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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas disease. Due to its genetic diversity, species have been divided into six groups denominated Discrete Typing Units (DTU I to VI). The G strain belongs to T. cruzi I group and CL to T. cruzi VI. Extracellular amastigotes forms (EA) are considered important in maintaining the vertebrate host cycle. Studies concerning the difference of infectiveness and the characterization of immunologic susceptibility in parasites belonging to different groups are relevant so that therapies based upon immunological response may be efficient for all distinct phylogenetic groups. T. cruzi´s P21 protein has recently been characterized and its probable action in parasites internalization process into host cell was observed. To give continuity to the functional characterization of T. cruzi´s P21 employing its recombinant form (P21-His6) is of great relevance taking into account that these could in the future take part into the potential therapeutic goals. The objectives of this study were to analyze the immunological profile by T. cruzi infection, seeking to identify the differentiated performance of this response against G and CL strains and different forms of the parasite (metacyclic trypomastigotes or extracellular amastigotes); to analyze the differential tropism of CL and G strains during the acute and chronic infection; characterize the biological activity of P21 T. cruzi protein, trying to analyze its function to the parasite and performance in the host cell. We observed that extracellular amastigotes from G strain does not induce patent infection in vivo due to their high susceptibility to IFN-γ production early in infection; There were differences in tropism between the different strains, since during the kinetics infection, the CL strain was maintained preferably in the stomach, both in the acute and chronic phase and G strain remained in the stomach throughout the entire infection, but was also able to migrate into the heart tissue, particularly in chronic infection; The chemokine KC seems to play an important role in controlling the infection and may influence the course of infection, as well as the possible migration of parasites; the P21-His6 enhances phagocytosis and the remodeling of the actin cytoskeleton by binding to CXCR4 receptor and activate via PI3-k. Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas. Devido à ampla diversidade genética e fenotípica existente em T. cruzi, a espécie foi dividida em seis discretas unidades de tipagem (DTU), denominadas T.cruzi I a VI. A cepa G pertence ao grupo T.cruzi I e a CL a T.cruzi VI. Formas amastigotas extracelulares (AE) são consideradas importantes na manutenção do ciclo no hospedeiro vertebrado. Estudos quanto à diferença de infectividade e caracterização da suscetibilidade imunológica de parasitas pertencentes aos diferentes grupos mostram-se relevantes para que terapias baseadas na resposta imunológica sejam eficientes para todos os grupos filogeneticamente distintos. A proteína P21 de T. cruzi foi recentemente caracterizada e sua possível atuação no processo de internalização do parasito na célula hospedeira foi observada. Dar continuidade à caracterização funcional da P21 de T. cruzi por meio do emprego de sua forma recombinante (P21-His6) é de grande relevância, pois esta poderá futuramente figurar entre os potenciais alvos terapêuticos para o tratamento da doença de Chagas. Os objetivos desse trabalho foram analisar o perfil imunológico mediante a infecção por T. cruzi, buscando identificar a atuação diferenciada dessa resposta frente a duas cepas (G e CL) e formas distintas do parasito (tripomastigotas metacíclios ou amastigotas extracelulares); analisar o tropismo diferencial das cepas G e CL de T. cruzi durante a infecção aguda e crônica em camundongos; caracterizar a atividade biológica da proteína P21 de T. cruzi, buscando analisar sua função para o parasito e atuação na célula hospedeira. No presente trabalho mostra-se que amastigotas extracelulares da cepa G não induzem infecção patente in vivo devido a sua alta susceptibilidade à produção de IFN-γ no início da infecção. Houve diferença no tropismo entre as distintas cepas, durante a cinética de infecção, sendo que a cepa CL manteve-se preferencialmente no estômago, tanto na fase aguda quanto crônica, e a cepa G manteve-se no estômago no decorrer de toda a infecção, mas também foi capaz de migrar para o tecido cardíaco, principalmente no processo de cronificação. A quimiocina KC parece exercer um importante papel no controle da infecção, podendo interferir no curso da mesma, assim como na possível migração dos parasitos; a P21- His6 aumenta a fagocitose e a remodelação do citoesqueleto de actina, ao se ligar no receptor CXCR4 e ativar a via de PI3-k. Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

RESUMO : O aumento na formação de produtos finais de glicação avançada (AGEs) têm sido apontado como via responsável pelo comprometimento da função imunológica levando ao aumento da suscetibilidade à infecções em indivíduos diabéticos. Estes mecanismos podem envolver ativação do sistema NADPH oxidase, redução da capacidade fagocítica, interação entre os AGE formados e macromoléculas importantes para a função imune ou com receptores específicos para AGE (RAGEs) com aumento na produção de citocinas inflamatórias. O uso terapêutico das folhas de diversas espécies do gênero Passiflora é comum na medicina popular em diversos países, inclusive no Brasil. Porém, as informações científicas a respeito do uso de extratos de folhas de Passiflora edulis no tratamento do diabetes e de suas complicações, ainda não estão totalmente esclarecidas. Sendo assim, este trabalho tem como objetivo avaliar os efeitos destes extratos sobre a capacidade fagocítica e a produção de espécies reativas de oxigênio em macrófagos de ratos diabéticos. Ratos machos Wistar (300 ± 25g) foram tratados com aloxano (120mg/kg de peso corporal dissolvido em salina 0,9%, via intraperitoneal). O extrato etanólico foi obtido por maceração em solução hidroalcólica 70%(V/V), seguida de evaporação sob pressão reduzida e liofilização. Este foi diluídos em água e administrado por gavagem (200mg do extrato etanólico seco/kg de peso do animal), durante 8 semanas após a indução do diabetes. Os animais foram anestesiados e o sangue colhido por punção cardíaca para obtenção de soro e determinação da glicemia por método enzimático colorimétrico e dos níveis de AGEs por fluorescência. Aconcentração de frutosaminas foi determinada no soro por método colorimétrico. A ativação celular foi avaliada através da produção de ERO bem como da capacidade fagocítica de macrófagos peritoniais ativados com C albicans (ATCC69548) opsonizada. A produção de ERO foi determinada por quimioluminescência amplificada com luminol. Os ensaios para avaliação da capacidade fagocítica e microbicida foram realizados através da incubação dos fagócitos frente à Candida albicans (ATCC 69548) em diferentes intervalos de tempo. Foram consideradas como tendo atividade fagocítica as células que apresentaram uma ou mais C. albicans internalizadas. A atividade microbicida foi determinada através da avaliação da viabilidade das leveduras fagocitadas The high production of advanced glycation end-products (AGEs) have been identified as reponsible for the impairment of immunological function, leading to an increase on susceptibility of infections on diabetic patients. This mechanisms can involve the NADPH oxidase activation, decrease of phagocytic capacity, interactions between the AGEs produced and important macromolecules to the immune function or with the receptor for advanced glycation end-products (RAGEs), increasing the production of inflammatory cytokines. The therapeutic use of leaves of several species of Passilfora is common in folk medicine in several countries, including Brazil. Nevertheless, some scientific information regarding the use of leaf extracts of Passiflora edulis in the treatment of diabetes and its complications, remains still unclear. Thus, the objective of this present work is to evaluate the effects of this extract on phagocytic capacity on macrophages in diabetic rats. Wistar male rats (300 ± 25g) were treated with alloxan (120 mg/kg body weight dissolved in saline 0,9% intraperitoneal). The ethanolic extract was obtained by maceration in wateralcohol solution 70% (v/v) followed by evaporation under reduced pressure and lyophilization. After this process, the extract was diluted in water and administered by gavage (200 mg of dry ethanolic extract/kg body weight), during 8 weeks after the diabetes induction. The rats were anesthetized and blood sample was collected by cardiac puncture to obtain the sérum for the determination of glucose by enzimatic colorimetric method and determination of AGEs levels by fluorescence. The concentration of fructosamine was determined by colorimetric method in serum. The cell activation was determined through the production of ROS and phagocytic capacity of peritoneal macrophages, activated with opsonized Candida albicans (ATCC69548). The production of ROS was determined by chemiluminescence activated with luminol. The evaluation of phagocytic capacity was performed through the incubation of the phagocytes with Candida albicans internalized. The microbicide activity was determined by evaluating the viability of phagocyted yeast Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

A ação de espécies reativas de oxigênio e/ou de nitrogênio (ERO/ERN), produzidas por neutrófilos através do complexo NADPH oxidase (Nox2) e óxido nítrico sintase (iNOS), estão diretamente associadas à capacidade microbicida de fagócitos. Entretanto, se a produção destes oxidantes escapa ao controle da homeostase bioquímica, ocorrem danos oxidativos aos tecidos circunvizinhos do foco inflamatório, quando, então, há necessidade de intervenção farmacológica. Neste trabalho foi testado o efeito dos nitróxidos piperídinicos 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidina-1-oxil (Tempo) e 4-((9 acridinecarbonil)amino)-2,2,6,6-tetrametil-1-piperidina-1-oxil (Ac-Tempo) sobre a atividade de Nox2 de neutrófilos inflamatórios e suas consequências sobre a capacidade fungicida dos fagócitos. Neutrófilos isolados de cavidade peritoneal de camundongos foram incubados (37°C, 10 min) com Tempo (50-400 μM) ou Ac-Tempo (25-200 μM) e estimulados com Candida albicans (ATCC 10231) opsonizadas (107 C. albicans/105 neutrófilos). A atividade de Nox2 foi determinada polarograficamente, pelo consumo de oxigênio mensurado através de eletrodo de Clark, ou espectrofotometricamente, medindo-se a redução de citocromo c (550nm). A atividade de Nox2 (119,311,6 nmol de O2-•.min-1) foi diminuída pelo tratamento com ambos os nitróxidos, de forma dose-dependente, embora Ac-Tempo tenha sido mais eficaz (ED50 31 M) que Tempo (ED50 160 M). Paralelamente, foi verificada a fluorescência (λexc361, λemi440) emitida pelo grupo acridina após reação de espécies radicalares com Ac-Tempo, corroborando a hipótese de que nitróxidos depletam radicais produzidos por neutrófilos estimulados com C. albicans. O nitróxido Tempo não mostrou nenhuma ação direta sobre culturas de C. albicans, conforme análises de antifugigramas padrões. Entretanto, testes de capacidade microbicida de neutrófilos mostraram que o tratamento prévio das células com Tempo (300 µM) causou decréscimo de 80% na efetividade fungicida sobre C. albicans. Testes in vivo mostraram que Tempo administrado em dose oral única (26,52 mg/kg) foi capaz de diminuir o edema de pata originado em resposta à inoculação do fungo (107 C. albicans) cujo ponto máximo de efeito foi 18 horas após a administração do nitróxido, bem como determinou significativa diminuição de nitração de proteínas em tecido muscular das patas dos animais, conforme resultados de ensaios com anticorpos anti-nitrotirosina. Em conjunto, os resultados corroboram a premissa de que a atividade de Nox2 é essencial para a resposta do hospedeiro a C. albicans e que a administração de nitróxidos para modular a produção de oxidantes nos focos infecciosos pode diminuir a resposta do sistema imune à infecção fúngica. Production of oxidants species by neutrophils through NADPH oxidase complex (Nox2) is directly associated with the microbicidal activity of phagocytes. In this work we tested the effect of the nitroxides 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-piperidine-1-oxil (Tempo) and 4-((9 acridinecarbonil)amino)-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidine-1-oxil (Ac-Tempo) on the activity of inflammatory neutrophil Nox2 complex and the consequences on the fungicidal phagocytes capability. Neutrophils were incubated with Tempo (50-400 mM) or Ac-Tempo (25-200 mM) and stimulated with Candida albicans. Nox2 activity was determined polarographically by oxygen consumption measured by Clark electrode. Oxidase activity decreased by treatment with both nitroxides in a dose-dependent manner. However, Ac-Tempo was more effective (ED5044M) that Tempo (ED50160M). In parallel, the fluorescence intensity elicited by acridine after reaction with free radicals was determined. Neutrophils stimulation elicited significant fluorescent response in direct correlation with Ac-Tempo doses (R2=0.997), supporting the hypothesis that nitroxide is consumed by free radicals neutrophils-released. Fungicidal neutrophils activity assay explicited that pretreatment of cells with Tempo caused 80% decrease in the effectiveness on C. albicans death. Oral administration of a Tempo single dose was able to reduce paw edema elicited in response to inoculation of the fungus. Also, a significant decrease in protein nitration in paw tissues was found in this condition. Together, the results support the premise that Nox2 activity is essential for the host response against C. albicans and that nitroxides cause a decrease on the oxidant immune response to fungal infection.

Diversos estudos têm evidenciado que as doenças inflamatórias estão fortemente ligadas à condição de estresse oxidativo. Dentre elas, uma das mais estudadas é a aterosclerose. A aterosclerose é uma doença de grande importância mundial, devido à alta mortalidade resultante de condições clínicas decorrentes da doença. Estudos demonstram que a modificação da LDL é um fator importante no desenvolvimento desta doença. Por isso, a determinação da LDLox plasmática é essencial, não apenas para investigar sua relevância para as doenças cardiovasculares, mas, também, como um auxiliar no diagnóstico destas doenças. A oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDLox) induz à formação de epítopos imunogênicos na molécula. Contudo, o papel desses anticorpos na fisiopatologia da aterosclerose e o seu significado clínico permanecem indefinidos. O objetivo deste estudo foi produzir anticorpos anti-LDLox para uso em diagnóstico laboratorial de risco cardiovascular e também avaliar a associação entre a LDLox e o complexo formado entre o LDLox e o anticorpos anti-LDL na resposta inflamatória de macrófagos pela ativação da NADPH oxidase associada a proteína dissulfeto isomerase (PDI). A ativação da NADPH oxidase de macrófagos requer o acoplamento das subunidades citosólicas aos componentes de grânulos e translocação do complexo à membrana do fagossoma. A PDI é uma chaperona envolvida no tráfego protéico celular, sendo encontrada na superfície de diversas células procarióticas e eucarióticas. Trabalhos prévios sugeriram que PDI pode ser um dos componentes responsáveis pela montagem de Nox2, facilitando o enovelamento correto das subunidades do complexo e/ou auxiliando o trânsito das subunidades até à membrana do fagossoma. Neste trabalho testou-se a atividade de Nox2 de macrófagos inflamatórios correlacionada à atividade redutase de PDI de membrana. Macrófagos dormentes apresentaram baixa atividade de PDI e não foi detectado consumo de oxigênio associado ao sistema Nox2. Sob estímulo de LDLox e do complexo LDLox/ anti-LDLox, os fagócitos consumiram quantidade significativa de oxigênio e apresentaram atividade de PDI, maior que as células dormentes. Testes com inibidores padrões de PDI (bacitracina e ácido ditionitrobenzóico- DTNB) confirmaram que a inibição de PDI determina decréscimo da atividade de Nox2, resultados obtidos através de ensaios espectrofotométricos (redução de citocromo c, 550 nm). Em conjunto, os resultados apontam que, simultaneamente à atividade de Nox2 em macrófagos estimulados, ocorre atividade redutase de PDI, confirmando que essa chaperona está diretamente associada à ativação e/ou manutenção da atividade da oxidase fagocitária. Inflammatory disorders are strongly associated with the condition of oxidative stress, and atherosclerosis is one of the most studied condition. Atherosclerosis is a disease of great world-wide importance due to the high mortality of decurrently clinical conditions of the illness. Studies have demonstrated that the modification of the LDL is an important factor in the development of the illness. Therefore, the determination of the plasma LDL-ox is essential not only to investigate its relevance for the atherosclerotic diseases, but also to contribute in the diagnosis of these illnesses. The oxidation of low-density lipoprotein (oxLDL) induces the formation of immunogenic epitopes in molecules. However, the role of these antibodies in the pathophysiology of atherosclerosis and their clinical significance remain undefined. Objective this study was produce antibodies anti-LDLox in the diagnosis of atherosclerotic diseases and evaluate the association between LDLox and complex LDLox/anti-LDLox in activation the regulatory activity of PDI interconnected to Nox2 in inflammatory macrophages. Protein disulfide isomerase is an ubiquitously expressed enzyme that catalyses the rearrangement of disulfide bonds in target proteins. Previous studies suggest that PDI, which is a chaperone involved in protein trafficking and translocates to the cell surface, may regulate the phagocytic NADPH oxidase complex (Nox2). LDLox and complex LDLox/ anti-LDLox-triggered superoxide anion release was correlated with the PDI reductase activity detected in macrophages, as determined by oxygen consumption and cleavage of a fluorescent probe, respectively. Assays with the known PDI inhibitors bacitracin and dithionitrobenzoic acid were performed to confirm their ability to decrease the macrophages respiratory burst. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES