Search

Altered oncogene expression in cancer cells causes loss of redox homeostasis resulting in oxidative DNA damage, e.g. 8-oxoguanine (8-oxoG), repaired by base excision repair (BER). PARP1 coordinates BER and relies on the upstream 8-oxoguanine-DNA glycosylase (OGG1) to recognise and excise 8-oxoG. Here we hypothesize that OGG1 may represent an attractive target to exploit reactive oxygen species (ROS) elevation in cancer. Although OGG1 depletion is well tolerated in non-transformed cells, we report here that OGG1 depletion obstructs A3 T-cell lymphoblastic acute leukemia growth in vitro and in vivo, validating OGG1 as a potential anti-cancer target. In line with this hypothesis, we show that OGG1 inhibitors (OGG1i) target a wide range of cancer cells, with a favourable therapeutic index compared to non-transformed cells. Mechanistically, OGG1i and shRNA depletion cause S-phase DNA damage, replication stress and proliferation arrest or cell death, representing a novel mechanistic approach to target cancer. This study adds OGG1 to the list of BER factors, e.g. PARP1, as potential targets for cancer treatment. S.R.P.'s laboratory is partially funded by funds from the Spanish National Research and Development Plan, Instituto de Salud Carlos III and FEDER [PI17/02303 to S.R.P]; R.T.R. is supported by a fellowship from the AECC scientific foundation; J.M.B. is supported by Spanish Ministry of Education, Culture and Sport [FPU15/01978]; J.B.'s laboratory is partially funded by FEDER funds, H2020 BRIDGES project and the Spanish Network on Rare Diseases (CIBERER) [FIS PI16/00440]; Faculty of Medicine at the Norwegian University of Science and Technology and the Central Norway Regional Health Authority supports [46056921 to A.S. and H.E.K.]; Svanhild and Arne Must's Fund for Medical Research (to A.S. and H.E.K.); Norwegian Research Council (to T.V.); SIN-TEF SEP project 102020885 (to T.V.); Vinnova (to A.C.K and P.S.); the Torsten and Ragnar Soderberg Foundation (to T.H.) and the Helleday Foundation (to C.B.). Funding for open access charge and project support: European Union's Horizon 2020 research and innovation programunder the Marie Sklodowska-Curie grant agreement [722729 to A.P., B.M.F.H., T.H.]; European Research Council [ERC TAROX-695376 to T.H.]; Swedish Research Council (to T.H. and P.S.); Swedish Cancer Society (to T.H. and P.S.); Swedish Children's Cancer Foundation (to T.H.); Swedish Pain Relief Foundation (to T.H.). Sí

Genomic uracil is a DNA lesion but also an essential key intermediate in adaptive immunity. In B cells, activation-induced cytidine deaminase deaminates cytosine to uracil (U:G mispairs) in Ig genes to initiate antibody maturation. Uracil-DNA glycosylases (UDGs) such as uracil N-glycosylase (UNG), single strand-selective monofunctional uracil-DNA glycosylase 1 (SMUG1), and thymine-DNA glycosylase remove uracil from DNA. Gene-targeted mouse models are extensively used to investigate the role of these enzymes in DNA repair and Ig diversification. However, possible species differences in uracil processing in humans and mice are yet not established. To address this, we analyzed UDG activities and quantities in human and mouse cell lines and in splenic B cells from Ung(+/+) and Ung(-/-) backcrossed mice. Interestingly, human cells displayed ∼15-fold higher total uracil excision capacity due to higher levels of UNG. In contrast, SMUG1 activity was ∼8-fold higher in mouse cells, constituting ∼50% of the total U:G excision activity compared with less than 1% in human cells. In activated B cells, both UNG and SMUG1 activities were at levels comparable with those measured for mouse cell lines. Moreover, SMUG1 activity per cell was not down-regulated after activation. We therefore suggest that SMUG1 may work as a weak backup activity for UNG2 during class switch recombination in Ung(-/-) mice. Our results reveal significant species differences in genomic uracil processing. These findings should be taken into account when mouse models are used in studies of uracil DNA repair and adaptive immunity.

DNA er et tilsynelatende stabilt molekyl, som overføres så å si uten endringer fra unnfangelse til alderdom og fra generasjon til generasjon. Men arvestoffet vårt er ikke så uforanderlig som det kan se ut som. DNA kan endres kjemisk ved å reagere med en rekke stoffer som er påført utenfra eller som normalt finnes inne i enhver celle. DNA består av repeterende enheter av nukleotider, som igjen består av fosfat-, sukker- og basegrupper. Fosfat og sukkergruppene danner en ryggrad, mens basene parer med andre baser på en motstående DNA-tråd. Fokus for denne avhandlingen er baseskadene uracil og 5-fluorouracil. Uracil dannes ved at den normale basen cytosin reagerer med vann. Dette resulterer i et uracil:guanin base-par. Eventuelt kan både uracil og 5-fluorouracil inkorporeres i stedet for den normale basen thymin under DNA-replikasjon. Dette resulterer i uracil paret med adenin, mens 5-fluorouracil kan pare med adenin eller guanin. For å unngå at skader på DNA resulterer i mutasjoner finnes det flere mekanismer i cellen som erstatter og reparerer skadd DNA. En av de viktigste reparasjonsmekanismene er base eksisjonsreparasjon (BER). BER initieres ved at en DNA-glykosylase kutter en skadd eller unormal base fra DNA. Hos mennesker er det identifisert fire forskjellige glykosylaser som alle kan initiere reparasjon av uracil og 5-fluorouracil: UNG, SMUG1, TDG og MBD4. En APendonuklease kutter så sukker-fosfat ryggraden ved å kutte ved siden av den nå base-løse sukkergruppen, og et nytt nukleotid settes inn av en DNA polymerase. Restene av sukkergruppen kan så fjernes direkte av DNA-polymerasen, før ryggraden på DNA-tråden bindes sammen av en DNA ligase. I sum blir dermed en skadd base erstattet med en normal (ennukleotid BER). I enkelte tilfeller klarer imidlertid ikke polymerasen å fjerne det som er igjen av sukkergruppen, dette skjer gjerne når sukkergruppen har blitt redusert eller oksidert. Da vil polymerasen sette inn flere nukleotider, slik at den skadde sukkergruppen fortrenges. Dette skaper en spesiell struktur som gjenkjennes av en flap endonuklease, som kutter ut den fortrengte biten, før en DNA ligase knytter DNA-tråden sammen igjen. Dermed fører reparasjon av en skadd base til at flere nukleotider erstattes (fler-nukleotid BER). Inntil nylig har ikke fler-nukleotid BER vært observert i cellenes mitokondrier, som har sitt eget DNA å ta vare på. Hvordan ville i så fall mitokondriene håndtere skader som i cellekjernen repareres av fler-nukleotid BER? Dette har vi undersøkt i det første arbeidet, hvor vi fant at også mitokondriene kunne utføre fler-nukleotid BER. Uttrykket av glykosylasen UNG varierer mellom forskjellige mennesker, organer og cellelinjer. I det andre arbeidet viser vi at hastigheten til BER sporet som helhet kontrolleres på det første trinnet, det vil si av mengde og aktivitet av DNA-glykosylasen som initierer reparasjonen. UNG initerte all observerbar reparasjon av uracil paret med adenin, mens reapasjon av uracil paret med guanin ble initiert hovedsakelig av UNG, med et relativt stort bidrag fra TDG i en av cellelinjene. I det tredje arbeidet har vi studert hvordan 5-fluorouracil repareres i DNA og hvilken betydning DNA-reparasjon har å si for virkningsmekanismen for 5-fluoruracil. Vi fant at BER, initiert av UNG2, står for det aller meste av reparasjonen når 5-fluorouracil er paret med adenin. Når 5-fluorouracil er paret med guanin utfører BER, initert av UNG2, SMUG1 eller TDG det meste av reparasjonen, mens mismatch-reparasjon ser ut til å være av mindre betydning. Nedregulering av de nevnte glykosylasene og hemming av BER-sporet påvirket imidlertid ikke kreftcellelinjers følsomhet for 5-fluorouracil. Dermed later det til at i dette tilfellet spiller ikke inkorporering i DNA og påfølgende DNA-reparasjon noen stor rolle for celledød. I stedet ser det ut som om 5-fluorouracil heller dreper celler via inkorporering i RNA, samt ved at dannelsen av thymidin-nukleotider hemmes.

Recent RNA virus outbreaks such as Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) and Ebola virus (EBOV) have caused worldwide health emergencies highlighting the urgent need for new antiviral strategies. Targeting host cell pathways supporting viral replication is an attractive approach for development of antiviral compounds, especially with new, unexplored viruses where knowledge of virus biology is limited. Here, we present a strategy to identify host-targeted small molecule inhibitors using an image-based phenotypic antiviral screening assay followed by extensive target identification efforts revealing altered cellular pathways upon antiviral compound treatment. The newly discovered antiviral compounds showed broad-range antiviral activity against pathogenic RNA viruses such as SARS-CoV-2, EBOV and Crimean-Congo hemorrhagic fever virus (CCHFV). Target identification of the antiviral compounds by thermal protein profiling revealed major effects on proteostasis pathways and disturbance in interactions between cellular HSP70 complex and viral proteins, illustrating the supportive role of HSP70 on many RNA viruses across virus families. Collectively, this strategy identifies new small molecule inhibitors with broad antiviral activity against pathogenic RNA viruses, but also uncovers novel virus biology urgently needed for design of new antiviral therapies.

På tross av lovende fremskritt innen immunterapi, som anses som en ny pilar i kreftbehandling, responderer kun en liten andel pasienter som ønsket på spesifikke behandlinger. Utviklingen av forenklede metoder for studie av komplekse og spesifikke cellulære responser på bestemte behandlinger, vil kunne fungere veiledende i pasientutvalg og muliggjøre økt fremdrift innen forskning på immunterapi. Makrofager har en viktig rolle i kreft-relatert inflammasjon, og en økt andel tumor-assosierte makrofager (TAMs) i tumorer korrelerer ofte med en redusert total prognose. I hovedsak er det funnet at TAMs uttrykker en M2-liknende fenotype, som fremmer tumorprogresjon og undertrykker en effektiv adaptiv immunrespons. Flere strategier for manipulering av makrofager har blitt foreslått som potensielle immunterapeutiske behandlinger mot kreft. I dette studiet ble det utviklet en forenklet makrofag polariseringsmodell for å undersøke kjennetegn ved makrofager stimulert mot en M1- eller M2-liknende fenotype. Monocytter av THP-1 cellelinjen ble behandlet med phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for å indusere differensieringen til makrofager. THP-1 makrofagene ble deretter enten eksponert for LPS og IFN-γ for å utvikle M1-liknende makrofager, eller IL-4 og IL-13 for å utvikle M2-liknende makrofager. Evaluering av THP-1 makrofagenes resulterende fenotype ble utført etter ulike eksponeringstider. Flowcytometri og ELISA ble brukt for å undersøke antatte M1 og M2 spesifikke markører på celleoverflaten og utskillelsen av karakteristiske cytokiner. Både flowcytometri- og ELISA-målingene indikerte en vellykket polarisering av THP-1 makrofager mot en M1-liknende fenotype. De M1 polariserte THP-1 makrofagene ble karakterisert ved en signifikant økning i antall celler med overflatemarkørene MHCII og CD80, og en signifikant økning i utskillelsen av TNF-α og CXCL10. I motsetning førte M2 polariseringen verken til den forventede uttrykkelsen av CD163 og CD206, eller til den antatte utskillelsen av IL-10 og IL-1Ra. Dataene indikerer et potensiale ved THP-1 monocytter til å utvikle en M1-liknende fenotype, mens aktiveringen og karakteriseringen av en M2-liknende fenotype i THP-1 makrofager krever videre undersøkelse. Med den oppnådde aktiveringen og karakteriseringen av M1 polariserte THP-1 makrofager, ble den forenklede makrofagmodellen brukt til å undersøke viktigheten av spesifikke aktiveringsspor for M1 polarisering. Effekten av å eksponere THP-1 celler for TH5487, BMS-345541 eller Rapamycin under M1 polarisering ble undersøkt ved å detektere følgende utskillelse av TNF-α. Både TH5487 og BMS-345541 er kjent for å hindre inflammatorisk genuttrykkelse ved å forstyrre NF-κB, mens Rapamycin er en anerkjent inhibitor av mTOR sporet. Verken TH5487 eller BMS-345541 endret utskillelsen av TNF-α. Resultatene antyder derfor at utskillelsen av TNF-α fra THP-1 makrofager under disse eksperimentelle betingelsene er uavhengig av NF-κB sporet. Likedan førte ikke tilstedeværelsen av Rapamycin under LPS- og IFN-γ-stimulering av THP-1 makrofagene til en endring i utskillelsen av TNF-α. Dermed viste forsøkene ingen tydelig kontroll over M1 polariseringen ved å inhibere mTOR sporet. Effekten av TH5487, BMS-345541 og Rapamycin, aktiveringssporene disse angriper, og den resulterende M1 polariseringsprofilen bør undersøkes nærmere ved å studere et utvalg av cytokiner, både på mRNA- og proteinnivå. Despite the promising advancements of immunotherapy, notifying a new pillar of cancer treatment, a limited portion of patients respond successfully to specific treatments. The development of simplified assays to investigate complex and specific cellular responses to particular treatments would aid in patient selection and advance the research on cancer immunotherapy. Macrophages play a prominent role in cancer-related inflammation, and the prevalence of tumor-associated macrophages (TAMs) within tumors often correlates with a reduced overall prognosis. Importantly, most TAMs have been found to resemble an M2-like phenotype, promoting tumor progression and suppression of an effective adaptive immune response. Several strategies of macrophage manipulation have been suggested as potential anti-cancer immunotherapeutic treatments. In this thesis, a simplified macrophage polarization model was developed to investigate the characteristics of macrophages stimulated towards either an M1- or M2-like phenotype. Monocytes of the THP-1 cell line were exposed to phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to induce differentiation into macrophages, followed by incubation with LPS and IFN-γ to develop M1-like macrophages or IL-4 and IL-13 to develop M2-like macrophages. Evaluation of the resulting THP-1 macrophage phenotypes was performed after various exposure times by flow cytometry and ELISA to investigate putative M1 and M2 specific cell surface markers and secreted cytokines, respectively. Flow cytometry and ELISA measurements indicated a successful polarization of THP-1 macrophages towards an M1-like phenotype. The M1 polarized THP-1 macrophages were characterized by a significantly increased amount of cells expressing the surface markers MHCII and CD80, and a significantly increased secretion of TNF-α and CXCL10. In contrast, exposure to M2 polarizing stimuli did not induce the hypothesized surface expression of CD163 and CD206 or the secretion of IL-10 and IL-1Ra. Therefore, the data suggest a potential of THP-1 macrophages to develop into an M1 macrophage phenotype, whereas the activation and characterization of an M2 phenotype in THP-1 macrophages require further investigations. With the achieved activation and characterization of M1 polarized THP-1 macrophages, the simplified macrophage model was utilized to investigate the impact of specific pathways on M1 macrophage polarization. The effect of exposing the THP-1 cells to TH5487, BMS-345541, or Rapamycin during M1 polarization was investigated by detecting the consequent secretion of TNF-α. Both TH5487 and BMS-345541 are known to prevent inflammatory gene expression by perturbing NF-κB, whereas Rapamycin is a recognized inhibitor of the mTOR pathway. Unexpectedly, neither TH5487 nor BMS-345541 altered the secretion of TNF-α. Hence, the results suggest an NF-κB-independent mechanism of TNF-α secretion in THP-1 macrophages under the investigated experimental conditions. Similarly, exposure to Rapamycin during LPS- and IFN-γ-stimulation of THP-1 macrophages did not alter the secretion of TNF-α, showing no apparent sign to control the M1 polarization. However, the effect of TH5487, BMS-345541, and Rapamycin on their target pathways and the resulting M1 polarization profile should be further investigated by studying an assortment of cytokines, both at the mRNA and protein levels.