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CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior FINEP - Financiadora de Estudos e Projetos, Financiadora de Estudos e Projetos INCT – Instituto nacional de ciência e tecnologia (Antigo Instituto do Milênio) A infecção pelo Zika virus (ZIKV) durante a gestação está associada com graves alterações congênitas, incluindo microcefalia, anormalidades sensoriais, articulares e musculares, entre outras, as quais são definidas como Síndrome Congênita pelo Zika. Ainda, diversas infecções durante a gravidez são associadas com o desenvolvimento de doenças neuropsiquiátricas secundárias às alterações no processo de neurodesenvolvimento. Entretanto, as consequências neuropsiquiátricas da prole nascida de mães infectadas pelo ZIKV durante a gravidez ainda permanecem desconhecidas. Neste trabalho, usando um modelo de camundongos imunocompetentes C57BL/6, uma caracterização dos efeitos da infecção congênita pelo ZIKV foi realizada nos estágios iniciais da gravidez até a idade adulta da prole nascida de mães infectadas pelo ZIKV. Para isso, camundongos fêmeas grávidas foram inoculadas com 1x106 UFP/animal de ZIKV por via intraperitoneal no dia embrionário 5,5 na presença ou ausência do anticorpo monoclonal pan-flavivirus anti-envelope 4G2 para avaliar o fenômeno de aumento da infecção dependente de anticorpos (ADE). Os resultados revelaram que a infecção pelo ZIKV induziu ativação imune materna (AIM), na qual foi associada com a ocorrência de alterações embrionárias e morte fetal. Importantemente, a administração terapêutica do peptídeo antiviral AH-D durante os estágios iniciais da gravidez preveniu a replicação do ZIKV e reduziu a morte da prole. No período pós-natal da prole, a infecção congênita pelo ZIKV foi associada com uma redução no volume cerebral, anormalidades oftalmológicas, alterações na morfologia testicular e o comprometimento da microarquitetura óssea. Algumas alterações foram exacerbadas na presença do anticorpo 4G2. Além disso, as alterações neuropatológicas induzidas pelo ZIKV não refletiram em anormalidades comportamentais nos animais machos da prole adulta, mesmo quando submetidos a um segundo insulto ambiental no período pré-púbere. De forma geral, os resultados revelaram que a infecção materna pelo ZIKV causa diversas alterações congênitas em camundongos imunocompetentes, as quais podem ser exacerbadas pelo fenômeno de ADE e estão associados com AIM. Adicionalmente, o tratamento antiviral com o peptídeo AH-D pode ser benéfico durante a infecção pelo ZIKV no início da gestação. Zika virus (ZIKV) infection is associated with serious birth defects, including microcephaly, sensory, articular and muscle abnormalities, among others, which are defined as Congenital Zika Syndrome. Several infections during pregnancy are associated with the development of neuropsychiatric disorders secondary to changes in the neurodevelopmental process. However, neuropsychiatric consequences in the offspring born to ZIKV-infected dams are still unknown. Here, using an immunocompetent C57BL/6 mouse model, we performed an in-depth characterization of the effects of congenital ZIKV infection in the early stages of pregnancy until adulthood of offspring born to infected dams. For that, mouse pregnant dams were inoculated with 1x106 PFU/mouse of ZIKV by intraperitoneal route on the embryonic day 5.5 in the presence or absence of anti-envelope pan-flavivirus monoclonal antibody 4G2 to evaluate the phenomenon of antibody-dependent enhancement (ADE). Our results revealed that ZIKV induced maternal immune activation (MIA), which was associated with the occurrence of fetal alterations and death. Importantly, therapeutic administration of antiviral peptide AH-D during the early stages of pregnancy prevented ZIKV replication and reduced death of offspring. During the post-natal period, congenital ZIKV infection was associated with a reduction in whole brain volume, ophthalmological abnormalities, changes in the testicular morphology, and disruption in bone microarchitecture. Some alterations were enhanced in the presence of 4G2 antibody. Moreover, neuropathological alterations induced by ZIKV did not reflect on behavioral abnormalities in the male adult offspring, even when subjected to a second environmental hit during the peripubertal period. Overall, our results revealed that early maternal ZIKV infection causes several birth defects in immunocompetent mice, which can be potentiated by the ADE phenomenon and are associated with MIA. Additionally, antiviral treatment with AH-D peptide may be beneficial during early maternal ZIKV infection.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior INCT – Instituto nacional de ciência e tecnologia (Antigo Instituto do Milênio) A febre Chikungunya é uma doença viral que tem como agente etiológico o Chikungunya virus (CHIKV) e é transmitida, principalmente, por mosquitos do gênero Aedes, como Aedes aegypti e A. albopictus. A doença causada pelo CHIKV apresenta sinais e sintomas semelhantes aos de outras arboviroses de importância clínica, como a dengue, porém, o principal fator patognomônico que a difere das demais arboviroses é a artralgia debilitante e persistente, que pode durar de meses a anos e está associada à perda de qualidade de vida dos indivíduos acometidos e elevado impacto econômico nos sistemas públicos de saúde. Por fim, não existe tratamento específico ou vacina disponível contra a febre Chikungunya (CHIKF), além de os mecanismos envolvidos na patogênese da artralgia induzida pelo CHIKV serem pouco conhecidos. Recentemente, durante a padronização do modelo experimental de infecção pelo CHIKV feita em nosso laboratório, foi observado que a inoculação do CHIKV em camundongos selvagens (WT) induziu diversos sinais e sintomas associados à infecção vista em humanos, a exemplo da hipernocicepção articular e o aumento expressivo de algumas quimiocinas relacionadas ao recrutamento de macrófagos e linfócitos. Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi estudar o papel dos receptores de quimiocina do tipo CC (CCR2 e CCR5) na patogênese da infecção pelo CHIKV in vitro e in vivo. Para isso, foram utilizados camundongos WT da linhagem C57BL/6 e deficientes para os receptores CCR2 (CCR2-/-) e CCR5 (CCR5-/-). O perfil de expressão desses receptores em diferentes tipos celulares, assim como de suas quimiocinas ligantes (CCL2, CCL3, CCL4 e CCL5) e diversos parâmetros clínicos e inflamatórios normalmente associados à doença em humanos foram avaliados. Utilizando análises de citometria de fluxo foi observado o aumento da expressão dos receptores CCR2 e CCR5 após infecção pelo CHIKV predominantemente em macrófagos (células F4/80+) e linfócitos (CD3+). Nos camundongos WT foram observados linfopenia, aumento das quimiocinas CCL2, CCL3, CCL4 e CCCL5 na pata e recuperação de carga viral na pata, baço e linfonodo poplíteo, além de dano tecidual e hipernocicepção articular prolongada. Na ausência do receptor CCR2 foi encontrado um maior nível das quimiocinas citadas, assim como um aumento de infiltrado de neutrófilos no coxim plantar e dano tecidual prolongado. Nos camundongos CCR5-/- também foi observado um maior nível de quimiocinas e aumento de infiltrado de neutrófilos no coxim plantar, além de maior recuperação viral em tempos iniciais pós-infecção. Em contrapartida, a hipernocicepção observada nos grupos de animais CCR2-/- ou CCR5-/- foi apenas nos tempos iniciais, enquanto em animais selvagens continua por até 21 dias. Por fim, estudos in vitro demonstraram que o vírus foi capaz de infectar macrófagos de camundongos WT e deficientes para os receptores CCR2 e CCR5, sem toxicidade às células, demonstrado pelos ensaios de MTT e LDH. As células de camundongos deficientes para CCR2 ou CCR5 apresentaram menor carga viral recuperada, diferente do que foi observado em experimentos in vivo. Neste contexto, este trabalho reforça a importância dos macrófagos e linfócitos no controle da doença causada pelo CHIKV, uma vez que são as principais células afetadas pela ausência dos receptores CCR2 e CCR5, além de demonstrar que os receptores estudados parecem ser importantes na montagem da resposta imune apropriada, para combater o vírus e resolver a inflamação. Estes receptores interferem, ainda, direta ou indiretamente em mecanismos associados a hipernocicepção induzida pela infecção pelo CHIKV. Chikungunya fever (CHIKF) is a viral disease that has the etiological agent known as Chikungunya virus (CHIKV) and it is transmitted mainly by the mosquitoes of the Aedes genus. The disease caused by the CHIKV shows signs and symptoms similar to other arboviral diseases that have clinical significance, such as the dengue fever. However, the main pathognomonic factor that differs CHIKF from other arboviral diseases is the debilitating and persistent arthralgia that can last for months or even years and the mechanisms involved in the pathogenesis of CHIKV-induced arthralgia are poorly understood. Recently, during standardization of the experimental model of CHIKV infection done in our laboratory, we observed that the inoculation of CHIKV on wild type mice (WT) induced several signs and symptoms associated with the infection that is normally seen in humans, such as the articular hypernociception and expressive increase of some chemokines related to the recruitment of macrophages and lymphocytes. Thereby, the aim of this work was to study the role of the chemokine type CC receptors (CCR2 and CCR5) in the pathogenesis of CHIKV in vitro and in vivo infection. To do so, WT mice of the C57BL/6 lineage were used along with and knockouts for CCR2 (CCR2-/- ) and CCR5 (CCR5-/- ) receptors. The expression profile of these receptors in different cell types, as well as their binding chemokines (CCL2, CCL3, CCL4 and CCL5), in addition to several clinical and inflammatory parameters normally associated with the disease in humans, were evaluated. Flow cytometry analyses showed increased expression of CCR2 and CCR5 receptors after the CHIKV infection predominantly in macrophages (F4/80+ cells) and lymphocytes (CD3+ ). On the WT mice, several signs of the disease along with inflammation were observed, such as: lymphopenia, increased CCL2, CCL3, CCL4 and CCCL5 chemokines and recovery of the viral load in several tissues, in addition to tissue damage and prolonged articular hypernociception. However, in the absence of the CCR2 and CCR5 receptors, the inflammation was more exacerbated, since in these groups a higher level of chemokines was found, as well as an increased neutrophil infiltrate and prolonged tissue damage in CCR2- /- mice. In the CCR5-/- mice, in addition to the mentioned findings, a higher viral recovery was also observed in initial post-infection time. However, the hypernociception observed in the groups of knockout animals happened only in the initial time with respect to the CCR2-/- , or nonexistent, in the CCR5-/- mice. In vitro studies also demonstrated that the virus was able to infect macrophages derived from WT mice and knockouts to the CCR2 and CCR5 receptors, but without toxicity to the cells. Interestingly, cells derived from CCR2-/- or CCR5-/- mice showed lower recovered viral load. As a final point, this work reinforces the importance of macrophages and lymphocytes in the control of the disease caused by CHIKV, since they are the main cells affected by the absence of the CCR2 and CCR5 receptors, besides demonstrating that the receptors studied seem to be important in the assembly of the appropriate immune response for fighting the virus and resolving the inflammation process. These receptors also interfere directly or indirectly in mechanisms associated with the hypernociception induced by the CHIKV infection.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior INCT – Instituto nacional de ciência e tecnologia (Antigo Instituto do Milênio) A febre Chikungunya é uma doença viral que tem como agente etiológico o Chikungunya virus (CHIKV) e é transmitida principalmente pelos mosquitos Aedes aegypti e A. albopictus. As principais manifestações clínicas da doença incluem febre, cefaleia, erupções cutâneas eritematosas e maculopapulares, dor nas costas, mialgia e artralgia simétrica de caráter bifásico, que na maioria das vezes evolui para crônica. Até o momento, não há tratamento antiviral específico ou vacina disponível para o tratamento da febre chikungunya. O desenvolvimento de modelos que permitam estudar a interação entre o vírus e o seu hospedeiro poderão servir de base para o entendimento de fatores associados com a doença, assim como servirão para testes de novas terapias antivirais e/ou anti-doença. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi implementar um modelo de infecção pelo CHIKV em camundongos imunocompetentes a fim de estudar a patogênese da doença e identificar possíveis alvos terapêuticos. Foram utilizados camundongos selvagens (WT) da linhagem C57BL/6j infectados pelo CHIKV e seus respectivos controles não infectados. Foi realizada uma cinética de infecção (1, 3, 7 e 14 dias) após a inoculação intraplantar do CHIKV e diversos parâmetros foram avaliados. Nossos resultados demonstram que a infecção pelo CHIKV em camundongos de 4 semanas induziu marcante leucopenia, principalmente de linfócitos, em relação aos camundongos controles não infectados. Observamos também uma maior resposta inflamatória frente à infecção, demonstrada por um maior recrutamento de neutrófilos para os sítios de infecção, aumento na produção de diversos mediadores inflamatórios, citocinas (TNFα e IL-6) e quimiocinas (CCL2, CCL3, CCL4, CLL5, CXCL-2 e CXCL-9) e elevada carga viral no coxim plantar, linfonodo poplíteo, quadríceps e baço dos animais. Os camundongos apresentaram hipernocicepção articular inflamatória prolongada, bem como demonstraram alteração sensitiva em resposta a um estímulo nociceptivo térmico. Ainda, demonstramos alterações histopatológicas importantes nas articulações do tornozelo e joelho, mesmo sem haver aumento de perda óssea ou alterações na função motora. Além disso, nós demonstramos, através da 16 utilização de camundongos deficientes para o receptor de IFN (IFNR/-/-), que o curso da doença induzida pela infecção pelo CHIKV é muito mais grave e está associado à elevada taxa de mortalidade e a um agravamento de todos os parâmetros clínicos e inflamatórios descritos anteriormente. De maneira geral, nós desenvolvemos um modelo experimental em camundongos WT jovens que mimetiza grande parte parâmetros da doença induzida pelo CHIKV em humanos. Ainda, demonstramos o papel protetor crucial exercido pelos interferons do tipo I (IFNα and IFNβ) na resposta do hospedeiro frente à infecção. Estes modelos contribuirão para a elucidação de futuros mecanismos associados à patogênese da interação CHIKV-hospedeiro e no desenvolvimento de novos potenciais terapêuticos antivirais e anti-doença. Chikungunya fever is an infectious viral disease that has as etiological agent the Chikungunya virus (CHIKV), and is mainly transmitted by the mosquitoes Aedes aegypti and A. albopictus. The most important clinical signs of disease include fever, headache, erythematous and maculopapular rash, back pain, myalgia, and symmetrical biphasic arthralgia, which in majority of cases evolve to chronic. Until now, there is no specific antiviral treatment or vaccine available to the treatment of chikungunya fever. The development of models to study the interaction between the virus and its host may be used as a basis for understanding factors associated with the disease, as well as for testing new antiviral and/or anti-disease therapies In this context, the aim of this work was to implement a model of CHIKV infection in immunocompetent mice in order to study the pathogenesis of the disease and to identify possible therapeutic targets. Wild-type (WT) mice of the C57BL/6j lineage were infected with CHIKV and their respective uninfected controls were also used. An infection kinetics (1, 3, 7 and 14 days) was performed after CHIKV inoculation and several parameters were evaluated. Our results shows that CHIKV infection in 4 weeks old mice induced strong leukopenia, predominantly composed of lymphocytes, in comparison to uninfected control mice. In addition, we observed a higher inflammatory response to infection, as demonstrated by an increased recruitment of neutrophils and macrophages to the sites of infection, increased production of several inflammatory mediators, such as the cytokines (TNFα and IL-6) and chemokines (CCL2, CCL3, CCL4, CLL5, CXCL-2 and CXCL-9) and elevated titers of viable viral loads in the rear foot pad, popliteal lymph node, quadriceps and spleen of CHIKV infected mice. Furthermore, these mice showed a sensitive alteration in response to a nociceptive stimulus (hot plate test), inflammatory articular hypernociception, and important histopathological changes in the ankle and knee joints, even without occurrence of bone loss or changes in motor function. Finally, the role type I interferons (IFNα and IFNβ) during CHIKV infection was evaluated. We have demonstrated, through the use of mice deficient to this receptor (IFNα/βR-/-), that the course of the disease 18 induced by CHIKV infection is much more severe and is associated with a high mortality rate and a worsening of all clinical and inflammatory parameters described above. Overall, those results demonstrate the development of an experimental model in young WT mice that mimics a great number of parameters of CHIKV-induced disease in humans. Furthermore, we demonstrate the crucial protective role of type I interferons (IFNα and IFNβ) in the host's response to the infection. Those models will contribute in the future to the elucidation of mechanisms associated with the pathogenesis of the CHIKV- host interactions and to the development of new antiviral and anti-disease therapeutic potentials.