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Introduction: Accidents caused by venomous animals are considered a public health problem in Brazil. Currently, there are about 37 thousand accidents with scuppers, 26 thousand accidents with snakes and 20 thousand with spiders in the country. Data related to these injuries are communicated in the notification health information system. However, there is a lack of data in the literature on accidents that occurred in the Northeast, mainly in Bahia. Objective: To describe the epidemiological aspects of accidents with venomous animals in the state of Bahia between 2010 and 2019, reported in SINAN. Methodology: This is a descriptive observational study. Data on accidents with venomous animals in Bahia between 2010 and 2019 were collected from SINAN. Results: Between 2010 and 2019, 173,334 cases of accidents with venomous animals that occurred in Bahia were registered in the SINAN. Desyes, 70.66% were caused by scorpions, 15.07% by snakes, 3.58% by spiders and 5.32% by larks and bees. In 2.69% of cases, there was no specification of the offending agents. Final Considerations: The present study identified that the epidemiological profile of accidents by venomous animals affects more young adults aged 20 to 39 years, economically active age group and males, mostly, evolved to cure after an accident with the animal. Introducción: Los accidentes causados ​​por animales venenosos son considerados un problema de salud pública en Brasil. Actualmente, hay cerca de 37 mil accidentes con imbornales, 26 mil accidentes con serpientes y 20 mil con arañas en el país. Los datos relacionados con estas lesiones se comunican en el sistema de notificación de información sanitaria. Sin embargo, faltan datos en la literatura sobre accidentes ocurridos en el Nordeste, especialmente en Bahía. Objetivo: Describir los aspectos epidemiológicos de los accidentes con animales venenosos en el estado de Bahía entre 2010 y 2019, reportados en SINAN. Metodología: Se trata de un estudio observacional descriptivo. Los datos sobre accidentes con animales venenosos en Bahía entre 2010 y 2019 fueron recolectados del SINAN. Resultados: Entre 2010 y 2019 se registraron en el SINAN 173,334 casos de accidentes con animales venenosos ocurridos en Bahía. Desyes, 70,66% fueron causadas por escorpiones, 15,07% por serpientes, 3,58% por arañas y 5,32% por alondras y abejas. En el 2,69% de los casos, no se especificó a los agentes infractores. Consideraciones Finales: El presente estudio identificó que el perfil epidemiológico de los accidentes por animales venenosos afecta a más adultos jóvenes de 20 a 39 años, grupo etario económicamente activo y machos, en su mayoría, evolucionados para curar tras un accidente con el animal. Introdução: Os acidentes por animais peçonhentos são considerados um problema de saúde pública no Brasil. Atualmente, ocorrem cerca de 37 mil acidentes com escopiões, 26 mil acidentes com cobras e 20 mil com aranhas no país. Os dados relacionados a essas lesões são comunicados no sistema de informação de agravos de notificação. No entanto, faltam dados na literatura sobre os acidentes ocorridos no Nordeste, principalmente na Bahia. Objetivo: Descrever os aspectos epidemiológicos dos acidentes com animais peçonhentos no estado da Bahia entre os anos de 2010 a 2019, notificados no SINAN. Metodologia: Trata-se de um estudo observacionbal descritivo. Dados sobre os acidentes com animais peçonhentos na Bahia entre 2010 e 2019 foram coletados no SINAN. Resultados: Entre 2010 e 2019, foram registrados no SINAN 173.334 casos de acidentes por animais peçonhentos ocorridos na Bahia. Desyes, 70,66% foram causados por escorpiões, 15,07% por cobras, 3,58% por aranhas e 5,32% por largatas e abelhas. Em 2,69% dos casos, não houve especificação dos agentes agressores. Considerações Finais: O presente estudo identificou que o perfil epidemiológico dos acidentes por animais peçonhentos atinge mais adultos jovens de 20 a 39 anos, faixa etária economicamente ativa e do sexo masculino, em sua maioria, evoluíram para cura apóso acidente com o animal.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Peptídeos bioativos são uma grande classe de biomoléculas com diversos potenciais farmacológicos, destacando-se os peptídeos antimicrobianos que agem sobre diferentes organismos tais como bactérias, fungos, protozoários e vírus. Muitos desses peptídeos apresentaram também atividade antitumoral. Nesta tese, focamos na secreção de Pithecopus megacephalus, bem como no peptídeo LyeTx I-Des-His, uma variação sintética de LyeTx I, um peptídeo purificado da peçonha da aranha Lycosa erythrognatha, com o objetivo de encontrar peptídeos ativos principalmente contra células de câncer, especificamente do tipo triplo negativo. O fracionamento da secreção de P. megacephala, apresentou rica variedade de peptídeos e 14 destes foram sequenciados. Desse grupo três peptídeos foram sintetizados e testados contra bactérias, fungos e três linhagens de células de câncer (MDA-MB-231, MCF-7, ambas de câncer de mama e HCT-116 de câncer colorretal) e uma linhagem não câncer (HEK-293), como controle. Os resultados sugeriram aumento da atividade proliferativa de dois peptídeos. sobre células de câncer, sem aparente atividade em células HEK-293. Numa segunda parte deste trabalho, propusemos testar LyeTx I-Des-His combinado com cisplatina, em três diferentes proporções molares. A proporção peptídeo:cisplatina (P:C) 1:1, na dose do IC50, apresentou efeito sinérgico, bem como um valor de índice de seletividade maior que o da cisplatina isolada. Quando investigados os possíveis mecanismos de morte envolvidos, observamos diversos indícios de morte celular por autofagia. Este mecanismo de morte foi suportado pelos seguintes resultados: células tratadas com as combinações P:C pararam na fase G2/M do ciclo celular, células foram marcadas em vermelho com o corante pH sensível laranja de acridina e quando pré tratadas com inibidor de autofagia (Bafilomicina A1) esta correlação foi revertida. Além do mais, experimentos de western blot indicaram uma possível redução da expressão de P21 e da fosforilação de AKT. A redução da fosforilação de AKT pode ser indício de autofagia, como já descrito. Entretanto, outros estudos são necessários para melhor elucidar as vias envolvidas nas atividades desse peptídeo. Além do mais, estudos de toxicidade são essenciais na possível validação de LyeTx I-Des-His como um candidato a droga terapêutica. Esses achados demonstraram que o peptídeo LyeTx I-Des-His parece um bom candidato para ser combinado com alguns fármacos já bem estabelecidos, melhorando o combate a células de câncer, por induzir outras cascatas de morte. Bioactive peptides are a vast class of molecules with diverse biopharmaceutical potentials, including antimicrobial activity over a broad organism classes such as bacteria, fungi, protozoa and viruses. Several of these peptides have also shown antitumoral activity. In this thesis we focused on Pithecopus megacephalus frog secretion, as well as the peptide LyeTx I-Des-His, a synthetic variation of LyeTx I, a peptide purified from the venom of the spider Lycosa erythrognatha, with the objective to find bioactive peptides mainly against cancer cells, more specifically of the triple negative type. The fractionation of the P. megacephala secretion showed a rich variability on peptides and 14 of them were sequenced. From this set, three peptides were synthesized and tested against bacteria, fungi and three cancer cell lines (MDA-MB-231, MCF-7, both from breast cancer and HCT-116 from colorectal cancer) and one non-cancer cell line (HEK- 293), as a control. The results suggested an increase on proliferative activity of two peptides over cancer cells, without apparent activity on HEK-293 cells. In a second part of this work, we proposed to test LyeTx I-Des-His combined with cisplatin, in three different molar proportions. The proportion peptide:cisplatin, (P:C) 1:1, in the IC50 dose, showed synergistic effect as well as a selectivity index value, greater than cisplatin isolated treatment. When investigating the possible cell death mechanisms involved, we observed several indications of autophagic cell death process. This mechanism was supported by the following results: cells treated with P:C combinations arrested in G2/M cell cycle phase, cells were marked in red with the pH sensitive dye acridine orange and when pretreated with an autophagy inhibitor (Bafilomycin A1) this coloration was reversed. In addition, western blot experiments indicated a possible reduction of P21 expression and of AKT phosphorylation. The decreasing of AKT phosphorylation could be indicative of autophagy, as already described. However, other studies are necessary to better clarify the involved pathways on these activities of the drugs. In addition, toxicity studies are essential in a possible validation of LyeTx I-DesHis as a therapeutic drug candidate These findings demonstrated that the peptide LyeTx I-Des-His seems a good candidate to be combined with some well-established drugs, improving the combat to cancer cells, by inducing other death cascades.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior As aranhas do gênero Loxosceles expressam em suas glândulas de veneno diversas toxinas, como as Fosfolipases D, responsáveis pela maior parte dos sintomas causados pelo Loxoscelismo e as Metaloproteases, que podem estar envolvidas nas ações hemorrágicas e de disseminação do veneno. Diversos estudos demonstram que o os casos cutâneos-viscerais, a forma mais grave do Loxoscelismo, são causados principalmente pela aranha Loxosceles laeta, sendo esta encontrada em diversos países da América de Sul, como o Brasil, Peru e Chile. Além disso, existe um número quase três vezes maior de óbitos relacionados à mordida da L. laeta no Peru - L. laeta (P) - em relação ao Brasil. Desta forma, o presente estudo objetivou a realização de uma análise dos transcritos da glândula de veneno da espécie L. laeta (P) por ferramentas bioinformáticas com foco nas metaloproteases, por não possuírem suas funções totalmente identificadas, a fim de descrevê-las e caracterizá-las, investigando diferenças intraespecíficas dos venenos que possam justificar a gravidade elevada dos acidentes peruanos. Foram descritas nove metaloproteases do veneno de L. laeta (P) e estes resultados foram validados por experimentos in silico e in vitro comparandoos com as metaloproteases do veneno de L. laeta brasileira – L. laeta (B). Os resultados demonstraram diferenças importantes entre as sequências de metaloproteases peruanas com todas as outras metaloproteases de espécies de Loxosceles bem como de sua atividade in vitro. Esses dados preliminares indicam que a investigação mais aprofundada da ação dessas enzimas no veneno Loxoscélico pode contribuir para o melhor entendimento do envenenamento causado por essas aranhas. Spiders of the genus Loxosceles express in their venom glands various toxins, such as Phospholipases D, responsible for most of the symptoms caused by Loxoscelism and Metalloproteases, which may be involved in the hemorrhagic actions and the dissemination of venom. Several studies have shown that the cutaneous-visceral cases, the most severe form of Loxoscelism, are mainly caused by the Loxosceles laeta spider, which is found in several countries of South America, such as Brazil, Peru and Chile. In addition, there are almost three times as many bite-related deaths from L. laeta in Peru compared to Brazil. Thus, the present study aimed to perform an analysis of the transcripts of the venom gland of the Peruvian L. laeta species by bioinformatic tools with a focus on metalloproteases, because they did not have their fully identified functions, in order to describe and characterize them, investigating intraspecific differences of poisons that may justify the high severity of Peruvian accidents. Nine metalloproteases from the L. laeta venom from Peru were described and these results were validated by in silico and in vitro experiments comparing them with the metalloproteases from the Brazilian lax Loxosceles venom. The results demonstrated important differences between the Peruvian metalloprotease sequences with all other metalloproteases of Loxosceles species as well as their in vitro activity. These preliminary data indicate that further investigation of the action of these enzymes on the loxoscelic venom may contribute to a better understanding of the poisoning caused by these spiders.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Acidentes com animais peçonhentos são um problema de saúde de pública no Brasil, sendo a aranha-marrom a segunda maior causadora de tais acidentes. O envenenamento acidental causado pela picada da aranha marrom gera efeitos dermonecróticos que podem ser seguidos de manifestações sistêmicas. Ainda que estas manifestações sistêmicas ocorram em uma parcela pequena dos casos, esta pode ser fatal. A produção de antivenenos para o tratamento de tais acidentes é dependente de uma variedade de experimentos animais, desde a extração do veneno das aranhas, à produção do antiveneno em cavalos, e até à avaliação in vivo do potencial neutralizante destes antivenenos, que é feita em coelhos. O presente trabalho apresenta tentativas de minimizar e otimizar experimentos com animais na produção de antivenenos com duas abordagens. A primeira se baseia na construção e produção de uma proteína quimérica, a Lil, contendo epitopos imunodominantes, previamente mapeados, da principal proteína do veneno de Loxosceles, a Esfingomielinase D. A proteína quimérica Lil contém epitopos encontrados nas Esfingomielinases D das três principais espécies brasileiras. Esta proteína se mostrou capaz de produzir anticorpos com o potencial de neutralizar parcialmente os efeitos tóxicos do veneno de Loxosceles intermedia, em um modelo animal. Por esta razão, de modo a reduzir o uso de aranhas e otimizar a vida útil dos cavalos produtores de antiveneno, a proteína Lil se mostrou um candidato promissor para uso em processos de imunização. A segunda abordagem foi a elaboração de um teste in vitro para a discriminação de soros com alto e baixo potencial neutralizante. A Smase I de Loxosceles laeta se mostrou capaz de discriminar a potência neutralizante dos soros de alta e baixa potência avaliados, em um teste de ELISA. Então, é sugerida a utilização deste teste como uma alternativa aos protocolos in vivo que utilizam coelhos. Accidents with venomous animmals represent a health issue in Brazil, and the brown spider’s accidents are pointed out as the second most frequent ones. The accidental envenomation by brown spiders (Loxosceles sp.) cause a strong local dermonecrotic effect which can be followed by systemic manifestations, and even though the systemic loxoscelism occurs in a small portion of the cases, it can be fatal. The production of antivenoms for the treatments of such accidents relies on a variety of animal experiments, from the spider venom extraction to the production of antivenom in horses and its in vivo neutralizing potency evaluation, which is performed in rabbits. In the present work, there is an attempt to reduce and optimize animal experiments with two different approaches. The first approach relies in the construction and production of a chimeric protein, named Lil, containing immunodominant epitopes that were previously mapped from the main protein of the Loxosceles venom, the Sphingomyelinase D. The Lil protein contains epitopes from Sphinomyelinases D of the three main species found in Brazil. The Lil protein was found capable of inducing antibodies with the potential to partialy neutralize the toxic effects of Loxosceles intermedia venom in an animal model. Therefore, in order to reduce spider usage and to provide a less harmfull life to the horses used for immunization we suggest the Lil protein as a potential candidate to replace the venom usage in the antivenom production protocols. The second approach was to elaborate an in vitro test for the distinction of high and low potency sera. The Loxosceles laeta Smase I was able to correctly diagnose the neutralizing potency of the evaluated sera, in an ELISA test. Thus, we suggest the use of such test as means to discriminate the neutralizing potency of the antiloxosceles sera as an alternative to the in vivo protocols relying on rabbits.

No Brasil, durante o ano de 2015 (últimos dados disponíveis), foram registrados 106.983 casos de acidentes com animais peçonhentos. Desse total, 19.495 envolveram aranhas (18,22%). O estado de Minas Gerais apresentou o maior número de acidentes com animais peçonhentos notificados com 19.474 casos registrados, sendo que 2.269 acidentes foram com aranhas (11,6%). Dentre os acidentes com Aranha, destaca-se o gênero Loxosceles (aranha-marrom), responsável por 58% dos acidentes com aranhas em que houve identificação da espécie. No mundo, já foram identificadas cerca de 100 espécies diferentes de Loxosceles, dentre elas, 10 são encontradas no Brasil. As espécies de maior importância médica são: L. intermedia, L. gaucho, L. similis e L. laeta. O veneno da aranha-marrom possui uma composição extremamente complexa, contendo diversas toxinas. Dentre as enzimas foram identificadas: hidrolases, hialuronidases, lipases, peptidases, colagenases, alcalino fosfatase, 5-ribonucleotidase, fosfohidrolases e proteases. Embora, provavelmente todas as enzimas presentes no veneno sejam capazes de contribuir de alguma forma para a progressão da lesão decorrente do acidente, somente as esfingomielinases D (SMase D), lipases presentes no veneno, foram capazes de produzir lesões dermonecróticas, hemólise e agregação plaquetária em animais de laboratório. Foi demonstrado em laboratório que as SMase D possuem diversos substratos e embora tenha sido demonstrado que em meio fisiológico a SMase D de L. laeta é capaz de liberar a colina da lisofosfatidilcolina (LPC), uma molécula de imunosinalização derivada de fosfatidilcolina (PC), assim gerando ácido lisofosfatídico (LPA), conhecido por induzir várias respostas biológicas e patológicas, o mecanismo das SMAses D causador dermonecrose ainda não foi totalmente elucidado. Recentemente foi identificado um motivo bem conservado na porção C-Terminal das SMases D (ATXXDNPW) de diferentes espécies e gêneros, logo após a última -hélice do TIM barril (/)8. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da mutação de aminoácidos conservados D277 e W280 na porção C-Terminal da esfingomielinase rLID1 do veneno de Loxosceles intermedia. As proteínas recombinantes rLID1, rLID1_D (D277A), rLID1_W (W280A) e rLID1_DW (D277A e W280A) foram submetidas a modelagem e dinâmica molecular a fim de avaliar os impactos das mutações in silico. Constatou-se que as mutações aumentam a flexibilidade da alça catalítica da proteína. Após a avaliação in silico, as proteínas foram expressas em BL21 (DE3) Arctic Express, porém, somente as proteínas rLID1, rLID1_D e rLID1_W ficaram solúveis. As proteínas solúveis foram purificadas utilizando cromatografia de afinidade e logo em seguida, cromatografia de gel filtração. Após a obtenção das proteínas puras, foi realizado o teste enzimático para avaliar a atividade das proteínas e foi observado que a proteína mutante rLID1_D possui atividade enzimática similar a proteína wildtype rLID1 enquanto a proteína rLID1_W possui atividade enzimática superior. Em seguida, foi realizado o teste biológico em coelho e foi constatado que as proteínas mutantes são capazes de causar dermonecrose, porém, a proteína rLID1_W, na quantidade testada, possui capacidade muito inferior a proteína wildtype. Nossos dados indicam que as mutações na região C-Terminal da rLID1 impactam na atividade enzimática e biológica da proteína. In Brazil, during the year 2015 (last available data), there were 106,983 cases of accidents with venomous animals. Of this total, 19,495 involved spiders (18.22%). The state of Minas Gerais had the highest number of accidents with venomous animals reported with 19,474 recorded cases, of which 2,269 were with spiders (11.6%). Among the accidents with Spider, the genus Loxosceles (brown spider) stands out, responsible for 58% of the spider accidents in which the species was identified. In the world, about 100 different species of Loxosceles have been identified, of which 10 are found in Brazil. The species of major medical importance are: L. intermedia, L. gaucho, L. similis and L. laeta. The venom of the brown spider has an extremely complex composition, containing several toxins. Among the enzymes were identified: hydrolases, hyaluronidases, lipases, peptidases, collagenases, alkaline phosphatase, 5-ribonucleotidase, phosphohydrolases and proteases. Although probably all the enzymes present in the venom are able to contribute in some way to the progression of the injury resulting from the accident, only sphingomyelinases D (SMase D), a lipase present in the venom, were able to produce dermonecrotic lesions, hemolysis and platelet aggregation In laboratory animals. It has been demonstrated in the laboratory that SMase D has several substrates and although it has been demonstrated that in physiological medium the SMase D of L. laeta is capable of releasing choline from lysophosphatidylcholine (LPC), an immunosin- guishing molecule derived from phosphatidylcholine (PC), thus generating lysophosphatidic acid (LPA), known to induce various biological and pathological responses, the mechanism of SMAse D causing dermonecrosis is still not fully elucidated. Recently, a well conserved motif was identified in the C-Terminal portion of SMasesD (ATXXDNPW) of different species and genera, shortly after the last -helix of the TIM barrel ( / )8. Thus, the objective of this work was to evaluate the effects of the conserved D277 and W280 amino acid mutation on the C-terminal portion of the rLID1 sphingomyelinase from the Loxosceles intermedia venom. The recombinant proteins rLID1, rLID1_D (D277A), rLID1_W (W280A) and rLID1_DW (D277A and W280A) were submitted to modeling and molecular dynamics in order to evaluate the impact of mutations in silico. The mutations were found to increase the flexibility of the protein's catalytic loop. After in silico evaluation, the proteins were expressed in BL21 (DE3) Arctic Express, however, only the rLID1, rLID1_D and rLID1_W proteins were soluble. Soluble proteins were purified using affinity chromatography and then, gel filtration chromatography. After obtaining the purified proteins, the enzymatic assay was performed to evaluate the activity of the proteins and it was observed that the mutant rLID1_D has enzymatic activity similar to the wildtype protein rLID1 while the rLID1_W protein has superior enzymatic activity. After that, it was performed a biological assay and mutant proteins were found to be capable of causing dermonecrosis, but the rLID1_W protein, in the concentration used, has much lower capacity than the wildtype protein. Our data indicates that the mutation on C-Terminal of rLID1 impacts both biological and enzymatic activity of the protein.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A peçonha da aranha "armadeira" Phoneutria nigriventer possui diversos componentes biologicamente ativos, dentre eles a toxina PnTx4(6-1), um peptídeo composto por 48 resíduos de aminoácidos e massa molecular de 5,2 kDa. PnTx4(6-1), também denominada δ-ctenitoxin-Pn1a, foi inicialmente descrita como uma neurotoxina inseticida que se liga ao sítio 3 de canais para sódio em sinaptossomas de corda nervosa de barata. Quando injetada por via intracerebroventricular em camundongos (30 μg), PnTx4(6-1) não provocou toxicidade aparente, além disso, esta toxina não apresentou efeito em canais para sódio de músculo esquelético (rSKM1) e de cérebro (rBIIA) de ratos. Posteriormente demonstramos que PnTx4(6-1) possui efeito antinociceptivo frente a três modelos de dor: i) inflamatório, evocado por carragenina; ii) nociceptivo, evocado por prostaglandina E2 e iii) neuropático, evocado por constrição do nervo ciático. Utilizando-se antagonistas verificamos que o sistema canabinoide, via receptor CB1, e o sistema opioide, via receptores μ e δ, estão envolvidos no efeito antinociceptivo evocado por PnTx4(6-1). No presente trabalho baseado na sequencia de aminoácidos de PnTx4(6-1), propusemos e sintetizamos um peptídeo linear, de 13 resíduos de aminoácidos denominado Pep13, na tentativa de reproduzir ou aumentar os efeitos antinociceptivos da toxina nativa. Verificamos que, assim como a toxina nativa, Pep13 apresenta ação antinociceptiva quando administrado por via intratecal e este efeito, também, relaciona-se aos sistemas canabinoide e opioide. Além disto, quando o efeito periférico foi avaliado, por administração intraplantar, Pep13 foi capaz de reverter o limiar hiperalgésico evocado por prostaglandina E2. Relacionada, ainda, ao efeito antinociceptivo periférico foi observada a participação do sistema opioide, uma vez que o antagonista não específico (naloxona) foi capaz de prevenir parcialmente o efeito de Pep13. Com relação ao sistema canabinoide, com a utilização de antagonistas específicos, observou-se a participação dos receptores CB1. Diferentemente da inseto-toxina nativa, Pep13 não causou nenhum efeito aparente quando administrado em moscas. Em conclusão, o peptídeo sintético Pep13, cuja sequência possui 35 resíduos de aminoácidos a menos que a toxina nativa PnTx4(6-1), reproduz os efeitos antinociceptivos apresentados pela mesma, sem entretanto, apresentar toxicidade para insetos e podendo assim, se tornar um bom modelo para novos analgésicos. The venom of the “armed” spider Phoneutria nigriventer has several biologically active peptides, one of them the toxin PnTx4(6-1) is a peptide composed of 48 amino acid residues and molecular mass of 5.2 kDa. PnTx4(6-1), also named δ-ctenitoxin-Pn1a, was initially described as a insecticidal neurotoxin, that binds to site 3 of sodium channels, in nerve cord synaptosomes of cockroach. When intracerebral injected in (30 μg) in mice, PnTx4(6-1) caused no apparent toxicity, moreover this toxin did not affect sodium channels of skeletal muscle (rSKM1) and brain (rBIIa), both of rats. Subsequently, we demonstrated that PnTx4(6-1) has antinociceptive effect in three pain models: i) inflammatory, evoked by carrageenan; ii) nociceptive, evoked by prostaglandin E2 and iii) neuropathic, evoked by constriction of the sciatic nerve. Using diverse receptors antagonists, we verified that the cannabinoid system, via the CB1 receptor, and the opioid system, through the μ and δ receptors, are both involved in the antinociceptive effect of PnTx4(6-1). In the present work, based on PnTx4(6-1) amino acid sequence we proposed and synthesized a linear peptide, with 13 amino acid residues named Pep13, based on the amino acid sequence of PnTx4(6-1) in order to try to reproduce or increase the analgesic effect of the toxin, with a simpler molecule. We verified, similarly to the toxin, the peptide has antinociceptive activity, when intrathecally administered, and this effect is also related to the cannabinoid and opioid systems. In addition, when the peripheral effect was evaluated, by intraplantar admistration, Pep13 was able to reverse the hyperalgesic threshold evoked by prostaglandin E2. Still related to the peripheral antinociceptive effect, the participation of the opioid system was observed, since the nonspecific antagonist (naloxone) was able to partially prevent the effect of Pep13. Regarding the cannabinoid system, by using specific antagonists, the participation of CB1 receptors was observed. Differently from the native toxin, which has a high toxicity to insects, the peptide caused no apparent effect when administered in flies. In conclusion, the synthetic peptide Pep13, which has 35 amino acid residues less than the native toxin PnTx4(6-1), reproduces the antinociceptive effects presented therein, without presenting however insect toxicity and may become a good model for new analgesics.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Aranhas do gênero Loxosceles spp apresentam nas suas glândulas de veneno alta expressão de toxinas pertencentes às famílias das esfingomielinases (Smases) e metaloproteases. Proteínas com atividade hialuronidásica também estão presentes no veneno loxoscélico e foram implicadas no espalhamento do veneno. Diversos estudos têm mostrado que anti-venenos contendo anticorpos dirigidos contra estas famílias de toxinas foram capazes de neutralizar in vivo e in vitro os efeitos tóxicos dos venenos loxoscélicos. Na atualidade, existe uma limitação na produção de antivenenos para fins terapêuticos, devido ao fato de que grandes quantidades de veneno bruto são necessárias para a imunização e testes de potência do antiveneno produzido e principalmente por que estes imunógenos são extremamente tóxicos para o animal produtor. No presente estudo, nós construímos, purificamos e caracterizamos imunologicamente uma proteína quimera recombinante contendo apenas epitopos de células B, lineares e/ou conformacionais previamente mapeados nas três principais classes de toxinas (SmasesD, metaloproteases e hialuronidase) presentes nos venenos das aranhas do gênero Loxosceles relevantes para o envenenamento humano. A proteína produzida mostrou-se não tóxica e induziu a produção de anticorpos com potencial neutralizante tanto in vivo quanto in vitro, sendo assim um potencial candidato para a substituição de veneno bruto no protocolo de produção de antivenenos. Spiders from the genus Loxosceles spp show high expression of sphingomyelinases (Smases) and metalloproteinase within its venom glands. Indeed, Smases can reproduce the main symptoms of loxoscelism, whereas metalloproteinases may be involved in hemorrhagic activity. Proteins with hyaluronidasic activity are also present transcripts and are implied in venom spreading. Several studies have shown that antivenoms containing antibodies directed against these proteins are capable of neutralizing in vivo and in vitro the toxic effects of loxoscelic venoms. However, nowadays, antivenom production for therapeutic purposes is limited, due to the fact that great amounts of crude venom is required for immunization and potency tests and, above all, because this immunogen is extremely toxic for the producer animal. For this reason, there is great interest in evaluating possibilities to replace or reduce the amount of crude venom used in antivenom production. In the present study, we have constructed, purified and immunologically characterized a recombinant chimeric protein containing only linear and/or conformational B cell epitopes previously mapped on the three main classes of toxins (SmasesD, metalloproteases and hyaluronidase) present in loxoscelic venom, relevant for human envenomation. The protein produced proved to be non-toxic and induced the production of antibodies with neutralizing potential both in vivo and in vitro.

Made available in DSpace on 2017-07-21T20:00:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Murilo Delgobo.pdf: 2288840 bytes, checksum: d9ce3a086e9ee92b92ac76ac76264e04 (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 Brown-Spider’s venom (Loxosceles sp.) is presented as a complex mixture of toxins, able to induce skin necrosis with gravitational spreading, intense inflammatory response, edema induction and increase in vascular permeability in vivo. Recently, the biotechnological potential of the toxins was explored by its use in clinical test, in the study of inflammatory response, as a research tool in cell biology, as a biopesticide and in immunotherapy, through the production of antiserum. In this context, immunotherapy is broadly spread through the production of vaccines, available for the treatment of deleterious reactions developed in accidents. In the present work, we investigated if immunological tolerance induction to dermonecrotic recombinant toxin (LiRecDT1) and its mutated form (LiRecDT1 H12A), through its oral administration, could modulate inflammatory and deleterious responses triggered by dermonecrotic toxin. For this purpose, an oral tolerance protocol was designed, consisting in the administration of 10 μg of LiRecDT1 and LiRecDT1 H12A three times in a week, for three weeks. Adult Swiss mice were further immunized, and oral tolerance induction was observed by reduction in serum levels of IgG antibody anti-toxin when compared with control group. It was observed that mice tolerant to LiRecDT1 H12A present a reduction in paw edema, caused by the injection of 6 μg of dermonecrotic toxin in plantar surface hind paw. Mice tolerized with LiRecDT1 and challenged with 50 μg of dermonecrotic toxin, exhibited higher survival, when compared to control group. This effect was not observed in mice tolerized to LiRecDT1 H12A. The present findings suggested that oral tolerance induction to LiRecDT1 H12A was able to alleviate inflammatory responses triggered by dermonecrotic toxin in paw edema and oral tolerance to LiRecDT1 increase survivability in challenge. The results shown that LiRecDT1 and LiRecDT1 H12A can be explored as a tool in the induction and study of oral tolerance phenomena. The generation of T regulatory cells (Tregs) and following involvement of immunosuppressive cytokines might take part in the modulation of immune response. O veneno de aranha-marrom (Loxosceles sp.) apresenta-se como uma mistura complexa de toxina, capazes de causar necrose com espalhamento local, intensa resposta inflamatória, indução de edema e aumento da permeabilidade vascular in vivo. Recentemente, o potencial biotecnológico das toxinas foi explorado através de seu uso em análises clínicas, no estudo da resposta inflamatória, como ferramenta de pesquisa na biologia celular, como biopesticidas e na imunoterapia, através da produção de anti-soro. No presente trabalho, foi investigado se a indução de tolerância imunológica à toxina dermonecrótica recombinante (LiRecDT1) e sua forma mutada (LiRecDT1 H12A), através de sua administração oral, poderia modular as respostas inflamatórias e deletérias causadas pela toxina dermonecrótica. Para tal, foi desenvolvido um protocolo para indução de tolerância oral, consistindo na administração de 10 μg de LiRecDT1 e LiRecDT1 H12A três vezes por semana, durante três semanas. Camundongos Swiss fêmeas adultas foram posteriormente imunizadas, e a indução de tolerância foi confirmada pela diminuição nos níveis de anticorpos IgG anti-toxina em relação ao grupo controle, resultado que aponta a obtenção de sucesso na indução de tolerância imunológica. Observou-se que animais tolerantes a LiRecDT1 H12A apresentaram uma diminuição no edema desenvolvida na pata, causado pela aplicação de 6 μg de LiRecDT1 na superfície plantar traseira. Animais tolerizados com LiRecDT1 e desafiados com 50 μg intraperitoneal de toxina dermonecrótica apresentaram maior índice de sobrevivência, quando comparados ao grupo controle. Esse efeito não foi observado em animais tolerizados com LiRecDT1 H12A. Os dados obtidos no presente trabalho sugerem que a indução de tolerância oral à LiRecDT1 H12A é capaz de atenuar o desenvolvimento da resposta inflamatória no edema de pata, enquanto a tolerância oral a LiRecDT1 foi capaz de aumentar a sobrevivência em animais desafiados com LiRecDT1. Os resultados demonstram que as toxinas LiRecDT1 e LiRecDT1 H12A podem ser exploradas como ferramenta na indução e estudo da tolerância oral. A geração de células T regulatórias (Tregs) e subsequente participação de citocinas imunossupressoras devem estar envolvidas na modulação da resposta imune.

O envenenamento por aranhas do gênero Loxosceles provoca um conjunto de sinais e sintomas, chamado de loxoscelismo, que na maioria dos casos manifesta-se através do quadro dermonecrótico. O modelo mais utilizado para o estudo do loxoscelismo cutâneo é o coelho. No entanto, o desenvolvimento de um modelo animal de menor porte, fácil manuseio, menor custo e manutenção são necessários para o estudo da patogênese do loxoscelismo. A inflamação provocada pelo veneno bruto de Loxosceles similis, foi avaliada considerando a ativação de neutrófilos e macrófagos, vasodilatação, hiperemia, edema, hemorragia e a produção do TNF e VEGF utilizando o modelo murino de implante de esponjas. Trinta e dois camundongos Swiss, machos (6-8 semanas) foram implantados subcutaneamente com discos de esponjas de poliéster-poliuretano. Quatorze dias após a implantação os animais foram separados em dois grupos: (1) grupo controle: 16 camundongos que receberam intraimplante 30 L de solução salina; (2) grupo tratado: 16 camundongos que receberam a injeção intra-implante de 30 L (0.5 g) do veneno bruto de L. similis. Os animais foram eutanaziados com xilazina/quetamina 1h e 4h pós-injeção intra-implante. Microscopicamente, os implantes dos grupos tratados apresentaram inflamação aguda caracterizada por: infiltrado neutrofílico, edema, vasodilatação, hiperemia e hemorragia intensa. Alguns vasos apresentaram-se com as suas paredes rompidas. Através da análise morfométrica foi possível observar que a área de vasos foi significativamente maior nos grupos tratados. Os parâmetros bioquímicos como: conteúdo de hemoglobina, níveis das citocinas fator de necrose tumoral (TNF), fator de crescimento endotelial (VEGF), atividade das enzimas n-acetil- - glucosaminidase (NAG) e mieloperoxidase (MPO) foram significativamente maiores nos grupos tratados. Os efeitos do veneno de Loxosceles no tecido de granulação do implante em camundongos foram similares ao que se observa no loxoscelismo cutâneo em outras espécies (humanos ou coelhos). Consequentemente, o modelo murino de implante de esponjas promove um novo método para investigação de mecanismos celulares e moleculares associados com o loxoscelismo cutâneo.O envenenamento por aranhas Loxosceles conduz a um conjunto de sinais e sintomas, denominado loxoscelismo, que na maioria dos casos se manifesta sob o quadro dermonecrótico. Neste estudo, utilizou-se o modelo de implante subcutâneo de esponja em camundongo para descrever os efeitos do veneno de Loxosceles similis, com ênfase em 24 h após a injeção intraimplante e para avaliar a patogenia do loxoscelismo 1, 4 e 24 horas após a injeção do veneno. O presente trabalho tem como objetivos: (1) caracterizar histologicamente os efeitos do veneno bruto de L. similis no implante subcutâneo de esponjas; (2) quantificar os mastócitos do implante e mensurar sua atividade de desgranulação; (3) quantificar os subtipos de colágeno tipo I e III; (4) verificar, quantificar e avaliar a importância da apoptose no implante 1, 4 e 24 horas após a injeção do veneno na patogenia do loxoscelismo. Trinta camundongos Swiss (6-8 semanas, machos) foram implantados subcutaneamente com esponjas de poliéster-poliuretano. Após o 14º dia de implante, os animais foram divididos em seis grupos (n=5 para cada grupo): três grupos controles (C1h, C4h e C24 h), no qual receberam a injeção intraimplante de 30L de solução salina e três grupos tratados (T1h, T4h e T24 h), no qual receberam a injeção intraimplante de 30L (0,5 g) do veneno de L. similis. Após os intervalos de 1, 4 e 24 horas os animais foram eutanaziados, os implantes foram colhidos e processados para microscopia de luz e eletrônica. À microscopia de luz observouse, nos implantes injetados com veneno, inflamação aguda com intenso edema, presença de trombos ocludentes, vasculite, aumento dos índices de mastócitos e de desgranulação de mastócitos e de apoptose de células gigantes. Além disso, observou-se degradação de colágeno dos tipos I e III. As análises das ultraestruturas evidenciaram-se vários tipos celulares em apoptose. Os presentes resultados sugerem que a apoptose, a desgranulação de mastócitos e a degradação do colágeno são importantes na patogenia do loxoscelismo e sua ocorrência em alguns tipos celulares pode explicar a dificuldade no reparo da úlcera que comumente se observa no loxoscelismo. Envenomation by Loxosceles spider bite leads to a set of signs and symptoms, called loxoscelism, which in most cases manifests through the dermonecrotic frame. The development of a smaller size animal model, of easy handling and maintenance, and lower cost is needed to study the loxoscelism pathogenesis. The inflammatory effects of the Loxosceles similis crude venom was evaluated considering neutrophil and macrophage activation, vasodilatation, hyperhaemia, edema, hemorrhage and TNF- and VEGF production using the murine sponge implant model. Thirty two, male, Swiss mice (68 weeks old) were implanted subcutaneously with polyetherpolyurethane sponge discs. Fourteen days post implantation, animals were separated into two groups: (1) control group16 mice received 30 L of saline intra-implant; (2) treated group-sixteen mice injected with 0.5 g/30 L of L. similis crude venom intra-implant. The animals were euthanized with xylazine/ketamine after 1 and 4 h post-injection. Microscopically, implants of the treated groups presented an acute inflammation characterized by: neutrophilic infiltrate, edema, vasodilatation, hyperhaemia, and severe hemorrhage. Some vessels presented ruptured walls. Under morphometric analysis, vessel area was bigger in the treated groups compared with the control ones. The biochemical parameters, hemoglobin content, levels of the cytokines tumor necrosis factor (TNF) and vascular endothelial growth factor (VEGF), inflammatory enzyme activities n-acethyl--glucosaminidase (NAG) and myeloperoxidadase (MPO) were also significantly higher in the venom-treated groups. The effects of Loxosceles venom in the granulation tissue of the implant in mice were similar to those observed in cutaneous loxoscelism in other species (human and rabbits). Consequently, the murine sponge implant model provides a new method to investigate cellular/molecular mechanisms associated with cutaneous loxoscelism.Envenomation by the Loxosceles spider causes loxoscelism, a pattern of signs and symptoms that primarily manifests in the dermonecrotic form. Our studies have shown that a mouse subcutaneous sponge implantation model may be useful in evaluating the effects of Loxosceles similis venom. This model provides an ideal microenvironment in which to study loxoscelism; however, it is still important to evaluate its pathogenesis and to observe the effects of L. similis venom for longer time periods than those in previous studies of this model. The aims of this study are: (1) to histologically characterize the effects of L. similis crude venom in a subcutaneous sponge implant; (2) to quantify the mast cells present in the implant and to measure their degranulation activity; (3) to quantify collagen subtypes I and III; and (4) to verify, quantify, and evaluate the effects of apoptosis in the implant on the pathogenesis of loxoscelism at 1h, 4h, and 24 h after injecting the venom. Thirty Swiss mice (6-8 weeks, male) were subcutaneously implanted with polyester-polyurethane sponge discs. Fourteen days post-implantation, the animals were divided into six groups (5 animals per group): three control groups (C1h, C4h, and C24h), in which the mice received 30 l injections of intra-implant saline, and three treated groups (T1h, T4h, and T24h), in which the mice received 30 L (0.5 g) injections of L. similis crude venom at 1h, 4h, and 24 h intervals. After each time interval, the animals were euthanized, and the implants were harvested and processed for light and electron microscopic analyses. The following results were observed in the implants harvested from the treated groups: acute inflammation with marked edema, thrombus, and vasculitis, as well as increased levels of mast cells and mast cell degranulation, and apoptosis in giant cells. Furthermore, degradation of collagen types I and III was observed. An analysis of the ultrastructure revealed apoptosis in various cell types. The present results suggest that apoptosis in some cell types associated with an increase in mast cell degranulation and the degradation of collagen fibers are important in the pathogenesis of loxoscelism therefore may explain the difficulty in repairing the ulcer is commonly observed in severe cases of loxoscelism cutaneous in humans.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo A peçonha da aranha Phoneutria nigriventer, conhecida como “aranha armadeira”, possui diversos componentes biologicamente ativos. Entre os sintomas decorrentes da picada desse animal destacam-se dor local, excitação, salivação, lacrimejamento, priapismo, convulsão e paralisia flácida e espástica dos membros anteriores e posteriores. A toxina PnTx4(6-1) foi isolada da fração PhTx4 deste veneno, sendo um polipeptídeo de cadeia única composto por 48 resíduos de aminoácidos, cuja massa é de 5244,6 Da. PnTx4(6-1) foi inicialmente descrita como uma neurotoxina inseticida, que liga-se ao sítio 3 de canais para sódio em sinaptossomas de barata (Periplaneta americana). Entretanto, canais para sódio de músculo esquelético (rSKM1) e cérebro (rBIIA), ambos de ratos, não foram alvos da toxina PnTx4(6-1). Estes resultados corroboraram resultados anteriores em que a injeção intracerebral da toxina purificada (15 e 30 μg), em camundongos, não provocou toxicidade aparente. O presente estudo avaliou o efeito antinociceptivo da toxina PnTx4(6-1) frente a hiperalgesia evocada por carragenina, prostaglandina E2 e por constrição do nervo ciático. A atividade antihiperalgésica foi avaliada pelo teste de retirada da pata do rato submetida à compressão, descrito originalmente por Randall & Selitto, em 1957. A hiperalgesia no modelo de dor inflamatória foi causada pela injeção intraplantar de 250 μg de carragenina. Quando administrada no mesmo local, após intervalo de duas horas e trinta minutos, a toxina PnTx4(6-1) (5 μg) foi capaz de restaurar o limiar nociceptivo da pata dos animais. A hiperalgesia, no modelo de dor nociceptiva, foi evocada pela injeção intraplantar de 2 μg de prostaglandina E2. A administração central da toxina, por injeção intratecal, causou um efeito antinociceptivo dose-dependente. As doses de 200 e 400 pmoles reverteram totalmente o efeito hiperalgésico evocado por prostaglandina E2, tendo duração de 20 minutos. Medidas na pata contralateral revelaram que PnTx4(6-1), quando administrada pela via intratecal, não altera o limiar nociceptivo da pata não tratada. Com relação ao modelo de dor neuropática a toxina na dose de 100 pmoles reverteu, com duração de dez minutos, a hiperalgesia evocada por constrição do nervo ciático. A investigação das propriedades biológicas das toxinas animais e a perspectiva de sua utilização para o alívio da dor demonstram forte potencial terapêutico. The venom of the “armed” spider Phoneutria nigriventer has several biologically active components including peptides, proteins, amino acids, salts etc. The symptoms resulting from this animal’s bite comprise local pain, arousal, salivation, lacrimation, priapism, seizures and spastic and flaccid paralysis of the anterior and posterior limbs. The toxin PnTx4(6-1), isolated from the PhTx4 fraction of these venom, is a single chain polypeptide composed of 48 amino acid residues, with a mass of 5244.6 Da. This polypeptide was initially described as a neurotoxin insecticide. PnTx4(6-1) appears to bind to site 3 of sodium channels in nerve cord synaptosomes of cockroach (Periplaneta americana) and slow down inactivation of sodium current in isolated axon of insect, without affecting sodium channels of skeletal muscle (rSKM1) and brain (rBIIA), both of rats. This result corroborated previous assays in which the intracerebral injection of the toxin (up to 30μg) in mice caused no apparent toxicity. The present study evaluated the antinociceptive effect of the PnTx4(6-1) in three experimental pain models, using the test paw withdrawal, subjected to compression (Randall & Selitto, 1957). The hyperalgesia in inflammatory pain model was caused by intraplantar injection of 250 μg of carrageenan. When administered in the same place, after an interval of two hours and thirty minutes, PnTx4(6-1) (5 μg) was able to restore the nociceptive threshold of the animals. The hyperalgesia in nociceptive pain model, was evoked by intraplantar injection of 2 μg of prostaglandin E2 (PGE2). The central administration of PnTx4(6-1) by intrathecal injection caused a dose-dependent antinociceptive effect against the hyperalgesia induced by PGE2. Briefly, a dose of 100 pmoles was able to raise the nociceptive threshold of the paw of rats, and the doses of 200 and 400 pmoles totally reversed the hyperalgesic effect evoked by PGE2, with duration of 30 minutes. The measurements in the contralateral paw revealed that PnTx4(6-1), when centrally administered, does not alter the nociceptive threshold of the paw untreated. Concerning to the neuropathic pain model the toxin (100 pmoles) reversed, lasting ten minutes, the hyperalgesia evoked by constriction of the sciatic nerve. This research with PnTx4(6-1) indicates a strong therapeutic potential to this molecule as a possible model to new analgesic.

O veneno da aranha Phoneutria nigriventer contém vários peptídeos que atuam em diferentes canais e receptores do sistema nervoso de insetos e mamíferos. As toxinas Tx3-6 e Tx3-4 são bloqueadoras de canais de cálcio sensíveis a voltagem e possuem um grande potencial farmacológico no tratamento da dor e na neuroproteção. Como apenas pequenas quantidades de cada toxina podem ser isoladas do veneno, testes farmacológicos e estruturais ficam restritos à obtenção destes peptídeos. Neste trabalho, nós testamos diferentes sistemas de expressão e purificação na tentativa de obtermos as toxinas Tx3-6 e Tx3-4 recombinantes funcionais e em grandes quantidades. A toxina Tx3-6 recombinante expressa no vetor pBADmycHis em E. coli teve efeito analgésico comparável à toxina nativa no teste da formalina em ratos, porém, o rendimento da expressão foi de apenas 0,3 mg/L de cultura. Cerca de 2 mg da mesma toxina foram obtidos no sistema pE-SUMO (E. coli), mas a toxina não teve nenhum efeito no bloqueio de glutamato em sinaptosomas corticais de camundongos. A Tx3-4 também foi expressa no sistema SUMO, de onde foram obtidos cerca de 800 g/L da toxinarecombinante solúvel e funcional e cerca de 3 mg/L da toxina insolúvel que foram renaturados in vitro e renderam 2 mg funcionais. Expressões nos sistemas pPICZ (leveduras), pET (E. coli) e pBADHis (E. coli) foram insatisfatórias devido a baixos rendimentos, expressão em corpos de inclusão e obtenção das toxinas de forma inativa. A caracterização da estrutura secundária da toxina Tx3-4 por dicroísmo circular revelou que a maior parte da sua estrutura apresenta um enovelamento aleatório, mas que a toxina contém também estruturas em -hélice e, em menor quantidade, folhas . Este arranjo é semelhante ao observado para oxytoxinas do veneno da aranha Oxyopes lineatus, que também são bloqueadoras de canais de cálcio sensíveis a voltagem. Apesar da disponibilidade de inúmeros sistemas de expressão, a produção de proteínas recombinantes funcionais ainda é uma tarefa difícil. A expressão funcional das toxinas recombinantes Tx3-6 e Tx3-4 criaram novas expectativas para futuros testes farmacológicos e análises estruturais e os resultados obtidos com a renaturação da toxina Tx3-4 abrem novos caminhos para a obtenção de toxinas em larga escala The venom of the spider Phoneutria nigriventer contains several peptides that act on ion channels and receptors of the nervous system of insects and mammals. The toxins Tx3-6 and Tx3-4 are voltage-gated calcium channel blockers and have shown a pharmacological potential in the treatment of pain and in neuroprotection. Only small amounts of these toxins can be purified from the venom and pharmacological and structural tests depend on their availability. In this work, we tested different expression and purification systems in order to identify the best method of getting functional toxins Tx3-6 and Tx3-4 in large amounts. The recombinant toxin Tx3-6 expressed in the vector pBADmycHis in E. coli was functional, however, the expression yield was only 0,3 mg/L of culture. Two miligrams of Tx3-6 was obtained using the SUMO system (E. coli) but the recombinant toxin was not functional. The Tx3-4 was also expressed in the SUMO system and approximately 800 g/L of a soluble functional recombinant toxin was produced. Three miligrams of insoluble Tx3-4 was also purified by the SUMO system and after refolding in vitro, we got 2 mg/L of a functional toxin. Expressions carried in the systems pPICZ (yeast), pET (E. coli) and pBADHis (E. coli) were unsuccessful due to low yield, expression as inclusion bodies and production of inative toxins. The secondary structural caracterization of the recombinant toxin Tx3-4 by circular dichroism revealed that the peptide is mainly arranged in random coil but it has some -helices and, in a lower percentage, -sheet structures are also present. This structure is similar to that described for the oxytoxins from the venom of the spider Oxyopes lineatus, which are also voltage-gated calcium channel blockers. Despitethe availability of numerous gene fusion systems, recombinant protein expression in Escherichia coli remains difficult. The functional expression of the toxins Tx3-6 and Tx3-4 created new expectations for further pharmacological and structural analysis and the results obtained from the refolding of the Tx3-4 opened new pathways for the production of these toxins in large scale

A propagação ascendente dos sinais dolorosos envolve trocas iônicas na membrana plasmática das células nervosas em resposta ao potencial de ação. Íons cálcio penetram nos terminais sinápticos, principalmente por canais de cálcio sensíveis a voltagem, disparando a exocitose em resposta aos potenciais de ação, culminando com a comunicação neuronal e, portanto, com propagação dos sinais sensórios. A toxina Ph1, isolada do veneno da aranha P. nigriventer é potente bloqueadora de canais de cálcio sensíveis a voltagem com especificidade para canais Tipo-N, possuindo ação antinociceptiva em modelos de dor aguda e crônica em ratos. Essa e outras toxinas bloqueadoras de canais de cálcio sensíveis a voltagem obtidas do venenvo da P. nigriventer também vem sendo investigadas quanto ao seu potencial antinociceptivo, mas o mecanismos dessas toxinas sobre a sinalização de cálcio em nociceptores ainda não é conhecido. O objetivo desse trabalho foi estudar como as principais -toxinas da P.nigriventer afetam as mudanças dos níveis de Ca2+ em nociceptores em resposta a um estímulo, com foco na sinalização de cálcio mediada por canais de cálcio sensíveis a voltagem Tipo-N e no receptor vanilóide tipo-1. Estudamos também como Ph1 e Tx3-4 modulam isoformas de canais tipo-N codificadas por diferentes variantes de splicing alternativo do RNAm. Tx3-4 e Ph1 inibiram o aumento dos niveis de Ca2+, induzido por KCl, em neurônios DRGs dissociados, sendo a Tx3-4 mais eficaz dentre as -phonetoxinas testadas. Entretanto, o bloqueio da Ph1 foi mais eficaz em neurônios de menor diâmetro. Além disso, a Ph1 inibiu a elevação da [Ca2+]i induzida por capsaicina, efeito que foi mais pronunciado em DRGs submetidos a processo inflamatório prévio. Em células transfectadas com receptor vanilóide, a Ph1 exerceu bloqueio modesto mas significativo da elevação da [Ca2+]i induzida por capsaicina. A Tx3-4 exerce bloqueio mais significativo em canais tipo-N contendo o éxon 37a ao invés de 37b. Juntos, esses dados mostram que as -phonetoxinas inibem a sinalização de cálcio em nociceptores. Além disso, mostramos, pela primeira vez, que isoformas de canais iônicos contendo diferentes variantes de splicing, podem ter identidades farmacológicas distintas. Propagation of ascending painful signals involves ionic exchanges throughout the plasma membrane of nerve cells in response to an action potential. Calcium ions penetrate the cell, mainly through voltage gated calcium channels, triggering exocytosis in cells in response to the action potentials, culminating with neuronal communication and thus, propagation of the sensory signals. The toxin Ph1, isolated from the venom of the spider P. nigriventer, is a potent blocker of N-type voltage gated calcium channels and pocesses antinociceptive action in acute and cronic pain models in rats. Ph1 and others toxins from P. nigriventer venom are being investigated regarding to its antinociceptive potentials, however the precise mechanism of such toxins on the calcium signaling in nociceptors is still unknown. The aim of this work was to study how the main -toxins from P. nigriventer venom affect the changes in intracellular Ca2+ levels in nociceptors in response to stimulus, focusing on calcium signaling mediated by N-type VGCCs as well as in the vaniloid-1 receptor. We also aimed to study how Ph1 and Tx3-4 modulates the function of isoforms of N-Type channels codified by variants of alternative splicing of mRNA. Tx3-4 and Ph1 inhibited KCl-induced increase in Ca2+ levels from dissociated DRG neurons, with Tx3-4 being more efficient between other tested - phonetoxins, in inhibiting such response. However, Ph1 blockage was more efficient in small diameter neurons. Furthermore, Ph1 inhibits capsaicin-induced calcium increase; such effect was more pronounced in DRGs from rats previously submitted to an inflammatory process. At ells transfected with the vaniloid receptor, Ph1 slightly blocked the [Ca2+]i elevation induced by capsaicin. Tx3-4 exerts stronger blockage in N-Type channels that contains exon 37a rather than 37b containing ones. Together these data shows that -phonetoxins inhibits calcium signaling in nociceptors. Moreover, we have shown, for the first time that isoforms of ionic channels containing distinct splicing variants might have differential pharmacological identities.

Acidentes com aranhas do gênero Loxosceles são um problema de relevância médica no Brasil. A picada da Loxosceles induz lesão dermonecrótica e hemorrágica, acompanhada, em alguns casos, de manifestações sistêmicas. A lesão dermonecrótica é antecedida pela trombose nos plexos dérmicos pró ximos ao local da picada. Recentemente, tem-se mostrado que a descamação de células endoteliais na proximidade da placa ateromatosa via apoptose predispõe à trombose. Apoptose é um tipo de morte celular que se processa com gasto de energia, além de síntese e degradação proteicas. Ainda não há, na literatura, a descrição das lesões histológicas produzidas pelo veneno da L. similis e, tampouco, estudos in vivo que demonstrem se o mesmo induz apoptose de células endoteliais. Os objetivos deste estudo foram: (1) analisar histologicamente e relatar, pela primeira vez, a lesão induzida na pele de coelhos injetados com o veneno de L. similis e (2) avaliar a importância da apoptose no mecanismo do loxoscelismo. Foram utilizados 40 coelhos Nova Zelândia, machos que foram divididos em 2 grupos: (1) controle injetados intradermicamente com 50 µl de PBS e (2) tratado injetados intradermicamente com 0,5 µg de veneno bruto diluído em 50 µl de PBS. Os grupos foram analisados 2, 4, 6 e 8 horas após a injeção. Fragmentos de pele foram colhidos, fixados em formol tamponado a 10% e processados rotineiramente para a inclusão em parafina. Cortes de 5 µm foram corados em HE. Algumas secções foram submetidas à reação de TUNEL e a imunoistoquímica para Bax. Algumas amostras de pe le foram também fixadas em glutaraldeído para inclusão em metacrilato. Secções de 3 µm foram coradas em HE. A análise microscópica mostrou que o veneno bruto da L. similis induz a uma lesão caracterizada por: edema envolvendo toda a derme e se estendendo a té o músculo cutâneo, trombose em todas as camadas da derme, infiltrado inflamatório predominantemente heterofílico, necrose fibrinóide em paredesarteriolares, hemorragia dérmica e necrose do músculo cutâneo. A intensidade da lesão progrediu com o intervalo de tempo. Além destas alterações, a partir de 2 horas de injeção do veneno, observou-se, em alguns vasos, a presença de células endoteliais contraídas, apresentando perda de adesão entre si e com a matriz extracelular (anoiquia), contendo núcleo retraído, carioteca irregular e cromatina condensada, caracterizando apoptose. Algumas secções foram submetidas à reação de TUNEL e a imunoistoquímica para Bax. A consequente descamação do endotélio via apoptose parece ser o principal fator indutor de trombose nos plexos dérmicos que culmina com a dermonecrose característica do loxoscelismo cutâneo. Com base no presente estudo pode -se concluir que o veneno de L. similis induz apoptose de células endoteliais. Accidents with Loxosceles spiders represent a relevant medical problem in Brazil. The Loxosceles bite to a dermonecrotic and hemorrhagic injury that can be followed by systemic manifestations. The dermonecrotic injury is preceded by thrombus formation in dermal vessels near to the bite site. It was shown recently that apoptosis of endothelial cell surrounding atherosclerotic plaques predisposes to thrombosis. Apoptosis is a kind of cellular death that is carried out with e nergy expenditure, besides protein synthesis and degradation. Up to now, there are no studies in vivo showing whether the poison of L. similis induces apoptosis of endothelial cells. Additionally, there are no descriptions of the histological lesion induced by the L. similis bite. The aim of this study is: (1) to analyze histologically at first, the induced injury in the skin of rabbits inoculated with the poison and (2) to evaluate the importance of apoptosis in the mechanism of the loxoscelism. Forty male rabbits were divided in 2 groups: (1) control - inoculated intradermically with 50 µl of PBS and (2) treated- inoculated intradermically with 0,5 µg of the L. similis crude venom diluted in 50 µl of PBS. Animals were analyzed 2, 4, 6 and 8 hours after inoculation. Fragments of skin were collected, fixed in 10% buffered formalin, routinely processed and paraffin embedded. Sections of 5 µm were stained with HE. Some sections were submitted to the TUNEL reaction and other sections were submitted to immunohistochemical detection of Bax. Skin samples were also fixed in glutaraldehyde and embedded in methacrylate. Sections 3 µm thick were stained with HE adapted to methacrylate. The crude L. similis venom induces a lesion characterized by oedema, inflammatory infiltrate predominantly heterophilic, fibrinoid necrosis of the arterial and arteriolar walls, thrombosis in all dermal layers and necrosis of the cutaneous muscle whose intensity progressed with the time interval. The lesion intensity increased with the inoculation time becoming into severe heterophilic dermatitis 8 hours post inoculation. A similar lesion is observed in experiments using the crude venom of other Loxosceles species. Additionally, 2 hours post inoculation, shrunken endothelial cells were noted, losing adhesion one to another and to the extracellular matrix (anoykic cells), containing basophilic nuclei, and condensed chromatin, suggesting apoptosis. Some sections were subjected to TUNEL assay and immunohistochemistry for Bax. Present data suggest that the crude L. similis venom induces apoptosis of endothelial cells. On the basis of the present study it can be concluded that the poison of L. similis induces apoptosis of endothelial cells.

O influxo de cálcio através de canais de cálcio regulados por voltagem (CCSVs) medeia a informação nociceptiva no corno dorsal da medula espinhal. A administração intratecal dos bloqueadores de CCSVs, tais como a -conotoxina-MVIIA (-CTx-MVIIA), tem efeito analgésico, mas estreita janela terapêutica, apresentando muitos efeitos adversos. O veneno da aranha brasileira Phoneutria nigriventer contém uma variedade de substâncias com ação predominantemente neurotóxica, dentre elas a toxina Ph1 que foi recentemente descrita como uma potente bloqueadora da neurotransmissão por interagir com canais de cálcio sensíveis a voltagem tipo N. Neste estudo, verificamos o potencial analgésico da Ph1, administrada por via intratecal, em modelos de dor aguda e persistente em roedores. A Ph1 produziu antinocicepção prolongada e com grande eficácia no modelo da placa quente em camundongos, quando comparada com a -CTx-MVIIA. Além disso, a Ph1 ou a -CTx-MVIIA não produziram efeitos adversos motores em camundongos. Quando avaliadas em ratos, a Ph1 foi mais efetiva e potente do que a -CTx-MVIIA não somente em prevenir a nocicepção induzida pela formalina, todadvia especialmente em reverter a nocicepção inflamatória persistente, previamente instalada. Além do mais, a ação analgésica de ambas as toxinas foi relacionada com a inibição da liberação de neurotransmissores pró-nociceptivos evocados por cálcio na medula espinhal, como o glutamato. Quando os efeitos adversos foram avaliados em ratos, verificamos que a Ph1 teve um índice terapêutico maior que a -CTx-MVIIA. Porém, ambas as toxinas foram capazes de produzir alterações na pressão arterial. Entretanto, o tratamento com a toxina Ph1 é capaz de reduzir a nocicepção aguda induzida por incisão cirúrgica ou crônica xiv causada por atrite ou por lesão do nervo ciático em roedores. Por fim a toxina recombinante Ph1 expressa em Escherichia coli mostrou uma atividade antinociceptiva similar à toxina nativa. Assim, o presente estudo demonstrou que a toxina Ph1 apresentou efeitos analgésicos em diferentes modelos de dor, sugerindo que esta toxina pode ter potencial para ser usado como uma droga para o controle da dor persistente. Calcium influx through voltage sensitive calcium channels (VSCCs) plays an important role on the nociceptive transmission in the dorsal horn of the spinal cord. The intrathecal administration of VSCCs blockers, such as -conotoxin-MVIIA (-CTx-MVIIA) has analgesic effect, but it narrows the therapeutic window, presenting many adverse effects. The Brazilian spider Phoneutria nigriventer venom contains a variety of substances with predominantly neurotoxic action, among them the Ph1 which was recently described as a potent neurotransmission blocker for interacting with N-type voltage sensitive calcium channels. In this study, we verify the analgesic potential of Ph1 by its intrathecal administration in acute and persistent pain models in rodents. The Ph1 produced a prolonged antinociception and with great effectiveness in the hot plate model in mice when compared to -CTx-MVIIA. However, Ph1 or -CTx-MVIIA did not produce adverse motor effects in mice. Ph1 was more effective and powerful than -CTx-MVIIA when assessed in rats, not only in preventing the nociception induced by formalin, but particularly in reversing the persistent inflammatory nociception previously installed. Furthermore, the analgesic action of both toxins was related to inhibition of pro-nociceptive neurotransmitter release evoked by calcium in the spinal cord, such as glutamate. When the adverse effects were evaluated in rats, we verified that Ph1 had a therapeutic index higher than -CTx-MVIIA. However, both toxins were able to produce blood pressure alterations. In addition, the treatment with Ph1 toxin is able to reduce the acute nociception induced by surgical incision, or chronic, caused by arthritis or by sciatic nerve injury in rodents. Finally, the recombinant Ph1 toxin xvi expressed in Escherichia coli showed an antinociceptive activity similar to native toxin. Thus, the present study demonstrated that Ph1 toxin presented analgesic effects in different models of pain, suggesting that this toxin may have a potential to be used as a drug for the control of the persistent pain.