen. MHC class II molecules present antigenic peptides on the cell surface for the surveillance by CD4+ T cells. To ensure that these ligands accurately reflect the content of the intracellular MHC loading compartment, a complex processing pathway has evolved that delivers only stable peptide/MHC complexes to the surface. As additional safeguard mechanism, MHC molecules quickly acquire a ‘non-receptive’ state once they have lost their ligand. This study shows that amino acid side chains of short peptides can bypass these safety mechanisms by triggering the reversible ligand-exchange. The catalytic activity of dipeptides such as Tyr-Arg (YR) is stereo-specific and could be enhanced by modifications addressing the conserved H-bond network near the P1 pocket of the MHC molecule. It enhanced both antigen-loading and ligand-release and strictly correlated with reported anchor preferences of P1, the specific target site for the catalytic side chain of the dipeptide. The effect was evident also in CD4+ T cell assays, where the allele-selective influence of the dipeptides translated into increased sensitivities of the antigen-specific immune response. The hypothesis that occupation of P1 prevents the ‘closure’ of the ‘empty’ peptide binding site into the ‘non-receptive’ state was further supported by molecular dynamic calculations. During antigen processing and presentation P1 may therefore function as important ‘sensor’ for peptide-load. Spectroscopic studies using ANS dye (8-aninilino-1-napthalenesulfonic acid) and intrinsic tryptophan fluorescence data, confirm the postulate by providing direct evidence for the conformational transitions. Moreover conformation specific antibodies previously described to be specific for ‘empty’ MHC could be shown to be a ‘probe’ for ‘receptive conformation’. As potent risk factors short peptides may be involved in the induction of autoimmune diseases. It could be shown here that they could enhance the loading of gluten derived antigen on celiac disease linked-HLA-DQ2 allele. At least in vitro the effect could enhance gluten specific CD4+ T cell response on T cell clones obtained from celiac disease patients. Thus, on one hand short peptides might work as ‘MHC loading enhancer’ (MLE) in the precipitation of inflammatory-‘autoimmune’ disorder, on the other hand they might be used as drug like vaccine ‘additive’ in various therapeutic settings.

Der globale Prävalenzanstieg allergischer Erkrankungen wird mit der westlichen Ernährung und einem sich ändernden Fettsäurespektrum assoziiert. Die omega-3 Fettsäure Docosahexaensäure (DHA) wurde bereits bei verschiedenen chronisch-entzündlichen Erkrankungen erfolgreich therapeutisch eingesetzt. Die dabei zugrunde liegenden Wirkmechanismen sind jedoch nicht vollständig geklärt. Deshalb wurde hier der molekulare Mechanismus der DHA-vermittelten Hemmung der IgE-Produktion in humanen B-Zellen sowie der verminderten Differenzierung IgE-produzierender Plasmazellen in vitro untersucht. Analysen der beteiligten Signaltransduktionswege offenbarten eine Reduktion der IL-4-abhängigen STAT6-Phosphorylierung und der CD40-vermittelten NFkappaB-Translokation, was zu einer Inhibition des IgE-Klassenwechsels auf dem Niveau des epsilon-Keimbahntranskriptes sowie der Aktivierungsinduzierten Desaminase führte. Weiterhin wurde in einer randomisierten, kontrollierten Doppelblindstudie die Supplementierung mit hochdosierter DHA bei Patienten mit atopischem Ekzem hinsichtlich klinischer und immunologischer Parameter geprüft. Dabei führte DHA zu einer Reduktion des Schweregrades der Erkrankung und zu einer verminderten IgE-Produktion anti-CD40/IL 4-stimulierter Blutzellen ohne Beeinflussung des Serum-IgE-Spiegels. Schließlich wurden die lokalen Prozesse nach DHA-Verabreichung in einem Mausmodell für proteininduzierte Dermatitis analysiert. Dabei war die Reduktion der klinischen Ekzemausprägung mit der verminderten Zahl dermaler CD8+ T-Zellen verbunden. Andere histologische Parameter und das Serum-IgE blieben jedoch unbeeinflusst. Durch die Fähigkeit von DHA, in den IgE-Klassenwechsel in B-Zellen einzugreifen, stellt die Supplementierung mit DHA somit eine mögliche präventive Maßnahme gegen allergische Erkrankungen dar. Ebenso ist DHA in der Lage, den Schweregrad des atopischen Ekzems durch die positive Beeinflussung lokaler inflammatorischer Prozesse signifikant zu verbessern., The prevalence of allergic diseases has increased worldwide. Westernised diet with its changing polyunsaturated fatty acid (PUFA) proportions is considered to contribute to this development. The omega-3 PUFA Docosahexaenoic acid (DHA) has been reported to be antiinflammatory, but its way of action is not completely understood. Initially, the molecular mechanisms of DHA impact on IgE production in human B cells were examined in vitro. Thereby, DHA inhibited IgE production and the differentiation of IgE secreting cells. This was mediated through direct inhibition of the immunoglobulin isotype switching process by decreasing epsilon germline transcript and activation induced desaminase transcription. Analysis of involved signalling pathways revealed an inhibition of IL-4 driven STAT6 phosphorylation and a reduced NFkappaB translocation into nucleus upon CD40 ligation. Next, in a randomised, double bind, controlled clinical study the efficacy of high-dose DHA supplementation in atopic eczema was determined by investigating the impact on clinical and immunological parameters. In the DHA, but not in control group a clinical improvement of atopic eczema and a reduction of CD40/IL-4 mediated IgE synthesis of peripheral blood cells were observed whereas serum IgE levels remained unchanged. Finally, in a mouse model the impact of oral DHA application on allergen induced dermatitis as well as the underlying local mechanisms were investigated. Thereby, the DHA mediated reduction of clinical skin score was associated with decreased dermal CD8+ T cell numbers, whereas other histological parameters or serum IgE values were not affected. In summary the results indicate that dietary DHA may be effective in prevention of allergic diseases by interference with the IgE switching process and improve the clinical outcome of atopic eczema by its positive impact on local inflammatory processes.

Apoptose und Seneszenz sind stress-responsive, genetisch verankerte „Failsafe“- Mechanismen, welche die Zelle vor maligner Transformation schützen. Onkogenes Ras induziert zelluläre Seneszenz über den p16/Retinoblastoma (Rb)-Signalweg und führt dabei zu einem permanenten Zellzyklusarrest - das tumorsuppressive Potential von Seneszenz in vivo bleibt jedoch bis heute fraglich. In seneszenten Zellen ist die Expression von S-Phase relevanten Gene durch die lokale Ausbildung von Heterochromatin, bzw. der Methylierung von Histon H3 an Lysin 9 (H3K9me) blockiert. Dies lässt vermuten, dass Seneszenz ein epigenetische kontrollierter Prozess ist und von Proteinen wie der Rb-assozierte Histonmethyltransferase Suv39h1 reguliert wird. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Eµ-N-Ras transgene Mäuse mit heterozygoten Läsionen im Suv39h1 oder p53 Lokus aggressive T-Zell Lymphome entwickeln, die gegen Suv39h1, bzw. p53-Expression selektieren. Im Gegensatz dazu entwickeln N-Ras-transgene Wildtyp-Tiere („Kontrollen“) vorrangig nicht-lymphoide Tumoren und sterben signifikant später. In primären Lymphozyten induziert onkogenes Ras einen Suv39h1-abhängigen, H3K9me-assoziierten Proliferationsarrest und kann dadurch Lymphomgenese verhindern. Suv39h1-defiziente Lymphomzellen wachsen exponentiell und sind, entgegen p53 defizienten Zellen, sensitiv gegenüber Adriamycin-induzierten Zelltod (Apoptose). Jedoch arretieren nur Kontroll-Lymphome unter Therapie in vitro wenn Apoptose blockiert ist, nicht aber Suv39h1 oder p53-defiziente Lymphomzellen. Diese Resultate identifizieren Ras-induzierte Seneszenz als einen neuen, H3K9me-abhängigen Tumorsuppressor-Mechanismus, wobei dessen Inaktivierung die Entwicklung von aggressiven, aber dennoch Apoptose-kompetenten Lymphomen herbeiführt. Cellular “failsafe” programs like apoptosis or senescence are genetically encoded, stress-responsive mechanisms that ultimately counteract malignant transformation. Acute induction of oncogenic Ras provokes cellular senescence that involves the p16/Retinoblastoma (Rb) pathway to induce a permanent arrest, but the tumor suppressive mechanism in vivo still remains questionable. Senescent cells display heterochromatic features on S-phase relevant genes involving methylation of histone H3 on lysine 9 (H3K9me), which may depend on the Rb-associated histone methyltransferase Suv39h1. In the present thesis it was shown that Eµ-N-Ras transgenic mice harboring targeted heterozygous lesions at the Suv39h1, or the p53 locus for comparison, succumb to invasive T cell lymphomas that lack expression of Suv39h1 or p53, respectively. By contrast, most N-Ras-transgenic wildtype (“control”) animals develop a non-lymphoid neoplasia significantly later. Proliferation of primary lymphocytes is directly stalled by a Suv39h1-dependent, H3K9me-related senescent growth arrest in response to oncogenic Ras, thereby cancelling lymphomagenesis at an initial step. Suv39h1-deficient lymphoma cells grow rapidly but, unlike p53-deficient cells, remain highly susceptible to adriamycin-induced apoptosis. In contrast, only control, but not Suv39h1-deficient or p53-deficient lymphomas senesce after drug therapy when apoptosis is blocked. These results identify H3K9me-mediated senescence as a novel Suv39h1-dependent tumour suppressor mechanism whose inactivation permits the formation of aggressive but apoptosis-competent lymphomas in response to oncogenic Ras.

Neutrophile Granulocyten wirken als einer der ersten Abwehrmechanismen gegen invasive Mikroorganismen im angeborenen Immunsystem von Mammalia. Aktiviert durch inflammatorische Signale verlassen diese Granulocyten das vaskuläre System und migrieren durch das Gewebe zum Infektionsherd. Dort binden sie die Mikroorganismen, phagozytieren und eliminieren diese schließlich mit hoher Effizienz. Humane Neutrophile Elastase (NE) ist Bestandteil der neutrophilen Granula und spielt eine entscheidende Rolle im Abbau von Virulenzfaktoren enteroinvasiver Bakterien, einschließlich der Shigella Virulenzfaktoren IpaB (invasion antigen plasmid B) und IcsA (intracellular spread A). NE gehört zu der Familie der Chymotrypsin-ähnlichen Serinproteasen, die sich durch Sequenz- und Strukurähnlichkeit auszeichnen, jedoch sehr unterschiedliche biologische Funktionen aufweisen. Cathepsin G (CG) ist wie NE eine Chymotrypsin-ähnliche Serinprotease und ebenfalls in neutrophilen Granula lokalisiert. Allerdings zeigt CG keine Aktivität gegenüber Virulenzfaktoren von Shigella. Obwohl die Kristallstrukturen von CG und NE fast identisch sind, konnten einzelne oder mehrere Aminosäuren in der Substratbindungsspalte identifiziert werden, die zwischen den beiden Enzymen differieren. Dies legte die Vermutung nahe, dass die Spezifität von NE gegenüber Virulenzfaktoren in diesen Unterschieden codiert sein könnte. Daher wurden diese Aminosäuren durch die analogen CG Aminosäuren oder durch Alanin ersetzt. Der Vergleich der funktionellen Eigenschaften der NE Mutanten mit wildtyp NE zeigte, dass die Aminosäuren an den Positionen 98 und 216-224 entscheidend für die Substratspezifität von NE sind. Die NE Mutanten N98A, 216-218 und 216-224 waren nicht mehr in der Lage, die Virulenzfaktoren IcsA und IpaB sowie das NE Peptidsubstrat abzubauen. Stattdessen haben diese Mutanten die Fähigkeit erlangt, das CG Peptidsubstrat abzubauen. Zusammenfassend konnten wir Aminosäuren in NE identifizieren, die sowohl die Spezifität von NE für das Peptidsubstrat als auch für die Virulenzfaktoren von Shigella flexneri determinieren., Neutrophil granulocytes are one of the first lines of defense of the mammalian innate immune system against invading microorganisms. In response to inflammatory stimuli, neutrophils migrate from the blood stream to infected tissues where they bind, engulf and inactivate microorganisms efficiently. Human neutrophil elastase (NE), a neutrophil granule component, is a key host defense protein that rapidly destroys virulence factors of enteroinvasive pathogens including IpaB (invasion plasmid antigen B) and IcsA (intracellular spread A) from Shigella. NE belongs to the family of chymotrypsin-like serine proteases with sequence and structural similarity but with very different biological functions. Cathepsin G (CG) is another abundant chymotrypsin-like serine protease in neutrophil granules. However, in contrast to NE, CG does not cleave virulence factors of Shigella. The crystallographic structures of NE and CG are very similar but we identified single or multiple residues in the substrate-binding cleft to differ in these two enzymes. We hypothesized that NE specificity for bacterial virulence factors resides within these structural differences. Therefore these specific residues in NE were replaced with the analogous amino acids of CG or with alanine. By comparing the functional properties of these NE mutants to wildtype NE we were able to show that the amino acids at position 98 and 216-224 are crucial for the substrate specificity of NE. The NE mutants N98A, 216-218 and 216-224 did not cleave the virulence factors IcsA and IpaB as well as the NE peptide substrate but cleaved the CG peptide substrate. In summary, we identified residues in NE that determine the specificity of NE for the peptide substrate and for the Shigella flexneri virulence factors.

Hintergrund: Die Versorgung von Immunzellen mit Energie in Form von ATP ist Grundlage eines funktionstüchtigen Immunsystems. Diese wird durch die mitochondriale OXPHOS oder durch die zytosolische Glykolyse gewährleistet. Sauerstoff und Glukose stellen die Hauptsubstrate dieser Stoffwechselprozesse dar. Fragestellung: Unter pathologischen Bedingungen wie sie in Entzündungsgebieten herrschen, konnte ein relativer Sauerstoffmangel experimentell nachgewiesen werden. Ziel dieser Arbeit war es herauszufinden, in welcher Weise die Funktionen einer definierten Lymphozytenpopulation (CD4+) durch Sauerstoffmangel beeinflusst werden. Methoden: Nach Isolation von CD4+ Zellen aus peripherem Blut gesunder Spender, wurden definierte Zellmengen stimuliert und in einem mit einer Sauerstoffelektrode ausgestatteten Gefäß unter Luftabschluß inkubiert. Zu definierten Zeitpunkten wurden Proben zur ATP-Messung entnommen, sowie Protein- und RNA-Lysate hergestellt. Die Vitalität zu Anfang und zum Ende der Inkubation wurde mittels Propidium-Jodid-Färbung im FACS bestimmt. Aus gesammelten Überständen wurden mittels Multiplex-ELISA die Konzentrationen von IL-1beta, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-alpha und MCAF gemessen. Als Kontrollen dienten unter Normoxie inkubierte Aliquots der Zellsuspensionen. HIF-1alpha wurde mit Immunoblotting nachgewiesen. Transkriptionsänderungen von SOD1 und HK1 wurden durch SYBR-Green Real-Time-PCR quantifiziert. Ergebnisse: Stimulierte CD4+-Zellen von Normalspendern schütten unter dem Einfluss von Hypoxie vermehrt proinflammatorische und chemotaktisch wirksame Zytokine, sowie zur Differenzierung notwendige antiinflammatorische Zytokine aus. Die Verfügbarkeit von Glukose hat hierauf einen verstärkenden Effekt. Eine hypoxische Umgebung sorgt in Abhängigkeit von der Versorgung mit Glukose für eine Anpassung der zellulären Atmungsrate. Glukose ist für die Aufrechterhaltung eines konstanten ATP-Levels verantwortlich. Die glykolytische Energiegewinnung unter Hypoxie kompensiert den Ausfall der OXPHOS. Hypoxie führt bei stimulierten CD4+-Zellen bei freier Glukoseverfügbarkeit zu einer vermehrten Transkription des Hexokinase1-Gens. Glukosemangel bewirkt dagegen in hypoxischer Umgebung eine Transkriptionssteigerung des SOD1-Gens., Background: The energy supply of immune cells in form of ATP is the cornerstone of a functional immune system. This supply is realized by either mitochondrial OXPHOS or cytosolic glycolysis. Oxygen and glucose present the main substrates in these metabolic processes. Objective: Relative shortness of oxygen could be determined experimentally under pathological conditions present in inflamed tissues. The aim of this study was to determine the extent of hypoxic influence on the cellular function of CD4+ lymphocytes. Methods: Human CD4+ cells were isolated from peripheral blood of healthy blood donors by MACS sorting. Following a defined protocol cells were stimulated and incubated in a sealed container with a Clark type electrode. Samples were taken for measurements of ATP content. RNA- and Protein lysates were made to quantify the transcription of SOD1 and HK1 by SYBR green RT-PCR and look for the presence of HIF-1alpha by immunoblot analysis respectively. Supernatants were used to measure the expression of IL-1beta, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-alpha and MCAF using a multiplex ELISA assay. Aliquots of cell supspensions incubated under normoxic conditions served as controls. Results / Conclusion: Under the influence of hypoxia stimulated CD4+ lymphocytes of healthy blood donors express proinflammatory and chemotactically active as well as anti-inflammatory cytokines important for cell differentiation. The availability of glucose leads to an increase of this effect. An hypoxic environment dependant on the availability of glucose leads to an adaptation of cellular respiration. Glucose deficiency provokes an increase in cellular oxygen utilization. The availability of glucose is responsible for a constant intracellular ATP level. This proves that in CD4+ lymphocytes glycolysis is capable of compensating for hypoxically impaired oxidative phosphorylation thus providing enough ATP to enable cellular function. Hypoxia under glucose provision leads to an increase in mRNA expression for HK1, a key enzyme of glycolysis. Lack of glucose under hypoxic conditions results in an increase in mRNA expression for SOD1. Glucose therefore serves in CD4+ cells as an agent of constant energy supply that leads to cell survival and an upkeep of a proinflammatory environment through cytokine expression.

Das Immunsystems muss gesunde Zellen von infizierten und Krebszellen unterscheiden können, um letztere selektiv zu bekämpfen. Dies ist die Aufgabe der CTL-Zellen, die dazu auf der Zelloberfläche präsentierte Peptide die aus intrazellulären Proteinen der jeweiligen Zelle stammen untersuchen. Diese präsentierten Peptide (Epitope) werden durch den MHC-I Antigenpräsentationsweg hergestellt. Das Ziel dieser Arbeit ist es Methoden zu entwickeln die Epitope aus der großen Zahl prinzipiell in Proteinen enthaltener Peptide heraussuchen können. Dazu wird die Selektivität dreier wichtiger Komponenten des Präsentationsweges untersucht: Die Herstellung der Peptide durch das Proteasom, der Transport in das ER durch TAP, und das Binden von Peptiden an leere MHC-I Moleküle. Zur sequenzbasierten Vorhersage der Bindung von Peptiden an MHC-I Moleküle wurde ein neuer Algorithmus entwickelt. Dieser kombiniert eine Matrix, welche die individuellen Beiträge einzelner Reste zur Bindung beschreibt, mit Paarkoeffizienten, die Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Positionen im Peptid beschreiben. Dieser Ansatz macht bessere Vorhersagen als bisher publizierte Methoden, und quantifiziert erstmals den Einfluss von Wechselwirkungen innerhalb eines Peptids auf die Bindung. Die Verteilung der Werte der Paarkoeffizienten zeigt, dass sich Wechselwirkungen nicht auf benachbarte Aminosäuren beschränken. Im Vergleich zu den Matrixeinträgen sind die Werte der Paarkoeffizienten klein, was erklärt warum Vorhersagen die Wechselwirkungen komplett vernachlässigen trotzdem gut sein können. Erstmals wurde ein Algorithmus zur Vorhersage der TAP-Transportseffizienz von Peptiden beliebiger Länge entwickelt. Das ist deshalb wichtig, da viele MHC-I Epitope als N-terminal verlängerte Prekursoren in das ER transportiert werden. Für die Vorhersage der Transportfähigkeit eines potentiellen Epitopes wird deshalb über die Transporteffiziens des Epitopes selbst und seiner Prekursoren gemittelt. Mit Hilfe dieser Definition von Transportfähigkeit wird gezeigt, dass TAP einen starken selektiven Einfluss auf die Auswahl von MHC-I Epitopen hat. Indem man Peptide die als 'nicht-transportierbar' vorhergesagt werden als mögliche Epitope ausschließt, kann man die ohnehin schon hohe Qualität von MHC-I Bindungsvorhersagen weiter steigern. So eine zweistufige Vorhersage scheitert, wenn man statt des TAP Transports die Vorhersage der Generierbarkeit eines Epitopes durch das Proteasom als Filter verwenden möchte. Dieses schlechte Abschneiden der proteasomalen Schnittvorhersagen wird auf eine mangelhafte experimentelle Datenbasis zurückgeführt, da proteasomale Schnittraten schwieriger zu messen und interpretieren sind als die Affinitätsdaten für TAP und MHC-I. Um die experimentelle Datenbasis in Zukunft verbessern zu können, wurde ein neues experimentelles Protokoll entwickelt und an einer Reihe von Experimenten getestet. Dabei werden zwei Probleme behandelt: (1) Durch die Verwendung von Massenbilanzen werden MS-Signale in quantifizierte Peptidmengen umgerechnet. (2) Durch das erste kinetische Modell des Proteasomes das die Entstehung und den Abbau von Peptiden während eines Verdaus zufrieden stellend beschreiben kann, können aus den Verdaudaten Schnittraten bestimmt werden. A major task of the immune system is to identify cells that have been infected by a virus or that have mutated, and discriminate them from healthy cells. This duty is assigned to cytotoxic T-lymphocytes (CTL), which scan epitopes presented to them on cell surfaces derived from intracellular proteins through the MHC-I antigen processing pathway. The goal of this work is to provide computational methods that allow to predict which epitopes get presented from the large pool of peptide candidates contained in intracellular proteins. This is achieved by examining the selective influence of three major steps in the pathway: peptide generation by the proteasome, peptide transport into the ER by TAP, and binding of peptides to MHC-I molecules. For peptide binding to MHC-I, a new algorithm is developed that combines a matrix-based method describing the contribution of individual residues to binding with pair coefficients describing pair-wise interactions between positions in a peptide. This approach outperforms several previously published prediction methods, and for the first time quantifies the impact of interactions in a peptide. The distribution of the pair coefficient values shows that interactions are not limited to amino acids in direct contact, but can also play a role over longer distances. Compared to the matrix entries, the pair-coefficients are rather small, explaining why methods completely ignoring interactions can nevertheless make good predictions. Next, a novel algorithm is developed to predict the TAP affinities of peptides of any length. Longer peptides are important because several MHC-I epitopes are generated by N-terminal trimming of precursor peptides transported into the ER by TAP. As the true in vivo precursors of an epitope are not known, a generalized TAP score is established which averages across the scores of all precursors up to a certain length. The ability of this TAP score to discriminate between epitopes and random peptides shows that the influence of TAP is a consistent, strong pressure on the selection of MHC-I epitopes. Using predicted TAP transport efficiencies as a filter prior to the prediction of MHC-I binding affinities, it is possible to further improve the already very high classification accuracy achieved using MHC-I affinity predictions alone. Such a 2-step prediction protocol failed when predictions of C-terminal proteasomal cleavages were combined with MHC-I affinity predictions. This disappointing result is thought to be caused by the lack of a sufficiently large set of quantitative and consistent experimental data on proteasomal cleavage rates, which are more difficult to measure and interpret than the affinity assays used to characterize peptide binding to TAP and MHC-I. Therefore, a new protocol for the evaluation of proteasomal digests is developed, which is applied to a series of experiments. This novel protocol addresses two problems: (1) Using mass-balance equations, a method is developed to quantify peptide amounts from MS-signals. (2) By introducing the first kinetic model of the 20S proteasome capable of providing a satisfactory quantitative description of the whole time course of product formation, cleavage probabilities can be extracted reliably from proteasomal in vitro digests.

In den humanen Leukozyten-Antigenen (HLA) wird die wichtigste genetische Ursache von rheumatoider Arthritis gesehen. Es wurden bisher mehrere Mechanismen beschrieben, wie diese HLA-Moleküle die Entstehung und den Verlauf der Erkrankung beeinflussen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die differentielle Expression von HLA-DRB-Genen in unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen als möglicher Mechanismus untersucht. Dabei wurden strukturelle Unterschiede zwischen den Promotoren des krankheitsassoziierten HLA-DR4-Haplotyps und den neutralen Haplotypen DR7 und DR9 eingehender betrachtet. Allen drei Haplotypen ist gemein, daß sie das DRB4-Gen als zweites funktionelles DRB-Gen tragen, wobei das DRB4-Gen entweder den DRB4A oder den -B-Promotor besitzt. Um den Einfluß einzelner Promotorelemente auf die mit dem Luziferase-Assay bestimmten Transkriptionsaktivitäten näher zu untersuchen, wurde mit Hilfe der surface plasmon resonance die Bindung der Transkriptionsfaktoren aus den Zellkernlysaten von der humanen Monozytenzellinie THP-1 und von der humanen B-Lymphom-Zellinie BJAB an die unterschiedlichen S-, X-, Y-, CCAAT- und TATA-Boxen analysiert. Es konnte gezeigt werden, daß die unterschiedliche Expression von DRB4A und DRB4B durch die ubiquitäre TATA-Box vermittelt wird. Dagegen wurde die INF-gamma-Stimulation der HLA-DR-Expression von THP-1- aber auch von BJAB-Zellen durch die für die HLA-DR-Promotoren spezifische X-Box vermittelt. Bei der Analyse von DR4-, DR7- und DR9-positiven Patienten einer bereits gut charakterisierten RA-Kohorte stellte sich heraus, daß der DRB4B-Promotor, welcher im Vergleich zu DRB4A eine höhere transkriptionelle Aktivität besitzt, mit einem schweren Krankheitsverlauf assoziiert ist, so daß eine erhöhte HLA-DR-Expression den Krankheitsverlauf negativ zu beeinflussen scheint. Disease associated human leukocyte antigen (HLA) genes have been identified in humans where they are assumed to promote the susceptibility and/or progression of rheumatoid arthritis. Several mechanisms have been described how these HLA haplotypes impact on the disease. Among them the differential expression of HLA-DRB molecules in different types of antigen-presenting cells, which was investigated here in detail. The promoters of the disease associated HLA-DR4 to the neutral DR7 and DR9 haplotypes were analyzed for sequence polymorphisms resulting in functional differences. All three haplotypes carry as a second functional DRB gene the DRB4 gene, which is regulated by the DRB4A or -B promoter. To determine the impact of the promoter elements on the transcriptional activities measured by luciferase assay the surface plasmon resonance technology was employed. To this end, nuclear extracts from the monocytic cell line THP-1 and from the B lymphoma cell line BJAB were used to analyze their binding to the various S-, X-, Y-, CCAAT-, and TATA boxes. It could be demonstrated that the differential expression of DRB4A and -B was regulated via the ubiquitous TATA box. By contrast, the INF-gamma stimulation of HLA expression in THP-1 and BJAB was mediated via the unique X box. Analyzing the DR4, DR7 and DR9 positive patients of an RA cohort, the DRB4B promoter, which has a higher transcriptional activity than the DRB4A promoter, is associated with radiographic progression of RA. This data is thus indicative of an impact of elevated HLA-DR expression on the progression of the disease.

Die Expression von Haupthistokompatibilitätsantigenen auf der Zelloberfläche kernhaltiger Zellen ist die Hauptursache für die Detektion durch das Immunsystem und die Rejektion allogener Transplantate. Eine vielversprechende Strategie, die MHC-I-Expression auf der Zelloberfläche zu senken, ist der Einsatz intrazellulär lokalisierter Antikörpern, sogenannter Intrabodies. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals versucht, eine die Expression an MHC-I-Molekülen auf der Zelloberfläche durch den Einsatz von anti-MHC-I-Intrabodies zu verhindern. Ein Hauptproblem in der Transplantation ist der Mangel an geeignetem Spendermaterial. Um diesem Zustand entgegenzuwirken, wird versucht, adäquaten Organersatz durch Tissue Engineering bereitzustellen. Die in vitro-Züchtung autologer epithelialer Zellen zur Generierung transplantierbarer Hautstücke spielt heute bereits eine große Rolle bei der Transplantation artifizieller Gewebe. Ferner werden diverse vollsynthetische Materialien für diesen Zweck hergestellt. Eine Verbesserung in diesen Bereich würde die Generierung von nicht-immunogenen allogenen Keratinozyten darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden primäre Rattenkeratinozyten mit anti-MHC-I-Intrabodies transfiziert. Diese Zellen zeigten einen MHC-I-"knock-out"-Phänotyp - eine starke Expression der Intrabodies war jedoch essentiell für die vollständige Zurückhaltung aller MHC-I-Moleküle in der Zelle. Neben der Applikation von Intrabodies in Rattenkeratinozyten konnte die MHC-I-Expression auf der Zelloberfläche von 293-Zellen und primären humanen Keratinozyten ebenfalls durch die Expression von anti-MHC-I-Intrabodies vermindert werden. Im Vergleich mit dem ebenfalls MHC-I-bindenden adenoviralen Protein p19 bewirkten die eingesetzten anti-MHC-I-Intrabodies bei gleich starker Expression eine wesentlich stärkere "Downregulation" der MHC-I-Oberflächenexpression von 293-Zellen. Intrabody-exprimierende Zellen zeigten keine signifikanten morphologischen oder physiologischen Veränderungen gegenüber untransfizierten Zellen: Wachstum, die Expression anderer Oberflächenmoleküle und morphologische Erscheinung waren unverändert. Es konnte lediglich eine verstärkte intrazelluläre Akkumulation von MHC-I-Molekülen detektiert werden. Die funktionelle Bedeutung der MHC-I-"Downregulation" durch Intrabodies konnte durch die stark verminderte zytolytische Aktivität zytotoxischer T-Zellen gegenüber Intrabody-exprimierender Rattenkeratinozyten im Vergleich zu unmodifizierten Zellen gezeigt werden. In der vorliegenden Arbeit ist es erstmals gelungen, Zellen mit einem vollständigen MHC-I-"knock-out"-Phänotyp zu erzeugen - bisherige Modifikationen der MHC-I-Oberflächenexpression durch die Generierung _2-Mikroglobulin- oder TAP-defizienter Mäuse führte zu keinem restlosen Verlust der Klasse-I-Moleküle auf der Zelloberfläche. MHC-I-"downregulierte" Keratinozyten könnten in der Hauttransplantation anstelle der limitiert zur Verfügung stehenden autologen Zellen eingesetzt werden oder in Kombination mit synthetischen Materialien verwendet werden, wo sie durch die Sekretion von heilungsfördernden Faktoren eine Verbesserung des Wundheilungsprozesses bewirken würden. The expression of major histocompatibility antigens on the surface of eucaryotic cells is the predominant reason for immunologic detection and the rejection of allogeneic transplants. A promising strategy to lower the MHC I expression on the cell surface is the use of intracellular localized antibodies, termed intrabodies. In this work it has been tried for the first time to prevent the expression of MHC class I molecules on the cell surface by intrabody expression. A major problem in transplantation is the shortage of suitable donor material. To overcome this situation tissue engineering has and will continue to enlarge the scope of organ grafting. Today, the in vitro culture of autologous epithelial cells to generate transplantable skin sheets plays an important role in the transplantation of artificial tissues. Furthermore various fully synthetic materials are produced for transplantation. An improvement in this field could be the generation of non-immunogeneic allogeneic keratinocytes. Within this work primary rat keratinocytes have been transfected with anti-MHC-I-Intrabodies. These cells show a MHC I "knockout" phenotype - yet a strong intrabody expression was essential for the complete retention of all MHC I molecules inside the cell. Besides the application of intrabodies in keratinocytes the MHC I expression on the surface of 293 cells and human primary keratinocytes could be reduced by anti-MHC I intrabodies as well. In comparison with the also employed adenoviral protein p19 the applied intrabodies generated at the same expression level a much stronger down-regulation of the MHC I surface expression of 293 cells. Intrabody expressing cells did not show any significant morphologic or physiologic alterations compared to untransfected cells: growth, the expression of other surface molecules and the morphological appearance were unaltered. Merely an enhanced intracellular accumulation of MHC I molecules could be detected. The functional relevance of the MHC I down-regulation by intrabodies could be shown by the strong diminished cytolytic activity of cytotoxic T cells to intrabody expressing rat keratinocytes in comparison to unmodified cells. In this work cells with a completely MHC I knock-out phenotype has been successfully generated for the first time - modifications of the MHC I surface expression by generation of _2-microglobulin or TAP deficient mice did not lead to a complete loss of all MHC I molecules on the cell surface so far. MHC I down-regulated keratinocytes could be employed in skin transplantation instead of the limited available autologous cells or utilized in combination with synthetic materials where they would induce an improvement of the healing process by the secretion of cytokines.