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Agradecimentos: The author(s) disclosed receipt of the following financial support for the research, authorship, and/or publication of this article: This work was supported by FAEPEX/UNICAMP (Fundo de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Extens~ao), Auxilios Emergenciais COVID-19 (grant number 2418/20) Abstract: In this cross-sectional study, we investigate the presence of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Ribonucleic Acid (SARS-CoV-2 RNA) in the tears of hospitalized COVID-19 patients. After laboratory confirmation of SARS-CoV-2 infection by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis, tear samples from both eyes of each patient were collected using conjunctival swab for RT-PCR. Detailed demographic profile, systemic and ocular symptoms, comorbidities, clinical, ancillary, and ocular manifestations were evaluated. Of the 83 patients enrolled in the study, 7 (8.43%) had SARS-CoV-2 RNA detected in the tear samples. Neutrophils’ count, C-reactive protein, and D-dimer were higher in patients with SARS-CoV-2 detected in tears than in patients without virus in ocular surface samples. One patient with SARS-CoV-2 in tears showed mild ocular eyelid edema, hyperemia, and chemosis. No relevant ocular manifestations were detected in the other patients. Although the levels of viral RNA on ocular surface samples were low for most patients (5/7), with positivity only for gene N and CT higher than 30, two patients were positive for all viral targets tested (N, E, and RpRd), with viral load near 1 105 ePFU/mL, indicating that the ocular transmission of SARS-CoV-2 is a possibility that needs to be considered, especially in the hospital environment. Further studies need to be conducted to demonstrate whether infective viral particles could be isolated from tears Aberto

Agradecimentos: The authors are thankful to Dr. Iscia Lopes-Cendes for providing facilities in her laboratory. The authors are grateful to FAPESP (Grants 2009/16150-6 and 2017/04377-2), CNPq and CAPES for the funding of this research. INFABiC is co-funded by FAPESP (Grant 2014/50938-8) and CNPq (Grant 465699/2014-6) Abstract: Environmental and nutritional factors, including fatty acids (FA), are associated with prostatitis, benign prostate hyperplasia and prostate cancer. We hypothesized that different FA in normolipidic diets (7%) affect prostate physiology, increasing the susceptibility to prostate disorders. Thus, we fed male C57/BL6 mice with normolipidic diets based on linseed oil, soybean oil or lard (varying saturated and unsaturated FA contents and omega-3/omega-6 ratios) for 12 or 32 weeks after weaning and examined structural and functional parameters of the ventral prostate (VP) in the systemic metabolic context. Mongolian gerbils were included because they present a metabolic detour for low water consumption (i.e., oxidize FA to produce metabolic water). A linseed oil-based diet (LO, 67.4% PUFAs, omega-3/omega-6 = 3.70) resulted in a thermogenic profile, while a soybean oil-based diet (SO, 52.7% PUFAs, omega-3/omega-6 = 0.11) increased body growth and adiposity. Mice fed lard (PF, 13.1% PUFA, omega-3/omega-6 = 0.07) depicted a biphasic growth, resulting in decreased adiposity in adulthood. SO and PF resulted in hepatic steatosis and steatohepatitis, respectively. PF and SO increased prostate epithelial volume, and lard resulted in epithelial hyperplasia. Animals in the LO group had smaller prostates with predominant atrophic epithelia and inflammatory loci. Inflammatory cells were frequent in the VP of PF mice (predominantly stromal) and LO mice (predominantly luminal). RNAseq after 12 weeks revealed good predictors of a later-onset inflammation. The transcriptome unveiled ontologies related to ER stress after 32 weeks on PF diets. In conclusion, different FA qualities result in different metabolic phenotypes and differentially impact prostate size, epithelial volume, inflammation and gene expression FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES Aberto

Orientador: Andre Schwambach Vieira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Poucas regiões cerebrais recebem tanta atenção quanto o hipocampo, uma estrutura neural que está envolvida em funções como aprendizagem, formação e armazenamento de memórias. As principais sub-regiões do hipocampo são o giro denteado (GD) e as camadas de neurônios piramidais: CA1, CA2 e CA3. Além disso, esta estrutura pode ser afetada por uma pluralidade de distúrbios psiquiátricos e neurológicos, como depressão, esquizofrenia, Alzheimer e epilepsia. Atualmente o canabidiol (CBD), um dos principais canabinóides presentes na Cannabis sativa, tem sido uma alternativa terapêutica para uma pluralidade de distúrbios. O CBD interage com os receptores endocanabinóides e também modula vários sistemas de sinalização não endocanabinóides. O receptor endocanabinóide CB1 é o receptor acoplado à proteína G mais abundante no sistema nervoso, e é encontrado amplamente expresso em todas as sub-regiões hipocampais. Assim, o CBD já foi explorado como estratégia terapêutica mostrando efeitos anticonvulsivante, neuroprotetores e antiepilépticos sob diversas condições, tanto em humanos quanto em modelos animais. Investigações anteriores já revelaram diversos efeitos da administração do CBD, no entanto, não há dados sobre alterações no transcriptoma para os efeitos do CBD em sub-regiões hipocampais. No Capítulo I da presente dissertação exploramos a heterogeneidade da expressão gênica do hipocampo de ratos usando microdissecção a laser para isolar suas diferentes sub-regiões (CA1, CA2, CA3, DG) e assim traçar o perfil de transcritos de cada uma delas. No Capítulo II, utilizando RNA-Seq, exploramos as alterações transcriptômicas no CA1 ventral do hipocampo de camundongos adultos após a administração intraperitoneal (i. p.) de CBD. No Capítulo I encontramos uma segregação evidente do perfil transcriptômico de diferentes regiões do hipocampo, observando milhares de genes diferencialmente expressos, além da expressão de genes marcadores conhecidos, bem como novos, específicos para cada região. No Capítulo II encontramos uma evidente segregação do perfil transcriptômico de diferentes frequências de administração do CBD. A análise de enriquecimento dos genes após a administração do CBD durante 7 dias indica uma redução nos transcritos da cadeia de transporte de elétrons e biogênese ribossomal, enquanto transcritos relacionados à modificações de cromatina e organização de sinapse foram encontrados aumentados. Além disso, os transcritos após a administração do CBD administrado em apenas 1 dia estavam associados apenas a processos de ubiquitinação. O presente conjunto de dados contribui para a compreensão mais profunda dos efeitos CBD na expressão gênica e fornece evidências de uma extensa mudança nos genes do metabolismo energético e na redução marcada da maquinaria de tradução de proteínas nos neurônios do CA1 ventral Abstract: Few brain regions are given as much attention as the hippocampus, a neural structure that is involved in functions such as learning, training and storage of memories. The main subfields of the hippocampus are the dentate gyrus (DG) and the pyramidal neurons: CA1, CA2 and CA3. In addition, this structure can be affected by a plurality of psychiatric and neurological disorders such as depression, schizophrenia, Alzheimer and epilepsy. Currently cannabidiol (CBD), one of the main cannabinoids present in Cannabis sativa, has been a therapeutic alternative for a plurality of disorders. CBD interacts with the endocannabinoid receptors and also modulates multiple non-endocannabinoid signaling systems. The endocannabinoid CB1 receptor is the most abundant G protein coupled receptor of the nervous system, and is found extensively expressed in all hippocampal subfields. Thus, CBD has already been explored as a therapeutic strategy showing anticonvulsant, neuroprotective, and antiepileptic effects under various conditions, both in humans and animal models. Previous investigation has already provided insights of the CBD administration, however, there is no transcriptome data for CBD effects on hippocampal subfields. In Chapter I, we explore the heterogeneity of the rat’s hippocampal gene expression using laser microdissection to isolate its different subfields (CA1, CA2, CA3, DG). In Chapter II, we explore the transcriptomic changes in the ventral CA1 of the adult mice hippocampus after intraperitoneal CBD administration. In Chapter I, we find thousands of differentially expressed genes and an evident segregation of the hippocampal subfields transcriptional profiles. In Chapter II we found evident segregation of the transcriptomic profile from CBD administration frequencies. The enrichment analysis of the 7 days of CBD administration indicates a decrease of electron transport chain and ribosome biogenesis transcripts, while chromatin modifications and synapse organization transcripts were found increased. Furthermore, transcripts of CBD administered once were only associated with the ubiquitin processes. The present dataset contributes to a deeper understanding of the CBD effects on gene expression and provides evidence that CBD induces an extensive change in energy metabolism genes and marked reduction of protein translation machinery in ventral CA1 neurons Mestrado Fisiologia Mestre em Biologia Funcional e Molecular CAPES 88887.373126/2019-00

Orientadores: Marcus Alexandre Finzi Corat, Marcelo Lancellotti Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Os Norovírus, pertencentes à família Caliciviridae, são vírus não envelopados, com genoma constituído de RNA fita simples com polaridade positiva. São os principais agentes causadores de surtos de gastroenterite não bacteriana esporádica e epidêmica em seres humanos, com distribuição mundial. Afetam também outras espécies animais como: bovinos, suínos, ovinos, cães e roedores. Norovírus murino (MNV) tem sido descrito como um dos mais recentes agentes infecciosos a acometer animais de laboratório. Devido sua prevalência e seu potencial em interferir em resultados experimentais, a apresentação de informações a respeito deste patógeno e seu monitoramento tornam-se de importante contribuição na pesquisa científica. Atualmente, não há dados demonstrando esta prevalência em nosso país. Neste estudo, avaliamos a ocorrência da infecção por MNV em colônias de camundongos nas cinco regiões do Brasil, abrangendo 26 biotérios nacionais localizados em universidades, institutos e centros de pesquisa, públicos ou privados, incluindo dois biotérios internacionais localizados também na América Latina. Um índice de positividade de 29,96% (175/584) foi obtido pela detecção de MNV nas amostras de fezes de camundongos, analisadas pela reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR) para a região conservada e não conservada do gene do capsídeo viral (VP1) localizado na região ORF2. A análise da região conservada do gene do capsídeo viral demonstrou uma identidade de nucleotídeos entre 87 a 99%, enquanto a região variável apresentou uma identidade de 42% a 88%. Ainda na tentativa de realizar o isolamento deste vírus, células RAW 264.7 inoculadas com suspensão fecal de uma linhagem geneticamente modificada, apresentou efeito citopático, sugestivo de infecção por MNV e confirmado pelo RT-PCR. O isolamento viral nos permitiu estabelecer a técnica de imunofluorescência indireta para estimar a soroprevalênciade MNV nos biotérios de produção e experimentação das diferentes instituições da América Latina. Uma porcentagem de 26,54% (219/825) das amostras testadas apresentou anticorpos específicos anti-MNV. Nosso estudo foi o primeiro a relatar com abrangência a identificação de MNV em colônias de camundongos em biotérios brasileiros, evidenciando a relevância na implantação de um programa de monitoramento sanitário no nosso país e com isso, respaldar nossa pesquisa científica biomédica através de triagens deste patógeno no Brasil e comparativamente no mundo Abstract: Norovirus which belongs to Caliciviridae family, is a non-enveloped, positive-sense RNA virus. It is worldwide distributed and causes epidemic and sporadic nonbacterial gastroenteritis in humans. It also affects animal species as cattle, dogs, sheep, pigs and rodents. Murine norovirus (MNV) is the most recent infectious agent in laboratory mice. Because your worldwide prevalence, and its potential to interfere in experimental studies, bring out information about norovirus and its surveillance turns an important assignment in scientific research. Actually, there is no data demonstrating the prevalence of MNV in our country. In this study, we evaluated the occurrence of MNV infection in mouse colonies in five regions of Brazil, 26 national facilities located in universities, institutes, and research centers, public or private, including two facilities located in Uruguai. A positivity index of 29.96% (175/584) was obtained in mouse fecal samples by reverse transcriptase polymerase chain reaction for a conserved and non-conserved region of the viral capsid gene located in the ORF2 region. Analysis of the conserved region of the viral capsid gene demonstrated a nucleotide identity between 87 to 99%, while the variable region had an identity of 42% to 88%. In an attempt to isolate MNV, RAW 264.7 cells inoculated with fecal suspension of a genetically modified strain had a suggestive cytopathic effect of MNV infection and confirmed by RT-PCR. Viral isolation allowed us to establish the indirect immunofluorescence technique to estimate MNV seroprevalence in production and experimental facilities in Latin America intitutions. A percentage of 26.54% (219/825) of samples tested showed anti-MNV specific antibodies. Our study was the first to report comprehensively the identification of MNV in mouse colonies of Brazilian facilities, evidencing the relevance in implantation the health monitoring program in our country and with that, support our biomedical scientific research through screenings of this pathogen in Brazil and comparatively in the world Doutorado Clínica Médica Doutora em Ciências

Orientador: Denise Pontes Cavalcanti Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: As osteocondrodisplasias (OCD) são doenças genéticas que afetam o crescimento e o desenvolvimento do tecido condro-ósseo, comprometem a estatura, e muitas vezes as proporções corporais, e contribuem para a morbimortalidade infantil. Cerca de um terço das OCD são letais no período perinatal, destacando-se entre estas a displasia tanatofórica (DT) e a osteogênese imperfeita (OI) letal. Algumas OCD letais são extremamente raras e apresentam grande variabilidade clínico-radiológica e heterogeneidade etiológica. Dados epidemiológicos desse grupo de OCD além de limitados são muitos antigos. O objetivo desse trabalho foi avaliar descritivamente as características clínico-radiológicas e epidemiológicas de uma casuística local de OCD letais reunida ao longo de 26 anos e investigar por meio do estudo do exoma, as bases moleculares de dois fetos identificados entre os casos, cujo fenótipo idêntico ainda é inédito. As variáveis clínicas referentes a dados de nascimento, de pré-natal, familiares, além dos diagnósticos clínico-radiológico e molecular foram computados numa planilha e analisados descritivamente. Amostras de DNA dos dois fetos com o fenótipo inédito foram submetidas à análise do exoma a partir da abordagem do trio das duas famílias. No período 1990 - 2016, um total de 131 fetos com OCD letais foram incluídos no presente estudo. Entre os nascidos localmente, a alta prevalência [9,4 (IC=7,40-11,79) por 10.000 nascimentos] encontrada pode ser atribuída a um viés decorrente do hospital ser de referência. Em 80 casos (61,1%) foi levantada uma hipótese diagnóstica no pré-natal. No entanto, a identificação do tipo de OCD no pré-natal ainda é muito imprecisa. A alta taxa de consanguinidade parental (9,2%) é explicada em grande parte pela origem das famílias, maioria oriunda do Nordeste. Os grupos mais frequentes encontrados e os fenótipos letais mais comuns entre esses grupos foram: o grupo FGFR3 [43 (32,8%)] sendo a DT-I a mais comum [36 (83,7%)]; o grupo das OI [33 (25,2%)] com a OI-IIA a mais prevalente [22 (66,7%)]; e o grupo das colagenopatias do tipo 2 [17 (13%)], destacando-se aqui o fenótipo da acondrogênese tipo II (ACG-II) [10 (58,8%)]. Esses três grupos juntos representaram 71% de toda a casuística. Os 38 casos restantes (29%) estão distribuídos em outros nove grupos. Do total de 131 casos, 75 (57,3%) possuem investigação molecular com confirmação do diagnóstico radiológico em 63 casos (84%). A análise do exoma dos dois casos com o fenótipo inédito se mostrou inconclusiva. Em conclusão, a avaliação epidemiológica da presente série de casos mostra uma alta prevalência de OCD letais, porém relacionada a um viés por se tratar de um hospital de referência na região. As principais OCD encontradas são a DT-I (grupo FGFR3), a OI-IIA (grupo OI) e a ACG-II (grupo colagenopatias tipo 2). Apesar da maioria dos casos de OCD letais serem suspeitadas durante a gestação, o diagnóstico pré-natal específico é ainda muito impreciso. A alta taxa de consanguinidade encontrada na casuística parece ser decorrente da origem das famílias, a maioria oriunda do Nordeste brasileiro Abstract: The osteochondrodysplasias (OCD) are genetic diseases that affect the growth and development of the chondro-osseous tissue leading to short stature, and body disproportion in several individuals, and contribute to the infant morbimortality. Around one-third of these conditions are lethal in the perinatal period, being thanatophoric dysplasia (TD) and lethal osteogenesis imperfecta (OI) the most frequent lethal-OCD. Some OCD in this group are extremely rare, present great clinical-radiological variability and used to be etiologically heterogeneous. Epidemiological information regarding the lethal-OCD is limited and outdated. The aim of this study was to perform a descriptive clinical-epidemiological study based on a local series of cases collected over 26 years. In addition, this study aimed to investigate the molecular bases of two fetuses with a novel phenotype by the whole exome sequencing (WES). The clinical data related to birth, prenatal, family, and clinical-radiological and molecular diagnoses were computed in a spreadsheet and analyzed descriptively. DNA samples from the two fetuses with the novel phenotype were submitted to the exome analysis with the trio approach for both families. In the period 1990 - 2016, a total of 131 fetuses with lethal-OCD evaluated and included in the present study. Among the patients born locally, the high prevalence [9.4 (CI = 7.40-11.79) per 10,000 births] found can be attributed to the bias of reference hospital. Prenatal diagnosis of skeletal dysplasia was performed in 80 cases (61.1%), however, this examination is still very imprecise regarding to reach the specific type of OCD. The high parental consanguinity rate (9.2%) found in this series of cases is, at least partially explained, by the origin of the families from the Brazilian Northeast. The most common groups and lethal phenotypes found were: the FGFR3 group [43 (32.8%)] mainly represented by DT-I [36 (83.7%)]; the OI group [33 (25.2%)] with OI-IIA [22 (66.7%)] as the most common; and the collagenopathies type 2 group [17 (13%)], being the achondrogenesis type II (ACG-II) [10 (58.8%)] the most frequent condition. Together these three groups represent 71% of the total patients. The remaining 38 cases (29%) are distributed in nine other groups. Of the total of 131 cases, 75 (57.3%) had molecular investigation, confirming the radiological diagnosis in 63 cases (84%). The analysis of the exome of the two cases with the novel phenotype was inconclusive. In conclusion, the epidemiological evaluation of the present case series shows a high prevalence of lethal OCD, but related to a bias because it is a reference hospital in the region. The main OCD found are DT-I (FGFR3 group), OI-IIA (OI group) and ACG-II (type 2 collagenopathies group). Although most cases of lethal OCD are suspected during pregnancy, prenatal diagnosis is too imprecise to identify the specific type of the OCD. The high rate of consanguinity found in the sample seems to be due to the origins of the families, most coming from the Brazilian Northeast Doutorado Genética Médica Doutora em Ciências CAPES 01-P-3368/2017

Orientador: Íscia Teresinha Lopes Cendes Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Tecnologias de sequenciamento de alto rendimento e a demanda crescente por análise de conjuntos de dados genômicos em larga escala criaram desafios computacionais e de reprodutibilidade. Grandes volumes de dados exigem sistemas otimizados para execução em ambientes de alto desempenho e eficientes, ao mesmo tempo em que os projetos de pesquisa expandem e novos recursos computacionais são adquiridos. Nesse contexto os protocolos de processamento tornaram-se mais complexos conforme técnicas de sequenciamento foram desenvolvidas para outras áreas além da genômica, como transcriptômica e epigenômica. Esses protocolos são compostos de dezenas de tarefas que devem ser executadas em um fluxo de trabalho que pode ter ramificações e uso de técnicas de paralelismo dificultando a publicação de pesquisas completamente reprodutíveis, requisito cada vez mais presente na literatura. Durante a execução deste trabalho, protocolos de processamento reprodutíveis foram descritos em Workflow Description Language e executados utilizando o sistema gerenciador de protocolos Cromwell. O sistema RNNR foi desenvolvido para gerenciamento de recursos computacionais, distribuição e execução de tarefas de processamento em computadores em rede. Outras ferramentas como Espresso-Caller e MethSeq foram desenvolvidas para automatizar a execução de protocolos complexos. As ferramentas computacionais desenvolvidas, quando combinadas a outros sistemas e padrões desenvolvidos pela comunidade, criaram um ecossistema para análises reprodutíveis de dados de sequenciamento de larga escala e suportado em diferentes ambientes computacionais. RNNR diminuiu o tempo total de análises de grandes volumes de dados de sequenciamento. As ferramentas de automação simplificaram a execução de análises com centenas de amostras. O ecossistema foi utilizado para analisar milhares de amostras de sequenciamento e possibilitou a execução de estudos em genômica, transcriptômica e epigenômica Abstract: High-throughput sequencing technologies and the growing demand for large-scale analysis of genomic data sets have created computational and reproducibility challenges. Large volumes of data require systems optimized for execution in high performance and efficient environments, while research projects expand, and new computational resources are acquired. In this context, processing protocols have become more complex as sequencing techniques have been developed for areas other than genomics, such as transcriptomics and epigenomics. These protocols are composed of dozens of tasks that must be performed in a workflow that may have ramifications and use of parallel techniques, making it difficult to publish completely reproducible research, a requirement that is increasingly present in the literature. Throughout the execution of this work, reproducible pipelines were described in Workflow Description Language and executed using the Cromwell management system. The RNNR system was developed to manage computational resources and distribute and execute processing tasks across networked computers. Other tools such as Espresso-Caller and MethSeq were developed to automate the execution of complex workflows. The computational tools built, when combined with other systems and standards developed by the community, created an ecosystem for analyzing large-scale sequencing data in reproducible and supported in different computing environments. RNNR decreased the total analysis time of large volumes of sequencing data. Automation tools have simplified the execution of analyzes with hundreds of samples. The ecosystem was used to analyze thousands of sequencing samples and empowered studies in genomics, transcriptomics and epigenomics Doutorado Fisiopatologia Médica Doutor em Ciências FAPESP 2016/04204-8

Orientadores: Iscia Teresinha Lopes Cendes, André Schwambach Vieira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O uso de modelos animais para estudo de doenças humanas é importante para o entendimento dos mecanismos fisiopatológicos destas doenças. Particularmente, os modelos que reproduzem a Epilepsia do Lobo Temporal (ELT) em roedores, apresentam uma epileptogenicidade similar à encontrada em tecidos "epilépticos" humanos quando estudados ex vivo. A ELT afeta cerca de 40% dos pacientes adultos, e é caracterizada clinicamente por um desenvolvimento progressivo de crises epilépticas com foco no lobo temporal. Pacientes que apresentam ELT normalmente não respondem aos tratamentos. Destas, a Epilepsia do Lobo Temporal Mesial (ELTM) e a mais comum e se caracteriza pelo acometimento das estruturas mesiais do lobo temporal, como o caso da Esclerose Hipocampal. A proteômica dispõe de ferramentas poderosas que nos permitem elucidar mecanismos biológicos complexos, encontrar proteínas alteradas em todo o organismo e descrever padrões de expressões proteicas em diferentes condições fisiológicas e patológicas. Portanto, é relevante analisar esse padrão de expressão no hipocampo de modelos animais de ELTM usando técnicas de proteômica, a fim de gerar informações que nos auxiliem no entendimento dos mecanismos envolvidos na epileptogênese desses modelos. No presente estudo, as proteínas identificadas podem nos indicar novas vias envolvidas com a epileptogênese. Além disso, nossos dados demonstram que uma complexidade molecular adicional pode ser observada quando analisamos as diferentes sub-regiões do hipocampo separadamente. Portanto, acreditamos que a integração dos dados de proteômica com dados obtidos por outras "ômicas" podem gerar dados ainda mais informativos sobre esses processos neuronais Abstract: Studies about human diseases using animal models are really important to our understanding about the physiopathology mechanisms from those diseases. Particularly, the models that reproduce the Temporal Lobe Epilepsy (TLE) in rodents, presents epileptogenicity similar to that found in ex vivo human tissues. The TLE affects around 40% of the adult patients and it is clinic characterized by a progressive development of seizures with temporal lobe focus, caused by an unbalance between the excitatory and inhibitory neurotransmission. Patients who present that type of epilepsy normally don¿t respond well to the treatments. Of this type of epilepsy, the Mesial Temporal Lobe Epilepsy (MTLE) is the most common one and it is characterized by the commitment of the mesial temporal lobe structures, such as in the Hipocampal Sclerosis. To realize these studies the proteomics has many powerful tools that allow us to elucidate complex biological mechanisms, to find altered proteins in the whole organism and describe protein expression patterns in different physiological and pathological conditions. Therefore, it¿s relevant to study this protein expression pattern in the hippocampus of animal models of MTLE using proteomics techniques, searching for informative data that lead us to the understanding of the involved mechanisms in the epileptogenicity. In this study we identified proteins that can indicate new pathways involved in the epileptogenesis processes. Furthermore, our data demonstrate that additional molecular complexity could be observed as hippocampal subfields were analyzed separately. We believe that the further integration of the proteomic data with other "omics" approaches could generate even more informative data about those neuronal processes Mestrado Fisiopatologia Médica Mestra em Ciências

Orientador: Daniel Martins de Souza Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A esquizofrenia é um transtorno mental debilitante incurável que afeta mais de 21 milhões de indivíduos da população mundial e cerca de 1,6 milhões da população brasileira. Trata-se de uma doença multifatorial que envolve fatores exógenos e endógenos desde o neurodesenvolvimento. A principal maneira de tratar essa doença é através do uso de antipsicóticos que gera um custo em torno de 222 milhões de reais para tratar 81,5% dos pacientes com esquizofrenia no sistema público de saúde do estado de São Paulo. Entretanto, o tratamento para uma parcela considerável dos pacientes com esquizofrenia ainda é ineficaz, sobretudo devido a limitada compreensão dos efeitos dessas drogas em nível molecular e na ausência de biomarcadores preditivos de sua eficiência, ocasionando um grande impacto socioeconômico e na qualidade de vida dos pacientes e de seus familiares. A proteômica é, por definição, uma ferramenta adequada para estudos de doenças complexas, como a esquizofrenia, dada a sua capacidade de identificar, quantificar e caracterizar proteínas sob diferentes condições.Para endereçar essas questões, nosso primeiro objetivo foi entender quais são os mecanismos moleculares envolvidos na sinalização de resposta a antipsicóticos atípicos, através da análise do proteoma do plasma sanguíneo coletados in vivo de pacientes antes e após seis semanas de tratamento com os antipsicóticos olanzapina (n=11) e risperidona (n=15). A partir dessa análise foi possível observar vias de sinalização relacionadas a funções do sistema imune e inflamatório em pacientes que tiveram resposta positiva ao tratamento. Essas proteínas foram principalmente atribuídas a vias de resposta de fase aguda, sistema imune inato, degranulação de neutrófilos, sistema de coagulação, ativação de protrombina, sistema complemento e ativação de LXR/RXR. Além disso, proteínas de resposta de fase aguda, como a alfa 1 antiquimotripsina e o angiotensinogenio têm sido encontradas alteradas em pacientes com esquizofrenia e os antipsicóticos desse estudo parecem ter um papel na regulação dos níveis das mesmas. Esses achados reforçam a hipótese da modulação do sistema imune pelo tratamento com antipsicóticos atípicos. Devido a importância dos marcadores moleculares para a condução de um tratamento eficaz nos estágios iniciais da doença, a segunda proposta dessa tese foi analisar o plasma sanguíneo coletados in vivo de pacientes com esquizofrenia antes do tratamento para identificar possíveis assinaturas proteicas de resposta positiva aos antipsicóticos olanzapina e risperidona de acordo com a eficácia da medicação observada na clínica. Com o objetivo de reduzir o foco nas assinaturas de proteínas de predição de resposta ao tratamento, em vez de vias amplas, realizamos análise de agrupamento hierárquico usando todas as proteínas com abundância diferencial para os dois tipos de tratamento o que resultou em boa separação entre os grupos. Além disso, ao realizar a análise de componentes principais, encontramos um resultado semelhante. Os resultados obtidos nessa tese reforçam o conceito de que o componente imune pode ser modulado por antipsicóticos atípicos e podem servir como base para estudos da sinalização periférica modulada por antipsicóticos, que corroborem com a melhor compreensão de seus mecanismos biológicos. Além disso, esses achados podem também direcionar o desenvolvimento de um painel de potencial assinaturas proteicas associadas à resposta ao tratamento Abstract: Schizophrenia is an incurable, debilitating mental disorder that affects more than 21 million individuals in the world population and about 1.6 million of the Brazilian population. It is a multifactorial disorder involving exogenous and endogenous factors and begins at neurodevelopment. This disease is managed mainly through the use of antipsychotics, which, for the 81.5% of schizophrenia patients in São Paulo state under the public healthcare system, incur a cost of an estimated 222 million Brazilian reals. Furthermore, treatment for a considerable portion of patients with schizophrenia is still ineffective, especially due to a limited understanding of the mechanisms of action of these drugs and a lack of biomarkers to predict or indicate their efficacy. Schizophrenia causes a great socioeconomic impact for a country and an unquestionable impairment of the quality of life of patients and their relatives. Proteomics is, by definition, a suitable tool to study of complex diseases such as schizophrenia, given its ability to identify, quantify, and characterize proteins under different conditions. Addressing this issue, our first objective was to understand what molecular mechanisms are involved in the signaling response to atypical antipsychotics in the plasma of schizophrenic patients after treatment. This was carried out by analyzing the proteome of blood plasma collected in vivo from patients before and after six weeks of olanzapine (n=11) or risperidone (n=15) treatment. From this analysis, it was possible to observe signaling pathways related to immunoinflammatory functions in the patients who had a positive response to treatment compared to those who had a poor response. These proteins were mainly related to acute phase response pathways, innate immune system, neutrophil degranulation, coagulation system, prothrombin activation, complement system, and LXR / RXR activation. In addition, acute phase response proteins such as alpha 1 antiquimotrypsin and angiotensinogen have been found altered in patients with schizophrenia and the antipsychotics of this study appear to play a role in regulating their levels.These findings support the hypothesis of immune system modulation by treatment with atypical antipsychotics. Considering the importance of molecular markers to provide effective treatment during the early stages of the disease, the second proposal of this project was to analyze blood plasma collected from patients with schizophrenia prior to treatment to identify possible protein signatures of a positive outcome to olanzapine and risperidone, classified according to the efficacy of the medication observed in the clinic. In order to reduce the focus on protein signatures for the prediction of treatment response rather than broad pathways, we performed hierarchical cluster analysis using all proteins with differential abundance for both types of treatment resulting in good separation between the two groups. In addition, when performing principal component analysis, we found a similar result. This study reinforces the concept that the immune component can be modulated by atypical antipsychotics. and may serve as a basis for studies of antipsychotic modulated peripheral signaling, which increases understanding of their biological mechanisms. In addition, these findings may also direct the development of a panel of potential protein signatures associated with treatment response, eventually improving future treatment Doutorado Bioquímica Doutora em Biologia Funcional e Molecular CAPES 88882329744/2010-01 FAPESP

Orientadores: Jacobus Willibrordus Swart, Roberto Ricardo Panepucci Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação Resumo: Este projeto de doutorado visa a produção de uma nova versão de Matrizes de Microeletrodos (MEAs) de alto desempenho, produzidas de forma customizada e empregadas para estudos de redes neurais in vitro. Tais dispositivos são compostos por eletrodos de grafeno (crescido por Deposição em Fase Vapor sobre folha de cobre e transferido ao substrato), e isolação de dióxido de silício, sobre substrato de vidro, geradas sem a utilização de máscaras, através da técnica de escrita direta a laser. Como resultado, duas gerações de MEAs foram fabricadas e caracterizadas, exibindo especificações elétricas e biológicas apropriadas para sua aplicação. Verificou-se que a resposta referente às MEAs discutidas nesta tese apresentou significativas melhorias quando comparada com àquelas presentes em estudos encontrados na literatura, principalmente com relação à carga que nossos microeletrodos são capazes de armazenar e aplicar na cultura celular durante pulsos estimulatórios. O nível de ruído foi inferior à 10 µV em ambos os dispositivos, enquanto a Capacidade de Injeção de Carga, que é calculada a partir da curva de Voltametria Cíclica, foi muito superior tanto quando comparada com MEAs comerciais (0,054 mC/cm²) como com MEAs com microeletrodos padrões de nitreto de titânio (TiN) produzidas durante o projeto de mestrado (0,63 mC/cm²). Para os nossos dispositivos, os valores médios foram de 0,67 ± 0,009 mC/cm² e 19,7 ± 0,025 mC/cm². Adicionalmente, o segundo dispositivo produzido também é significativamente superior também quando confrontado com os dados divulgados na literatura, cujo melhor resultado foi 3,1 mC/cm². Com relação à Espectroscopia de impedância, a resposta verificada para as nossas MEAs de grafeno também foi superior. O valor médio da impedância para a frequência de 1 kHz foi de 28,65 ± 3,98 k'omega' e 73,95 ± 3,84 k'omega', para as versões 1 e 2, respectivamente, que são valores compatíveis com os apresentados por MEAs comerciais padrão da MultiChannel Systems (30-400 k'omega'), além de ser melhor que aquele obtido para MEAs produzidas durante o projeto de mestrado, cujo valor foi 141,60 ± 5,27 k'omega'. Por fim, o teste de biocompatibilidade mostrou que a MEA produzida é adequada para realizar medidas de potenciais celulares, não induzindo efeitos tóxicos sobre as células. Consequentemente, nós conseguiumos fabricar um novo modelo de MEA com microeletrodos transparentes, com grande CIC e baixos níveis de impedância e ruído de grafeno com resposta altamente superior àquela encontrada para as MEAs comerciais e divulgadas na literatura. Com isso, trata-se de um dispositivo adequado para atuar como interface bioeletrônica no estudo de redes neurais tanto para estimulação quanto para medição dos potenciais elétricos (espontâneos ou induzidos) das mesmas Abstract: This PhD project aims to produce a new version of high performance, custom made Microelectrode Arrays (MEAs), applied for in vitro neural network studies. Such devices are composed of graphene electrodes (grown by Chemical Vapor Deposition on copper foil and transferred to the substrate), and silicon dioxide passivation on glass substrate, generated without the use of masks, through laser direct writing technique. As a result, two generations of MEAs have been manufactured and characterized, exhibiting appropriate electrical and biological specifications for their application. It was found that the response of the MEAs discussed in this thesis improved when compared to those shown in studies in the literature, especially the charge that our microelectrodes are capable of storing and applying to cell culture during stimulatory pulses. Noise level was below 10 µV for both devices, while Charge Injection Capacity, which is calculated from the Cyclic Voltammetry curve, was much higher if compared to commercial MEAs (0.054 mC/cm²) and MEA with standard titanium nitride microelectrodes (TiN) produced during the master¿s project (0.63 mC/cm²). For our devices, the mean values were 0.67 ± 0.009 mC/cm² and 19.7 ± 0.025 mC/cm². Additionally, the second device produced is also significantly better also when compared to data published in the literature, whose best result was 3.1 mC/cm². Regarding impedance spectroscopy, the response verified for our graphene MEAs was also superior. The average impedance value at 1 kHz was 28,65 ± 3,98 k'omega' and 73,95 ± 3,84 k'omega' for the first and second versions, respectively, which are values compatible with those presented standard commercial MEA from MultiChannel Systems (30-400 k?), and are better than those obtained for MEAs produced during the master¿s project, whose value was 141.60 ± 5,27 k'omega'. Finally, biocompatibility test showed that our de-vice is adequate to measure cellular potentials, not inducing toxic effects on cells. Consequently, we were able to produce a new model of MEA with transparent microelectrodes, with high CIC and low impedance and graphene noise levels with highly superior response to that found for commercial MEAs published in the literature. Thus, it is a suitable device to act as a bioelectronic interface in the study of neural networks for both stimulation and measurement of their electrical potentials (spontaneous or induced) Doutorado Eletrônica, Microeletrônica e Optoeletrônica Doutora em Engenharia Elétrica CAPES 88882.329438/2019-01, 1555137

Orientador: André Schwambach Vieira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A Epilepsia do Lobo Temporal (ELT) constitui a forma mais comum de epilepsia focal em adultos. A ELT pode ser classificada como mesial, o subtipo mais frequente de acordo com à origem e à semiologia das crises. O achado histopatológico mais comum na ELT mesial (ELTM) é a esclerose hipocampal. A estimulação elétrica da via perfurante, por um período de 8 horas em ratos acordados causa uma lesão hipocampal semelhante à lesão observada em humanos com epilepsia do lobo temporal mesial, a atrofia hipocampal, sem levar ao Status Epilepticus (SE). No entanto, para que os animais sobrevivam a um período de estimulação de 8 horas, é necessário um pré-condicionamento por estimulação elétrica da via perfurante, consistindo de uma sessão diária de meia hora por dois dias. Porém, os mecanismos moleculares desencadeados por tal pré-condicionamento ainda são desconhecidos. Explorar tais mecanismos poderia possivelmente evidenciar fenômenos associados à epileptogênese que posteriormente se observa neste modelo após estimulação elétrica por 8 horas. Para a realização deste trabalho foi feito a cirurgia de implante de eletrodos em 10 ratos, onde 5 tiveram o estímulo elétrico do pré-condicionamento, e os outros 5 foram o grupo controle. As regiões do Giro Denteado dorsal (GDD), Giro Denteado ventral (GDV), CA3 dorsal (CA3D) e CA3 ventral (CA3v) do hipocampo foram microdissecadas, sendo extraído o RNA, e realizada a análise de transcriptoma por sequenciamento de alto desempenho (RNAseq). Um total de 1.894 genes foram encontrados diferencialmente expressos no GD dos animais do grupo estimulado quando comparado aos animais do grupo controle. Foram 1436 genes no GDD e 987 no GDV. Na região CA3 foram encontrados 1122 genes diferencialmente expressos, 744 na região dorsal (CA3D) e 662 genes na região ventral (CA3V). Nossos dados mostram diversos possíveis mecanismos responsáveis pela indução resistência a crises e ao Status Epilepticus (SE) após o pré-condicionamento, sendo eles, mecanismos inibitórios, como um aumento coordenado da inibição do giro denteado pela via GABAérgica nos neurônios do GD, diminuição do AMPc e de receptor dopaminérgico D1, baixa expressão de eferinas nas regiões GDD, GDV e CA3D e super expressão das semaforinas nas regiões dorsais (GD e CA3). Também foi observado um indício de aumento de atividade excitatória, semelhante à processos epileptogênicos, tanto no GD quanto em CA3. Desta forma o pré-condicionamento implicaria grande remodelamento do GD e CA3, sendo este diferente entre ambas as estruturas, e diferente também quando se compara a região dorsal com a ventral. Estas observações podem indicar possíveis futuras estratégias para a melhor compreensão do modelo experimental de ELTM por meio da estimulação elétrica da via perfurante, particularmente sobre os componentes da circuitaria hipocampal Abstract: Temporal Lobe epilepsy (TLE) is the most common focal epilepsy in adults, and Mesial Temporal Lobo Epilepsy (MTLE) the most frequent subtype. The histopathological most frequent finding in drug resistant MTLE is Mesial Temporal Sclerosis (MTE), with hippocampal sclerosis being the principal component. The electrical stimulation of the perforant pathway for a period of 8 hours in awake rats reproduces hippocampal lesion with a morphology that resembles the human condition without the induction of an episode of status epilepticus (SE). In order for animals to survive such a long period of stimulation in this model it is necessary two days of 30 minutes preconditioning sessions per day by electrical stimulation of the perforant pathway. However, the molecular mechanisms triggered by electrical stimulation of the perforant pathway for a period of 30 minutes on two consecutive days are still unknown. Exploring such mechanisms could possibly highlight phenomena associated with epileptogenesis that is later observed in this model after electrical stimulation for 8 hours. To carry out the project, electrode implantation surgery was performed on 10 rats, where 5 had the electrical preconditioning stimulation, and the other 5 were the control group. The Dorsal Dentate Gyrus (GDD), Ventral Dentate Gyrus (GDV), Dorsal CA3 (CA3D) and Ventral CA3 (CA3v) regions of the hippocampus were microdissected, and RNA was extracted, and transcriptome analysis using high-throughput sequencing (RNAseq) was performed. A total of 1,895 genes were found differentially expressed in the GD of animals from the stimulated group when compared to animals from the control group. There were 1436 genes in GDD and 987 genes in GDV. In the CA3 region 1122 differentially expressed genes were found, 744 in the dorsal region (CA3D) and 662 genes in the ventral region (CA3v). Our data show several possible mechanisms responsible for the induction of seizure resistance after preconditioning, such as inhibitory mechanisms indicated by a coordinated increase in GABAergic inhibition in DG neurons, decreased cAMP and D1 dopaminergic receptor, low expression of epherins in the GDD, GDV and CA3D regions and overexpression of semaphorins in the GDD and CA3D. There was also a sign of increased excitatory activity, similar to an epileptogenic processes, in both GD and CA3. Thus, preconditioning presents a major remodeling of GD and CA3, which is different between both structures, and also different when comparing the dorsal and ventral regions. These observations may indicate possible future strategies for a better understanding of the effects of electric stimulation of the perforant pathway on different hippocampal circuit components Mestrado Fisiologia Mestre em Biologia Funcional e Molecular CAPES 88882.329750/2019-01

Orientador: André Schwambach Vieira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A epilepsia do lobo temporal mesial (ELTM) é caracterizada por danos em estruturas como o hipocampo. O subiculum é uma região de transição entre hipocampo e córtex entorrinal, possuindo funções na amplificação e modulação de respostas neuronais. O presente estudo objetiva caracterizar o perfil de expressão gênica das porções dorsal e ventral do subiculum e também o perfil de expressão gênica destas regiões após a indução a crises epilépticas agudas pela estimulação elétrica da via perfurante. Foram utilizados 8 ratos controle e 8 ratos estimulados eletricamente (CEMIB-UNICAMP). Os animais foram submetidos a cirurgia de implante de eletrodos na via perfurante e após 7 dias o grupo estímulo recebeu estimulação elétrica na via perfurante durante 30 minutos por 2 dias consecutivos. Após 24 horas, os cérebros de 5 animais controle e 5 animais estimulados foram coletados, congelados e histologicamente processados, separando as regiões do subiculum dorsal (dSub) e ventral (vSub) por microdissecção a laser. O RNA das amostras microdissecadas foi isolado e a biblioteca de cDNA foi produzida utilizando o kit de preparação Truseq (Ilumina). O sequenciamento utilizou a plataforma Hiseq 4000, produzindo uma média de 17,9 milhões de reads por amostra. Os reads foram alinhados ao genoma do rato utilizando o alinhador STAR. Utilizando o software estatístico DESEq2 na comparação entre as amostras controles dSub com vSub, foram encontrados 4670 genes diferencialmente expressos e na comparação entre as amostras controle (cdSub e cvSub) com as amostras pré-condicionamento (pcdSub e pcvSub), encontrou-se um total de 204 genes diferencialmente expressos em pcdSub e 972 genes diferencialmente expressos na região de pcvSub.Dentre as vias enriquecidas utilizando os softwares DAVID e Enrichr, observou-se o enriquecimento da via glutamatérgica considerando os genes superexpressos e com expressão reduzida no dSub, enquanto que no vSub, observou-se o enriquecimento da via GABAérgica considerando os genes superexpressos e com expressão reduzida. Já na comparação dos controles com os aqueles que receberam estimulação elétrica, observou-se enriquecimento comum com genes superexpressos na via da biossíntese de colesterol. Enquanto que na região vSub, considerando genes com expressão reduzida, foi identificado o enriquecimento da via de orientação axonal. Ademais, em ambas regiões, observou-se o aumento na expressão dos genes GFAP, C3 e GAD2, e a redução na expressão dos genes GLS2, enquanto que considerando apenas a região vSub, observou-se a redução na expressão do gene GAT-1. Em conclusão, nossos dados sugerem que a região dorsal do subiculum apresenta participação relevante de genes associados à transmissão glutamatérgica, enquanto a região ventral do subiculum apresenta participação relevante de genes associados à transmissão GABAérgica. Ademais, em ambas regiões do subiculum o pré-condicionamento poderia induzir reorganização sináptica pró neuroproteção, devido ao aumento na biossíntese de colesterol associado a astrogliose. Este achado estaria relacionado ao aumento da transmissão GABAérgica, visto pelo aumento da formação de GABA (GAD2) e diminuição da recaptação de GABA na fenda sináptica (GAT-1), e redução da transmissão Glutamatérgica, devido diminuição da formação de glutamato (GLS2) e possível eliminação de sinapses glutamatérgicas (C3) Abstract: Mesial temporal lobe epilepsy (MTLE) is the most frequent type of Temporal Lobe Epilepsy (TLE) and it is characterized by damage in structures such as the hippocampus. The subiculum connects the hippocampus with the entorhinal cortex, which allows for high amplification and modulation of the neuronal response. This study aims to characterize the gene expression profile of dorsal and ventral subiculum and gene expression changes after the induction of acute seizures by electrical stimulation of the Perforant Pathway (PP) in rats. For this study, we used 8 sham-control and 8 electrical stimulated rats (CEMIB-UNICAMP). For all rats, stimulation electrodes were implanted in the PP and recording electrodes in the Dentate Gyrus, after 7 days rats from the stimulated group received an electric stimulation of the PP for 30 minutes in 2 consecutive days. After 24h, 5 SHAM and 5 Stimulated rat brains were collected, frozen, histologically processed and the dorsal (dSub) and ventral subiculum (vSub) were laser microdissected using a PALM (Zeiss system). After RNA¿s isolation from microdissected samples, the cDNA libraries were produced using Truseq (Illumina) library preparation kit according to manufacturer instructions. Sequencing was performed in an Hiseq 4000 platform, producing an average of 10 million paired-end 100bp reads per sample. Reads were aligned to the Rat genome using the STAR aligner. Using the DESEq2 statistics package in comparing the controls dSub with vSub, we found 4670 differential expression genes in control dSub and in comparing of SHAM to Stimulated samples, we found 204 differential expression genes in dSub and 972 differential expression genes in vSub. The gene ontology enrichment analysis was performed using DAVID and Enrichr, the most significant pathway with up-regulated and down-regulates genes in dSub was the increase of glutamatergic synapse, while in vSub the most significant pathway with up-regulated and down-regulates genes was the increase of GABAergic synapses. Moreover, comparing SHAM to Stimulated samples, the most significant common enrichment pathways with up-regulated genes in dSub and vSub were related to Cholesterol Biosynthesis, while the enrichment pathway using down-regulated genes in vSub was axon guidance. It was found GFAP, C3 and GAD2 up-regulated in dSub and vSub, down-regulation of GLS2 in dSub and vSub, and down-regulation of GAT-1 in vSub. In conclusion, our data indicates that in the analysis of control samples, the dSub has an increase of glutamatergic transmission, while vSub has an increase of gabaergic transmission. Moreover, in both regions of the subiculum, the preconditioning induces synaptic reorganization to neuroprotection, which was shown by an increase of cholesterol biosynthesis associated with astrogliosis. These findings would be associated with the increase of GABAergic transmission and reduction of glutamatergic transmission Mestrado Fisiologia Mestra em Biologia Funcional e Molecular CNPQ 157221/2018-0

Orientadores: Patricia Aline Boer, Andre Schwambach Vieira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Fatores adversos influenciam o desenvolvimento do embrião, feto ou neonato e, estão correlacionados com aumentando do risco de doenças cardiovasculares, diabete tipo 2, hipertensão arterial, predisposição a obesidade e a adiposidade abdominal, resistência periférica à insulina, prejuízos no desenvolvimento dos rins, doenças psiquiátricas e maior susceptibilidade ao estresse oxidativo e a processos inflamatórios na vida adulta. No modelo de restrição proteica gestacional tem sido demonstrado diminuição na concentração da enzima 11-?-HSD2, permitindo que os glicocorticoides maternos tenham acesso ao feto, ocasionando redução da proliferação celular e início precoce do processo de diferenciação de células, podendo promover modificações na morfologia e função destes tecidos através de mudanças da regulação da expressão gênica pelo fenômeno epigenético. Supomos que, pelo fato do envelhecimento ser um fator de risco para doenças cardiovasculares, a associação com fenômenos epigenéticos decorrentes de programação fetal, poderia aumentar sobremaneira estes riscos. A crescente população de pacientes idosos portadores de doenças crônicas e degenerativas tem elevado os custos com cuidados à saúde, o estudo da biologia do envelhecimento é prioritário para a compreensão dos mecanismos envolvidos no envelhecimento e nos fatores preventivos e ligados ao tratamento. Sendo assim, presente trabalho teve como objetivo avaliar a expressão gênica no coração da prole de ratos Wistar HanUnib machos submetidos a restrição proteica gestacional com 62 semanas de idade. Ratas Wistar prenhes foram divididas em dois grupos, de acordo com o conteúdo proteico da dieta oferecida durante a prenhez: 1. NP (normal-protein - 17%) ou, 2. LP (low-protein - 6%). A pressão sistólica da prole foi aferida semanalmente a partir da 32ª até 62ª semana de vida, a área de miócitos, a fração de colágeno e a expressão gênica e a concentração de proteínas especificas foram realizadas. Nossos resultados corroboram dados da literatura mostrando que a restrição proteica gestacional causa baixo peso ao nascer e catch-up growth associados ao desenvolvimento de hipertensão arterial, aumento no conteúdo de colágeno e da área dos cardiomiócitos nos animais do grupo LP. Entretanto, embora os animais apresentaram aumento no conteúdo de colágeno e hipertrofia dos cardiomiócitos, não observamos aumento na massa do coração, nem dos ventrículos isolados. À análise por sequenciamento, verificamos alterações na expressão de 137 genes, avaliamos gene a gene quanto a importância biológica e, verificamos alterações em vias metabólicas que causam a fibrose e hipertrofia acarretando em alterações na função cardíaca podendo levar a insuficiência. Como análise geral dos resultados do presente trabalho, os animais submetidos a restrição proteica gestacional, apresentaram diversas alterações em vias metabólicas; na pressão arterial; na atividade inflamatória e estresse oxidativo; nos processos de apoptose, autofagia e senescência pelo envelhecimento que poderiam de forma associada, causar hipertrofia celular e fibrose de órgãos e tecidos, incluindo do coração. Somados, podem acarretar alterações precoces na função cardíaca, causando insuficiente cardíaca e a morte. Portanto, supomos que os animais do grupo LP poderiam apresentar processo precoce de envelhecimento que culminaria com morte celular antecipada, o que pode ser verificado no presente estudo, pelo menos em parte, a partir da análise da sobrevida dos animais Abstract: Adverse stimulus influences the development of the embryo, fetus or neonate and are correlated with increased risk of cardiovascular disease, type 2 diabetes, hypertension, predisposition to obesity and abdominal adiposity, peripheral resistance to insulin, in kidney development, psychiatric diseases and increased susceptibility to oxidative stress and inflammatory processes. The model of gestational protein restriction has been shown that this causes a decrease in concentration of the enzyme ?-11-HSD2 allowing the maternal glucocorticoids have access to the fetus, causing reduction of cell proliferation associated with early process of differentiation of cells, which may promote morphological changes and function of these tissues through changes of regulation of gene expression by the epigenetic phenomenon. We assume that because of aging to be a risk factor for cardiovascular disease, the association with epigenetic phenomena resulting from fetal programming, could greatly increase these risks. The growing population of elderly patients suffering from chronic diseases and degenerative diseases have high health care costs, the study of the biology of aging is priority for the understanding of the mechanisms involved in aging and preventive factors and linked to the treatment of prevalent diseases. Therefore, this study aimed to assess the gene expression in the heart of the offspring of Wistar rats HanUnib males submitted to protein restriction in elderly animals of 62 gestational weeks of age. Pregnant Wistar rats were divided into two groups according to the protein content of the diet offered during pregnancy: 1. NP (standard-protein-17%), or 2. LP (low-protein-6%). The systolic pressure measured weekly offspring from the 32 ND until 62nd week of life; the glucose tolerance test with an intraperitoneal injection of a 25% glucose solution; the mass of the heart, the area of cardiomyocytes, the fraction of collagen and the gene expression and the concentration of specific proteins were made. Our results corroborate data from the literature showing that protein restriction dates cause low birth weight and catch-up growth associated with the development of arterial hypertension, increased collagen content and area of cardiomiócitos. However, although the animals had increase collagen content and hypertrophy of the cardiomyocytes, we did not observe increase in the mass of the heart, neither of the isolated ventricles. The sequencing analysis, we verified alterations in the expression of 137 genes, evaluated the gene for biological importance, and verified changes in pathways that cause the hypertrophy and fibrosis resulting in changes in heart function and may lead to heart failure. As a general analysis of the results of this study, the animals of offspring whose mothers were submitted to gestational protein restriction, presented several changes in metabolic pathways; in blood pressure; in inflammatory activity and oxidative stress; in the process of apoptosis, Autophagy and senescence by aging that could in no way associated with, cause cell hypertrophy and fibrosis of organs and tissues, including the heart. When added together, can lead to early changes in the cardiac function, causing insufficient, and death. Therefore, we assume that the animals from group LP could present early aging process that would culminate in early cell death, which can be verified in the present study, at least in part, from the analysis of the survival of the animals from group LP when compared to offspring NP Mestrado Fisiopatologia Médica Mestra em Ciências CNPQ 147547/2016-4

Orientadores: Daniel Martins de Souza, Juliana Silva Cassoli Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A esquizofrenia é um transtorno mental crônico que atinge em média 0,7% da população mundial, sendo seu desenvolvimento relacionado a soma de fatores genéticos e ambientais. Distúrbios cognitivos como atenção, memória e funções executivas são frequentemente observados em pacientes com a doença. Os antipsicóticos consistem na principal forma de tratamento, sendo amplamente utilizados na clínica. No presente projeto foram analisados o proteoma de uma linhagem celular de oligodendrócitos humanos (células MO3.13) tratados com quatro antipsicóticos, sendo dois de primeira-geração (clorpromazina e haloperidol) e dois de segunda-geração (quetiapina e risperidona). Primeiramente, foi estabelecido um protocolo para cultivo das células, publicado como um capítulo de livro. Por conseguinte, a análise dos tratamentos foi realizada através de nano-cromatografia líquida seguida de espectrometria de massas em tandem (nano LC-MS/MS). Posteriormente, as proteínas encontradas com p-value < 0,05 foram submetidas a análise no programa Ingenuity Pathway Analysis (IPA) para obtenção das vias metabólicas relacionadas a cada tratamento. Foram encontradas vias de sinalização em comum e específicas para cada antipsicótico. Os dados gerados nesta dissertação de mestrado auxiliarão na compreensão das vias bioquímicas envolvidas no mecanismo de ação desses medicamentos, que podem orientar o desenvolvimento de novos tratamentos Abstract: Schizophrenia is a chronic mental disorder that affects on average 0.7% of the world population, and its development is related to genetic and environmental factors. Cognitive disorders such as attention, memory and executive functions are often observed in patients with the disease. Antipsychotics consist of the main form of treatment and are widely used in the clinic. In the present project the proteome of a human oligodendrocyte cell line (MO3.13 cells) treated with four antipsychotics, two of the first generation (chlorpromazine and haloperidol) and two of the second generation (quetiapine and risperidone) were analyzed. The analysis of the treatments was performed by liquid nano-chromatography followed by tandem mass spectrometry (nano LC-MS / MS). Subsequently, the proteins found with p-value

Orientadores: Cláudia Herrera Tambeli, César Renato Sartori Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Enquanto o exercício físico agudo induz antinocicepção por aumentar a atividade do sistema opióide endógeno, exercício físico regular diminui a antinocicepção induzida pela morfina devido a tolerância cruzada entre opióides endógenos e exógenos... O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: While acute exercise induces antinociception through an increased activity of the endogenous opioid system, regular exercise decreases morphine-induced antinociception probably due to a cross-tolerance between endogenous and exogenous opioids... The abstract is available with the full electronic document Doutorado Fisiologia Doutor em Biologia Funcional e Molecular CAPES 23038.013648/2018-51

Orientadores: Íscia Teresinha Lopes Cendes, André Schwambach Vieira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A epilepsia do lobo temporal mesial (ELTM) é uma doença neurológica crônica caracterizada pelo desenvolvimento de crises epiléticas e por anormalidades histopatológicas nas estruturas mediais do lobo temporal, principalmente a esclerose hipocampal (EH). O perfil de expressão gênica de tecido específico fornece informações biológicas relevantes sobre mecanismos moleculares potencialmente envolvidos em fenômenos biológicos complexos. Recentemente, devido à heterogeneidade da expressão gênica em diferentes subconjuntos de células, fica mais claro o quanto é importante a delimitação de regiões especificas, especialmente no sistema nervoso central. Utilizamos a técnica de RNAseq para determinar o perfil de expressão gênica no giro denteado (GD) do hipocampo e Cornu Ammonis 3 (CA3) em um modelo animal de epilepsia do lobo temporal induzido por pilocarpina. O sequenciamento de alto rendimento do RNA foi realizado a partir do tecido microdissecado do hipocampo, região dorsal e ventral do GD e CA3, assim como a intermediária de CA3, no modelo de pilocarpina em ratos Wistar. Avaliamos o perfil de expressão gênica e os processos biológicos enriquecidos a partir dos genes diferencialmente expressos. Os resultados indicam a presença de muitos genes regulados diferencialmente, dos quais, alguns foram específicos para cada sub-região do hipocampo nos ratos tratados com pilocarpina. No entanto, identificamos alguns importantes processos biológicos de sinalização que foram enriquecidos em todas os grupos celulares estudados e nas áreas examinadas, como, inflamação, navegação axonal, atividade neuronal e função sináptica. Os dados apresentados destacam a importância da análise de alto rendimento do transcriptoma no estudo de doenças complexas, como a epilepsia, e a vantagem de obter áreas delimitadas de tecido para analisar plenamente a grande heterogeneidade biológica de diferentes populações de células no sistema nervoso central. Nossos resultados sugerem uma predominância na região dorsal relacionada a atividade elétrica neuronal e orientação axonal, além de identificar uma interação entre vários componentes moleculares que levam à epileptogênese neste modelo animal que exibe dano hipocampal generalizado Abstract: Mesial temporal lobe epilepsy (MTLE) is a chronic neurological disorder characterized by the development of seizures and by histopathological abnormalities in the mesial temporal lobe structures, mainly hippocampal sclerosis (HS). It is well known that gene expression profile of specific tissue provides relevant biological information about molecular mechanisms potentially involved in complex biological phenomena. Recently, it has been recognized that due to the marked heterogeneity of gene expression in a different subset of cells, it is important to take sub-regional specificities when studying gene expression, especially in the central nervous system. We used RNA sequencing analysis to determine the profile of gene expression in the hippocampus dentate gyrus (DG) and Cornu Ammonis 3 (CA3) in an animal model of mesial temporal lobe epilepsy induced by pilocarpine. The high-throughput RNA sequencing was performed in tissue obtained from the dorsal and ventral DG and CA3, as well as the intermediate CA3, by laser-microdissection in Wistar rats. We evaluated the gene expression profile and the enriched signaling biological processes. Our results indicate that there were many differentially regulated genes, some of which were specific to each sub-regions of the hippocampus in the pilocarpine rats. However, we identified some major signaling biological processes that were enriched in all layers and areas examined, such as inflammation, axon guidance, neuronal activity and synaptic function. The data presented highlights the importance of high-throughput transcriptome analysis in the study of complex disorders such as epilepsy, and the advantage of obtaining tissue from delimitated areas to fully appreciate the large biological heterogeneity of different cell populations within the central nervous system. Our results suggest a predominance of the dorsal region in the neuronal electrical activity and axonal guidance. Furthermore, we identified an interaction among several molecular components leading to the epileptogenesis in this animal model that displays widespread hippocampal damage Doutorado Fisiopatologia Médica Doutor em Ciências FAPESP 2013/8635-5 CNPQ

Orientador: Carlos Amilcar Parada Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O gânglio da raiz dorsal (GRD) tornou-se um grande foco de estudos ao longo dos últimos anos, devido ao seu papel modulatório no desenvolvimento das hiperalgesias. Resultados prévios de nosso grupo demonstraram que a ativação da enzima ciclooxigenase-2 (COX-2) e receptores NMDA, nas células do gânglio da raiz dorsal, participam do desenvolvimento da hiperalgesia inflamatória no tecido periférico. Desta maneira, o objetivo deste estudo foi investigar se a ativação do receptor NMDA media um crosstalk entre neurônios e células gliais satélites, e se é dependente da ativação do receptor purinérgico P2X7 e/ou enzima COX-2. A administração ganglionar (gl.) de oligodeoxinucleotídeo antisense (ODN-AS) contra o receptor P2X7 e enzima COX-2 preveniu a hiperalgesia induzida pela administração ganglionar do agonista do receptor NMDA. Em contraste, o tratamento com ODN-AS contra os receptores NMDA não afetou a hiperalgesia mecânica induzida pela administração ganglionar de 2'(3')-0-(4-Benzoilbenzoil) adenosina 5'-trifosfato trietilamônio (BzATP) ou interleucina-1beta (IL-1beta). A histologia do GRD, realizada através de microscopia eletrônica de transmissão, mostrou um tecido diversificado, onde, há uma relação íntima entre neurônios e células satélites. Através da técnica de imunogold observou-se que as subunidades NR1 e NR2B do receptor NMDA e o receptor P2X7 são expressos em neurônios e células satélites. Em conjunto, nossos achados sugerem que a hiperalgesia do tecido periférico é desencadeada pela ativação dos receptores NMDA, que ativa os receptores P2X7, induzindo a liberação de IL-1beta que ativa a ciclooxigenase-2. A ativação da COX-2 no gânglio da raiz dorsal produz e libera prostaglandina-E2, que sensibilizará os nociceptores aferentes primários Abstract: The dorsal root ganglion (DRG) has become a major focus of several studies over the last few years mainly because of its modulatory role in hyperalgesia development. We have previously demonstrated that the activation of cyclooxygenase-2 (COX-2) enzyme and NMDA receptors (NMDAR), in the dorsal root ganglion cells, participate of the development of inflammatory hyperalgesia in the peripheral tissue. Thus, the aim of this study was to investigate, in male Wistar rats, whether NMDA receptor activation mediates a crosstalk between neurons and satellite glial cells, and if it is dependent on P2X purinergic receptor 7 (P2X7) and/or COX-2 activation. Ganglionar (gl.) administration of oligodeoxynucleotide antisense (ODN-AS) against P2X7 receptor and COX-2 enzyme prevented the hyperalgesia induced by ganglionar administration of NMDAR agonist. In contrast, the treatment with ODN-AS against NMDAR did not affect the mechanical hyperalgesia induced by ganglionar administration of 2' (3')-O-(4-Benzoylbenzoyl) adenosine 5'-triphosphate triethylammonium (BzATP) or interleukin-1beta (IL-1beta). The histological analysis of DRG cuts, performed through transmission electron microscopy, showed a diversified tissue and an intimate relationship between neurons and satellite cells. By the immunogold technique, followed by observation with transmission electron microscopy, we demonstrated that NMDAR NR1 and NR2B subunits and P2X7 receptor are expressed in both neurons and satellite glial cells of DRG. Our in vitro experiments (DRG culture) indicate that the NMDA receptor inhibition interferes with the calcium influx in satellite cells induced by the P2X7 receptor agonist. Taken together, our findings suggest the hiperalgesia is triggered by NMDAR activation, which activates P2X7 receptors, inducing the release of IL-1beta, which activates COX-2. The activation of COX-2 in DRG cells produces and releases prostaglandin-E2, which sensitizes primary afferent nociceptors Doutorado Fisiologia Doutor em Biologia Funcional e Molecular CAPES

Orientadores: Everardo Magalhães Carneiro, Elaine Cristina Vieira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O aumento crescente da prevalência da obesidade no mundo coincide com o crescente uso de luz artificial a noite (LAN). Estudos recentes tem demonstrado que a exposição à LAN, leva a dessincronização do relógio biológico e predispõe ao desenvolvimento de doenças metabólicas. A restrição de proteínas durante o período gestacional ou após o desmame leva a alterações no relógio biológico, sendo já demonstrado que a redução desse nutriente, in utero, leva ao desenvolvimento de alterações metabólicas mais acentuadas induzidas pela dieta hiperlipídica (HFD). Contudo, ainda não é conhecido os mecanismos pelos quais a exposição à LAN leva a alterações no metabolismo energético, e também se a restrição de proteína concomitante a exposição à LAN poderia contribuir para a indução de alterações metabólicas mais acentuadas favorecendo o desenvolvimento de doenças metabólicas. Nós observamos em nosso trabalho que camundongos expostos à LAN (LL) por 8 semanas exibiram maior peso corpóreo e resistência à insulina. Além disso, esses camundongos desenvolveram esteatose hepática, fato que poderia ser atribuído a redução da expressão do gene Rev-erbalfa e aumento da expressão dos seu alvos lipogênicos. Ainda, camundongos LL apresentaram no fígado aumento da expressão de microRNAs (miRNAs) que tem como alvo o gene Rev-erbalfa tais como miR-140-5p, 185-5p, 326-5p and 328-5p. Em cultura primária de hepatócitos a superexpressão desses 4 miRNAs levou a redução gênica e proteica de Rev-erbalfa. Contudo, apenas os miR-140-5p, 185-5p apresentaram ação direta na região 3¿UTR do gene Rev-erbalfa. Assim, nós concluímos que a exposição à LAN poderia levar ao desenvolvimento de esteatose hepática devido ao aumento da expressão de miRNAs que modulam a expressão de Rev-erb?. Em seguida nós observamos que camundongos alimentados com dieta hipoproteica (LP), por 14 semanas e expostos à LAN durante as 8 últimas semanas apresentaram alterações semelhantes as exibidas no grupo alimentado com dieta normoproteica (NP), as quais incluem: aumento do peso corpóreo e da glicemia de jejum e alimentado, intolerância à glicose, e maior expressão da Pck1 no fígado durante o subjetivo dia. Contudo, camundongos LP/LL também exibiram algumas diferenças as quais foram dependentes do teor de proteínas como: resistência à insulina no subjetivo dia e perda da variação diária da expressão da Pck1. Além disso, camundongos LP/LL não apresentaram mudança no período do consumo alimentar. Assim nós concluímos que a restrição de proteínas modifica algumas das alterações induzidas pela exposição à LAN ao invés de suscetibilizar o desenvolvimento dos efeitos deletérios promovidos por essa condição Abstract: The use of electric light, as well as, the exposure to irregular light schedules has become common over the 20th century and coincides with increased global prevalence of obesity and metabolic diseases. Several studies have reported that exposure to artificial light at night (ALAN) leads to disruption of circadian rhythm and predispose to obesity and metabolic disorders. Dietary protein restriction, in utero and at early life, leads to altered circadian system. Furthermore, reduced protein on diet at gestation exacerbates the metabolic changes induced by HFD and predisposes to obesity and metabolic syndrome at adulthood. However, remains unclear which mechanisms underlie the metabolic changes induced by exposure to ALAN and, whether protein restriction, after weaning, could exacerbates the deleterious effects induced by nighttime light exposure, and predispose to obesity and metabolic disorders. First we found that mice exposed to ALAN, during 8 weeks, exhibited increased body and fat pad weights, as well as peripheral insulin resistance. Furthermore, these mice developed hepatic steatosis, which could be explained by decreasing expression of the clock gene Rev-erbalpha and consequent up-regulation of it lipogenic targets ACL and FAS. Mice exposed to ALAN also exhibited increased expression of Rev-erbalpha-targeting microRNAs (miRNAs) miR-140-5p, 185-5p, 326-5p and 328-5p, in liver. Besides, in primary hepatocyte culture, the exogenous expression of these miRNAs down-regulated the expression of Rev-erbalpha at gene and protein level. However only the miR-140-5p and miR-185-5p directly bind in the Rev-erbalpha 3¿UTR region. Taken together, these evidences indicate that exposure to ALAN could leads to hepatic steatosis through increasing the expression of miRNAs, which coordinate the down-regulation of Rev-erbalpha expression. Next we observed that mice fed to low-protein (LP) diet during 14 weeks and exposed to ALAN (LL) during the last 8 weeks, exhibited some metabolic changes similar than mice fed to normal protein (NP) diet including, increased body weight, as well as increased fasting and fed glycemia, which was followed by glucose intolerance and up-regulation of Pck1 at subjective day. On the other hand LP/LL group also showed specific metabolic changes, as reduced peripheral insulin sensitivity at subjective day and lost of daily variation in Pck1 expression. Also, these mice did not exhibit altered timing of energy intake toward the subjective day. Thus, our results suggest that protein restriction modify some of the metabolic alteration promoted by nighttime light exposure instead of exacerbates the deleterious effects induced by this condition Doutorado Fisiologia Doutora em Biologia Celular e Estrutural FAPESP 2013/26740-0 CNPQ CAPES

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Lesões a nervos periféricos se constituem num problema clínico global que, normalmente, resulta em recuperação ausente ou incompleta, reduzindo a qualidade de vida de inúmeros pacientes. O reparo de tais lesões depende de abordagem cirurgia, sendo rotineiramente empregada a neurorrafia término-terminal, considerada padrão ouro, com os melhores resultados clínicos. Quando o reparo direto não é possível, devido à retração dos cotos, utiliza-se o enxerto autólogo, a partir de nervos doadores. Ao passo que as técnicas cirúrgicas têm propiciado os melhores resultados práticos, o grau de recuperação se mostra aquém do esperado, além de ser altamente variável. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias que possam otimizar o processo regenerativo, após reparo nervoso periférico, é necessário. Neste sentido, a terapia celular surge como promissora opção. Assim, o transplante de células tronco embrionárias humanas (hESCs) mostra-se uma abordagem viável, tendo em vista a pluripotência, que resulta na possibilidade de substituição de elementos celulares do nervo, além da capacidade de se dividirem indefinidamente. Contudo, as hESCs necessitam de constante aporte exógeno de FGF2 para manter sua capacidade de auto-renovação e pluripotência, bem como para conduzir a diferenciação em diferentes tipos celulares. O FGF-2 exógeno pode estimular a expressão de genes fundamentais das células tronco, assim como eliminar morte celular por suprimir genes pró-apoptóticos. O objetivo principal do presente estudo é encontrar condições ideais para a recuperação funcional após neurorrafia término-terminal. Para isso, postulamos que hESCs sozinhas ou combinadas com arcabouço de fibrina possam ser empregadas para sustentar a regeneração axonal em camundongos submetidos à neurorrafia término-terminal. Dessa forma, o nervo ciático de camundongos C57BL/6J foi transeccionado (5mm) e, após rotação de 180º, tal segmento foi suturado simulando o enxerto término-terminal, ligando os cotos proximal e distal. Quando previsto, foi aplicado o selante de fibrina e/ou hESCs alteradas geneticamente para superexpressar FGF2 no local da lesão. O estudo foi desenhado de forma a serem formados seis grupos experimentais: neurorrafia (N), neurorrafia+selante de fibrina (N+F), neurorrafia+selante de fibrina+doxicilclina (N+F+D), neurorrafia+selante de fibrina+hESCs selvagens (N+F+W), neurorrafia+selante de fibrina+hESCs não induzidas (N+F+T) e neurorrafia+selante de fibrina+hESC induzidas a produzir FGF2 (N+F+D+T). Foi avaliada a recuperação funcional da marcha utilizando-se o sistema CatWalk, bem como o limiar nociceptivo pelo método de von-Frey. O processo regenerativo foi estudado por imunoistoquímica, com marcadores para fibras motoras e sensitivas, bem como para reatividade das células de Schwann. Os resultados indicaram melhora na sensibilidade quando as hESCs foram utilizadas, na forma induzida para expressar FGF2. A regeneração das fibras sensitivas levou à melhora do reflexo de retirada, em resposta à estimulação da planta da pata ipsilateral à lesão, fato corroborado pela análise imunoistoquímica. O sistema CatWalk, contudo, não mostrou diferenças significativas na recuperação da marcha, comparando-se os grupos estudados. Conclui-se, portanto, que o emprego de hESCs, modificadas geneticamente para superexpressar FGF2 de forma induzida, pode ser útil como suporte adicional ao processo regenerativo, melhorando a regeneração axonal, especialmente do componente sensitivo Abstract: Peripheral nerve injury is a worldwide clinical problem that often results to incomplete or no functional recovery, thus impairing the quality of life of many patients. To repair such injuries, a type of surgical operation is commonly involved. The preferred surgical method for this aim is the direct nerve repair (end-to-end neurorrhaphy) as it provides the best functional outcomes. Where the end-to-end suturing is not possible due to large nerve gap, autologous nerve grafting is used as the gold standard alternative. Whereas such surgical techniques have proved to lead to better nerve regeneration, the degree of recovery is shown to be highly variable. It is thus very important to seek complementary techniques to improve the degree of recovery. One of the promising technique for this aim could be cell therapy. Transplantation therapy by human embryonic stem cells (hESCs) is very appealing because they are true pluripotent that can differentiate into specialized cell type and have the ability to self-renew indefinitely. However, the hESCs require exogenous FGF-2 to sustain self-renewal and pluripotency, and develop the capacity to differentiate into a large number of somatic cell types. The exogenous FGF-2 can also stimulate the expression of stem cell genes while eliminating cell death and apoptosis genes. The main objective of this research is to find conditions under which functional recovery is improved after sciatic nerve neurorrhaphy. We assumed that hESC, either alone or in combination with fibrin sealant scaffold, could be used to support regeneration in a mouse model of sciatic nerve injury and repair via autografting with end-to-end neurorrhaphy. To fulfill this objective, we transected 5 millimeters of the sciatic nerve of C57BL/6J mice and inverted by 180° to simulate an injury, and then sutured the stumps. Next, we applied fibrin sealant and/or human embryonic stem cells altered genetically to overexpress FGF2 at the site of injury. The study was designed to include six experimental groups comprising neurorrhaphy (N), neurorrhaphy + fibrin sealant (N+F), neurorrhaphy + fibrin sealant + doxycycline (N+F+D), neurorrhaphy + fibrin sealant + wild type hESC (N+F+W), neurorrhaphy + fibrin sealant + hESC off (N+F+T), and neurorrhaphy + fibrin sealant + hESC on via doxycycline (N+F+D+T). We evaluated the recovery rate using Catwalk and von Frey tests and immunohistochemistry analysis under a fluorescence microscope. The experiments indicated that sensory function improved when transgenic hESCs were used. The regeneration of sensory fibers indeed led to increased reflexes, upon stimulation of the paw ipsilateral to the lesion, as seen by von-Frey evaluation and supported by immunohistochemistry. The Catwalk system, however, was not successful in showing the functional recovery, likely due to its incapability to record partial paw usage with this particular animal model. Our work indicated that the simultaneous use of sensory test (von Frey) and Catwalk could provide a more detailed picture of sciatic nerve recovery. Overall, our research demonstrated that transgenic embryonic stem cells, engineered to overexpress FGF-2, could be employed to support regeneration aiming at the recovery of both motor and sensory function Mestrado Biologia Celular Mestra em Biologia Celular e Estrutural CAPES

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A intensa morte neuronal, inflamação e formação de um microambiente inibitório representam importantes desafios para reparo de lesões medulares. Neste sentido, o emprego de células tronco mesenquimais (CTM) tem sido considerado como alternativa para o tratamento de traumas à medula espinal. Assim, para avaliar a neuroproteção, modulação da resposta inflamatória e formação da cicatriz glial, o tratamento com CTM foi realizado após axotomia intramedular (AI), através de lesão perfurante no funículo anterior, nos níveis medulares L4-6, em ratas Lewis fêmeas. Com o objetivo de reter as CTM no sítio da lesão empregou-se o selante de fibrina (SF) como arcabouço. Após 7 dias de sobrevida pós lesão, foi realizado PCR quantitativo em tempo real para avaliar os níveis de transcritos gênicos de VEGF e BDNF; iNOS2 e Arginase-1 (marcadores de macrófagos M1 e M2, respectivamente); citocinas pró-inflamatórias TNF-alfa, IL-6 e IL-1beta e citocinas anti-inflamatórias IL-4, IL-10, IL-13 e TGF-beta. O grupo que recebeu SF apresentou maior expressão dos genes iNOS2 e arginase-1, aumento na expressão das citocinas pró-inflamatórias TNF-alfa e IL-1beta e anti-inflamatórias IL-10, IL-4 e IL-13. Assim, o SF promoveu maior resposta inflamatória, bem como a antecipação de sua resolução. Com sobrevida de 14 dias após a lesão foi realizada a contagem de motoneurônios alfa-medulares (MN), evidenciados por coloração de Nissl. Para análise da astrogliose na lâmina IX e destacamento sináptico ao redor de MN lesionados (GAP-43 positivos) foi realizada imunoistoquímica anti-GFAP e anti-sinaptofisina, respectivamente. Observou-se morte celular de cerca de 70% dos MN nos grupos sem tratamento. Os grupos tratados com SF e/ou CTM apresentaram maior sobrevivência neuronal comparada aos demais grupos, revelando o efeito neuroprotetor desses tratamentos. A reatividade astroglial mostrou-se menos intensa nos grupos tratados com CTM, quando comparada aos demais grupos, mostrando que as CTM influenciaram na redução da astrogliose reativa nesse período. A análise do destacamento sináptico evidenciou maior preservação sináptica ao redor do corpo celular dos MN de animais que foram tratados com CTM, refletindo um possível papel das mesmas na preservação de circuitos sinápticos. Com sobrevida de 28 dias após a lesão, a cicatriz glial no funículo anterior foi estudada através de imunoistoquímica anti-GFAP (marcador de astrócitos) e anti-CS-56 (marcador de condroitin sulfato proteoglicano). Ao longo desse período, a marcha dos animais foi avaliada através do walking track test (Catwalk). O estudo da cicatriz glial revelou similar quantidade de astrócitos e condroitin sulfato em todos os grupos experimentais. Na avaliação da recuperação motora, os animais tratados com CTM apresentaram melhor performance. O SF sozinho mostrou-se neuroprotetor e promotor de inflamação pró-regenerativa, assim como acelerou sua resolução. A combinação de SF e CTM promoveu neuroproteção, diminuição da astrogliose e preservação sináptica. Porém, tal tratamento combinado gerou padrão de inflamação distinto do grupo tratado apenas com SF, não apresentando a mesma melhora na função motora observada no grupo tratado apenas com CTM. Assim, os animais tratados apenas com CTM apresentaram a melhor performance regenerativa. Neste grupo foi possível observar neuroproteção, diminuição da astrogliose, preservação dos circuitos próprio-espinais e melhor função motora. Portanto, a terapia com CTM pode ser realizada com sucesso, mesmo sem a administração conjunta de um substrato que as retenha no sítio da lesão. Possivelmente essas células são ativamente capazes de se manter no microambiente lesado, através de sinais moleculares emanados pelos neurônios/glia presentes no local do trauma Abstract: The intense neuronal death, inflammation, and formation of an inhibitory microenvironment represent a great challenge for spinal cord injury repair. In this sense, the use of mesenchymal stem cells (MSC) has been considered as an alternative for the treatment of trauma to the spinal cord. Thus, to evaluate neuroprotection, modulation of the inflammatory response and formation of the glial scar, MSC treatment was performed after intramedullary axotomy (IA), through a perforating lesion at the anterior funiculus, at the spinal levels L4-6, in female Lewis rats. To retain the MSC at the site of the lesion, a fibrin sealant (FS) scaffold was used. After 7 days of post-injury survival, real-time quantitative PCR was performed to evaluate the levels of VEGF and BDNF gene transcripts; INOS2 and Arginase-1 (M1 and M2 macrophage markers, respectively); proinflammatory cytokines TNF-alpha, IL-6 and IL-1beta and anti-inflammatory cytokines IL-4, IL-10, IL-13 and TGF-beta. The FS-treated group had higher expression of the iNOS2 and arginase-1 genes, proinflammatory cytokines TNF-alpha and IL-1beta and anti-inflammatory cytokines IL-10, IL-4 and IL-13. Thus, FS promoted greater inflammatory response, as well as an anticipation of its resolution. With survival of 14 days after injury, spinal alpha motor neurons (MN), evidenced by Nissl staining were counted. For the analysis of astrogliosis in spinal lamina IX and synaptic detachment around lesioned MN (GAP-43 positive), anti-GFAP and anti-synaptophysin immunohistochemistry were performed, respectively. Cell death of about 70% MN was observed in the untreated groups. The groups treated with FS and/or MSC presented higher neuronal survival compared to the other groups, revealing the neuroprotective effect of these treatments. Astroglial reactivity was less intense in the MSC-treated groups when compared to the other groups, showing that MSC caused reduced astrogliosis in this period. The analysis of the synaptic detachment showed greater synaptic preservation around MN cell bodies in the MSC-treated group, reflecting a possible role for the cells on the preservation of synaptic circuits. With a 28-day survival after injury, the glial scar on the anterior funiculus was studied by anti-GFAP (astrocyte marker) and anti-CS-56 (chondroitin sulfate proteoglycan marker) immunohistochemistry. Throughout this period, the gait of the animals was evaluated by the walking track test (Catwalk). The study of glial scar revealed similar quantity of astrocytes and chondroitin sulfate in all experimental groups. In the evaluation of the motor recovery, the animals treated with MSC presented better performance. FS alone was shown to be neuroprotective and promoter of pro-regenerative inflammation, as well as acceleration of its resolution. The combination of FS and MSC promoted neuroprotection, decreased astrogliosis and synaptic preservation. However, such a combined treatment generated a different inflammation pattern compared to the FS-treated group and did not show a similar improvement in motor function observed in the MSC-treated group. Thus, animals treated only with MSC showed a better regenerative performance. In this group, it was observed neuroprotection, reduced astrogliosis, preserved spinal circuits and better motor function. Therefore, MSC therapy can be successfully performed, even without a co-administration of a substrate for the retention at the lesion site. Possibly these cells are actively able to remain within the injured microenvironment, through molecular signals emanated by neurons/glia present in lesion site Doutorado Biologia Celular Doutora em Biologia Celular e Estrutural FAPESP 2012/22750-9, 2016/19954-2

Orientadores: Iscia Teresinha Lopes Cendes, André Schwambach Vieira e Fabio Rossi Torres Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: As displasias corticais focais (DCFs) são uma importante causa de epilepsia refratária às drogas antiepilépticas e nossos objetivos neste trabalho foram ajudar a elucidar os mecanismos moleculares envolvidos na DCF tipo II e, identificar e validar biomarcadores não invasivos para serem utilizados no diagnóstico desta malformação cortical, usando para essas duas abordagens os microRNAs. Foi utilizado o tecido cerebral de pacientes com DCF tipo II submetidos à cirurgia para controles das crises epilépticas e tecido cerebral de indivíduos controles; além de plasma sanguíneo desses mesmos pacientes e de pacientes com epilepsia do lobo temporal mesial, bem como de indivíduos normais. Foram utilizadas as seguintes técnicas neste trabalho: microarranjos de microRNAs, PCR quantitativa, hibridização in situ, ensaios de gene repórter e sequenciamento de nova geração. Identificamos três microRNAs, hsa-let-7f, hsa-miR-31 e hsa-miR34a, com a expressão diminuída nos tecidos do pacientes. Em contrapartida, observamos um aumento da expressão de um fator de transcrição envolvido na diferenciação neuroglial, NEUROG2. Também encontramos o gene RND2, um alvo de NEUROG2, com a expressão aumentada, e sabe-se que tem um papel fundamental na migração radial dos neurônios corticais. Experimentos in vitro mostraram que NEUROG2 é regulado na região 5¿ não traduzida por hsa-miR-34a. Além disso, foi observada uma forte expressão nuclear de NEUROG2 em células aberrantes presentes neste subtipo da DCF. Juntos, esses achados indicam que provavelmente há uma falha na regulação pós-transcricional da expressão de NEUROG2 e que isso tem uma repercussão em cadeia, levando a falhas tanto no processo de diferenciação neuroglial como de migração neuronal na DCF tipo II, o que pode explicar a presença de células aberrantes e a epileptogênese nesta malformação cortical. Outro achado importante, em nosso estudo, consistiu da identificação do hsa-miR-134 como potencial biomarcador não invasivo para ajudar no diagnóstico de pacientes com epilepsia do lobo temporal mesial. Este microRNA circulante no plasma sanguíneo é capaz de discriminar o grupo de pacientes do grupo de controles com uma área sob a curva (AUC) de 0.75, independentemente da sua resposta ao tratamento medicamentoso ou à presença de sinais de esclerose hipocampal nos achados de ressonância magnética. Com isso, por meio dos microRNAs, foi possível sugerir um mecanismo molecular envolvido na DCF tipo II, bem como identificar um microRNA circulante com potencial uso no diagnóstico de epilepsia do lobo temporal Abstract: Focal cortical dysplasias (FCDs) are an important cause of drug-resistant epilepsy and our goals were to help elucidate the molecular mechanisms involved in FCD type II and to identify and validate reliable non-invasive biomarkers to be used in diagnosis of epilepsy related with this cortical malformation, using for these two approaches microRNAs as a molecular tool. We used brain tissue from patients with FCD type II and normal controls, besides blood plasma was used from patients with FCD type II, patients with mesial temporal lobe epilepsy (MTLE), as well as controls individuals. Microarrays of microRNAs, quantitative PCR, in situ hybridization, luciferase reporter assays and exome sequencing was performed to validate and further explore our data. We identified hsa-let-7f, hsa-miR-31 and hsa-miR34a were downregulated in tissue from FCD type II, whereas a transcription factor involved in neuronal and glial fate specification, NEUROG2, was found upregulated. We also found RND2 gene, a NEUROG2-target, upregulated, which has a key role in radial migration of cortical neurons. In vitro experiments showed that hsa-miR-34a downregulates NEUROG2 by binding to its 5'-untranslated region. Moreover, we observed strong nuclear expression of NEUROG2 in aberrant cells present in FCD type II, balloon cells and dysmorphic neurons. Together, these findings indicate that a faulty coupling in neuronal differentiation and migration mechanisms may explain the presence of aberrant cells and intrinsic epileptogenesis in this cortical malformation. Another important finding, in our study, was the identification of the downregulation of hsa-miR-134 as a potential non-invasive biomarker to support the diagnosis of patients with MTLE. This circulating microRNA could be used to discriminate MTLE patients with an area under the curve (AUC) of 0.75, regardless of their response to pharmacotherapy or the presence of MRI signs of hippocampal sclerosis. Together, these findings allowed us to suggest a potential molecular mechanism involved in FCD type II, due to microRNAs, as well to identify a circulating microRNA as biomarker of epilepsy Doutorado Fisiopatologia Médica Doutora em Ciências CAPES

Orientador: Marcio Luiz Figueredo Balthazar Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A demência na doença de Alzheimer (DA) é um grave problema de saúde pública que tende a se intensificar devido, sobretudo, ao envelhecimento da população. Quanto aos aspectos clínicos da doença, o primeiro sintoma geralmente observado é a dificuldade em armazenar informações novas, afetando principalmente a memória episódica, à medida que a doença progride, outras funções cognitivas também são afetadas. A fisiopatologia da DA é caracterizada por uma série de alterações neuropatológicas que incluem: placas senis que contêm em excesso depósitos extracelulares de peptídeo ß-amiloide (ßA) e emaranhados neurofibrilares intracelulares que contêm proteína Tau hiperfosforilada (p-Tau), levando a uma maciça perda sináptica, morte neuronal e alterações funcionais em redes neurais, como na Default Mode Network (DMN). A conectividade funcional (CF) da DMN é alterada na DA devido ao acumulo de ßA em suas regiões, contribuindo para severidade dos sintomas cognitivos e clínicos. Alterações estruturais como atrofia cerebral, principalmente atrofia do hipocampo, também são observadas na doença. Há crescente evidência de que a inflamação sistêmica, através de mediadores inflamatórios, como por exemplo, as citocinas, desempenha um papel importante na produção e regulação dessas proteínas (ßA e Tau) presentes no líquido cefalorraquidiano (LCR). Existem vias de comunicação entre o cérebro e o sistema imune periférico que podem estar alteradas desde da fase pré-demencial, favorecendo ou não a progressão da doença, decorrente disso a inflamação sistêmica também tem sido associada com a cognição e morfologia cerebral. Nosso objetivo principal foi verificar a hipótese se a inflamação sistêmica pode ser associada com os principais biomarcadores da DA (proteínas do LCR e neuroimagem). Para isso, adquirimos imagens de ressonância magnética em 3T de 25 controles saudáveis, 45 pacientes com Comprometimento Cognitivo Leve amnéstico (CCLa) e 28 pacientes com DA leve. Observamos que os pacientes com CCLa nos quais detectamos IL-12, TNF-'alfa' e IL-6 apresentaram aumento da CF das regiões da DMN; os pacientes do grupo DA nos quais detectamos IL-12, IL-6, IL-10 e TNF-'alfa' apresentaram maior volume do hipocampo, menos ßA1-42 e diminuição na CF da DMN. Nossos resultados podem indicar uma possível relação entre o perfil de inflamação sistêmica e os biomarcadores da DA Abstract: Dementia in Alzheimer's disease (AD) is a serious public health problem that tends to intensify, mainly due to the aging of the population. Regarding the clinical aspects of the disease, the first symptom usually observed is the difficulty in storing new information, affecting episodic memory, as the disease progresses, other cognitive functions are affected. The pathophysiology of AD is characterized by a series of neuropathological changes that include: senile plaques that contain excess extracellular deposits ß-amyloid peptide (Aß) and intracellular neurofibrillary tangles that contain hyperphosphorylated Tau protein (p-Tau), leading to a massive neuronal death, and functional abnormalities in neural network, such as in the Default Mode Network (DMN). The functional connectivity (FC) of DMN is altered in AD due to the accumulation of Aß in its regions, contributing to the severity of cognitive and clinical symptoms. Structural changes such as brain atrophy, especially hippocampal atrophy, are also seen in the disease. There is increasing evidence that systemic inflammation, through inflammatory mediators, such as cytokines, plays an important role in the production and regulation of these proteins (ßA and Tau) present in cerebrospinal fluid (CSF). There are pathways of communication between the brain and the peripheral immune system that may be altered from the pre-dementia phase, favoring or not the progression of the disease, as a result of which systemic inflammation has also been associated with cerebral cognition and morphology. Our main objective was to verify the hypothesis that sistemic inflammation may be associated with the main biomarkers of AD (CSF proteins and neuroimaging). For this, we acquired magnetic resonance imaging in 3T of 25 healthy controls, 45 amnestic Mild Cognitive Impairment (aMCI) and 28 patients with mild AD. We observed that patients with aMCI in whom we detected IL-12, TNF-'alpha' and IL-6 showed increased FC of the regions of the DMN; the patients in the mild AD group in which we detected IL-12, IL-6, IL-10 and TNF-'alpha' had higher hippocampal volume, less Aß1-42, and decreased FC in DMN. Our results may indicate a possible relationship between the systemic inflammation profile and the biomarkers of AD Mestrado Neurologia Mestra em Ciências CNPQ 133343/2015-4 FAPESP 2011/17092-0

Orientador: Antonio Carlos Boschiero Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A hiperinsulinemia, frequentemente associada a obesidade e diabetes melitus tipo 2, decorre do aumento da secreção de insulina e/ou da redução do clearance desse hormônio. Este último processo ocorre principalmente no fígado, pela ação da insulin-degrading enzyme (IDE), principal enzima responsável pela degradação da insulina. Sabe-se que o exercício físico reduz a insulinemia, pelo menos em parte, devido ao aumento do clearance de insulina associado a um aumento da expressão da IDE, entretanto os mecanismos envolvidos nessa modulação ainda não são conhecidos. Durante o exercício físico, o tecido muscular em contração secreta várias moléculas, denominadas miocinas, sendo uma das principais a interleucina-6 (IL-6). O objetivo deste trabalho foi investigar, inicialmente, a função da IL-6 sobre a modulação da expressão e atividade da IDE e, numa segunda fase, averiguar se, durante o exercício físico, esta citocina seria responsável pelo aumento do clearance de insulina e da expressão da IDE. Primeiramente, foram utilizados camundongos C57BL/6 wild type (WT) e knockout (KO) para o gene da IL-6. Nestes camundongos, avaliamos a homeostase glicêmica, através dos testes de tolerância à glicose (ipGTT) e à insulina (ipITT), e o clearance de insulina. Também avaliamos a secreção de insulina estimulada por glicose em ilhotas isoladas e a expressão (gênica e proteica) e atividade da IDE no fígado e músculo gastrocnêmio. Os camundongos KO apresentaram redução da tolerância à glicose, comparado ao grupo WT, decorrente, provavelmente, da menor secreção de insulina pelas ilhotas desses camundongos, uma vez que não observamos diferenças na sensibilidade à insulina. Além disso, observamos redução do clearance de insulina, a qual foi acompanhada de uma menor expressão e atividade da IDE no fígado e no músculo gastrocnêmio dos camundongos KO. In vitro, incubamos células HEPG2 e C2C12 na presença de diferentes concentrações de IL-6. Após 3 h em 50 ou 100 ng/ml de IL-6, a expressão da IDE foi significativamente maior nas células HEPG2 e C2C12, respectivamente. Em seguida, camundongos selvagens, foram distribuídos em 3 grupos: controle (CTL), exercitado (EXE), e exercitado tratado com 2 mg/kg de tocilizumabe (EXE+TCZ), um anticorpo que se liga ao receptor da IL-6, impedindo sua sinalização. O exercício agudo foi realizado em esteira inclinada com duração de 3 h em intensidade moderada. Nesses grupos, também foram avaliados os mesmos parâmetros citados acima. Camundongos EXE+TCZ tiveram tanto o aumento do clearance de insulina quanto o aumento da expressão e atividade da IDE bloqueados, principalmente no músculo gastrocnêmio. Por fim, coletamos amostras de plasmas de humanos, antes e 3 h depois do exercício agudo (30 min em cicloergômetro a 70% do VO2peak). Após 3 h da sessão de exercício, observamos aumento das concentrações plasmáticas de IL-6 e IDE, as quais foram positivamente correlacionadas. Apesar de não observarmos aumento significativo da atividade da IDE, também registramos uma correlação positiva entre IL-6 e atividade dessa enzima. Em resumo, nossos resultados apontam para uma função ainda desconhecida da IL-6 sobre o controle glicêmio, atuando sobre o clearance de insulina via modulação da IDE. Além disso, observamos que essa função da IL-6 tem papel fundamental no aumento do clearance de insulina durante o execício físico, através do aumento da expressão e atividade da IDE, principalemte no músculo esquelético, um efeito que parece ocorrer também em humanos, a exemplo dos camundongos Abstract: Hyperinsulinemia is often associated with pathological conditions such as obesity and type 2 diabetes mellitus. It depends on increase in insulin secretion and/or decrease in insulin clearance that occurs, mainly, in liver by insulin-degrading enzyme (IDE). It is known that physical exercise reduces insulinemia, at least in part, due to increase in insulin clearance and IDE expression, however, the mechanisms involved in this modulation remains unclear. During exercise, muscle contractions secrete several molecules, named myokines, and the most important, in terms of quantity, is the inteleukin-6 (IL-6). In this study we first investigated the role of IL-6 on the modulation of IDE expression and activity. Secondly, we assessed a possible role of this cytokine on the increase in insulin clearance and IDE expression, during an acute exercise. First, we used C57BL/6 wild type (WT) and IL-6 knockout (KO) mice, and to evaluate the glycemic homeostasis, we performed both glucose and insulin tolerance tests (ipGTT and ipITT, respectively). We also evaluated the insulin clearance, glucose stimulated insulin secretion in isolated pancreatic islets and IDE (gene and protein) expression and activity in the liver and gastrocnemius muscle. The KO mice displayed impairment of glucose tolerance, compared with WT, an effect probably due to a reduced insulin secretion by the islets from these mice. This assumption was based on the fact that we did not observed alteration in insulin sensitivity. In addition, it was observed a reduction of the insulin clearance, probably due to the lower IDE expression and activity, in the liver and gastrocnemius muscle from KO mice, compared with WT. In vitro experiments, using HEPG2 and C2C12 cells, were also performed. The increase in IDE expression was observed after 3-h incubation at 50 or 100 ng/ml IL-6, in the HEPG2 and C2C12 cells, respectively. After, WT mice were distributed into 3 different groups: control (CTL), exercised (EXE), and exercised treated with 2 mg/kg tocilizumab (EXE+TCZ), an IL-6 receptor antibody. The acute exercise was performed on a treadmill during 3-h at moderate intensity. In these groups, we also evaluated the same parameters cited above. Interestingly, the inhibition of IL-6, in the EXE+TCZ mice, abrogated the increase of insulin clearance and IDE expression and activity, mainly in the gastrocnemius muscle. Finally, we also collected plasma samples from humans, before and 3-h after an acute exercise (30 min cycling at 70% VO2peak). Three hours after the end of the acute exercise, we observed an increase in IL-6 and IDE plasma concentrations, which were positively correlated. Although the increase in plasma IDE activity was only marginal, a positive correlation between IL-6 and IDE activity was also observed. In summary, our outcomes demonstrated a function, not yet described, of IL-6 on glycemic control that consists of incrase in insulin clearance and IDE expression and activity. This function seems to be essential for the augmentation of insulin clearance during physical exercise, increasing the IDE expression and activity mainly in the skeletal muscle, an effect that likely also occurs in human Doutorado Fisiologia Doutora em Biologia Funcional e Molecular FAPESP 2014/24719-7 CNPQ

Orientadores: José Antonio Rocha Gontijo, Patricia Aline Boer Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Considerando que, atualmente observa-se, principalmente em populações ocidentais, aumento expressivo da ingestão de alimentos processados ricos em gorduras saturadas, torna-se importante o estudo do efeito desta mudança de hábito na incidência de doenças. Obesidade, hiperglicemia e hipertensão têm sido frequentemente associadas a altos níveis circulantes de metabólitos oxidantes, como os superóxidos. Sabe-se que tanto as dietas materna e paterna, quanto o estresse materno e a isquemia intra-uterina têm efeitos epigenéticos que podem alterar a expressão gênica dos fetos levando ao aumento da predisposição a doenças na vida adulta. Neste contexto, o presente estudo busca analisar o efeito da ingestão crônica de dieta hiperlipídica (DHL), associada ao uso do antioxidante TempolR sobre as mães e prole de machos. Ratas Sprague-Dawley foram alimentadas com dieta hiperlipídica com 60% das calorias provenientes de lipídios, adicionada à ingestão de Tempol por seis semanas adicionado dos períodos de acasalamento, prenhez e lactação. Os grupos submetidos à DHL apresentaram consumo de água e ração significativamente menores, com aumento da ingestão calórica e consequente aumento da massa corporal. O grupo que consumiu a DHL adicionada do antioxidante teve diminuição do ganho de peso durante a prenhez e alterações na excreção de potássio ao fim do período de lactação. Quanto à prole de machos, os animais cujas mães receberam dieta hiperlipídica com ou sem Tempol (Dieta e DTempol) apresentaram uma menor massa corporal ao nascer em relação ao grupo Controle. A prole de mães Dieta, após 16 semanas de vida apresentou redução dos níveis de HDL e surpreendente, diminuição do índice de adiposidade, o que foi normalizado pelo uso de Tempol. Houve elevação pressórica em ambos os grupos cujas mães foram alimentadas com DHL. A análise do metabolismo glicídico e insulínico mostrou modificações na prole Dieta, com diminuição da secreção de insulina. A prole DTempol também apresentou queda na filtração glomerular e modificações na manipulação renal de sódio e de potássio na 16ª semana de vida. A programação fetal induzida pela ingestão materna de DHL induziu à diminuição do número e redução do volume glomerular na prole Dieta aos 12 dias de vida, mas estes parâmetros não foram modificados na idade adulta (16 semanas de vida). Adicionalmente, a prole advinda de mães que ingeriram DHL apresentou importantes alterações morfológicas renais caracterizadas por: infiltrado inflamatório, aumento da deposição renal de colágeno, e elevação da expressão renal de marcadores de transição epitélio mesenquimais tais como desmina e vimentina. Estas alterações foram acompanhadas de elevação na excreção urinaria de proteínas e parecem estar vinculadas à redução da expressão da SOD e elevação da expressão de NADPH. Também, o tratamento das mães submetidas à DHL com Tempol promoveu uma atenuação significativa das alterações inflamatórias e morfológicas descritas. Assim, o estudo mostrou que a DHL pode promover a programação fetal em proles de ratos machos com alterações futuras renais caracterizadas pela elevada expressão de proteínas glomerulares que sugerem estarem estes rins sujeitos à transição epitélio-mesenquimal. Todas estas alterações parecem decorrer pelo menos em parte, de modificações do sistema de óxido-redução Abstract: Considering that there is a significant increase in processed foods rich in saturated fat intake, mainly in Western populations, is important to study the effect of this change in the incidence of diseases. Obesity, hyperglycemia and hypertension have been associated with high circulating levels of oxidizing metabolites, such as superoxides. It is known that both maternal and paternal diets, maternal stress and intrauterine ischemia have epigenetic effects that may alter the gene expression of fetuses leading to increased predisposition to diseases in adult life. In this context, the present study aims to analyze maternal long-term consumption of hyperlipidic diet (HFD), associated with the use of the antioxidant Tempol on the mothers and offspring male rats. Sprague-Dawley rats were fed a HFD (60% of calories from lipids), added to Tempol for 6 weeks prior to pregnancy and throughout gestation and lactation. HFD dams showed significantly lower water and food consumption, with an increase in caloric intake and a consequent increase in body mass. HFD added the antioxidant group (DTempol) had a decrease in weight gain during pregnancy and changes in potassium excretion at the end of the lactation period. HFD offspring with or without Tempol (Diet and Dtempol) had a lower birth weight compared to the Control group. After 16 weeks HFD offspring had a reduction in HDL levels and a surprising decrease in the adiposity index, which was normalized by the antioxidant consume. There was an increase in blood pressure in both groups from HFD dams. Glucose and insulin metabolism were altered HFD offspring, with decreased insulin secretion. DTempol also presented a drop in glomerular filtration and modifications in the sodium and potassium renal manipulation at the 16th week. Maternal long term HFD consumption induced a decrease in nephron number in offspring at 12 days, but with normalization in adulthood (16 weeks of life). In addition, offspring of HFD dams presented important renal morphological changes characterized by: inflammatory infiltrate, increased renal collagen deposition, and elevated renal expression of mesenchymal epithelial transition markers such as desmin and vimentin. These changes were accompanied by elevation in urinary protein excretion and appear to be linked to reduced SOD expression and elevated NADPH expression. Also, HFD with Tempol dams treatment promoted a significant attenuation of the described inflammatory and morphological changes. Thus, the study showed that HFD intake can promote fetal programming in male offspring rats with future renal changes characterized by expression of glomerular proteins that suggest that these kidneys are subject to the epithelial-mesenchymal transition. All these changes appear to be at least in part due to modifications of the oxide-reduction system Doutorado Clínica Médica Doutora em Ciências CAPES 01-P-1739/2016

Orientadores: Cláudia Herrera Tambeli, Cesar Renato Sartori Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Estudos epidemiológicos revelam uma frequente co-morbidade entre dor crônica e depressão. O tratamento de ambas as condições ainda é um grande desafio para a ciência, e denota a necessidade de maior compreensão dos mecanismos de neuroplasticidade central, subjacentes ao desenvolvimento de tais estados. Tem sido demonstrado que o Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF), promotor de plasticidade neuronal, participa da modulação da dor e da etiologia da depressão. No entanto, não se sabe se esta neutrofina, no Núcleo Accumbens (NAc), através do receptor de proteína Tirosina Quinase B (TrkB), está envolvida no processo de cronificação da dor, e se esta cronificação estaria associada à depressão. Uma vez que, a Área Tegmental Ventral (VTA) é a principal fonte de BDNF do NAc, e que o Ativador de Plasminogênio tecidual (tPA) é uma protease envolvida na síntese da isoforma madura de BDNF, a partir da isoforma precursora, foi investigado o papel do BDNF do NAc no desenvolvimento da hiperalgesia persistente e se essa hipersensibilização afeta a expressão gênica de BDNF e de tPA na VTA e os níveis das isoformas precursora, truncada e madura do BDNF no NAc. Foi verificado também se o tratamento com PGE2 desenvolve comportamento do tipo depressivo nos animais sensibilizados. Para responder a estas perguntas, foi utilizado um modelo animal de desenvolvimento de hiperalgesia persistente em que a administração diária de Prostaglandina E2 (PGE2) na pata do rato, ao longo de 14 dias, induz um estado de sensibilização do nociceptor que dura mais de um mês. Nossos dados demonstraram que a infusão intra-NAc do antagonista selectivo de TrkB (K252a), durante os primeiros sete dias de tratamento com PGE2, impediu o desenvolvimento de hiperalgesia persistente. Além disso, a hiperalgesia persistente, não induziu comportamento depressivo nos animais, mas, durante as suas fases de indução (14 dias de administração de PGE2) e de manutenção (14 dias após o término do tratamento com PGE2), aumentou significativamente a expressão gênica do BDNF e de tPA na VTA, mas não os níveis das isoformas do BDNF no NAc. Estes resultados sugerem que o BDNF no NAc desempenha um papel crucial no desenvolvimento da hiperalgesia persistente, e assim sendo, da cronificação da dor Abstract: Epidemiological studies reveal a frequent comorbidity between chronic pain and depression. The treatment of both conditions is still a great challenge for science, and denotes the need for greater understanding of central neuroplasticity mechanisms underlying the development of such states. It has been shown that Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), promoting neuronal plasticity, participates in the modulation of pain and the etiology of depression. However, it is not known if this neurotrophin in the Nucleus Accumbens (NAc) by protein Tyrosine receptor Kinase B (TrkB) is involved in the process of becoming chronic pain, and if this chronicity would be associated with depression. Since the Ventral Tegmental Area (VTA) is the primary source of BDNF NAc, and that tissue Plasminogen Activator (tPA) is a protease involved in the synthesis of the mature isoform of BDNF from the precursor isoform, was investigated the role of NAc BDNF in the development of persistent hyperalgesia and if this sensitization affects the gene expression of BDNF and tPA in the VTA and the levels of precursor isoforms, truncated and mature BDNF in the NAc. It was also found that the treatment with PGE2 develops depressive-like behavior in animals sensitized. To answer these questions, we used an animal model of persistent hyperalgesia developing that daily administration of Prostaglandin E2 (PGE2) in the rat paw over 14 days, induces nociceptor sensitization state that lasts more than one month. Our data demonstrated that NAc infusion of the selective TrkB antagonist (K252a), during the first seven days of treatment with PGE2, has prevented the development of persistent hyperalgesia. Furthermore, persistent hyperalgesia did not induce depressive behavior in animals, but during the phases of induction (14 days PGE2 administration) and maintenance (14 days after the end of treatment with PGE2), significantly increased gene expression of BDNF and tPA VTA, but not levels of the isoforms of BDNF in the NAc. These results suggest that BDNF in NAc plays a crucial role in the development of persistent hyperalgesia, and therefore, the chronicity of pain Doutorado Fisiologia Doutora em Biologia Funcional e Molecular FAPESP 2012/11371-7

Orientador: Daniel Martins de Souza Dissertação (mestrado) Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A esquizofrenia (SCZ) é um transtorno mental incurável que está relacionado ao neurodesenvolvimento e afeta cerca de 1% da população mundial. A SCZ pode ser considerada a principal forma de psicose devido a sua grande frequência e importância clínica, sendo devastadora tanto para o paciente quanto para os seus familiares. No presente trabalho foram analisados e comparados o proteoma e fosfoproteoma do corpo caloso provindos de pacientes com esquizofrenia e controles pareados coletados post-mortem. Foram usados amostras previamente enriquecida para as proteínas solúveis (citoplasma) e proteoma total, nessa última análise verificamos também o conjunto de proteínas diferencialmente fosforiladas. A análise desses conjuntos de amostras foram feitas por nano-cromatografia líquida seguida de espectrometria de massas em tandem (nano LC-MS/MS). As proteínas encontradas diferencialmente expressas em ambos os estudos foram submetidas a análise de vias metabólicas no programa Ingenuity Pathway Analysis. Foi encontrado que vias de sinalização celular estão desreguladas na maior região de substância branca cerebral, com destaque para as vias Efrina e 14-3-3. Os dados gerados nessa dissertação auxiliaram em uma melhor compreensão das bases moleculares da esquizofrenia, através da integração das vias bioquímicas e na identificação de moléculas-chave na patologia Abstract: Schizophrenia (SCZ) is an incurable mental disorder that is related to neurodevelopment and affects about 1% of world population. SCZ can be considered the main form of psychosis given its high frequency and clinical significance, and it is devastating for both patients and family. This study aimed to analyze and compare the proteome and phosphoproteome of the corpus callosum stemmed from schizophrenia patients and matched controls collected post-mortem. We used previously enriched samples to analyze soluble proteins (cytoplasm) and total proteome, in which were also identified the set of differentially phosphorylated proteins. The analysis of these sets of samples were made by nano liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (nano LC-MS / MS). The proteins found differentially expressed in both studies were subjected to analysis of metabolic pathways in the Ingenuity Pathway Analysis software. It was found that cell signaling pathways are deregulated in most of cerebral white matter, especially the Ephrin and 14-3-3 way. The data generated in this work aided in better understanding the molecular basis of schizophrenia, through the integration of biochemical pathways and the identification of key molecules in the pathology Mestrado Bioquímica Mestra em Biologia Funcional e Molecular CNPQ 151787/2F2014-0

Orientadores: IÍscia Teresinha Lopes Cendes, Cláudia Vianna Maurer-Morelli Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: As epilepsias formam um grupo de doenças neurológicas crônicas caracterizadas por crises epilépticas, as quais podem ser definidas como um distúrbio intermitente do sistema nervoso causado por descarga elétrica anormal, súbita e sincronizada dos neurônios cerebrais. A epilepsia de lobo temporal (ELT) é a mais frequente, representando aproximadamente 50% dos casos em adultos e tem como manifestação típica, a crise parcial complexa. Além disso, é frequentemente refratária ao tratamento medicamentoso. Os principais sintomas gerados pela ELT são predominantemente pelo acometimento das estruturas mediais do lobo temporal, sendo a ELT mesial (ELTM), a forma mais comum de ELT. Atualmente é ainda controversa a participação de fatores genéticos contribuindo na etiologia das epilepsias, principalmente da ELTM, que não teve até hoje nenhum gene inequivocamente associado a sua predisposição. O objetivo deste trabalho foi investigar o papel de dois genes candidatos: o PTPRM e o IL1B na predisposição à ELTM. Para tanto utilizamos as seguintes modalidades de estudo em pacientes com ELTM (i) estudo de associação genética através da genotipagem de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) localizados nos referidos genes candidatos (esta etapa do estudo foi realizada durante o mestrado); (ii) quantificação dos transcritos de ambos os genes, por PCR em tempo real em tecido das estruturas mediais do lobo temporal (principalmente hipocampo) que foi obtido através da realização de cirurgia para tratamento das crises refratárias. (iii) Para o PTPRM, foi também realizada a localização do transcrito pela técnica de hibridação "in situ" em tecido hipocampal de pacientes e de controle. Além disso, como existem evidências do envolvimento do PTPRM em etapas importantes do desenvolvimento cerebral, e pouco se conhece da função específica desse gene no cérebro realizamos (iv) a quantificação do transcrito de PTPRM durante o desenvolvimento em cérebro de camundongos. (v) Finalmente, com o objetivo específico de avaliar se o aumento de expressão de IL1B no tecido hipocampal se refletia também na circulação realizamos a quantificação do transcrito e proteica do IL1B no plasma de pacientes com ELTM. Nossos resultados revelaram associação genética entre SNPs localizados em ambos os genes investigados e o fenótipo estudado. No entanto, em nenhum dos estudos uma variante funcional pode ser identificada. A quantificação dos transcritos em tecido hipocampal dos pacientes com ELTM indicou que ambos os genes PTPRM e IL1B estão hiper-regulados em pacientes quando comparados ao tecido controle. Não identificamos variação significativa na expressão do transcrito de PTPRM no cérebro de camundongos nas diferentes etapas de desenvolvimento. Não identificamos variação significativa na quantificação do transcrito e proteica de IL1B no plasma dos pacientes com ELTM quando comparados aos controles. Em conclusão, nossos resultados dos estudos de associação indicam um papel de PTPRM e de IL1B na predisposição à ELTM, porém não fomos capazes de encontrar uma variante funcional associada ao fenótipo. Corroborando o papel de ambos os genes nosso estudo de expressão gênica no tecido acometido indicou um aumento de expressão de ambos os genes. No entanto, o aumento de expressão de IL-1beta no tecido hipocampal não se traduziu pelo aumento no plasma dos pacientes. Finalmente, nosso estudo do perfil de expressão de PTPRM durante o desenvolvimento cerebral não aponta para um papel desse gene em etapas específicas do desenvolvimento Abstract: The epilepsies are a group of chronic neurological disorders characterized by seizures, which can be defined as an intermittent disorder caused by an abnormal and sudden electrical discharge of neurons in the brain. Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most frequent form, representing approximately 50% of cases in adults, and it is often refractory to drug treatment. The main symptoms in TLE are generated by the involvement of the medial temporal lobe structures, characterizing mesial TLE (MTLE). The contribution of genetic factor to MTLE it is still controversial and to date, no gene has been unequivocally associated with the predisposition to MTLE. Therefore, the aim of this study was to investigate the role of two candidate genes: PTPRM and IL1B in the predisposition to MTLE. To achieve this we use the following type study modalities in patients with MTLE (i) genetic association study by genotyping of single nucleotide polymorphisms (SNPs) located in these two candidate genes; (ii) quantification of the transcripts of both genes by real-time PCR in hippocampal tissue obtained from epilepsy surgery for the treatment of refractory seizures. (iii) For PTPRM we also performed in situ hybridization experiments in order to localize the transcript in hippocampal tissue from patients and controls. Furthermore, since there is evidence that PTPRM could be involved in key stages of brain development and little is known about the specific role of this gene in the brain, we performed (iv) quantification of its transcript during development in mouse brain. (v) Finally, with the specific objective of assessing whether the increase of IL1B expression in hippocampal tissue was also seen outside the central nervous system we quantified IL1B transcript and protein in plasma of patients with MTLE. Our results revealed genetic association between SNPs located in both genes and the phenotype. The quantification of transcripts in hippocampal tissue of patients with MTLE indicated that both genes are hyper-regulated when compared to control tissue. We did not find any significant variation in transcript expression of PTPRM in mouse brain during developed. In addition, no difference in transcript expression and protein levels of IL1B was observed in plasma of patients with MTLE. In conclusion, our results indicate an involvement of PTPRM and IL1B in the predisposition to MTLE; however, we are unable to find a functional variant associated with the phenotype. Corroborating the role of both genes in MTLE gene expression in affected tissue (hippocampus) indicated an up-regulation of both genes. However, the increase in IL1B expression in hippocampal tissue was not reflected by an increase of transcript or protein in plasma of patients with MTLE. Finally, our expression profile of PTPRM during brain development does not point to a role for this gene in specific stages of development Doutorado Fisiopatologia Médica Doutora em Ciências