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Ubiquinone (UQ) is a polyprenylated lipid that plays an important role in electron transport in the respiratory chains of E. coli. The aerobic biosynthesis of UQ in E. coli requires eight reactions and involves at least twelve proteins (UbiA-UbiK and UbiX). In this work, we demonstrate that seven Ubi proteins form the Ubi complex, a stable metabolon that catalyzes the last six reactions of the UQ biosynthetic pathway. The X-Ray structure of the SCP2 domain of UbiJ forms an extended hydrophobic cavity that could bind UQ intermediates inside the 1-MDa Ubi complex. The Ubi complex is purified from cytoplasmic extracts and UQ biosynthesis occurs in this fraction, challenging the current thinking of a membrane-associated biosynthetic process. UQ is reported to be biosynthesized under both anerobic and anaerobic conditions. We characterize a novel, O2-independent pathway for the biosynthesis of UQ. This pathway relies on three proteins, UbiT, UbiU, and UbiV. UbiT contains an SCP2 lipid-binding domain and is likely an accessory factor of the biosynthetic pathway, while UbiU and UbiV (UbiU-UbiV) are involved in hydroxylation reactions and represent a novel class of O2-independent hydroxylases. We demonstrate that UbiU-UbiV from E.coli form a heterodimer, wherein each protein binds a [4Fe-4S] cluster via conserved cysteines that are essential for activity. Moreover, we show that purified UbiU from P. aeruginosa is able to bind UQ, suggesting a different role of UbiU and UbiV. UbiU and UbiV belong to peptidase U32 family whose function remains questionable. By bioinformatic analyses, we demonstrated that U32 proteins were characterized by four conserved cysteines important for their enzymatic activities and by biochemical tools, we confirmed that RlhA and TrhP, two others U32 subfamilies, like UbiU and UbiV, are all Fe-S proteins.; L’ubiquinone, ou coenzyme Q (CoQ ou UQ), est un lipide polyprénylé qui joue un rôle important dans le transport des électrons dans les chaînes respiratoires chez E. coli. La biosynthèse de l'UQ en aérobie chez E. coli nécessite huit réactions et implique au moins douze protéines (UbiA-UbiK et UbiX). Dans ce travail, nous démontrons que les protéines Ubi forment le complexe Ubi, un métabolon stable qui catalyse les six dernières réactions de la voie de biosynthèse. La structure tridimensionnelle du domaine SCP2 d’UbiJ forme une cavité hydrophobe étendue qui lie les intermédiaires de l’UQ à l'intérieur du complexe d’1-MDa. Le complexe Ubi est purifié à partir des extraits cytoplasmiques et la biosynthèse de l'UQ a lieu dans cette fraction, remettant en question l’hypothèse actuelle d'un processus de biosynthèse associé à la membrane. L’UQ est connue pour être synthétisée en aérobie et anaérobie. Nous caractérisons une nouvelle voie de biosynthèse de l’UQ indépendante de l'O2. Cette voie repose sur trois protéines, UbiT, UbiU et UbiV. UbiT possède un domaine de liaison aux lipides SCP2 et est probablement un facteur accessoire de la voie de biosynthèse, tandis qu’UbiU et UbiV (UbiU-UbiV) sont impliqués dans les réactions d'hydroxylation et représentent une nouvelle classe d'hydroxylases indépendantes de l’O2. Nous démontrons qu’UbiU-UbiV d’E.coli forme un hétérodimère, chaque protéine se lie à un centre [4Fe-4S] via des cystéines conservées essentielles à l'activité. De plus, nous montrons qu’UbiU purifié de P. aeruginosa est capable de lier de l’UQ, suggérant un rôle différent d’UbiU et d’UbiV. UbiU et UbiV appartiennent à la famille des peptidases U32, dont la fonction reste discutable. Nous démontrons, par des analyses bioinformatiques, que les protéines U32 sont caractérisées par quatre cystéines conservées très importantes pour leurs activités enzymatiques et par des outils biochimiques, nous confirmons que RlhA et TrhP, deux autres protéines de la famille U32, comme UbiU et UbiV, sont des protéines Fe-S.