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Trabajo presentado en el 4th International Conference of the IUFRO Working Party 2.09.02: Somatic Embryogenesis and Other Vegetative Propagation Technologies. Development and application of vegetative propagation technologies in plantation forestry to cope with a changing climate and environment, celebrado en Buenos Aires (Argentina), del 19 al 23 de septiembre de 2016

Several limitations of somatic embryogenesis in mature and selected hardwood tree species hinder application of the process for mass clonal propagation. After many years of research, our understanding of the basic aspects of the process is still very limited. The objective of the present review is to highlight some difficulties in the different steps of somatic embryogenesis in adult hardwood trees. The experimental models, applied to species of the family Fagaceae, will be defined. These models could be used to increase the propagation capacity by applying both organogenesis and somatic embryogenesis together. Application of these experimental models to the study of basic aspects of embryogenesis will be highlighted. The potential use of somatic embryogenesis as a rejuvenation procedure for mature hardwood trees will also be discussed.

Trabajo presentado en la XI Reunión de la Sociedad Española de Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales, celebrada en Valencia (España), los días 3 y 4 de septiembre de 2015, La encina, Quercus ilex L., una de las Fagáceas más representativas del bosque Mediterráneo, sufre un decaimiento progresivo, debido entre otras causas, a la enfermedad conocida como "la seca". Esta problemática ha provocado una reducción de sus masas forestales originando un problema ambiental grave que amenaza su sostenibilidad. El objetivo del trabajo es el establecimiento y mantenimiento in vitro de cultivos de encina, mediante la proliferación de yemas axilares y posterior utilización de hojas y ápices de los brotes micropropagados como explantos iniciales para inducir embriones somáticos (ES), como vía eficaz para la multiplicación rápida de individuos seleccionados. Se han recogido estacas (25-30 cm) de la copa de ocho encinas seleccionadas en Quintos de Mora (Toledo), genotipos Q2, Q3, Q6, Q7, Q8 y Q10 y en el Encín (Alcalá de Henares), genotipos E00 y E2. Las estacas se trataron con fungicida y se sometieron a brotación forzada en condiciones controladas. Los nuevos brotes se esterilizaron con aplicación sucesiva de etanol de 70% y diferentes concentraciones/tiempos de hipoclorito sódico; seguidamente se seccionaron segmentos nodales que fueron establecidos in vitro. El proceso de esterilización fue crítico, siendo necesario la eliminación del etanol y el uso de concentraciones/tiempos bajos de hipoclorito (0.3% de cloro libre 2-3 min.) para conseguir el crecimiento in vitro de estos genotipos. Las tasas de contaminación oscilaron entre 0-8%. Según el genotipo, entre 11-70% de los explantos respondieron positivamente formando brotes. La estabilización de los cultivos se ha logrado en seis de los ocho genotipos seleccionados permitiéndonos utilizarlos como fuente de explantos para la inducción embriogénica. Los primeros estudios realizados con material del Q3 y Q10 mostraron la posibilidad de inducir ES en ápices caulinares cultivados en medios sin reguladores de crecimiento o adicionados con AIA o ANA en combinación con BA, con tasas del 2-4% de inducción., Se agradece al Dr. M. Toribio el suministro del material vegetal utilizado en este trabajo. Este trabajo fue parcialmente financiado por el MINECO (España) mediante el proyecto AGL2013-47400-C4-3R.

La obtención de plantones de robles y encinas genéticamente diversos y resistentes a las enfermedades está recibiendo cada vez más atención en los pro-gramas de restauración forestal, dada la importancia económica y ecológica de es-tas especies en nuestro país. Sin embargo, los métodos de reproducción y mejora tradicionales aplicados a estos árboles resultan muy poco eficaces para lograr tal propósito debido a las bajas tasas de germinación que presentan las bellotas. En este sentido, las herramientas biotecnológicas disponibles hoy en día, entre las que se incluyen los sistemas de multiplicación de plantas in vitro (micropropagación), revisten un enorme interés. Uno de los avances más destacables ha sido la embriogénesis somática

Trabajo presentado en el Biospain 7th International Meeting on Biotechnology, celebrado en Santiago de Compostela (España), del 24 al 26 de septiembre de 2014, European chestnut or sweet chestnut (Castanea sativa Mill.) is a tree species with a wide distribution and an important economical role in Europe. In addition to its original productive role, European chestnut stands may play an important role in wildlife, rural tourism, recreational areas, and protection from erosion and landscape. European chestnut is seriously threatened by fungal attacks: ink disease, caused by Phytophthora spp. which penetrates through the roots of the tree blocking the vascular system and blight disease, caused by the fungus Cryphonectria parasitica which attacks the trunk and branches of the tree. The production of disease-resistant trees by conventional breeding is based on the Asian species C. mollissima Blume and C. crenata Sieb. and Zucc. both of which exhibit natural tolerance/resistance to the diseases. Programs for developing inter-specific hybrids with European chestnut have been carried out but this approach requires about 25-30 years to obtain resistant trees exhibiting the European phenotype. One alternative is the over-expression of genes conferring resistance through the production of transgenic trees. Specific genes for resistance to ink disease are not yet identified but it is suspected that ink disease resistance appears to be conferred by a single gene while blight resistance is conferred by more than one gene. An integrated web-based resource for members of the Fagaceae family, including Castanea (http://www.fagaceae.org), disseminates genomic data which are being posted as they become available and thousands of genes have been isolated. It is expected that in the coming years genes directly related to chestnut diseases would be identified to facilitate the production of resistant trees. Alternatively, the use of pathogenesis-related (PR) proteins, which play a major role in natural defense against pests and pathogens, would be an interesting alternative approach. Among these, the PR-5 family of proteins (thaumatin-like proteins,TLP) cause transmembrane pore on fungal plasma membranes promoting osmotic rupture. Chitinases, belonging to the PR-3 family of proteins, hydrolyze the ß-1, 4 glycosidic bonds that link the N-acetylglucosamine residues of chitin and play a direct role in plant defense by hydrolyzing chitin. We are using these proteins in order to obtain resistant chestnut trees. Genetic transformation requires a solid and repetitive somatic embryogenesis procedure able to regenerate whole plants. In a previous work, we have used an Agrobacterium-mediated transformation procedure already successfully developed for European chestnut using somatic embryos as target material and marker genes. The last results achieved on somatic embryogenesis and genetic transformation with genes enhancing disease resistance in European chestnut trees will be highlighted and constitutes the objective of the present work.

Trabajo presentado en la 3rd International Conference of the IUFRO Unit 2.09.02 : Woody plant production integrating genetic and vegetative propagation technologies, celebrado en Vitoria-Gasteiz (España), del 8 al 12 de septiembre de 2014, Among North American oak species, Q. rubra (red oak) is of particular ecological and economic importance, and the development of a procedure for inducing somatic embryogenesis (SE) would be of great interest for accelerating red oak improvement programs. The objectives of this study were to induce SE in explants from young trees of Q. rubra and to establish the culture conditions for reliable embryo proliferation of embryogenic lines by secondary embryogenesis in order to obtain suitable material for plant regeneration. Axillary shoot proliferation cultures, established from three 7-year-old Q. rubra trees, were used as a source of both leaf explants and shoot apex explants (1.5-2.0 mm long). Induction of somatic embryos was achieved by a culture procedure including the following steps: (a) successive culture of explants in Murashige and Skoog medium supplemented with naphthaleneacetic acid (21.48 µM, NAA) and 6-benzyladenine (2.22 µM, BA) for 8 weeks; (b) transfer onto fresh medium of the same composition but with lower concentrations of NAA and BA (0.54 µM and 0.44 µM, respectively) for a further 4 weeks; and (c) culture of explants in plant growth regulator-free medium for another 8 weeks. SE was successfully induced in all three red oak genotypes, with frequencies ranging from 2.0% to 3.3%, and embryogenic lines were established and maintained by repetitive embryogenesis. To promote embryo proliferation and development of secondary embryos up to the cotyledonary stage, nodular embryogenic structures (0.2 mg fresh weight) and torpedo-stage embryos (0.8 mg fresh weight) were used as embryogenic explants and were subcultured on a different embryo proliferation medium containing 20 µM silver thiosulphate (STS). Secondary embryogenesis was promoted by use of nodular structures as embryogenic explants and culture in medium containing 0.4% charcoal, yielding an induction rate of 79.2%, in contrast to the 48.8% achieved with torpedo-embryo explants. Embryo production was also improved with the proliferation medium containing 3% sucrose, in which well-formed and easily detachable cotyledonary-shaped embryos were formed. Somatic embryos were germinated on medium supplemented with 0.44 µM BA and 20 µM STS, yielding 40% embryo germination and 11% plantlet conversion., The authors thank Foresta Mantenimiento de Plantaciones for kindly providing the plant material. This research was partially funded by Ministerio de Economía y Competitividad (Spain), through project AGL2013-47400-C4-3-R.

Trabajo presentado en la 3rd International Conference of the IUFRO Unit 2.09.02 : Woody plant production integrating genetic and vegetative propagation technologies, celebrado en Vitoria-Gasteiz (España), del 8 al 12 de septiembre de 2014, Castanea sativa Mill.(sweet chestnut, European chestnut) is a tree species with a wide distribution and an important economic role in Europe, covering an area of over 2 million hectares (Conedera et al. 2004). The ink disease (caused by Phytophthoraspp.) and chestnut blight (caused by Cryphonectriaparasitica) are the two most important diseases that affect European chestnut. Genetic transformation of the disease-prone Castanea species with antifungal or antimicrobial genes to increase disease resistance or tolerance could be the initial step towards a reliable and complementary biotechnological alternative to conventional breeding efforts. The most widely used approach is the overexpression of pathogenesis-related (PR) proteins such as chitinases and thaumatin-like proteins. PR proteins are de¿ned as proteins encoded by the host plant induced under pathological or related conditions (Veluthakkal and Dasgupta 2010). In the present work the objective was to obtain chestnut somatic embryos and plants that overexpress chestnut chitinase (CsCh3) and thaumatin-like protein (CsTL1) genes. Explants consist of small clumps of two to three somatic embryos in globular or early-torpedo stages were co-cultured for 5 days with Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 harbouring with pK7WG2D-CsCh3 or pK7WG2D-CsTL1 binary vectors. Each plasmid also contains the neomycin phosphotransferase (nptII) selective gene and the green fluorescent protein (egfp) reporter gene. Vectors were introduced to EHA105 separately so each Agrobacteriumclonehad only one vector. Co-transformation was performed by mixing equal concentrations of two Agrobacteriumclones transformed with each vector. The fluorescent protein simplified and improved the evaluation of transformation events as compared with the GUS assay used in previous protocols in chestnut transformation. The transformation efficiency, determined in basis to the fluorescence of surviving explants, was clearly genotype-dependent and the rates were 33% for CI-9 line and 1% for CI-3 line. A total of 34 independent transformed lines were obtained. The presence of both CsTL1 and CsCh3 genes in genomic DNA was determined by PCR. The results reported in the present work on the overexpression of two native genes into chestnut somatic embryos could be considered as a first step toward the production of fungal-diseases tolerant cisgenic chestnut plants., The authors gratefully acknowledge Dr. I. Allona and Dr. C. Aragoncillo for providing the CsCh3 and CsTL1 genes. This research was partially funded by Xunta de Galicia (Spain) through the project 09MRU002400PR.

Trabajo presentado en el ANQUE ICCE BIOTEC, Science the key for a better life, celebrado en Madrid (España), del 1 al 4 de julio de 2014, Chestnut blight, caused by the ascomycete fungus Cryphonectria parasitica (Murr.) Barr, is one of the major diseases of chestnut, affecting at both Castanea dentata (Marsh) Borkh (American chestnut) and C. sativa (MilI.) (European chestnut). At present, specific genes conferring resistance to blight disease are not knO\vn. An altemative to obtain resistant trees ,vould be the overproduction of pathogenesis-related (PR) proteins which play maj or role in natural defense against pests and pathogens. Among these, chitinases, belonging to the PR-3 family ofproteins, hydrolyze the p-l, 4 glycosidic bonds that link the N-acetylglucosarnine residues of chitin and playa direct role in plant defense by hydrolyzing chitin [1]. In European chestnut, an endochitinase of 32 kD (CsCh3), purified from mature cotyledons, showed in vitro antifungal properties \Vhen assayed against Trichoderma viride [2]. The aim of the present work is to achieve the overexpression of the native chitinase-like protein CsCh3 gene in embryogenic cultures of European chestnut via Agrobacterium-mediated transformation in order to obtain chestnut plants "ith increased potential resistance/tolerance to blight disease. For the transformation experiments, explants consist of small clumps of two to three somatic embryos in globular or early-torpedo stages form three chestnut embryogenic lines \Vere co-cultured for 5 days v.;th Agrobacterium tumefaciens strain EHAI05 harboring the binary plasmid pK7WG2D-Ch3. This plasmid also contains neomycin phosphotransferase 11 (nptlJ) gene as the selectable marker gene for kanamycin resistance and the green fluorescente protein gen (gfp) as reporter marker gene. The transformation efficiency, determined in basis on the fluorescence of surviving explants, ,vas clearly genotype-dependent ranging from 20% in CI-9 line to 4.2% in the C12-Hl line. A total of 175 independent transformed lines were obtained. The presence and integration of CsCh3 gene in genomic DNA \Vas determined by PCR and Southem blot analyses and CsCh3 gene expression \Vas evaluated by qPCR. Successful embryo proliferation \Vas achieved in all of the transgenic lines regenerated and plants \Vere recovered after maturation and germination of transformed somatic embryos. No phenotypic differences \Vere found ,,,ith relation to control plants, suggesting no potential cytotoxic effects of the GFP. The results reported in the present work on the oyerexpression of a native gene into chestnut somatic embryos could be considered as a first step toward the production of blight-disease tolerant chestnut plants. These plants should be denominated "cisgenic" because an intact native gene derived from European chestnut has been used., This research was partially funded by Xunta de Galicia (Spain) through the project 09MRU002400PR.

Trabajo presentado en la 3rd International Conference of the IUFRO Unit 2.09.02 : Woody plant production integrating genetic and vegetative propagation technologies, celebrado en Vitoria-Gasteiz (España), del 8 al 12 de septiembre de 2014, This research was partially funded by Ministerio de Economía y Competitividad (Spain), through project AGL2013-47400-C4-3-R.

Trabajo presentado en la 3rd International Conference of the IUFRO Unit 2.09.02 : Woody plant production integrating genetic and vegetative propagation technologies, celebrado en Vitoria-Gasteiz (España), del 8 al 12 de septiembre de 2014

[ES] Por vez primera se ha abordado el estudio de la sobre-expresión de los genes CsTL1 y CsCh3, aislados de castaño y que codifican una proteína tipo taumatina y una quitinasa, respectivamente, con el fin de regenerar plantas de castaño que muestren tolerancia o resistencia a las enfermedades de la tinta y del chancro, causadas por los hongos Phytophthora cinnamomi Rands, y Cryphonectria parasitica (Murr.) Barr utilizando para ello la transformación genética de líneas embriogénicas de castaño europeo. Los genes se clonaron en el vector pK7WG2D que contiene el gen marcador de selección neomicina fosfotransferasa (nptII) y el gen reportero de la proteína verde fluorescente (gfp). La eficiencia de la transformación con el gen CsTL1 fue dependiente del genotipo y varió del 32,5% en la línea CI-9 al 7,1% en la línea CI-3. Se obtuvieron un total de 126 líneas independientes transformadas. También la eficacia de la transformación con el gen CsCh3 varío con el genotipo, alcanzando el 25,0% en la línea CI-9 y el 4,2% en la línea C12- H1, obteniéndose un total de 175 líneas transgénicas independientes. La presencia e integración de ambos genes en el ADN genómico se confirmó mediante PCR y Southern blot. Mediante qPCR se demostró que la expresión de CsTL1 fue 13.5 veces mayor en una línea transgénica comparada con su correspondiente línea no transformada. Se regeneraron plantas transgénicas de castaño después de las etapas de maduración y germinación de los embriones somáticos transformados. Las plantas completan su desarrollo en un invernadero específicamente diseñado para el crecimiento de plantas transgénicas y se han iniciado los ensayos de resistencia a las enfermedades de las plantas regeneradas, [EN] The availability of a system for direct transfer of anti fungal candidate genes into European chestnut (Castanea sativa) would offer an alternative approach to conventional breeding for production of chestnut trees tolerant to ink disease caused by Phytophthora spp. and blight disease caused by Cryphonectria parasitica (Murr.) Barr. For the first time, a chestnut thaumatin-like protein gene (CsTL1) and a chitinase (CsCh3), both isolated from European chestnut cotyledons, have been overexpressed in three European chestnut somatic embryogenic lines. Transformation experiments have been performed using an Agrobacterium tumefaciens vector harbouring the nptII selectable and the green fluorescent protein (gfp) reporter genes. The transformation efficiency for CsTL1 was clearly genotype-dependent and ranged from 32.5% in the CI-9 line to the 7.1% in the CI-3 line. A total 126 independent transformed lines were obtained. A similar pattern has been recorded for CsCh3: 25.0% in the line CI-9 and 4.2% in the line C12-H1 and a total number of 175 transgenic lines were recorded. The presence and integration of chestnut genes in genomic DNA was confirmed by PCR and Southern blot analyses. qPCR revealed that CsTL1 expression was up to 13.5 fold higher in a transgenic line compared with its corresponding untransformed line. Transgenic plants were regenerated after maturation and germination of transformed somatic embryos which were acclimatized and grown in greenhouse. Analyses of tolerance/resistance to the fungal diseases on these plants are under way.

Trabajo presentado en la X Reunión de la Sociedad Española de Cultivo In Vitro de Tejidos Vegetales, celebrada en Zaragoza (España), del 22 al 24 de octubre de 2013, El castaño (Castanea sativa) es una especie forestal de gran valor económico y cultural que ha sufrido el ataque devastador de varias enfermedades fúngicas causadas por Phytophthora cinnamomi y P. cambivora (tinta), y Cryphonectria parasitica (chancro). Aunque el mecanismo exacto de acción de genes que codifican para proteínas del tipo taumatina se desconoce, en algunas especies en las que se han obtenido plantas transgénicas que expresan estos genes, éstas exhiben mejores niveles de resistencia a hongos patógenos o retraso en el desarrollo de síntomas en comparación con las plantas control. En este trabajo se abordan los siguientes objetivos:1) transformación genética del castaño con el gen CsTL1 (aislado en castaño) y que codifica una taumatina y 2) evaluación del nivel de resistencia a la tinta de las plantas transgénicas obtenidas. Embriones somáticos de castaño de tres líneas embriogénicas (CI-3, CI-9 y C12-H12) se cocultivaron con la cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens que está transformada con el vector pK7WG2D-TAU. Además del gen CsTL1, el vector contiene el gen de la neomicina fosfotransferasa (NPTII) y el gen de la proteína verde fluorescente (GFP). Se obtuvieron un total de 126 líneas transformadas, de las cuales 18 corresponden al genotipo CI-3, 27 al genotipo C12-H1 y 81 al genotipo CI-9. La presencia y expresión del gen de la taumatina en las diferentes líneas que resultaron GFP positivas se determinó mediante PCR, Southern blot y qRT-PCR. En base a los resultados de la qRT-PCR se han seleccionado tres líneas transgénicas que presentaban un incremento de 2 a 4 veces del nivel de expresión del gen de la taumatina. Tras las etapas de germinación de los embriones somáticos y de proliferación y enraizamiento de los brotes, éstos se transfieren a un medio WPM líquido con puente de papel inoculado con zoosporas de P. cinnamomi para los ensayos de resistencia in vitro (Cuenca et al. 2009). El grado de resistencia o susceptibilidad a la enfermedad se determinó en función del tiempo transcurrido para producir el 100% de la mortalidad en plantas transgénicas, en plantas no transformadas, en plantas de C. sativa (control susceptible externo) y en plantas de C. crenata (control resistente). Los primeros ensayos indican que existe una correlación entre los niveles de expresión y el tiempo de supervivencia, observándose que las líneas CI-3-TAU3 y CI-3-TAU4 que presentan unos mayores niveles de resistencia a la tinta son las que muestran unos mayores niveles de expresión., Los autores agradecen al prof. Cipriano Aragoncillo y a la prof. Isabel Allona (ETSI Montes, Madrid) la cesión del gen CsTL1. Se agradece a Mª José Cernadas Cernadas su ayuda. Trabajo parcialmente financiado por la Xunta Proyecto 09MRU002400PR.

Trabajo presentado en la X Reunión de la Sociedad Española de Cultivo In Vitro de Tejidos Vegetales, celebrada en Zaragoza (España), del 22 al 24 de octubre de 2013, Las poblaciones de castaño europeo y americano han sido devastadas por el ataque de dos enfermedades fúngicas causadas por Phytophthora cinnamomi y P. cambivora (tinta) y Cryphonectria parasitica (cáncer o chancro). La transformación genética podría ser una herramienta complementaria a los programas de mejora convencional con la introducción de genes que puedan incrementar la resistencia a dichas enfermedades. Al no conocerse los mecanismos de resistencia a ambas enfermedades la transformación ha de hacerse con genes no específicos que puedan conferir algún tipo de resistencia a la entrada o al movimiento de los patógenos dentro del árbol (Connors y col., 2002), como pueden ser genes tipo osmotina y quitinasa. Las quitinasas, enzimas hidrolíticas producidas por las plantas en respuesta a una infección fúngica, actúan degradando la quitina de los hongos con pared celular como es el caso de Cryphonectria parasitica. El objetivo del presente trabajo ha sido obtener castaños con resistencia/tolerancia al chancro transformado embriones somáticos con el gen CsCh3, aislado en castaño, y que codifica una endoquitinasa (Allona y col., 1996). Esta proteína se ha comprobado que posee actividad antifúngica in vitro para Trichoderma viride (Collada y col., 1992)., Esta investigación ha sido financiada parcialmente por la Xunta de Galicia (Proyecto 09MRU002400PR).

Trabajo presentado en la X Reunión de la Sociedad Española de Cultivo In Vitro de Tejidos Vegetales, celebrada en Zaragoza (España), del 22 al 24 de octubre de 2013, En la mayoría de los sistemas de embriogénesis somática de Angiospermas, el mantenimiento y proliferación de las líneas embriogénicas se lleva a cabo mediante embriogénesis secundaria en medio semisólido. Durante esta etapa, en diferentes especies de Quercus es frecuente la formación de masas proembriogénicas (PEMs) que se multiplican de forma recurrente y que ocasionalmente producen embriones cotiledonares. El objetivo de este trabajo es optimizar la etapa de proliferación incrementando el número y la calidad de los embriones somáticos (ES) para lograr un mayor rendimiento en la producción de plantas tras la etapa de germinación. Se han utilizado líneas embriogénicas establecidas a partir de explantos foliares derivados de árboles adultos de Q. robur, Q. alba, Q. bicolor, y Q. rubra, y de amentos de Q. ilex, que se mantienen en medio basal de Murashige y Skoog (1962) adicionado con 500 mg/L de hidrolizado de caseína y 0,6% de agar. Se evaluó el efecto de reguladores de crecimiento, carbón activo (0,4%; CA), tiosulfato de plata (20µM; STS) y diferentes carbohidratos (3% ó 6% sacarosa, 2% glucosa) sobre las tasas de producción de ES y su estado de diferenciación e individualización. En las líneas de Q alba, Q rubra y Q ilex, con tendencia a formar PEMs como forma de embriogénesis repetitiva, la adición de CA y STS favoreció la histodiferenciación de los ES incrementando el número de embriones cotiledonares así como su individualización con respecto a los medios con/sin reguladores y sin CA, donde los ES tienden a desarrollarse fusionados formando grupos compactos. En general, la adición de STS redujo la formación de PEMs, como en el caso de Q. alba en el que el 25% y 75% de los explantos generan de 9-16 PEMs por explanto en medios con y sin STS, respectivamente. La concentración de sacarosa no influyó en el número de ES cotiledonares, aunque afectó su morfología, incrementando el tamaño y duplicando el porcentaje de embriones opacos en medios con 6% sacarosa, lo que sugiere un mayor nivel de diferenciación. La adición de 2% glucosa en Q.ilex no incrementó el número de ES, pero mejoró el desarrollo de los cotiledones. En las líneas de Q. robur y Q. bicolor, en las que la embriogénesis repetitiva ocurre con diferenciación de ES cotiledonares y escasa formación de PEMs, el medio con CA, STS y 6% sacarosa promovió la diferenciación de los embriones, al mostrar mayor tamaño, cotiledones opacos y mejor individualización, características que los hacen más adecuados para las etapas de maduración-germinación., El trabajo ha sido parcialmente financiado por la Xunta de Galicia (09MRU002400PR) y por el MINECO (AGL2010-22292-C03-03)

Trabajo presentado en la XI Reunión de Biología Molecular de Plantas, celebrada en Segovia (España),del 14 al 16 de junio de 2012

Trabajo presentado en la 2nd International Conference of the IUFRO WORKING PARTY 2.09.02: Somatic Embryogenesis and Other Vegetative Propagation Tecnhologies, celebrada en Brno (República Checa) del 25 al 28 de junio de 2012

Trabajo presentado en la 2nd International Conference of the IUFRO WORKING PARTY 2.09.02: Somatic Embryogenesis and Other Vegetative Propagation Tecnhologies: Integrating vegetative propagation, biotechnologies and genetic improvement for tree production and sustainable forest management, celebrada en Brno (República Checa) del 25 al 28 de junio de 2012

Trabajo presentado en la 2nd International Conference of the IUFRO WORKING PARTY 2.09.02: Somatic Embryogenesis and Other Vegetative Propagation Tecnhologies, celebrada en Brno (República Checa) del 25 al 28 de junio de 2012, Somatic embryogenesis is a powerful method of tree regeneration that potentially offers an efficient system for mass clonal propagation, germplasm conservation and genetic improvement (Vieitez et al. 2012). Somatic embryos develop through a sequence of stages associated with morphological and biochemical changes related to genomic activity. Reprogramming of the current gene expression pattern of differentiated somatic cells is required for cellular dedifferentiation and the acquisition of embryogenic competence of certain responsive cells to allow them to establish new development programmes. This developmental switching involves activation and repression of specific genes that confer on somatic cells the ability to initiate the embryogenic pathway (Chugh and Khurana, 2002). Moreover, the different developmental stages of somatic embryos are also controlled by the temporal expression of specific genes. However, the molecular mechanisms underlying the switch of the somatic cell fate towards embryogenic competence and the regulation of embryo development remain unclear. In our laboratory, somatic embryos have been induced from different types of oak and chestnut material, allowing the establishment of different clonal embryogenic lines which had been maintained by secondary embryogenesis (Corredoira et al. 2003; Toribio et al. 2004; Valladares et al. 2006). The induction system and the different embryogenic lines are highly valuable for studying the molecular events that control the onset and development of somatic embryos. To study the gene expression during somatic embryo histodifferentiation, embryos at the globular, torpedo and cotyledonary stage were collected from proliferating cultures. In addition, leaf explants cultured following the somatic embryo induction procedure were used to examine the gene expression during early stages of somatic embryo initiation. The objective of this study was to analyse the spatio-temporal expression of four genes (SCL1, ERF1, SERK-like and CPE), associated with morphogenetic processes in oak and chestnut, which have been isolated by our research group. Gene expression analysis has been carried out by qPCR and in situ hybridization (Vielba et al. 2011). The SCL1 gene encodes a GRAS family transcription factor (Sanchez et al. 2007), the ERF1 gene belongs to the AP2/ERF family, the SERK-like gene encodes a protein containing characteristics domains of the SERK proteins, and the CPE gene encodes for a glycine rich protein (Gil et al. 2003). In general, we found not fundamental differences in the expression pattern of each gene between chestnut and oak somatic embryos. However, some differences in the gene expression profiles were observed among different embryogenic lines that could be related to their embryogenic potential. The CPE gene was abundantly expressed in very early stages of somatic embryos, being developmentally regulated during somatic embryogenesis. The SCL1 and SERK-like transcripts also accumulated at the highest levels in globular stage somatic embryos, being down-regulated during embryo development. Transcript levels of ERF1 increased during embryo development, and the highest levels were detected in cotyledonary somatic embryos. In situ hybridization experiments revealed the presence of high mRNA levels of QrCPE, QrSCL1, QrSERK-like and QrERF1 in oak proembryogenic structures originated during the induction process. Therefore, these genes seem to be associated with embryo induction in oak. In addition, initial experiments showed that each gene exhibit a distinct tissue-specific expression at different stages of embryo development. Our results indicate that these four genes participate in the induction and development processes of somatic embryos in oak and chestnut. Further experiments are now being carried out in order to better characterize the expression pattern and regulation of these genes and to elucidate their possible role during somatic embryogenesis., This work was funded by the Xunta de Galicia (10MRU00033PR)

Trabajo presentado en la Reunión de Transferencia de Tecnología, celebrada en Aranjuez (España) los días 25 y 26 de enero de 2012

Trabajo presentado en la IX Reunión de la Sociedad Española de Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales (2011), celebrada en Puerto de la Cruz, Tenerife (España), del 26 al 29 de abril de 2011, El uso de la embriogénesis somática repetitiva permite la proliferación de embriones somáticos y el mantenimiento del potencial embriogénico. En este estudio se investigaron los efectos de los reguladores del crecimiento (auxinas y/o citoquininas] del medio de proliferación de embriones y del sistema de cultivo (medio semisólido o estándar frente a inmersión temporal] con el fin de mejorar las tasas de multiplicación y la calidad de los embriones somáticos de dos líneas embriogénicas de Quercus robur derivadas de árboles adultos (San-José et al.. 20101· Los reguladores del crecimiento tuvieron un efecto significativo en el proceso de embriogénesis repetitiva, obteniéndose mayores tasas de multiplicación (en base al número total de embriones y número de embriones en fase cotileclonar] con el medio suplementado con benciladenina (0.44 !-1M]mientras que la producción de embriones se reclujo significativamente cuando el medio contenía ácido naftalenacético (0,27 !-1M]como único regulador. Los sistemas de inmersión temporal (TIS] constituyen un método eficaz para la automatización de la embriogénesis somática (Etienne y Berthouly, 2002] y su aplicación a los sistemas embriogénicos de roble se desarrolló en este estudio. En los experimentos de proliferación embriogénica en condiciones de TIS se evaluó la aplicación de cuatro ciclos con inmersiones de un minuto cada 6, 8, 12 Y24 horas, comparándolas con el cultivo en medio semisólido. En general. la inmersión temporal mejoró la proliferación y la calidad de los embriones somáticos. Los ciclos de inmersión de un minuto cada B o 12 horas resultaron ser los que produjeron una mayor sincronización del proceso. con una producción aproximada del 90% de los embriones somáticos en fase cotiledonar, junto con un incremento de la biomasa total y de la tasa de multiplicación. También se observó un efecto genotípico en la respuesta proliferativa de ambas líneas embriogénicas tanto con el sistema de cultivo estándar como con el sistena de inmersión temporal. Los embriones proliferados mediante el sistema de inmersión temporal mantuvieron la capacidad germinativa. obteniéndose tasas de conversión en plántula similares al método estándar., R. Mallón es investigador postdoctoral contratado del programa JAE-Ooc (CSIC).Esta investigación ha sido parcialmente financiada por la Xunta de Galicia mediante el proyecto 09MRU002400PR .

Trabajo presentado en la IX Reunión de la Sociedad Española de Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales (2011), celebrada en Puerto de la Cruz, Tenerife (España), del 26 al 29 de abril de 2011

Trabajo presentado en la IX Reunión de la Sociedad Española de Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales (2011), celebrada en Puerto de la Cruz, Tenerife (España), del 26 al 29 de abril de 2011

Trabajo presentado en la IX Reunión de la Sociedad Española de Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales (2011), celebrada en Puerto de la Cruz, Tenerife (España), del 26 al 29 de abril de 2011, En el presente estudio se ha inducido la embriogénesis somática en Quercus bicolor a partir de explantos foliares y de ápices caulinares. Se desarrollaron embriones somáticos mediante el cultivo en medio de inducción consistente en medio basal Murashige & Skoog [MS, 1962] suplementado con 0,5 mg/L de benciladenina [8A] y 4 mg/L de ácido naftalenacético [ANA] durante 8 semanas, transfiriendo los explantos sucesivamente a medios de 3xpresión con concentraciones reducidas de reguladores [4 semanas] y en medio desprovisto de ellos [8 semanEls). Dado el papel que se atribuye a las arabinogalactanoproteínas [AGP] en la inducción embriogénica de diversas especies, se evaluó el efecto de estos compuestos a lo largo del proceso de ES suplementando o no los diferentes medios con AGP de diferente origen [Larix sp. o Acacia sp.] a diversas concentraciones. Los em Jriones se desarrollaron a partir de las 12 semanas de cultivo en los explantos foliares y de las 15 semanas en los ápices. La frecuencia de callo superó el 90% en todos los tratamientos, si bien el porcentaje de emb:~iogénesis fue relativamente bajo. Sin embargo, las líneas de embriones establecidas se mantienen y multiplican fácilmente mediante embriogénesis secundaria. La respuesta embriogénica se incrementó significativamente al 4,5% frente al 0,5% en las hojas en expansión aisladas del primer nudo a partir del ápice en presencia de AGP de Larix. La AGP de Acacia no promovió respuestas embriogénicas, aunque sí incrementó el peso del callo desarrollado . Antes dB germinar los embriones fue necesaria la aplicación de tratamientos de maduración, mediante el cultivo en medios con dosis elevadas de carbohidratos [sorbitol o maltosa durante 4 semanas] y la aplicación de estratificación en frío [4ºC durante 8 semanas). El cultivo en sorbitol incrementó la respuesta de germinación, aunque fue el almacenamiento en frío el que tuvo un efecto significativamente positivo en la conversión en plántula. La utilización de medios basales diferentes, Gresshoff & Doy [GD, 1972] frente a % MS, durante la etapa de germinación no afectó a la frecuencia de conversión en plántula, sin embargo con el medio GD se observó una importante reducción del porcentaje de propágulos con embriogénesis secundaria, lo que representa una ventaja para el desarrollo de la nueva planta ., R. Mallón es investigador postdoctoral contratado del programa JAE-Doc [CSIC). Los autores agradecen a la empresa "Faresta Mantenimiento de Plantaciones" la cesión del material vegetal. Esta investigación ha sido parcialmente financiada por la Xunta de Galicia mediante el proyecto 09MRU002400PR.

Trabajo presentado en la IX Reunión de la Sociedad Española de Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales (2011), celebrada en Puerto de la Cruz, Tenerife (España), del 26 al 29 de abril de 2011

Trabajo presentado en el Seminario Sobre Biodiversidad Vegetal en el Sistema Agroforestal Atlántico (AGROFOR), celebrado en Pontevedra (España), del 27 al 28 de octubre de 2010, El castaño europeo (Castanea sativa Mill.) y el alcornoque (Quercus suber L.) son especies forestales de gran importancia económica, ecológica y social que en la actualidad se encuentran amenazadas tanto por la actividad humana como por el ataque de patógenos. Para el mantenimiento de la diversidad genética de estas especies es necesario diseñar estrategias de conservación, tanto in situ como ex situ. Dentro de los sistemas de conservación ex situ, y englobada en las técnicas de cultivo in vitro de tejidos, se encuentra la crioconservación [la conservación del material vegetal en nitrógeno líquido (NL)], que es un método seguro y económico para el mantenimiento a largo plazo de germoplasma de especies que son propagadas vegetativamente o que tienen semillas recalcitrantes al almacenamiento convencional. Las condiciones indispensables para iniciar un proceso de crioconservación son disponer de a) un sistema de acondicionamiento de las células de los tejidos a crioconservar para evitar la formación intra e intercelular de cristales de hielo, y b) un sistema de regeneración de plantas factible y repetitivo, que permita la recuperación de plantas completas después de que las células, órganos o tejidos hayan estado inmersos en NL. En castaño y alcornoque se cumplen ambas condiciones ya que las metodologías para la crioconservación de embriones somáticos de alcornoque (Valladares et al., 2004) y de ápices caulinares de castaño (Vidal et al., 2005) han sido desarrollada en el Instituto de Investigaciones Agrobiológicas de Galicia. Por otra parte, la empresa pública TRAGSA trabaja desde el año 2000 en la selección y desarrollo de materiales de especies frondosas de alto valor económico, como el castaño y el alcornoque, para su propuesta al Catálogo Nacional de Materiales de Base. El presente trabajo ha consistido en la transferencia de la tecnología de crioconservación, adaptándola a las necesidades de la empresa, con el objetivo de desarrollar por primera vez bancos de germoplasma aplicados de ambas especies., Se han utilizado 46 clones de castaño de origen adulto y establecidos in vitro en el Departamento de Mejora Agroforestal de TRAGSA en Maceda (Ourense). Estos genotipos fueron seleccionados en campo por sus características de aparente resistencia a la enfermedad de la tinta. Por otra parte, se utilizaron 51 líneas embriogénicas de alcornoque establecidas a partir de árboles seleccionados por su forma, tamaño, condición fitosanitaria y calidad del corcho, localizados en 15 rodales selectos de 4 regiones de procedencia de Extremadura. Para el cultivo y crioconservación de castaño se ha seguido el método descrito por Vidal et al. (2005). Previamente a su aplicación a los genotipos seleccionados, se realizaron estudios destinados a evaluar a) la estabilidad genética tras la crioconservación utilizando RAPDs, y b) el efecto de la adición del Supercool X-1000 (SC) a la disolución crioprotectora (Vidal et al., 2010). En el alcornoque se ha seguido el método de Valladares et al. (2004), evaluándose además el uso de placas con papel de filtro durante las 24 horas siguientes a la descongelación y la influencia de la duración del periodo de precultivo en sacarosa 0,3 M sobre los porcentajes de recuperación de la capacidad embriogénica (Vidal et al., 2008), a fin de facilitar la simplificación del protocolo y su adaptación a la empresa., Los resultados obtenidos indican que la respuesta a la crioconservación en ambas especies, como muchas otras características de las especies leñosas, depende en gran medida del genotipo. En castaño, el análisis mediante RAPDs no revela modificaciones genéticas en las plantas obtenidas a partir de los ápices caulinares crioconservados. Por otra parte, se ha observado que la adición de 0,1% de SC a la disolución crioprotectora PVS2 mejora los porcentajes de supervivencia en 6 de los 8 clones utilizados en dicho estudio y que la aplicación de SC duplica los valores de recuperación de brotes en 5 de los 6 clones que los forman. Por tanto, este compuesto se utilizó en la crioconservación de los 46 clones que constituyen el banco de germoplasma, obteniéndose la supervivencia del material en 43 de ellos y recuperación de brotes en 29 genotipos. En alcornoque, se ha simplificado el protocolo de crioconservación original y se ha obtenido la recuperación de la capacidad embriogénica en los 51 genotipos objeto de estudio, aunque de nuevo se observan diferencias genotípicas ya que las frecuencias de formación de embriones secundarios oscilan entre 18 y el 100% en los distintos clones crioconservados., Se han establecido dos bancos de germoplasma, uno de castaño y otro de alcornoque, a los que se continúan añadiendo nuevos genotipos. De los 46 genotipos caracterizados en castaño, el 93% ha mostrado alta capacidad de supervivencia y el 63% capacidad de recuperación de brotes. El banco de alcornoque está constituido hasta el momento por 51 genotipos y todos ellos muestran alta capacidad de recuperación de embriones. Estos resultados confirman la posibilidad de utilizar la crioconservación para conservar a largo plazo germoplasma de estas especies., Esta investigación ha sido financiada parcialmente por los proyectos CIT-010000-2007-5 (Ministerio de Educación y Ciencia) y PGDIT07MRU003E (Xunta de Galicia).

Trabajo presentado en la X Reunión de Biología Molecular de Plantas, celebrada en Valencia (España), del 8 al 10 de julio de 2010, El gen CsSCL-1 (Castanea sativa SCARECROW-LIKE 1) caracterizado en nuestro laboratorio, presenta una elevada homología con genes que codifican proteínas de la familia GRAS. Estas proteínas son una familia de putativos factores de transcripción implicados en diferentes procesos de señalización y desarrollo en plantas. El gen CsSCL-1 se induce en brotes de castaño en respuesta a la aplicación de auxina y parece que juega un papel durante los estadíos tempranos de la formación de raíces adventicias. En un estudio previo, hemos analizado la expresión del gen mediante qRT-PCR durante el desarrollo de embriones somáticos y zigóticos de castaño. En los embriones zigóticos, los niveles relativos mas altos del transcrito se detectaron en óvulos con embriones en estados muy tempranos de desarrollo, alcanzando niveles 10 veces superiores a los de los embriones en estado cotiledonar. De manera similar los embriones somáticos en etapa globular presentaron al menos un nivel de expresión dos veces mayor que el de los embriones cotiledonares. El objetivo del presente trabajo es localizar la expresión espacio-temporal del gen CsSCL-1 mediante hibridación in situ, durante la embriogénesis somática y zigótica de castaño para determinar en qué tipo de tejidos tiene lugar la acumulación del transcrito. En el caso de embriones somáticos se utilizaron dos líneas embriogénicas mantenidas mediante embriogénesis secundaria, aislándose embriones en diferentes estados de desarrollo (globular, cotiledonar temprano y cotiledonar). El gen CsSCL-1 mostró una elevada expresión en los embriones globulares con una mayor acumulación en la protodermis. A medida que avanza la histodiferenciación de los embriones, el gen se expresa preferencialmente en el procambium y en el meristemo radicular, mostrando una ligera expresión en los cotiledones. Para el análisis realizado en los embriones zigóticos, se recogieron semanalmente (dos recogidas por semana), dentro de un intervalo de tiempo desde finales de Julio hasta finales de Septiembre, muestras de semillas inmaduras y maduras de castaño del mismo árbol. En las últimas semanas, en las que ya se observaba el embrión en estado cotiledonar avanzado, se aisló el eje embrionario. Los resultados preliminares de hibridación in situ muestran una mayor acumulación del transcrito en los embriones en estadío globular, mientras que en los estados mas avanzados de desarrollo la expresión parece estar asociada al desarrollo de los cotiledones, no detectándose apenas expresión en los ejes embrionarios de los embriones cotiledonares, Este trabajo ha sido financiado por el MEC (Ref. AGL2006‑01387/FOR; AGL2008-05105-C02-02/FOR) y la Xunta de Galicia (PGIDIT06PXIB400003PR)

Cryopreservation of selected genotypes of Europeanchestnut and cork oak was carried out in two laboratories in a proect involving conservation of field collections. Plant material was selected on the basis of disease resistance (chestnut), growth habit, phytosanitary performance and cork quality (cork oak). The cryopreservation technique comprised vitrification of shoot apices isolated from in vitro stock shoot cultures (chestnut) and somatic embryos (cork oak). Forty three out 46 chestnut genotypes assayed survived the freezing process, but only 63% recovered their capacity to produce new shoots. After completion of multiplication and rooting steps, the surviving shoots produced plants that were morphologically identical to those derived from non-supercooled material. All 51 cork oak genotypes withstood freezing and were able to produce new somatic embryos through a process of secondary embrygenesis. Multiplication and germination of the recovered embryos enabled production of plants that were morphologically identical to thse derived from non‐supercooled material. In light of the results obtained, long-term cryopreservation of these species is feasible, thereby ensuring conservation of valuable genotypes during field

Trabajo presentado en el Seminario Sobre Biodiversidad Vegetal en el Sistema Agroforestal Atlántico (AGROFOR), celebrado en Pontevedra (España), del 27 al 28 de octubre de 2010, La crioconservación o almacenamiento en nitrógeno líquido (NL) se considera, actualmente, una de las técnicas más prometedoras para la conservación a largo plazo del germoplasma de especies que se propagan vegetativamente o poseen semillas recalcitrantes, siendo además un método complementario a los sistemas tradicionales de conservación. Durante la última década, los trabajos sobre la crioconservación de masas embriogénicas y embriones somáticos de especies forestales se ha ido incrementando en número e importancia, aplicándose ya a gran escala para la conservación de miles de líneas embriogénicas de coníferas (Häggman et al., 2000), de café, cacao o palma de aceite (Engelman, 2004). La combinación de embriogénesis somática y crioconservación es especialmente útil ya que con ella se puede mejorar considerablemente la capacidad de seleccionar genotipos superiores. Además la crioconservación facilita el manejo de las líneas embriogénicas reduciendo costes y tiempo empleado en ello, limitando así el riesgo de aparición de variación somaclonal o contaminación. Para la crioconservación de material embriogénico se aplica fundamentalmente el método tradicional del enfriamiento lento (ampliamente aplicado a cultivos embriogénicos de coníferas) o mediante la aplicación de técnicas basadas en la vitrificación. El objetivo de este trabajo consistió en la crioconservación de líneas embriogénicas de Fagáceas incluyendo roble, alcornoque y castaño mediante metodologías de vitrificación y/o desecación. En el caso del castaño también se han crioconservado líneas embriogénicas modificadas genéticamente., En roble se utilizaron líneas embriogénicas inducidas a partir de hojas de plántulas (Cuenca et al., 1999) y hojas de árboles adultos (Toribio et al., 2004; Valladares et al., 2006). En alcornoque las líneas embriogénicas también se iniciaron de hojas de árboles adultos mientras que en castaño las líneas embriogénicas utilizadas fueron inducidas a partir de hojas aisladas de cultivos mantenidos mediante la multiplicación de yemas axilares (Corredoira, 2002). Todas las líneas embriogénicas se han mantenido mediante embriogénesis secundaria en medio de proliferación con subcultivos secuenciales cada 4-6 semanas. En los experimentos de crioconservación se utilizaron como explantos grupos de embriones somáticos (e.s.) en estadio globular-torpedo (4-6 mg) en el caso del roble, estadio globular (2-4 mg) en alcornoque y globular-corazón (6-8 mg) en castaño., Crioconservación mediante desecación: e.s. de roble y castaño Los grupos de embriones se precultivaron durante 3 días en medio de proliferación en el que se incrementó la concentración de sacarosa a 0,3 M seguido de cuatro días con sacarosa 0,7 M. Posteriormente los explantos fueron transferidos a placas Petri vacías y expuestos a desecación en cámara de flujo laminar durante cinco periodos diferentes (0, 1, 2, 3 y 4 h). Después de cada periodo de desecación, la mitad de los explantos desecados se transfirieron a medio de proliferación (control de tratamiento) y la otra mitad se introdujo en crioviales con posterior inmersión en NL durante al menos 24 h. Después de la descongelación (2 min en baño a 40ºC), los explantos se cultivaron en medio de proliferación durante 8 semanas. Crioconservación mediante vitrificación: e.s. de roble, alcornoque y castaño Los grupos embriogénicos se precultivaron durante 3 días en medio de proliferación sin reguladores del crecimiento con la concentración de sacarosa incrementada a 0,3M. Posteriormente, las muestras se introdujeron en crioviales con 1,8 ml de solución de vitrificación PVS2 (Sakai y col., 1990)., Después de diferentes periodos de exposición a la solución de vitrificación (0, 60, 90 ó 120 min) se introdujeron en NL durante al menos 24 h. Después de la descongelación, los explantos se cultivaron en medio de proliferación durante 6-8 semanas. Además de los controles tratados con PVS2 y no crioconservados, también se utilizaron controles con material no tratado procedente del cultivo stock y material tratado solamente con sacarosa 0,3M. En todos los experimentos, la toma de datos se llevó a cabo evaluando la recuperación embriogénica definida como el porcentaje de explantos que muestran formación de nuevos embriones somáticos en estado cotiledonar., Los mejores resultados en la crioconservación de embriones somáticos de roble y castaño se obtuvieron con la técnica de vitrificación. Con la técnica de desecación las tasas de recuperación embriogénica más altas fueron del 31-57% en roble y del 33% en castaño al aplicar el tratamiento de desecación en cámara de flujo laminar durante 2 horas lo que corresponde a un contenido hídrico de los tejidos del 25% (en base a peso fresco). Las tasas de recuperación embriogénica se incrementaron significativamente con la metodología de la vitrificación, obteniéndose valores entre el 57-92% en las diferentes líneas embriogénicas de roble independientemente de su origen, juvenil o adulto, y valores del 57-68% en las líneas embriogénicas de castaño. Las líneas embriogénicas de alcornoque mostraron una elevada capacidad de regeneración tras la crioconservación, alcanzándose valores alrededor del 90% en la mayoría de los genotipos., El protocolo de crioconservación desarrollado permite el almacenamiento indefinido de germoplasma seleccionado de roble, alcornoque y castaño, permitiendo de esta forma la creación de un banco de germoplasma de genotipos de alto interés científico y comercial.

[ES] La fitorremediación es una tecnología que utiliza las plantas para eliminar contaminantes de suelos y aguas contaminados como consecuencia de actividades mineras, industriales, agrícolas o militares. Algunas plantas son capaces de metabolizar compuestos orgánicos así como de tolerar, detoxificar y almacenar elevadas cantidades de metales pesados, aunque los mecanismos utilizados son poco conocidos. Precisamente, el cultivo in vitro de tejidos vegetales está considerado como una herramienta fundamental no sólo para entender mejor las relaciones planta-contaminante sino también para poder predecir la respuesta de las plantas enteras al medioambiente contaminado o para desarrollar plantas con elevada capacidad de fitorremediación. En este trabajo se resume la aplicación del cultivo in vitro en aspectos relacionados con la fitorremediación como son los estudios básicos del metabolismo de contaminantes, la selección de variantes somaclonales y el desarrollo de plantas transgénicas con elevada capacidad de fitorremediación, [EN] Phytoremediation is the technology which uses plants to remove pollutants from the environment that has resulted from mining, industrial, agricultural and military practices. Little is known on the metabolic pathways in the transformation of xenobiotic compounds and in the ability of certain plants to tolerate, detoxify and store high concentrations of heavy metals. Plant cell and tissue culture may be considered an important tool in phytoremediation studies, specifically to increase our understanding of the plant-contaminant relationship, to predict the response of whole plants to environmental pollutants and to develop plants with enhanced capacity of phytoremediation. In this article, the role of in vitro tissue culture techniques on phytoremediation studies is reviewed.

Trabajo presentado en la Reunión de la Red de genómica y Diversidad genética Forestal (GEN2FOR) (2010), celebrada en Navas del Marqués, Ávila (España), los días 1 y 2 de diciembre de 2010

Trabajo presentado en el Seminario Sobre Biodiversidad Vegetal en el Sistema Agroforestal Atlántico (AGROFOR), celebrado en Pontevedra (España), del 27 al 28 de octubre de 2010, En los últimos años se ha detectado una agresiva plaga causada por el hongo Phytophthora alni que está secando miles de alisos en toda Europa. La enfermedad se caracteriza por una lesión necrótica en la raíz y cuello del árbol, con un exudado oscuro en la zona externa, disminución del número y del tamaño de las hojas que presentan un color más amarillento, un incremento de la fructificación y el árbol atacado suele morir rápidamente. Entre las especies de alisos europeos (Alnus glutinosa, A. cordata, A. viridis y A. incana), A. glutinosa es la especie predominante en Galicia y la que presenta una mayor susceptibilidad al ataque del hongo (Webber y Gibbs, 2006).Existe una gran preocupación por el efecto que una sequía masiva de alisos tendría sobre los ecosistemas fluviales, dada la importancia que estas formaciones vegetales tienen en el funcionamiento ecológico de los ríos, como hábitats de especies catalogadas y por los múltiples servicios ambientales y sociales a los que contribuye. Por estos motivos, planteamos en este trabajo el desarrollo de un protocolo para la micropropagación y conservación del aliso como una forma de preservar su diversidad genética., Establecimiento: Para la iniciación de los cultivos se recogieron ramas de la copa de 4 árboles de entre 25-30 años de la Reserva de la Biosfera “Terras do Miño” (R1-R4) y renuevos basales de un árbol de entre 20-25 años que había sido talado en las proximidades de Santiago de Compostela (G1) Las recogidas de material se efectuaron en los meses de noviembre y junio. Las estaquillas se forzaron a brotar en un fitotrón y los ápices y nudos (1 cm) de los brotes desarrollados se utilizaron para establecimiento in vitro una vez esterilizados con hipoclorito sódico al 0.6%. El medio de cultivo está compuesto por las sales y vitaminas de Woody Plant Medium (WPM, Lloyd y McCown 1980), sacarosa 3%, agar Difco 0.7%, 2 mg/l de 6-benciladenina (BA) y 0,5 mg/l de ácido indol acético (AIA). El pH de los medios se ajustó a 5.7 antes de autoclavar. Multiplicación: Se utilizó el medio WPM, realizando 3 ciclos de transferencia a medio fresco de 3 semanas cada uno. Como reguladores de crecimiento se utilizaron BA 0,2 mg /l + AIA 0,5 mg /l en el 1er ciclo, reduciendo la concentración de BA a 0,1 mg/l en el 2º y 3er ciclo y adicionando además 0,5 mg/l de zeatina en el tercero. Como explantos se utilizaron segmentos apicales y basales de los brotes. Los ensayos se realizaron con el clon G1. Los resultados se recogieron al final de los 3 ciclos de transferencias (9 semanas). Enraizamiento: La formación de las raíces adventicias se indujo en brotes de 2-3 cm aislados de los cultivos en multiplicación del clon R4. Se utilizó el medio WPM con los macronutrientes reducidos a la mitad con o sin la adición al medio de 0.1 mg/l de ácido indol butírico (AIB). Los resultados se evaluaron a las 4 semanas. Todos los cultivos se mantuvieron en una cámara con temperatura (25/20ºC día/noche) y fotoperíodo (16/8h) controlado, con una intensidad luminosa de 50-60 µmol m-2 s-1., Establecimiento: Los mejores resultados (100%) se obtuvieron con el clon G1 de origen juvenil, mientras que en el resto de los clones los porcentajes de establecimiento oscilaron entre un 14% (R1, recogida de Junio) y un 75% (R3, recogida de noviembre). El tiempo de estabilización de los cultivos osciló entre 5 meses para el clon G1 y 12 meses para el R1., Multiplicación: Se ha basado en la proliferación de los brotes axilares. Al igual que sucede con otras especies (San José et al 1990; Vieitez et al 1993) la eficacia de la micropropagación depende del tipo de explanto utilizado, la mejor respuesta tuvo lugar con los explantos basales (nº total de brotes 3.4 frente a 1.8 con los apicales). Aunque algunos autores (Tremblay et al 1986) han utilizado la BA como único regulador de crecimiento para el desarrollo de brotes de Alnus, nosotros obtuvimos una mejora significativa en el desarrollo de los brotes al realizar 3 ciclos de transferencia y añadir zeatina en el tercero. En Fagus sylvatica, se ha señalado que estas transferencias sucesivas aportan nutrientes para el crecimiento de los cultivos, mientras que la combinación de BA y Z favorece el desarrollo in vitro de los brotes y las hojas (Vieitez et al 1993, 2003). Resultados similares obtuvieron con Q. alba y Q. bicolor (Vieitez et al 2009) Enraizamiento: Los resultados obtenidos (80 % de enraizamiento en el control frente a un 66.7% con IBA), muestran la facilidad de enraizamiento del aliso, no siendo necesaria la aplicación de auxina para que tenga lugar la formación de raíces adventicias en los brotes desarrollados in vitro., Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de micropropagar distintos individuos de A. glutinosa como una forma de preservar su diversidad genética que se encuentra amenazada en diferentes puntos de nuestra geografía como consecuencia del ataque del hongo Phytophthora alni.

Trabajo presentado en la X Reunión de Biología Molecular de Plantas, celebrada en Valencia (España), del 8 al 10 de julio de 2010, La embriogénesis somática no sólo es un método de gran importancia para la propagación vegetativa sino que constituye también un buen modelo para estudiar el desarrollo del embrión. Durante este proceso tienen lugar cambios morfológicos y bioquímicos en respuesta a alteraciones en las pautas de expresión génica. El objetivo del presente trabajo es la caracterización de genes relacionados con el proceso de embriogénesis somática de roble, asociados a las distintas fases de desarrollo de los embriones, utilizando para ello líneas embriogénicas mantenidas mediante embriogénesis secundaria. Entre los genes involucrados en el proceso de inducción de la embriogénesis somática, el gen SERK se considera uno de los mejores marcadores moleculares del inicio de los embriones. Mediante RACE y utilizando RNA procedente de embriones globulares, hemos identificado el gen QrSERK‑like que codifica una proteína con ciertos dominios característicos de las proteínas SERK. Su dominio kinasa posee actividad tirosina‑kinasa en cuanto a especificidad de sustrato, con un lugar de unión a ATP. Puesto que se trata de una proteína RLK (receptor‑like protein kinase), se puede inferir que su función en los procesos de desarrollo es la transducción de señales del entorno para desencadenar respuestas específicas, tal es el caso de la embriogénesis somática. Actualmente se está llevando a cabo el análisis de la expresión espacio‑temporal del gen QrSERK‑like en embriones somáticos de roble en sus diferentes estados de desarrollo. Usando una metodología similar se aisló el gen QrQR, homólogo de una Quinona oxidorreductasa de Fragaria. El análisis estructural de la proteína QrQR muestra que tiene un dominio catalítico ADH, así como otro de unión a Zn. La proteína QrQR también presenta homología con una secuencia proteica de Vigna radiata codificada por un gen inducido por auxina que fue aislado durante la formación de raíces adventicias, proceso que requiere una reprogramación celular, al igual que ocurre durante la inducción de la embriogénesis somática. El análisis de expresión génica durante el desarrollo de los embriones permitirá inferir si QrQR tiene algún rol en la embriogénesis. Finalmente, se ha aislado la secuencia parcial de un gen que muestra una alta homología con genes que codifican proteínas transportadoras de Zn de la familia ZIP y que codifica un polipéptido de 567 aminoácidos. Los genes de esta familia tienen una relevancia importante durante el metabolismo mediando el transporte de iones metálicos., Este trabajo ha sido financiado por el MEC (Ref. AGL2006‑01387/FOR) y la Xunta de Galicia (PGIDIT06PXIB400003PR)