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A indução de poliploidia é uma ferramenta muito empregada em programas de melhoramento de plantas, mas geralmente resulta em baixa eficiência e elevada taxa de indivíduos mixoploides ou aneuploides. Poliploides artificiais podem ser obtidos pela utilização de antimitóticos, que interferem na formação do fuso durante a divisão celular. Dentre eles, a colchicina é o mais empregado em estudos de poliploidia. No entanto, os mecanismos responsáveis por sua ação sobre as células ainda não foram totalmente elucidados. Solanum melongena L. (berinjela) apresenta tecidos com elevado potencial de regeneração in vitro, característica interessante para o desenvolvimento de estudos básicos e biotecnológicos. O presente trabalho teve como objetivo utilizar a berinjela como modelo para o estudo do processo de duplicação cromossômica em plantas. Foram empregadas técnicas de citogenética, citometria de fluxo e indução de poliploidia in vitro. O capítulo I destinou-se à caracterização citogenética da cultivar Embu de berinjela, que foi empregada em todos os experimentos. Esta cultivar apresentou 24 cromossomos, com tamanho variando entre 1,77 e 2,63 μm. O caritóripo mostrou-se simétrico e foram observadas duas constrições secundárias. Através do bandeamento com fluorocromos CMA3 e DAPI, foram observadas quatro bandas CMA positivas. A técnica de FISH permitiu a visualização de um par de sinais para a sonda DNAr 5S e dois pares para a sonda DNAr 45S. O capítulo II teve como objetivo avaliar os efeitos da colchicina (0,2% e 0,02%) sobre o ciclo celular de berinjela e a eficiência destas concentrações no processo de indução de poliploidia. De forma pioneira, a hidroxiureia foi utilizada como sincronizador do ciclo celular, com o intuito de aumentar a eficiência da poliploidização. A avaliação do ciclo celular foi conduzida em meristemas radiculares com e sem a sincronização e as análises foram realizadas por microscopia e citometria de fluxo. A indução de poliploides in vitro, por sua vez, foi realizada em sementes e segmentos nodais sincronizados e não sincronizados. Não foram observadas diferenças significativas em relação ao índice mitótico. Maiores percentuais de cmetáfases, metáfases duplicadas e núcleos poliploidizados (2xG2) foram observados em resposta à maior concentração de colchicina (0,2%). Os protocolos de indução de poliploidia testados mostraram-se eficientes, sendo regeneradas plantas poliploides após todos os tratamentos. Dos 480 explantes tratados com colchicina, 342 foram regenerados com sucesso, sendo 45 tetraploides e 90 mixoploides. Polyploidy induction is an important tool in plant breeding, but usually results in low efficiency and high rates of mixoploid and aneuploid plants. Synthetic polyploids can be obtained by the exposure to antimitotic agents, which interfere with the spindle formation during cell division. Colchicine is the most widely used antimitotic in polyploidy induction studies. However, the underlying mechanisms of its action on cells are not completely clear. Solanum melongena L. (eggplant) has a great in vitro regeneration capacity, an interesting feature to the development of basic and biotechnological studies. This work aimed to use eggplant as a model to study the process of chromosome doubling in plants. Cytogenetic techniques, flow cytometry and in vitro polyploidy induction were performed. Chapter I focused on the cytogenetic characterization of the cultivar Embu of eggplant, which was used in all experiments. This cultivar presented 24 chromosomes with length ranging from 1.77 to 2.63 μm. The karyotype was symmetrical and two secondary constrictions were observed. The CMA3/DAPI banding showed four CMA positive bands. The FISH technique allowed the observation of one pair of sites of 5S rDNA and two pairs of 45S. The objective of chapter II was to evaluate the effects of colchicine (0.2% and 0.02%) on the eggplant cell cycle and the efficiency of these concentrations in the polyploidy induction. Innovatively, hydroxyurea was used as a cell cycle synchronizer, in an attempt to increase the efficiency of polyploidization. The cell cycle evaluation was conducted in root meristems with and without cell synchronization and the analysis were performed by light microscopy and flow cytometry. In vitro induction of polyploidy was performed on synchronized and non-synchronized seeds and nodal segments. No significant differences were detected in the mitotic index. Higher frequencies of c-metaphases, polyploid metaphases and polyploid nuclei (2xG2) were observed after the exposure to the higher treatment with colchicine (0.2%). The polyploidy induction protocols tested were efficient, with the regeneration of polyploid plants after all colchicine treatments. Of the 480 treated explants, 342 were successfully regenerated, being 45 tetraploids and 90 mixoploids.

O teste de Allium cepa L. tem sido rotineiramente empregado para a avaliação de ecotoxicologia e prospecção de efeitos biológicos. A estratégia mais comum associada ao teste é a análise de parâmetros citogenéticos, tais como índice mitótico e percentual de alterações cromossômicas. O uso da citometria de fluxo para a análise de citogenotoxidade e mutagênese em A. cepa ainda é um aspecto pouco explorado. Diante disto, o presente trabalho teve como objetivo estabelecer parâmetros de citometria de fluxo para a análise de citogenotoxidade em A. cepa, utilizando como agente mutagênico o cloreto de sódio. Bulbos de A. cepa foram expostos em água destilada por um período mínimo de 24 horas e em seguida submetidos às concentrações de cloreto de sódio (0; 31,25; 62,5; 125; 250 e 500mM) por 2, 4, 8, 12 e 24 horas. O cloreto de sódio foi utilizado por ser conhecido na literatura como indutor de morte celular em plantas. Os parâmetros considerados na citometria de fluxo foram: intensidade de fluorescência, FSC (tamanho nuclear) e SSC (complexidade nuclear). Já na análise citogenética, os parâmetros avaliados foram índice mitótico (IM) e alterações cromossômicas. Foi realizado ensaio cometa nos tratamentos expostos por 24 horas para a averiguação de fragmentação do DNA. Células controle foram caracterizadas quanto ao tamanho nuclear, por meio de técnicas citogenéticas e pela citometria de fluxo. Houve redução no IM com o aumento da concentração e tempo de exposição aos tratamentos. Da mesma forma, os resultados de citometria de fluxo indicaram uma diminuição gradual significativa no percentual de células em G1, S e S + G2. Nos tratamentos com índice mitótico próximo ou igual a zero foram observadas características de morte celular, como condensação do núcleo (diminuição do FSC e intensidade de fluorescência) e fragmentação do material genético (aumento de sub-G1 e coeficiente de variação); esta fragmentação também foi observada no ensaio cometa. Os resultados da análise de complexidade interna (SSC) foram inversamente proporcionais aos dados de tamanho nuclear (FSC), indicando que a condensação da cromatina ocorre de maneira irregular. Diante dos resultados, pode-se identificar que estes parâmetros de citometria de fluxo podem ser utilizados com segurança na avaliação de morte celular em A. cepa, considerando as características de condensação do núcleo e fragmentação do DNA. Curiosamente, em todas as análises a concentração 62,5mM de NaCl se destacou por apresentar um elevado percentual de c-metáfases e algumas metáfases poliploidizadas. Esta mesma concentração foi testada quanto à capacidade de induzir c-metáfases em células de alface e tomate e os resultados sugerem o cloreto de sódio como potencial agente antimitótico. Allium cepa L. assay has been routinely used for the evaluation of ecotoxicology and prospecting of biological effects. The most common strategy associated with this test is the analysis of cytogenetic parameters such as mitotic index and percentage of chromosomal abnormalities. The use of flow cytometry for cytogenotoxicity and mutagenesis analysis in A. cepa is still an unexplored aspect. The present work aims to establish parameters from flow cytometry for cytogenotoxicity analysis in the Allium cepa test using with mutagen, sodium chloride. A. cepa bulbs were exposed in distilled water for a minimum of 24 hours and then exposed to the concentrations of sodium chloride (0, 31.25, 62.5, 125, 250, and 500mM) for 2, 4, 8, 12 and 24 hours. The sodium chloride was used because it is known in the literature as an inducer of cell death in plants. The parameters considered in flow cytometry were: fluorescence intensity, FSC (nuclear diameter) and SSC (nuclear complexity). In the cytogenetic analysis, the parameters evaluated were: mitotic index (MI) and chromosomal alterations. Comet assay was carried out in treatments exposed for 24 hours to the investigation of DNA fragmentation. Control cells were characterized by nuclear size, either by cytogenetic as by flow cytometry. A decrease in the percentage of dividing cells was observed in a dose-time dependent. Likewise, the results of flow cytometry showed significant decrease in the percentage of cells in G1, S and S + G2. In the treatments with mitotic index equal or close to zero features of cell death were observed as nuclei condensation (decrease of the FSC and fluorescence intensity) and fragmentation of genetic material (increased sub-G1 and coefficient of variation); this fragmentation was also viewed by comet assay. The results of analysis of internal complexity (SSC) were inversely proportional to the FSC data indicating that chromatin condensation occurs irregularly in the nuclear membrane. From the results, you can identify those parameters that flow cytometry can be used safely in assessing cell death in A. cepa, considering the characteristics of the nucleus condensation and DNA fragmentation. Interestingly, in all analyzes the NaCl concentration 62,5mM stood out with a high percentage of c-metaphase and some polyploid metaphase. This same concentration was tested for ability to induce c-metaphases lettuce and tomato cells and the results suggest the potential sodium chloride as antimitotic agent.

Schinus molle L. é uma planta pertencente à família Anacardiaceae utilizada para fins medicinais, paisagístico e na silvicultura. Seus metabólitos, no contexto ambiental, podem interagir com outras plantas e organismos presentes no ecossistema por meio do efeito conhecido como alelopatia. Essa interação pode ser avaliada por vários parâmetros, fisiológicos, bioquímicos e citogenéticos em bioensaios vegetais. Nesse contexto, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito alelopático de diferentes órgãos de S. molle L., bem como o efeito de diferentes modos de manejo (presença e ausencia de poda) sobre a ação alelopática da espécie em bioensaios com Alface (Lactuca sativa L.). O primeiro trabalho consistiu em avaliar o comportamento do bioteste exposto aos extratos aquosos e etanólicos de diferentes órgãos vegetais que foram coletados de uma população na cidade de Alfenas- MG. A segunda parte do trabalho teve por objetivo avaliar diferentes modos de manejo sobre a ação alelopatica da espécie, para isso foram coletadas folhas em duas populações distintas, uma com poda regular e outra sem poda. Para avaliar o efeito alelopático da espécie foram avaliados germinação (G), número de plântulas normais (NP), índice de velocidade de germinação (IVG), alongamento de raiz (AR), massa fresca (BF), massa seca (BS), índice mitótico (IM) e anormalidades cromossômicas (AC). O delineamento experimental utilizado foi em blocos inteiramente casualizados, com três repetições e cinco concentrações no primeiro experimento. No segundo experimento foram avaliadas somente quatro concentrações. A análise estatística consistiu de análise de variância - ANAVA (p< 0,05), ajustado modelo de regressão linear, quando possível; para os demais resultados foi feita comparação de médias pelo teste de Scott-Knott. Nos resultados obtidos no primeiro experimento tanto para extrato aquoso quanto para extrato etanólico foram observadas diferenças entre os órgãos vegetais testados, sendo as menores interferências obtidas quando a Alface foi exposta a extratos de fruto maduro e as maiores interferências quando expostos a extratos de frutos verdes. Em todos os casos foi observado que o aumento da concentração reduz o valor do parâmetro avaliado, sendo evidente o efeito concentração dependente. No segundo experimento também foi observado efeito concentração dependente nos parâmetros testados com exceção da biomassa fresca exposta ao extrato etanólico, independente da população. Extrato aquoso e etanólico apresentaram comportamento diferente nos diferentes parâmetros testados, com exceção de IM, BF e AC, que a resposta do bioteste não dependeu do tipo de extrato. Todas as variáveis evidenciaram o efeito alelopático da espécie. Schinus molle L. is a plant belonging to the family Anacardiaceae that presents many popular uses, among which the medical, landscape and timber purposes. Their metabolites, at an environmental context, can interact with plants and other organisms in the ecosystem through the effect known as allelopathy. This interaction can be assessed by several parameters, mainly the germination of neighboring plants. In this context, the aim of this study was to evaluate the allelopathic effect of different organs of S. molle L., as well as the behavior of this effect in populations under different environmental and management pressures, in bioassays with lettuce (Lactuca sativa L.). The first work consisted in to evaluate the behavior of lseeds of letucce exposed to water and ethanol extracts of different plant structures that were collected from a population of Alfenas. The second part of the work was to evaluate the interference effect of pruning on allelopathy. For it, leaves were collected in two distinct populations, one with pruning and one without regular pruning. To evaluate the allelopathic effect of S. molle, germination, number of normal seedlings, germination velocity index, root elongation, fresh weight, dry weight, mitotic index and chromosomal abnormalities were evaluated. The experimental design was a completely randomized block design with three replications and five concentrations in the first experiment. In the second experiment were evaluated only four concentrations. Statistical analysis consisted of analysis of variance - ANOVA (p

Submitted by Maykon Nascimento (maykon.albani@hotmail.com) on 2015-07-13T20:57:26Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Prospeccção de toxicidade de fungicidas por análises macroscópicas, microscópicas e moleculares em Allium cepa.pdf: 1168740 bytes, checksum: c286fcdd595f8bb76c47200ba99602b9 (MD5) Approved for entry into archive by Patricia Barros (patricia.barros@ufes.br) on 2015-08-12T16:13:50Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Prospeccção de toxicidade de fungicidas por análises macroscópicas, microscópicas e moleculares em Allium cepa.pdf: 1168740 bytes, checksum: c286fcdd595f8bb76c47200ba99602b9 (MD5) Made available in DSpace on 2015-08-12T16:15:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Prospeccção de toxicidade de fungicidas por análises macroscópicas, microscópicas e moleculares em Allium cepa.pdf: 1168740 bytes, checksum: c286fcdd595f8bb76c47200ba99602b9 (MD5) Previous issue date: 2014 Capes Apesar dos benefícios econômicos dos agrotóxicos para a agricultura, os efeitos negativos à saúde humana e ao meio ambiente são questionados. Dentre os agroquímicos que são usados na agricultura, destacam-se os fungicidas, que são utilizados em grande quantidade nas lavouras para controle de doenças. Com intuito de verificar os danos ocasionados por esses compostos, diversos métodos de avaliação têm sido utilizados na análise de toxicidade e mutagenicidade dos agrotóxicos. As análises macroscópicas (germinação e crescimento radicular) e microscópicas (índice mitótico, aberrações cromossômicas e nucleares) são importantes na determinação da toxicidade de compostos lançados ao meio ambiente, porque permite averiguar danos na germinação, no desenvolvimento da plântula e no ciclo celular. No entanto, para melhor compreensão dos mecanismos moleculares da mutação e de seus efeitos sobre a população exposta à contaminação ambiental, os marcadores moleculares oferecem perspectivas, por medir o efeito direto da exposição sobre o DNA. O objetivo do trabalho foi avaliar o potencial tóxico dos fungicidas por análises macroscópicas, microscópicas e moleculares em Allium cepa. Os resultados indicam redução nos parâmetros de germinação, crescimento radicular e índice mitótico nas maiores concentrações para os princípios ativos difenoconazol, tebuconazol, procimidona e iprodiona, quando comparados ao controle negativo, mostrando que os princípios apresentaram efeito genotóxico, citotóxico, fitotóxico para as raízes de Allium cepa pela alta frequência de aberrações cromossômicas, nucleares e redução do índice mitótico. Os resultados moleculares indicaram mudança no perfil de amplificação dos primers SSR (Sequência Simples Repetitiva) e o ISSR (Inter Sequência Simples Repetitiva), após a exposição do Allium cepa aos princípios ativos, incluindo alterações na perda, ganho e mudança na intensidade de banda. A perda e o ganho de bandas aconteceram à medida que aumentou a concentração dos princípios ativos. O método de agrupamento e as distâncias e dissimilaridades mostraram relação de dose-dependência, pois conseguiu separar as maiores concentrações do controle negativo para os princípios ativos no ISSR e SSR, com exceção dos princípios procimidona e iprodiona no SSR. Esses dados indicam que possui relação entre as análises utilizadas, sendo indicadores confiáveis para detectar alterações por substâncias químicas. Os marcadores moleculares ISSR e SSR são ferramentas eficientes em avaliar alterações ocasionadas no DNA por fungicidas podendo ser utilizada em estudos de toxicidade. Despite the economic benefits of agrotoxics to agriculture, the negative effects to human health and to the environment are questioned. Among the agrochemicals that are used in agriculture, the fungicides, which are used in elevated quantity in the fields to control diseases, are detached. Aiming to verify the damage caused by these compounds, several evaluation methods have been used on agrotoxics toxicity and mutagenicity analyses. The macroscopic (germination and radicular growing) and microscopic analyses (mitotic index, chromosome and nuclear aberrations) are important on toxicity determination of the compounds which are threw into the environment, because it allows to investigate damage on germination, on plantlets development and on nuclear cycle. However, for better understanding of the molecular mechanisms of mutation and of their effects upon the population exposed to environment contamination, the molecular markers offer perspectives, for measuring the direct effect of exposition upon DNA. The objective of the work was to evaluate fungicides toxic potential by macroscopic, microscopic and molecular analyses in Allium cepa. The results indicate reduction on germination parameters, radicular growing and mitotic index on higher concentrations for the active principles difeconazole, tebuconazole, procimidone and iprodione, when compared to negative control, showing that the principles presented genotoxic, cytotoxic, fitotoxic effects for Allium cepa roots by the high frequency of chromosome, nuclear aberrations and mitotic index reduction. The molecular results indicated change on the profile of the SSR (Single Simple Repeat) and the ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) primers amplification after Allium cepa exposition to the active principles, including alteration in loss, gain and band intensity change. The loss and gain of bands happened as the active principles concentration raised. The cluster method and the dissimilarity distances showed relation of dose dependence, because it separated the higher concentrations of negative control for the active principles on ISSR and SSR, with exception of the principles procimidone and iprodione on SSR. These data indicate relation among the used analyses, and are reliable indicators to detect alterations by chemical substances. The molecular markers ISSR and SSR are efficient tools on evaluating alterations caused on DNA by fungicides and may be used in toxicity studies.

Made available in DSpace on 2016-12-23T14:37:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stefanie Cristina Oliveira.pdf: 1100238 bytes, checksum: e4200efbe53a66bdaa4fc82fbfac51ed (MD5) Previous issue date: 2012-07-27 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O uso de bioenergia tem sido apontado como uma estratégia para diminuição da utilização de combustíveis fósseis. Fundamentado nesse fato, muitos países, incluindo o Brasil, aumentaram os esforços para financiar pesquisas com espécies vegetais produtoras de biocombustíveis. Dentre essas espécies, Jatropha curcas L. destaca-se pelo alto potencial para produção de óleo. Visando à propagação clonal e massal de acessos elite de J. curcas, técnicas de cultura de tecidos têm sido aplicadas. Entretanto, diferentes autores frisaram a necessidade de ampliação de estudos envolvendo ferramentas da cultura de tecidos vegetais, dentre elas a poliploidização in vitro. A indução de poliploides in vitro é uma importante ferramenta no melhoramento genético de plantas, por possibilitar a obtenção de maior variabilidade de materiais com possíveis incrementos de características agronômicas desejáveis. Nesse sentindo, um dos objetivos deste trabalho foi estabelecer um protocolo de indução in vitro de plântulas poliploides da variedade / Gonçalo/ (2C = 0.85 pg, 2n = 2x = 22 cromossomos). Os resultados de citometria de fluxo evidenciaram que tetraploides e mixoploides foram obtidos a partir de ápices caulinares tratados com diferentes concentrações de colchicina e tempos de exposição. Fundamentado em três parâmetros (número de plântulas sobreviventes, tetraploides e mixoploides), o tratamento envolvendo 0,5 mM de colchicina a um pulso de 96 horas foi considerado o mais adequado. Com base nesse resultado, um segundo experimento de poliploidização foi realizado somente com a dosagem de 0,5 mM com pulsos de 96, 120, 144 e 168 horas. Os resultados confirmaram que a concentração de 0,5 mM por 96 horas é ideal para indução de tetraploides de J. curcas / Gonçalo/ . Plântulas mixoploides também foram encontradas nos tratamentos com0,5 mM de colchicina aos pulsos de 96, 120 e 144 horas. Visto a relevância da propagação clonal e massal de acessos elite de J. curcas, inclusive das plântulas poliploides obtidas no primeiro estudo, o presente trabalho também teve como objetivo induzir a calogênese in vitro a partir de explantes foliares. Os resultados mostraram que a combinação ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)/cinetina (KN) promoveu maior número de explantes com calos friáveis quando comparado à combinação ácido indol-3-butírico (AIB)/KN. Dessa forma, o procedimento envolvendo a combinação auxina/citocinina é fundamental para gerar calos friáveis, os quais representam a base para estabelecimento de um sistema embriogênico in vitro de acessos elite. Pela primeira vez, um sistema de cultura de tecidos foi adaptado para indução, propagação e recuperação de tetraploides e mixoploides de J. curcas / Gonçalo/ . Além disso, os dados gerados contribuem para criação e ampliação de bancos de germoplasma in vitro da espécie The use of bioenergy has been suggested as a strategy for reducing the utilization of fossil fuels. Thereafter, many countries, including Brazil, have increased efforts to fund the research of plant species for biofuel production. Among these species, Jatropha curcas L. stands out mainly due to its high potential for oil production. Thus, tissue culture techniques have been applied aiming at the mass and clonal propagation of J. curcas elite lines. However, different authors have emphasized the necessity of expanding studies that involve plant tissue culture tools such as in vitro polyploidization. In this sense, the present study sought to establish a protocol for in vitro induction of polyploid seedlings from shoot tips of the variety Gonzalo (2C = 0.85 pg, 2n = 2x = 22 chromosomes). Flow cytometry revealed mixoploids and tetraploids obtained from shoot tips treated with different colchicine concentrations and exposure times. Based on three criteria (survival rate of the explants, and numbers of tetraploid and mixoploid plantlets), the treatment with 0.5 mM colchicine in a 96 hour pulse was statistically considered the most appropriate. Based on these data, a second polyploidization experiment was carried out, using a dosage of 0.5 mM colchicine in pulses of 96, 120, 144 and 168 hours. The results confirmed that the concentration of 0.5 mM for 96 hours was the ideal treatment for J. curcas Gonçalo tetraploid induction. Mixoploid seedlings were also detected in the treatments with 0.5 mM colchicine in pulses of 96, 120 and 144 hours. Considering the relevance of mass and clonal multiplication of elite J. curcas accessions, and the polyploid seedlings obtained in the first investigation, this study further aimed to establish in vitro callogenesis from leaf explants. The results showed that the combination of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and kinetin (Kn) provided greater number of explants with friable calli in relation to the combination indol-3-butyric acid (IBA) and Kn. Thus, 2,4-D/Kn was the treatment of choice to generate friable calli, which are essential for somatic embryogenesis. Ultimately, a tissue culture system was adapted for induction, propagation and recovery of in vitro tetraploids from the J. curcas variety Gonçalo, as well as other inbred lines. Besides providing a new protocol for polyploidy generation, this study also contributed to the germplasm of J. curcas and the achievement of genetic variability through obtainment of tetraploid and mixoploid seedlings