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The human mutilating disease chromoblastomycosis is caused by melanized members of the order Chaetothyriales. To assess population diversity among 123 clinical strains of agents of the disease in Brazil we applied sequencing of the rDNA internal transcribed spacer region, and partial cell division cycle and β-tubulin genes. Strains studied were limited to three clusters divided over the single family Herpotrichiellaceae known to comprise agents of the disease. A Fonsecaea cluster contained the most important agents, among which F. pedrosoi was prevalent with 80% of the total set of strains, followed by 13% for F. monophora, 3% for F. nubica, and a single isolate of F. pugnacius. Additional agents, among which two novel species, were located among members of the genus Rhinocladiella and Cyphellophora, with frequencies of 3% and 1%, respectively.

Muitos micro-organismos são estudados em virtude da melhoria nas características organolépticas e tecnológicas que são capazes de conferir a uma grande variedade de alimentos e bebidas. As leveduras não-convencionais destacam-se por sua habilidade de utilização de diferentes rotas metabólicas, o que favorece a produção de biomoléculas que podem ser interessantes do ponto de vista biotecnológico. Desta maneira, a atual pesquisa teve como objetivo avaliar a capacidade de consumo de um composto terpênico, o α-terpineol, por leveduras não-convencionais depositadas no centro de coleções CMRP. Para isso, 23 leveduras não-convencionais e produtoras de aroma frutais foram selecionadas dentre as leveduras depositadas em uma das coleções integrantes do centro de coleções CMRP. Realizou-se a identificação molecular de cada uma delas. As linhagens, então, foram testadas quanto à sua tolerância ao α-terpineol, sendo cultivadas em caldo YM, em pH 5,0, por 48 h com adição de concentrações de 2,5 μL/mL, 5,0 μL/mL, 7,5 μL/mL e 10,0 μL/mL da mistura de α-terpineol e álcool etílico. As leveduras que apresentaram tolerância a alguma dessas concentrações foram cultivadas novamente, mas em meio mineral DP líquido, para avaliação de seu consumo de α-terpineol. O tempo de cultivo total foi de 48 h, e amostras foram coletadas a cada 12 horas de cultivo, inclusive no tempo inicial.Extraíram-se as amostras coletadas com diclorometano e os extratos foram analisados por cromatografia em camada delgada, utilizando tolueno:acetato de etila (93:7) como fase móvel e p-anisaldeído ácido sulfúrico como revelador. As características das manchas foram observadas e os valores de Rf foram calculados. Com a identificação molecular, revelou-se que 12 leveduras pertenciam a espécie Clavispora lusitaniae, 8 eram Rhodotorula mucilaginosa e 3 eram Lodderomyces elongisporus. Segundo a árvore filogenética, duas dessas linhagens (C. lusitaniae e L. elongisporus) apresentam maior proximidade genética entre si em relação à levedura R. mucilaginosa. Do total de 23 leveduras, 6 delas se mostraram tolerantes à concentração de 2,5 μL/mL de α-terpineol, sendo uma destas tolerante também à concentração de 10,0 μL/mL mas somente durante 12 horas. As linhagens tolerantes foram identificadas como C. lusitaniae (n=1), L. elongisporus (n=2) e R. mucilaginosa (n=3). A levedura que aguentou a maior concentração, R. mucilaginosa, no entanto, resistiu apenas 12 h em todas as concentrações. Suspeita-se que seu mecanismo de defesa tenha sucumbido ao composto, que tenha havido degradação enzimática ou a produção de compostos tóxicos pela mesma linhagem ao consumir o α-terpineol. Durante a primeira análise de CCD, as amostras CMIB 46 (R. mucilaginosa) e CMIB 33 (L. elongisporus) apresentaram resultados potencialmente promissores, portanto, repetiu-se o processo de cultivo, coleta e análise para estas amostras. Com a segunda análise por CCD obtiveram-se resultados inconclusivos para o consumo de αterpineol pelas duas linhagens, principalmente pela baixa concentração das amostras, sugerindo-se futuramente o uso de técnicas auxiliares, como cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas para detecção destes compostos com maior sensibilidade. Many microbial species are acknowledged by their ability to provide distinct organoleptic properties to countless foods and drinks, especially alcoholic beverages. Non-conventional yeasts stand out in using different metabolic pathways to produce biomolecules that may be interesting from the biotechnological point of view. The present research aimed to analyze the potential consumption of a monoterpenic compound, α-terpineol, by non-conventional yeasts CMRP collection center. For this purpose, 23 fruity aroma-producing, non-conventional yeasts were selected from one of the collections belonging to the CMRP collection center. Thereafter, these strains were molecularly identified. Subsequently, the strains were tested for their tolerance to α-terpineol, by cultivating them in YM broth, at pH 5.0, for 48 h. Concentrations of 2.5 μL/mL, 5.0 μL/mL, 7.5 μL/mL and 10.0 μL/mL of a mixture of α-terpineol and ethyl alcohol were added in the broth. The yeasts that survived any of these concentrations were cultured again, but this time in mineral DP liquid culture medium. This technique aimed to assess their consumption of α-terpineol. The overall cultivation time was 48h, however samples were collected every 12 hours of cultivation, including the initial time of 0 hour. The samples collected were extracted with dichloromethane and the extracts were analyzed by thin layer chromatography, using toluene: ethyl acetate (93:7) as a mobile phase and p-anisaldehyde sulfuric acid as stain for further visualization of the spots. The size, color and intensity of the spots were observed and the Rf values were calculated. The yeasts species were identified as Clavispora lusitaniae, being it 12 strains, Rhodotorula mucilaginosa with 8 strains and the last 3 strains were identified as Lodderomyces elongisporus. Furthermore, according to the phylogenetic tree, two of these strains (C. lusitaniae and L. elongisporus) have greater genetic proximity to each other than to the yeast R. mucilaginosa. From the 23 yeasts, 6 of them were shown to be tolerant to the concentration of 2.5 μL/mL of α-terpineol, one of which also showed tolerance to the concentration of 10.0 μL/mL for 12 hours. The tolerant strains were identified as C. lusitaniae (n = 1), L. elongisporus (n = 2) and R. mucilaginosa (n = 3). The yeast that endured the highest concentration, R. mucilaginosa, however, resited only 12 hours in all concentrations. It is more likely that the defense mechanism of the yeast was not able to prevent further damage to its membrane as the time in contact with α-terpineol increased, it could also be that there was an enzymatic degradation to some level, or even that the death of the strain might be due to the production of toxic compounds by that same strain. The TLC results showed that the extracts from CMIB 46 (R. mucilaginosa) and CMIB 33 (L. elongisporus) could be interpreted as potentially promising results of the production of new compounds by the yeasts. Therefore, both yeasts were cultivated again, thus the analysis could be performed one more time. At last, the results for the consumption of α-terpineol by these two strains were rather inconclusive, mainly due to the low concentration of the samples. For future analysis, it is proposed the use of auxiliary techniques, such as gas chromatography coupled to mass spectrometer for greater sensitivity in the detection of these compounds.

Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR) As enzimas são catalisadores naturais de alto interesse biotecnológico. Esses biocatalisadores podem ser extraídos de tecidos animais, vegetais e de microorganismos, sendo as de origem microbianas as mais utilizadas. Existe um aumento mundial no consumo de enzimas industriais e os fungos filamentosos estão entre as principais fontes microbianas produtores destas enzimas. Neste trabalho foi avaliado o potencial enzimático de fungos isolados do solo da região de Ponta Grossa - PR, utilizando farelo de trigo como substrato. Para isso, realizou-se 3 etapas: seleção dos fungos, fermentações em frascos agitados e fermentação em biorreator. A seleção dos isolados foi realizado inoculando os fungos em placas de Petri contendo meio ágar suplementado com carboximetilcelulose (CMC) incubadas por 4 dias à 32ºC. Após o período de incubação, as placas foram reveladas utilizando o corante Vermelho do Congo 0,1% (p/v), para a verificação do halo de degradação enzimática. Em seguida foram determinados os índices enzimáticos (I.E). Com essa etapa foi possível selecionar 3 fungos com os melhores índices enzimáticos para a etapa de fermentação submersa sob agitação. A fermentação submersa foi realizada a 32 °C, pH 5,4 e agitação de 150 rpm. Os fungos foram avaliados quanto a produção de celulases. O isolado CMIB-174 apresentou uma maior atividade enzimática tanto para CMCase (0,032 UI/mL) quanto a FPase (0,060 UI/mL). Portanto, o isolado CMIB-174 foi escolhida para o teste em biorreator. Pode-se observar que o ensaio em biorreator favoreceu as atividades de CMCase e FPase com um aumento significativo de 433% e 146%, respectivamente. Porém, todas as linhagens utilizadas no presente trabalho, apresentaram baixas atividades enzimáticas quando comparadas a outros resultados obtidos na literatura. Enzymes are natural catalysts of high biotechnological interest. These biocatalysts can be extracted from animal, vegetable and microorganism tissues, with microbial origin being the most used. There is a worldwide increase in the consumption of industrial enzymes and filamentous fungi are among the main microbial sources producing these enzymes. In this work, the enzymatic potential of fungi isolated from the soil of the region of Ponta Grossa - PR was evaluated, using wheat bran as a substrate. For this, 3 stages were carried out: fungi screening, fermentation in agitated flasks and fermentation in a bioreactor. The screening was carried out by inoculating the fungi in Petri dishes containing agar medium and supplemented with carboxymethylcellulose (CMC) incubated for 4 days at 32ºC. After the incubation period, the petri dishes were developed using the Congo Red 0.1% (w/v) dye, to verify the enzyme halo. Then the enzyme indexes (I.E) were determined. With this step, it was possible to select 3 fungi with the best enzyme indexes for the submerged fermentation step in agitated flasks. Submerged fermentation was carried out at 32 °C, pH 5.4 and stirring at 150 rpm. Fungi were evaluated for cellulose production. The CMIB-174 strain showed a higher enzymatic activity for both CMCase (0.032 IU/mL) and FPase (0.060 IU/mL). Therefore, the CMIB-174 strain was chosen for the bioreactor test. It can be observed that the bioreactor assay favored the activities of CMCase and FPase with a significant increase of 433% and 146%, respectively. However, all strains used in the present study showed low enzymatic activities when compared to other results obtained in the literature.

O objetivo desta pesquisa foi a instalação, padronização e gestão de uma coleção de culturas microbiológicas na UTFPR/Ponta Grossa com envio dos dados das linhagens a Rede CMRP/Taxonline. O desenvolvimento do trabalho foi efetuado em 4 etapas, onde a princípio foi realizada uma pesquisa para estimar a quantidade de linhagens na UTFPR/PG, posteriormente as linhagens disponíveis foram depositadas e o sistema de gestão foi desenvolvido através de Termos de Depósito e de Retirada, Procedimentos Operacionais Padronizados (POP’s) e de uma planilha de armazenamento de dados. O último passo foi o envio dos dados para a disposição na Rede CMRP/Taxonline. A partir do levantamento realizado na UTFPR/PG estimou-se que 37,5% dos professores consultados possuíam linhagens para depósito imediato e que 88,9% dos professores que já utilizaram microorganismos em seus trabalhos, não encontraram linhagens para acesso dentro da instituição. Após a estruturação física do laboratório as linhagens foram coletadas e encaminhadas para o local e suas características identificadas e catalogadas em planilha eletrônica, ao final do trabalho foram depositados 149 micro-organismos, entre eles: 31 fungos, 55 leveduras e 63 bactérias. A coleção foi denominada internamente como: Coleção Microbiológica de Interesse Biotecnológico da UTFPR/Ponta Grossa com a sigla: CMIB-UTFPR/PG, sendo parte integrante da Rede Paranaense CMRP - Coleções Microbiológicas da Rede Paranaense. Para gestão da coleção foram desenvolvidos Termos de Depósito e de Retirada de Material Biológico e 7 POP’s, para descrição das atividades da coleção. O último passo foi o envio dos dados da planilha com a caracterização dos micro-organismos aos gestores da Rede CMRP/Taxonline oficializando a integração da CMIB na rede, e nos foi concedido os códigos das Coleções Microbiológicas da Rede Paranaense (CMRP) correspondente ao número oficial das linhagens microbiológicas na rede. The objective of this research was the installation, standardization and management of a collection of microbiological cultures in UTFPR / Ponta Grossa with transmission of data from the lines to the CMRP / Taxonline Network. The development of the work was carried out in 4 stages, in which a research was initially carried out to estimate the number of lineages in the UTFPR / PG, later the available lineages were deposited and the management system was developed through Deposit and Withdrawal Terms, Standard Operating Procedures (POPs) and a data storage worksheet. The last step was to send the data to the layout in the CMRP / Taxonline Network. From the UTFPR / PG survey, it was estimated that 37.5% of the teachers consulted had strains for immediate deposit and that 88.9% of the teachers who had already used microorganisms in their work did not find lineages for access within the institution. At the end of the study, 149 microorganisms were deposited, among them: 31 fungi, 55 yeasts and 63 bacteria. After the physical structure of the laboratory, the lines were collected and sent to the site and their characteristics were identified and cataloged in a spreadsheet. The collection was internally denominated as: Microbiological Collection of Biotechnological Interest of UTFPR / Ponta Grossa with the acronym: CMIB-UTFPR / PG, being an integral part of the Paranaense Network CMRP - Microbiological Collections of the Paranaense Network. For the management of the collection were developed Terms of Deposit and Withdrawal of Biological Material and 7 POPs, to describe the activities of the collection. The last step was the sending of data from the spreadsheet with the characterization of the microorganisms to the managers of the CMRP / Taxonline Network, officializing the integration of the CMIB in the network, and we were granted the codes of the Microbiological Collections of the Paranaense Network (CMRP) corresponding to the number of the microbiological lines in the network.

Orientadora : Drª Débora do Rocio Klisiowicz Coorientador : Drª. Vânia Aparecida Vicente Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 30/11/2017 Inclui referências Resumo: A pediculose, doença causada pelo artrópode Pediculus humanus capitis é considerada um problema de saúde pública, pois afeta milhões de pessoas em todo o mundo, no entanto, crianças em idade escolar são as mais acometidas. É de conhecimento popular que alguns indivíduos são mais suscetíveis à parasitose que outros, porém, fatores inerentes ao hospedeiro, que podem influenciar na suscetibilidade à essa doença não estão totalmente esclarecidos. Assim, o objetivo do presente estudo foi isolar e identificar a microbiota do couro cabeludo e analisar se determinadas caracteríscas da morfologia do cabelo (tipo, cor, comprimento, escamas e diâmetro) podem interferir na predisposição à doença. Para a análise da microbiota do couro cabeludo, 10 crianças com pediculose (grupo A) e 10 crianças sem pediculose (grupo B) foram analisadas. As amostras da microbiota do couro cabeludo foram coletadas através de swabs que foram friccionados na cabeça e acondicionados em meios de transporte Stuart. O isolamento da microbiota fúngica foi feito em Ágar Sabouraud (SBA) com tetraciclina e o isolamento bacteriano foi feito em ágar sangue. A identificação molecular foi realizada através de sequenciamento da região 16S e ITS do DNA ribossomal bacteriano e fúngico, respectivamente. Um total de 186 isolados foram obtidos sendo 35 bactérias e 40 fungos (grupo A) e 47 bactérias e 64 fungos (grupo B). Os resultados sugerem que a microbiota isolada pode estar envolvida na suscetibilidade à pediculose. Em relação à microbiota bacteriana, no grupo A, Staphylococcus captis foi significativamente diferente (P 0,05). No entanto, quando comparado os grupos etários, meninos com idades de 2-3 anos estavam mais infestados que as meninas. Palavras-chave: Piolho; cabelo; bactérias; fungos e prevalência. Abstract:Pediculosis, a disease caused by the arthropod Pediculus humanus capitis is considered a public health problem as it affects millions of people around the world. However, school children are the most affected. It is popular knowledge that some individuals are more susceptible to parasitosis than others, but factors inherent to the host that may influence the susceptibility to this disease are not well understood. In this context, the objective of the present study was to isolate and identify the scalp microbiota and to analyze if certain characteristics of hair morphology (scales, type, color, length and diameter) may interfere with predisposition to the disease. For analysis of the scalp microbiota, 10 children with pediculosis (group A) with 10 children without pediculosis (group B) were analyzed. Samples of the scalp microbiota were collected through swabs that were rubbed on the children's heads and packed into Stuart transport medium. Isolation of the fungal microbiota was done in Sabouraud Agar (SBA) with tetracycline and bacterial isolation was done on blood agar. Sequencing was done for the 16S and 18S region of the bacterial and fungal ribosomal DNA, respectively. A total of 186 isolates were obtained from group A, from these 35 bacteria and 40 fungi and for group B, 47 bacteria and 64 fungi were isolated. The results suggest that the isolated microbiota may be involved in pediculosis susceptibility. In relation to the bacterial microbiota, in group A, Staphylococcus capitis was significantly different (p 0.05). However, when compared to age groups, boys aged 2-3 years were more infested than girls. Keywords: Head lice; hair; bacterium; fungi and prevalence

Orientadora : Profª Drª Vânia Aparecida Vicente Coorientadora : Profª Drª Renata Rodrigues Gomes Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 04/02/2016 Inclui referências : f. 76-92 Resumo: As leveduras negras pertencentes à família Herpotrichiellaceae são microrganismos extremamente relevantes do ponto de vista ecológico e clínico. Esses organismos comuns sapróbios apresentam alta capacidade de adaptação e parecem apresentar um ciclo de vida composto e potencial de patogenicidade. No gênero Fonsecaea foram relatadas diferentes espécies associadas a hospedeiros humanos, animais e de fontes ambientais. Fonsecaea monophora é relatada como agente de cromoblastomicose com formação de corpos muriformes e agente de infecção cerebral. Buscando compreender a biologia e potencial de patogenicidade desta espécie, foi realizada sua análise genômica parcial e o desenvolvimento incial de um protocolo para caracterização carotípica do gênero. Para isto, o genoma parcial foi obtido utilizando a combinação de leituras de sequências provenientes das plataformas Illumina e Ion Proton. O draft de maior qualidade obtido apresenta tamanho de 34,21Mb, com 301 supercontigs e N50 de 268.916 pb. A partir do genoma parcial gerado, foi realizada a anotação automática e uma análise genômica preliminar. Para a caracterização cariotípica, podemos determinar o tiabendazol como agente bloqueador do desenvolvimento celular e estabelecer o protocolo para obtenção de protoplastos. Palavras-chave: Leveduras negras. Fonsecaea monophora. Anotação. Análise genômica. Cariótipo. Abstract: Black yeast belonging to Herpotrichiellaceae family are extremely relevant microorganisms ecological and clinical point of view. These common saprobes organisms have a high capacity to adapt and appear to have a life cycle compound and potential pathogenicity. In the genus Fonsecaea different species were reported related to human, animal and environmental sources hosts whose ecology seems to direct the evolution of clinical conditions. Fonsecaea monophora is reported as chromoblastomycosis agent with training muriformes bodies and brain infection agent. Trying to understand the biology and potential pathogenicity of this species, it was carried out partial genomic analysis and the initial development of a protocol for carotípica characterization of the genre. For this, the partial genome was obtained using the combination of readings from sequences of Proton Ion and Illumina platform. The higher quality obtained draft has size 34,21Mb with 301 supercontigs and N50 of 268,916 bp. From the generated partial genome automatic annotation and preliminary genomic analysis was performed. For karyotype characterization, we can determine thiabendazole as blocking agent of cell growth and establish the protocol for protoplasts. Key words: Black yeasts. Fonsecaea monophora. Annotation. Genomic analysis.Karyotype.

Orientadora : Profª Drª Vânia Aparecida vicente Co-orientadora : Profª Drª Mariangela Hungria Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 22/03/2016 Inclui referências : f. 84-91 Resumo: O Brasil é um país, em grande parte, sustentado pela agricultura, que ocupa milhões de hectares no território nacional, onde a região do Cerrado representa a principal cultivada e a região sul a mais antiga em cultivo. A introdução da agricultura causa perturbação do solo, resultando em diferenças em relação aos solos nativos; contudo, existem manejos com menor ou maior grau de alteração, como o plantio direto (PD) e o plantio convencional (PC), respectivamente. No entanto, ainda existem poucas informações sobre os impactos causados nas comunidades microbianas por diferentes manejos do solo e das culturas, que agora podem ser reveladas pelo uso de novas tecnologias, como a metagenômica, que detecta microrganismos independe do seu cultivo em meios de cultura. Neste trabalho, foram estudadas duas regiões agrícolas do Brasil: uma no norte do Paraná, Região Sul, e outra nos Cerrados, no Distrito Federal. A partir do solo amostrado em cada região, o DNA foi extraído e sequenciado, resultando em milhões de sequências em cada estudo. Para as análises taxonômicas e funcionais as sequências foram submetidas ao servidor online MG-RAST e para as análises estatísticas foram submetidas ao programa STAMP. Nos solos do Norte do Paraná, os dados metagenômicos entre diferentes manejos de solo (PD e PC), e das culturas (rotação e sucessão) foram comparados, e foram constatadas diferenças consideráveis na diversidade taxonômica, mas de menor magnitude na diversidade funcional, indicativo de redundância de vias metabólicas. Os solos sob PD apresentaram maior quantidade de sequências de metabolismo de compostos aromáticos, que podem auxiliar na degradação de pesticidas, enquanto que solos sob PC apresentaram grande quantidade de sequências de metabolismo de carboidratos, que podem estar relacionada à menor oferta de nutrientes nesse solo. No Distrito Federal, os dados dos solos agrícolas foram comparados com uma área nativa do Cerrado, identificando se a predominância de algumas ordens bacterianas, tais como, Rhizobiales e Burkholderiales, em solos agrícolas (PD e PC), em comparação com solos nativos do Cerrado, os quais apresentaram maior abundância dos gêneros Rhizobium, Azospirillum, Xanthomonas, Pseudomonas e Acidobacterium. O Cerrado também apresentou maior diversidade de subsistemas funcionais. Os resultados obtidos neste estudo indicam que a introdução da agricultura em uma área nativa, e o uso de manejos do solo menos conservacionistas provocam profundo impacto principalmente na diversidade taxonômica dos microrganismos do solo. Abstract: Brazil is a country largely sustained by agriculture, which occupies millions of hectares, with the Cerrado representing the main cropping region and the southern region the most traditional. Agriculture introduction causes soil disturbance, resulting in differences in relation to the native soil; however, there are managements with greater or lesser degree of disturbance, such as no-tillage (NT) and conventional tillage (CT), respectively. However, there is still little information about impacts on soil microbial communities by different soil and agricultural managements, which can now be revealed with the use of new technologies, such as the metagenomics, which allows the detection of microorganism independently of their growth in culture media. In this thesis, we studied two agricultural regions in Brazil, one in the north of Paraná, southern Brazil and the other in the Federal District, in the Cerrado biome. The soil was collected from each region, DNA was extracted and sequenced, resulting in millions of sequences in each study. For taxonomic and functional analyzes sequences were submitted to the online server MG-RAST and for statistical analyzes the data were submitted to the STAMP program. In Paraná's soils, different soil (NT and CT) and crop (rotation and sucession) managements were compared and significant differences were observed in taxonomic diversity, but lower in magnitude on the functional analysis, indicating metabolic redundancy. The soils under NT were more abundant in sequences of the aromatic compounds metabolism, that could help in pesticide degradation, while soils under CT showed higher abundance of sequences of the carbohydrate metabolism, which might be related to the lower supply of nutrients. In the Cerrado, we compared the population of cropped soils with an undisturbed soil covered with native vegetation. We identified higher abundance of some bacterial orders, such as Rhizobiales and Burkholderiales in agricultural soils (NT and CT), while the native Cerrado showed greater abundance of Rhizobium, Azospirillum, Xanthomonas, Pseudomonas and Acidobacterium genus. The undisturbed Cerrado was also more abundant in the variety of functional subsystems. The results obtained in our study shown that the introduction of agriculture and the use of less conservationists practices deeply affect soil microbial community, especially the taxonomic diversity.