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Agradecimentos: We thank ER, GF, and LS for technical assistance. This work was supported by funding provided by the Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo, Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico, grants from the Trust in Science Initiative from Glaxo-Smithkline, UK, and the National Institutes of Health (DK089036, DK098466; EAS). The Laboratories of Cell Signaling and Experimental Endocrinology belong to the Obesity and Comorbidities Research Center and the National Institute of Science and Technology—Diabetes and Obesity Abstract: Background/Objectives Hypothalamic neurons play a major role in the control of body mass. Obese subjects present radiologic signs of gliosis in the hypothalamus, which may reflect the damage or loss of neurons involved in whole-body energy homeostasis. It is currently unknown if hypothalamic gliosis (1) differs between obese nondiabetic (ND) and obese diabetic subjects (T2D) or (2) is modified by extensive body mass reduction via Roux-n-Y gastric bypass (RYGB). Subjects/Methods Fifty-five subjects (all female) including lean controls (CT; n = 13), ND (n = 28), and T2D (n = 14) completed at least one study visit. Subjects underwent anthropometrics and a multi-echo MRI sequence to measure mean bilateral T2 relaxation time in the mediobasal hypothalamus (MBH) and two reference regions (amygdala and putamen). The obese groups underwent RYGB and were re-evaluated 9 months later. Analyses were by linear mixed models. Results Analyses of T2 relaxation time at baseline showed a group by region interaction only in the MBH (P < 0.0001). T2D had longer T2 relaxation times compared to either CT or ND groups. To examine the effects of RYGB on hypothalamic gliosis a three-way (group by region by time) mixed effects model adjusted for age was executed. Group by region (P < 0.0001) and region by time (P = 0.0005) interactions were significant. There was a reduction in MBH relaxation time by RYGB, and, although the T2D group still had higher T2 relaxation time overall compared to the ND group, the T2D group had significantly lower T2 relaxation time after surgery and the ND group showed a trend. The degree of reduction in MBH T2 relaxation time by RYGB was unrelated to clinical outcomes. Conclusion T2 relaxation times, a marker of hypothalamic gliosis, are higher in obese women with T2D and are reduced by RYGB-induced weight loss FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ Fechado

Agradecimentos: We thank the São Paulo Foundation Research (FAPESP), Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES) and Obesity and Comorbidities Research Center (OCRC) for technical and financial support Abstract: Obesity and aging lead to abnormal transforming growth factor-ß1 (TGF-ß1) signaling in the hypothalamus, triggering the imbalance on glucose metabolism and energy homeostasis. Here, we determine the effect of acute exercise on TGF-ß1 expression in the hypothalamus of two models of obesity in mice. The bioinformatics analysis was performed to evaluate the correlation between hypothalamic Tgf-ß1 messenger RNA (mRNA) and genes related to thermogenesis in the brown adipose tissue (BAT) by using a large panel of isogenic BXD mice. Thereafter, leptin-deficient (ob/ob) mice and obese C57BL/6 mice fed on a high-fat diet (HFD) were submitted to the acute exercise protocol. Transcriptomic analysis by using BXD mouse reference population database revealed that hypothalamic Tgf-ß1 mRNA is negatively correlated with genes related to thermogenesis in brown adipose tissue of BXD mice, such as peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator and is positively correlated with respiratory exchange ratio. In agreement with these results, leptin-deficient (ob/ob) and HFD-fed mice displayed high levels of Tgf-ß1 mRNA in the hypothalamus and reduction of Pgc1a mRNA in BAT. Interestingly, an acute exercise session reduced TGF-ß1 expression in the hypothalamus, increased Pgc1a mRNA in the BAT and reduced food consumption in obese mice. Our results demonstrated that acute physical exercise suppressed hypothalamic TGF-ß1 expression, increasing Pgc1a mRNA in BAT in obese mice COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP Fechado

Agradecimentos: The Laboratory of Cell Signaling is supported by funding provided by the Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo, Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico. The Laboratories of Cell Signaling belongs to the Obesity and Comorbidities Research Center and the National Institute of Science and Technology - Neuroimmunomodulation Abstract: The characterization of the hypothalamic neuronal network, that controls food intake and energy expenditure, has provided great advances in the understanding of the pathophysiology of obesity. Most of the advances in this field were obtained thanks to the development of a number of genetic and nongenetic animal models that, at least in part, overtook the anatomical constraints that impair the study of the human hypothalamus. Despite the undisputed differences between human and rodent physiology, most seminal studies undertaken in rodents that have unveiled details of the neural regulation of energy homeostasis were eventually confirmed in humans; thus, placing experimental studies in the forefront of obesity research. During the last 15 years, researchers have provided extensive experimental proof that supports the existence of hypothalamic dysfunction, which leads to a progressive whole-body positive energy balance, and thus, to obesity. Here, we review the experimental work that unveiled the mechanisms behind hypothalamic dysfunction in obesity FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ Fechado

Agradecimentos: This work was supported by grant # 07/59319-5 Sao Paulo Research Foundation - Fapesp - http://www.fapesp.br/en/ - NBM; grant # 015/2014 - Fundo de Apoio a Dermatologia do Estado de Sao Paulo "Sebastiao Sampaio" - Funadersp - http://www.sbd-sp.org.br/funadersp.php - PENFV; grant #043/2016 - Fundo de Apoio a Dermatologia do Estado de Sao Paulo "Sebastiao Sampaio" - Funadersp - http://www.sbd-sp.org.br/funadersp.php - PENFV; grant # 01P-04520-2013 - Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior - Capes - http://www.capes.gov.br/ - BGL; Fundo de Apoio ao Ensino, a Pesquisa e Extensao, Universidade Estadual de Campinas (0044/17). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript Abstract: The use of medicinal plants and their derivatives is increasing, and approximately one-third of all traditional herbal medicines are intended for wound treatment. Natural products used in these treatments include vegetable oils, which are rich in essential fatty acids. Once in contact with an ulcerative surface, the oil reaches the blood and lymphatic vessels, thus eliciting systemic effects. Objective This study evaluated the local and possible systemic effects of essential fatty acids (sunflower oil) applied topically to rat wounds. Methods Cutaneous punch wounds (6 mm) were produced on the dorsa of 30 rats. Saline (SS), mineral oil (MO) or essential fatty acid (EFA) solutions were applied topically. Healing was evaluated after 2, 4 and 10 days (n = 5 per group) by visual and histological/morphometric examination, second harmonic generation (SHG) microscopy, and cytokine and growth factor quantification in the scar tissue (real-time PCR) and in serum (ELISA). Results MO/EFA-treated animals had higher IGF-1, leptin, IL-6 and IFN-gamma mRNA expression and lower serum IL-6 levels than the control (SS/MO) animals. SHG analysis showed no difference in collagen density between the animals treated with MO and EFA. Conclusion EFA treatment induces topical (observed by local IGF-1, leptin, IL-6 and IFN-gamma production) and systemic effects, lowering IL-6 levels in the serum. As the oil is widely used to shorten ulcer healing time, studies are needed to evaluate the treatment safety and possible undesired effects FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES Aberto

Agradecimentos: The study was supported by grants from the São Paulo Research Foundation (2013/07607-8) and Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Cientifico. INFABIC is co-funded by Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (08/57906-3) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) (573913/2008-0) Abstract: Inflammation is the most relevant mechanism linking obesity with insulin-resistance and metabolic disease. It impacts the structure and function of tissues and organs involved in metabolism, such as the liver, pancreatic islets and the hypothalamus. Brown adipose tissue has emerged as an important component of whole body energy homeostasis, controlling caloric expenditure through the regulation of non-shivering thermogenesis. However, little is known about the impact of systemic inflammation on the structure and function of brown adipose tissue. The relations between IL10 and mitochondria structure/function and also with thermogenesis were evaluated by bioinformatics using human and rodent data. Real-time PCR, immunoblot, fluorescence and transmission electron microscopy were employed to determine the effect of IL10 in the brown adipose tissue of wild type and IL10 knockout mice. IL10 knockout mice, a model of systemic inflammation, present severe structural abnormalities of brown adipose tissue mitochondria, which are round-shaped with loss of cristae structure and increased fragmentation. IL10 deficiency leads to newborn cold intolerance and impaired UCP1-dependent brown adipose tissue mitochondrial respiration. The reduction of systemic inflammation with an anti-TNFa monoclonal antibody partially rescued the structural but not the functional abnormalities of brown adipose tissue mitochondria. Using bioinformatics analyses we show that in both humans and mice, IL10 transcripts correlate with mitochondrial lipid metabolism and caspase gene expression. IL10 and systemic inflammation play a central role in the regulation of brown adipose tissue by controlling mitochondrial structure and function Obesity CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP Aberto

Selected subpopulations of hypothalamic neurons play important roles in the regulation of whole body energy homeostasis. Studies have shown that the saturated fats present in large amounts in western diets can activate an inflammatory response in the hypothalamus, affecting the capacity of such neurons to respond appropriately to satiety and adipostatic signals. In the first part of this review, we will explore the mechanisms behind saturated fatty acid-induced hypothalamic dysfunction. Next, we will present and discuss recent studies that have identified the mechanisms that mediate some of the anti-inflammatory actions of unsaturated fatty acids in the hypothalamus and the potential for exploring these mechanisms to prevent or treat obesity CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP Fechado

Agradecimentos: We thank E. Roman and G. Ferraz from the University of Campinas for technical assistance. Support for the study was provided by the Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo, Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico and grants from the Trust in Science Initiative from Glaxo-Smithkline, UK. The Laboratories of Cell Signaling and Experimental Endocrinology belong to the Obesity and Comorbidities Research Center and the National Institute of Science and Technology–Diabetes and Obesity Abstract: BACKGROUND/OBJECTIVES: The identification of brown/beige adipose tissue in adult humans has motivated the search for methods aimed at increasing its thermogenic activity as an approach to treat obesity. In rodents, the brown adipose tissue is under the control of sympathetic signals originating in the hypothalamus. However, the putative connection between the depots of brown/beige adipocytes and the hypothalamus in humans has never been explored. The objective of this study was to evaluate the response of the hypothalamus and brown/beige adipose tissue to cold stimulus in obese subjects undergoing body mass reduction following gastric bypass. SUBJECTS/METHODS: We evaluated twelve obese, non-diabetic subjects undergoing Roux-in-Y gastric bypass and 12 lean controls. Obese subjects were evaluated before and approximately 8 months after gastric bypass. Lean subjects were evaluated only at admission. Subjects were evaluated for hypothalamic activity in response to cold by functional magnetic resonance, whereas brown/beige adipose tissue activity was evaluated using a (F 18) fluorodeoxyglucose positron emisson tomography/computed tomography scan and real-time PCR measurement of signature genes. RESULTS: Body mass reduction resulted in a significant increase in brown/beige adipose tissue activity in response to cold; however, no change in cold-induced hypothalamic activity was observed after body mass reduction. No correlation was found between brown/beige adipose tissue activation and hypothalamus activity in obese subjects or in lean controls. CONCLUSIONS: In humans, the increase in brown/beige adipose tissue activity related to body mass reduction occurs independently of changes in hypothalamic activity as determined by functional magnetic resonance FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ Fechado

Orientador: Licio Augusto Velloso Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Os desfechos metabólicos e cardiovasculares da obesidade, estão entre os principais determinantes de morte, e nos últimos dois anos, sua associação a casos graves de COVID-19 revelou uma nova face de seu impacto na saúde de seres humanos. Estudos com gêmeos e GWAS (Genome Wide Association Studies) contribuíram para estabelecer o conceito segundo o qual a obesidade é o resultado de uma interação entre determinantes genéticos e exposição a fatores ambientais, o que torna sua prevenção e tratamento ainda mais complexos. Uma das estratégias que pode resultar em aumento do sucesso das abordagens terapêuticas para a obesidade é o desenvolvimento de intervenções que promovam o aumento do gasto energético por termogênese no tecido adiposo marrom/bege (BAT/bege). Neste trabalho foi investigado se há um impacto diferencial de genética e de fatores ambientais na ativação do tecido adiposo marrom, e na homeostase energética, em três linhagens de camundongos, Balb/c/JUnib (Balb), C57BL/6JUnib (C57) e Unib: SW (Swiss), com background genético diferente. Os animais foram comparados quanto as suas diferenças fenotípicas, metabólicas e de ativação do BAT, em condições basais e após intervenção com estímulos ambientais, mais especificamente dieta hiperlipídica e atividade física. Nas condições basais, a linhagem Balb apresentou melhor controle metabólico e térmico, já que foi a linhagem com menor glicemia de jejum, melhor controle de glicemia, menor perda de temperatura do BAT e core quando exposto ao frio agudo e menor massa relativa de tecidos adiposos. Após a intervenção com atividade física, a linhagem Balb foi a única que diminuiu a porcentagem de ganho de peso e melhorou o controle da glicemia, e a linhagem Swiss foi quem teve maior diminuição da massa relativa dos tecidos adiposos brancos. Com a dieta hiperlipídica, as três linhagens aumentaram a porcentagem de ganho de peso, glicemia de jejum e a massa relativa dos tecidos adiposos, e tiveram uma menor perda de temperatura do BAT quando expostos ao frio agudo. A linhagem Balb teve melhores características metabólicas e fenotípicas após a adição dos dois estímulos ambientais, já que teve menor porcentagem de ganho de peso, glicemia de jejum e massa relativa de tecidos adiposos, e teve melhor tolerância glicêmica e controle térmico quando comparada as outras duas linhagens. Não se observou diferenças na composição corporal entre as três linhagens, mas observou-se que a linhagem Balb possui maior expressão de genes termogênicos do BAT, Bmp8b, Pgc-1? e Pm20d1, maior quantidade de proteína no BAT, maiores níveis de HDL e menores níveis de colesterol, após exposição ao frio agudo, quando comparado as demais linhagens. Isso sugere que os fatores genéticos têm um impacto no metabolismo, fenótipo e homeostase energética em camundongos. Além disso, a linhagem Balb possui um background genético que promoveu uma vantagem na capacidade de responder aos riscos e benefícios associados aos estímulos ambientais, tendo melhor controle metabólico, térmico e maior expressão de Pm20d1. Assim, a ativação do BAT, principalmente pela termogênese independente da UCP1, parece ser uma área promissora para explicar a vantagem da linhagem Balb em termos metabólicos e de homeostase energética Abstract: Obesity has become a major cause of death, due to metabolic and cardiovascular disorders associated with it. In the past two years, this disease has also been associated with severe cases of COVID-19, reveling an additional impact of obesity in public health. Studies with twins and GWAS (Genome Wide Association Studies) have identified that obesity is the result of the interaction between lifestyle factors and genetics, which makes its treatment and prevention even more complex. One of the alternative strategies to increase the success of therapeutic approaches to weight loss is the increase in energy expenditure, through thermogenesis, regulated by the beige/brown adipose tissue (BAT). In this study we investigated gene-by-environment interactions on BAT activity and energy expenditure, in three mice strains Balb/c/JUnib (Balb), C57BL/6JUnib (C57) e Unib: SW (Swiss), with different genetic background. These animals were compared regarding its metabolic, phenotypic and BAT activity differences, both in basal conditions and after environmental factors interventions (high fat diet and physical activity). The baseline of these animals revealed that Balb had a better metabolic and thermic control, since it was the strain with lower fasting glucose, better glycemic control, lower BAT and core heat loss after acute cold exposure, and lower relative mass of adipose tissues. After the physical activity intervention, Balb was the only strain that decreased its percentage of weight gain and improved its glycemic control, and Swiss animals had greater decrease in relative mass of white adipose tissue. With the high fat diet, all three strains increased its percentage of weight gain, fasting glucose and relative mass of adipose tissues, and decreased BAT heat loss after cold exposure. Balb was the strain with better metabolic and phenotypic characteristics after the addition of the two environmental factors under analysis, since it had lower percentage of weight gain, fasting glucose and relative mass of adipose tissue, and had better glycemic and thermic control when compared to the other two strains. We did not observe differences in body composition between the three strains, but we did notice that Balb had higher expression of BAT’s thermogenic genes, Bmp8b, Pgc-1? e Pm20d, higher BAT amount of protein, higher levels of HDL and lower levels of cholesterol, after acute cold exposure, comparing with the other two strains. This suggests that genetic factors have an impact on metabolism, phenotype, and energy homeostasis in mice. In addition, Balb has a genetic background that promotes and advantage of this strain to respond to benefits and risks associated with environmental factors, having a better metabolic and thermic control and higher expression of Pm20d1. Hence, BAT activation, specially via UCP-1 independent thermogenesis seems to be a promising area to explain Balb’s superiority in maintaining metabolic and energy homeostasis Mestrado Fisiopatologia Médica Mestra em Ciências FAPESP 2014/07607-8 CAPES 001

Orientador: Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Obesidade e sobrepeso afetam mais da metade da população mundial, sendo hoje considerados problemas de saúde pública. O controle do peso corporal, comportamento alimentar e homeostase energética são mantidos pelo sistema melanocortina hipotalâmico, composto por neurônios de primeira ordem, anorexigênicos (POMC e CART) e orexigênicos (AgRP e NPY), presentes no núcleo arqueado do hipotálamo que detectam tanto níveis hormonais circulantes (leptina, insulina, grelina e colecistoquinina), quanto componentes alimentares (ácidos graxos). Assim, esses neurônios integram esses sinais periféricos e produzem os neuropeptídeos (POMC/CART e NPY/AGRP) que mantém a homeostase energética. Entretanto, o aumento na ingestão de alimentos ricos em gorduras saturadas promove uma regulação anômala do neuropeptídeo POMC e um quadro de inflamação hipotalâmica que leva ao estabelecimento de um fenótipo obeso. Como estratégia terapêutica para manejo da obesidade, são utilizados alguns fármacos, como os análogos do GLP1 (peptídeo 1 semelhante ao glucagon), baseados em receptores acoplados à proteína G (GPCRs). Contudo, além de não existir tratamento efetivo para obesidade, e por ser uma condição patológica sistêmica que afeta vários órgãos, ainda sim se torna necessário a identificação de novos componentes e de novos alvos terapêuticos que possam contribuir no reestabelecimento da homeostase energética. Desse modo, nosso estudo identificou dois novos GPCRs (GPR68e GPR139), ambos presentes no sistema melanocortina hipotalâmico e modulados pelo curto período de alimentação em dieta hiperlipídica (HFD) e por privação de nutrientes. Além disso, nossas abordagens farmacológicas, por meio de moduladores alostéricos do GPR68, mostraram seu efeito no controle da ingestão alimentar. Por meio da inibição parcial do GPR139, pontuamos que esse receptor é importante no controle da glicemia, peso corporal e ingestão alimentar. Logo, os novos participantes, GPR68 e GPR139, caracterizados nesse trabalho, mostraram estar relacionados diretamente com o comportamento alimentar (GPR68 e GPR139), bem como a manutenção adequado do peso corporal e homeostase glicêmica (GPR139) Abstract: Obesity and overweight affect more than half of the world's population, and are now considered public health problems. Control of body weight, feeding behavior and energy homeostasis are maintained by the hypothalamic melanocortin system, composed of first-order, anorexigenic (POMC and CART) and orexigenic (AgRP and NPY) neurons, located in the arcuate nucleus of the hypothalamus that detect both hormonal levels circulating substances (leptin, insulin, ghrelin and cholecystokinin), as well as food components (fatty acids). Thus, these neurons integrate these peripheral signals and produce neuropeptides (POMC/CART and NPY/AGRP) that maintain energy homeostasis. However, the increase food intake of saturated fats promotes an anomalous regulation of the neuropeptide POMC and a state of hypothalamic inflammation that leads to the establishment of an obese phenotype. As a therapeutic strategy for obesity management, some drugs are used, such as GLP1 (glucagon-like peptide 1) analogues, based on G protein-coupled receptors (GPCRs). However, in addition to the fact that there is no effective treatment for obesity, and because it is a systemic condition that affects several organs, it is still necessary to identify new participants and new therapeutic targets that can contribute to the reestablishment of energy homeostasis. Thus, our study identified two new GPCRs (GPR68 and GPR139), both present in the hypothalamic melanocortin system (GPR139 is only express in Agrp and Pomc neurons) and modulated by short-term high-fat diet (HFD) and nutrient deprivation. In addition, our pharmacological approaches, through allosteric modulators of GPR68, have shown its effect on the control of food intake. Through the partial inhibition of GPR139, we pointed out that this receptor is important in the maintenance of fasting glucose levels, body weight and food intake. Therefore, the new participants, GPR68 and GPR139, characterized in this work, showed to be directly related to eating behavior (GPR68 and GPR139), as well as the adequate maintenance of body weight and fasting glucose (GPR139) Doutorado Anatomia Doutor em Biologia Celular e Estrutural CAPES 88882.329652/2019-01

Orientador: Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A obesidade se manifesta de forma pandêmica, acometendo milhões de pessoas, principalmente nos países ocidentais e industrializados. Além dos inúmeros aspectos comportamentais e sociais, o desenvolvimento dessa doença contribui consideravelmente para o aumento da morbidade e mortalidade em decorrência de sua freqüente associação com outras doenças que compõem a síndrome metabólica, tais como, diabetes mellitus, hipertensão arterial, dislipidemia, ovários policísticos, esteatose hepática, entre outras. Os distúrbios no metabolismo de ácidos graxos frequentemente relacionados à obesidade contribuem para a disfunção de múltiplos órgãos e sistemas. No fígado, o simples acúmulo de gordura no parênquima (esteatose hepática) pode ser um estado transitório e benigno, facilmente reversível. Entretanto, com a perpetuação do quadro, e dependendo de algumas características genéticas ainda pouco conhecidas, ativa-se uma resposta inflamatória que desempenhará papel central na progressão da esteatose para esteato-hepatite, fibrose e cirrose, sendo esta um estágio final da doença hepática. Durante a instalação da inflamação hepática, uma série de citocinas pró-inflamatórias são expressas e participam da indução da disfunção orgânica. Entretanto, alguns estudos recentes revelam que a interleucina-10 (IL-10), uma citocina antiinflamatória, também é produzida no fígado e que sua presença nesse contexto ameniza a progressão para graus avançados de lesão hepática. O objetivo desse trabalho foi investigar como a IL- 10 endógena modula alguns parâmetros inflamatórios e metabólicos no fígado de um modelo animal de obesidade, resistência à insulina e esteato-hepatite induzidos por dieta. Para tal, a IL-10 foi inibida in vivo por técnicas de inativação com anticorpo específico e oligonucleotídeos de cDNA modificado complementares ao RNAm dessa proteína, impedindo sua tradução. A inibição da IL-10 em animais que consumiram dieta rica em gordura acentuou a disfunção hepática, inibindo a atividade de importantes proteínas como as do receptor de insulina e seus substratos (IR, IRS-1 e IRS-2), fomentando o processo inflamatório local e ativando vias pró-apoptóticas. A partir desses resultados, conclui-se que a IL-10 endógena atua como um fator protetor, controlando vias inflamatórias durante a progressão da esteatose para esteato-hepatite não alcoólica. Abstract: Obesity has grown as an epidemiological phenomenon that threatens millions of people worldwide, and particularly those living in western, developed countries. Besides its multiple behavioral and social problems, obesity contributes considerably to increase morbidity and mortality due to its common association with diseases that compose the metabolic syndrome, such as diabetes mellitus, hypertension, dyslipidemia, polycystic ovaries, hepatic steatosis, among others. The abnormalities in the metabolism of fatty acids that frequently occur in obesity, contribute to the dysfunction of a number of organs and systems. In the liver, the simple accumulation of fat in the parenchyma cells leads to steatosis which is somewhat benign and reversible. However, as far as the condition is maintained, and depending on some yet to be known genetic factors, an inflammatory response can be installed leading to steatohepatitis, fibrosis and cirrhosis, a terminal liver disease. During the installation of steatohepatitis, a number of proinflammatory cytokines are expressed, contributing to the progression of the liver damage. However, some recent studies have shown that interleukin-10 (IL- 10), an anti-inflammatory cytokine, is produced in the liver and plays a role in the negative modulation of the inflammatory response. The objective of the present study was to evaluate the roles of IL-10 as an endogenous factor controlling inflammatory and metabolic parameters in diet induced hepatic steatosis. IL-10 was inhibited in vivo by two distinct methods, a neutralizing antibody and an antisense oligonucleotide. The inhibition of IL-10 in diet induced steatohepatitis increased proinflammatory cytokine expression and worsened a number of metabolic parameters, including insulin signal transduction. Thus, IL-10 is an endogenous factor that modulates inflammatory response in diet-induced hepatic disease. Doutorado Ciências Básicas Doutor em Clínica Médica

Orientador: Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A leptina, hormônio com semelhança funcional e estrutural às citocinas, é conhecida por exercer, além das ações clássicas de controle da ingestão alimentar e termogênese, importantes funções na modulação das respostas do sistema imune. Alguns destes efeitos são dependentes da propriedade da leptina em modular a apoptose das células tímicas. Neste trabalho, utilizamos ratos Wistar para investigar os mecanismos moleculares envolvidos no controle, dependente da leptina, da apoptose no timo. A apoptose foi avaliada por citometria de fluxo e ELISA para determinação de nucleossomos, enquanto que a transdução do sinal foi avaliada por imunoprecipitação, imunoblot e microscopia confocal. O ObR estava expresso na maioria das células tímicas e a sua quantidade relativa reduziu-se progressivamente durante a maturação dos timócitos. A expressão do ObR estava co-localizada com JAK-2 e STAT-3, e a injeção aguda, in vivo , de leptina promoveu a fosforilação em tirosina de JAK-2 e o engajamento de STAT-3. O tratamento com leptina, também, levou à fosforilação em tirosina de IRS1 e fosforilação em serina de Akt. O tratamento crônico com leptina reduziu a apoptose tímica, e este efeito não foi inibido pelo AG490, um inibidor de JAK, mas foi significativamente inibido por LY294002, um inibidor de PI3-Quinase, e por um oligonucleotídeo antisense para IRS1. Portanto, a leptina inibe a apoptose em células tímicas via um mecanismo independente da ativação de JAK-2 mas dependente do engajamento da via IRS1/PI3-Quinase Abstract: The cytokine-like hormone leptin is known to exert important functions on the modulation of immune responses. Some of these effects are dependent on the property of leptin to modulate the apoptosis of thymic cells. In the present study, we employed Wistar rats to investigate the molecular mechanisms involved in leptin-dependent control of apoptosis in thymus. Apoptosis was evaluated by flow cytometry and ELISA for nucleosome determination, while signal transduction was evaluated by immunoprecipitation, immunoblot and confocal microscopy. The ObR was expressed in most thymic cells and its relative amount reduced progressively during thymocyte maturation. ObR expression was co-localized with JAK-2 and STAT-3, and an acute, in vivo , injection of leptin promoted the tyrosine phosphorylation of JAK-2 and the engagement of STAT-3. The treatment with leptin also led to the tyrosine phosphorylation of IRS1 and serine phosphorylation of Akt. Chronic treatment with leptin reduced thymic apoptosis, an effect that was not inhibited by the JAK inhibitor AG490 but was significantly inhibited by the PI3-kinase inhibitor LY294002 and by an antisense oligonucleotide to IRS1. Thus, leptin inhibits the apoptosis of thymic cells through a mechanism that is independent of the activation of JAK-2 but depends on the engagement of the IRS1/PI3-kinase pathway Doutorado Medicina Experimental

Orientador: Licio Augusto Velloso Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A proteína PGC1? é um co-ativador de transcrição gênica que desempenha papel importante na regulação de uma série de fenômenos metabólicos que compreendem desde o controle da termogênese e mitocondriogênese até a regulação da secreção de insulina e a produção hepática de glicose. Como vários dos fenômenos biológicos controlados direta ou indiretamente pela PGC1? tem importância vital, a regulação dos níveis de PGC1? nos tecidos deve ser finamente ajustada. Nos últimos anos, inúmeros estudos exploraram os mecanismos envolvidos com o controle da expressão gênica e tradução da PGC1?. Entretanto, apenas alguns poucos estudos avaliaram a degradação da mesma. Um dos mais importantes mecanismos envolvidos com a regulação funcional e da meia-vida de proteínas é a ubiquitinação, que pode direcionar proteínas alvo ao proteassoma para degradação ou a outras modificações pós-traducionais. O objetivo do presente estudo foi avaliar a participação de uma proteína com atividade deubiquitinase e ubiquitina ligase, a A20, na manutenção da homeostase do tecido adiposo de animais submetidos à dieta rica em gordura e voluntários humanos magros e obesos antes e após cirurgia de redução de peso. Foram utilizados o tecido adiposo branco visceral e subcutâneo e o tecido adiposo marrom de camundongos Swiss machos submetidos a 16 semanas de dieta hiperlipídica e o tecido adiposo subcutâneo de voluntários magros e obesos antes e após a cirurgia bariátrica. Esses tecidos foram avaliados quanto ao conteúdo protéico e expressão gênica da proteína A20, e sua associação com a PGC1? por imunoprecipitação e imunofluorescência, bem como a ubiquitinação desta última. Os resultados obtidos a partir do tecido adiposo de humanos mostram uma diminuição na expressão da proteína A20 nos pacientes antes e após a cirurgia bariátrica com relação aos voluntários magros. A PGC1? aparece mais ubiquitinada nos pacientes obesos em relação e a associação entre A20 e PGC1? parece aumentar com o ganho de peso na mesma proporção que o conteúdo protéico de PGC1? parece diminuir. No tecido adiposo subcutâneo de camundongos obesos, observamos uma diminuição de PGC1? bem como redução da marcação por cadeias de poliubiquitina desta proteína, associado a um aumento de A20 e aumento da associação de A20 com PGC1?. Camundongos obesos foram também tratados com um oligonucleotídeo antisense (ASO) para A20, resultando na redução de sua expressão gênica. Os animais tratados apresentaram uma piora na tolerância à glicose no teste de GTT o que ocorreu concomitantemente a redução de PGC1?. Nossos resultados indicam que, no tecido adiposo, a A20 se associa a PGC1? e a redução da sua expressão resulta em redução da expressão da PGC1? o que é acompanhando de uma piora no controle homeostático da glicose Abstract: Peroxisome proliferator-activated receptor ? coactivator 1 alpha (PGC-1?) plays an important role in whole body metabolism and, particularly in glucose homeostasis. Its expression is tightly regulated and, small variations in tissue levels can have a major impact in a number of physiological and pathological conditions. Recent studies have shown that the ubiquitin/proteasome system plays a role in the control of PGC-1? degradation. Here we evaluated the interaction of PGC-1? with the protein A20, which plays a dual-role in the control of the ubiquitin/proteasome system acting as a deubiquitinase and as an E3 ligase. We employed immunoprecipitation, quantitative real-time PCR and immunofluorescence staining to evaluate PGC-1?, A20, PPAR? and ubiquitin in the adipose tissue of humans and mice. Our results show that, in distinct sites of the adipose tissue A20 binds to PGC-1?. At least in the subcutaneous fat of humans and mice the levels of PGC-1? decrease during obesity, while its physical association with A20 increases. The inhibition of A20 leads to a reduction of PGC-1? and PPAR? expression, suggesting that A20 acts as a protective factor against PGC-1? disposal. Thus, we provide evidence that mechanisms regulating PGC-1? ubiquitination are potentially involved in the control of the function of this transcriptional co-activator Mestrado Fisiopatologia Médica Mestra em Ciências

Orientador: Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Diabetes melhtus tipo 2 é uma doença de etiologia multifatorial que resulta da confluência de pelo maios dois fenômenos distintos, resistência à ação e falência na produção de insulina. Evidências recentes tem sugerido que mecanismos comuns podem participar dos eventos que precipitam o desenvolvimento tanto da resistência à insulina quanto da falência da célula beta pancreática. A caracterização destes eventos pode abrir perspectivas para abordagens terapêuticas unificadas visando corrigir simultaneamente os dois mais importantes distúrbios que participam da gênese desta doença. A proteína co-ativador la do receptor ativado por prolíferador de peroxissoma, ou PGC-la, cumpre alguns requisitos que permitem sua inclusão numa lista de possíveis participantes nos mecanismos acima expostos. Para avaliar o papel desta proteína na produção e na ação periférica da insulina, utilizou-se um oligonucleotídeo antisense capaz de reduzir significativamente a expressão da PGC-la. Através deste método observou-se que a PGC- la responde a estímulos simpáticos que promovem a inibição da secreção de insulina. Tais estímulos induzem o aumento da expressão desta proteína que por sua vez leva a um aumento da expressão da proteína desacopladora-2 (UCP-2) em ilhotas pancreáticas. O desacoplamento da respiração mitocondrial deve favorecer a redução da produção de ATP decorrente do metabolismo da glicose e desta forma reduzir a secreção de insulina. Por outro lado, em um modelo animal de obesidade e diabetes induzido por dieta hiperüpídica observou-se um aumento da expressão da PGC-la em fígado e tecido adiposo. A inibição da expressão da PGC-la nestes animais promoveu restauração da homeostase da glicose, aumento da secreção de insulina, melhora na sinalização de insulina em tecidos periféricos e surpreendentemente, regressão da esteatose hepática induzida por dieta. Portanto, a proteína PGC-la surge como promissor alvo para abordagem terapêutica em diabetes mellitus e doenças afins Abstract: Type 2 diabetes mellitus is a multifactorial disease that results from the confluence of at least two distinct events, insulin resistance and failure of the pancreatic beta cell. Recent evidences suggest that common mechanisms may participate in the events that precipitate the development of both insulin resistance and beta cell disarrangement. The characterization of such events may offer new perspectives for a unified therapeutic approach for diabetes. The protein PGC-la fulfills some of the requirements to be included in a list of potential candidates for playing a role in the genesis of both the main mechanisms involved in the development of diabetes. To evaluate the role of this protein in the production and action of insulin we employed an antisense oligonucleotide to PGC-la, which is capable of significantly reducing the expression of this protein. Through this approach it was observed that PGC-la responds to sympathetic stimuli mat inhibit insulin secretion. Such stimuli induce the expression of PGC-la and subsequently of the uncoupling protein-2 (UCP-2). Once induced UCP-2 favors a reduction of ATP production from glucose metabolism and therefore reduces insulin secretion. In addition, the expression of PGC-la was increased in liver and adipose tissue of an animal model of diet-induced obesity and diabetes. The inhibition of PGC-la promoted an increase of insulin secretion, an increase of peripheral insulin action, an improvement of insulin signal transduction and, surprisingly the reversal of diet-induced hepatic steatosis. Thus, PGC-la appears as an attractive potential target for therapeutics in diabetes and related diseases Doutorado Ciências Básicas Doutor em Clínica Médica

Orientadores: Mario Jose Abdalla Saad, Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: O substrato-1 do receptor de insulina (IRS-1) desempenha função importante na conexão entre os receptores de insulina (IR) e do fator de crescimento insulina-like-1 (IGF-1R), e as moléculas que participam das etapas subseqüentes da transdução dos sinais gerados pelos respectivos ligantes. No presente estudo, utilizou-se um oligonucleotídeo antisense para o IRS-1 (AS IRS-1), com a finalidade de inibir a expressão dessa proteína in vivo e avaliar as conseqüências desse bloqueio em diferentes tecidos de ratos Wistar. O tratamento com AS IRS-1 durante três dias reduziu a expressão desta proteína em cerca de 80%, 75% e 65% (p

Orientador: Licio Augusto Velloso Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDL) desempenha um papel importante dentro do processo de aterogênese, e a suplementação terapêutica de vitamina E (VE) toma as partículas de LDL mais resistentes à oxidação. Partículas de LDL oxidadas (Ox-LDL) são imunogênicas, levando à formação de anticorpos específicos. Usando uma modificação da técnica de ELISA, nós analisamos a modulação dos títulos de anticorpos contra um epitopo de Ox-LDL em hamsters alimentados com ração padrão, acrescida de 2% de colesterol e 10% de manteiga, com e sem adição de VE 0,2%. Os grupos alimentados com dieta hipercolesterolêmica apresentaram um aumento de três vezes no colesterol sérico (p

Orientadores: Antonio Carlos Boschero, Licio Augusto Velloso Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A desnervação aguda é um modelo reprodutível de resistência à insulina. Músculos soleus de ratos controles e de ratos submetidos à desnervação foram utilizados para investigar as bases moleculares da resistência à insulina. A desnervação aguda induziu uma redução significativa na taxa de captação de glicose (62%) analizada pelo clamp euglicêmico hiperinsulinêmico de membro isolado, a qual foi associada à diminuição significativa da fosforilação em tiro sina do IR (73%), IRSl (69%), IRS2 (82%) e fosforilação em serina da Akt (39%), estimuladas pela insulina. Além disso, a desnervação reduziu a associação entre IRS1/IRS2 e p85/PI3kinase, induzida pela insulina. No entanto, a desnervação causou um aumento da atividade da PI3-kinase associada ao IRSl (275%) e IRS2 (180%), embora o conteúdo de fosfoinositóis fosforilados, detectados por HPLC, fosse significativamente reduzido em fIações lípides. Diante dessa aparente discrepância, avaliamos a expressão e atividade da fosfatase SIllP2 e a fosforilação em serina da p85/PI3-kinase. Não houve diferença na expressão da SIDP2 entre músculos controles e desnervados. Entretanto, a fosforilação em serina da p85/PI3-kinase foi reduzida no músculo desnervado, enquanto que o bloqueio da expressão da SIllP2 pelo tratamento com oligonucleotídeo antisense específico restaurou parcialmente o conteúdo de fosfoinositóis fosforilados e normalizou a captação da glicose. Concluindo, alterações no estado funcional da SIllP2 podem contribuir para a resistência à insulina induzida pela desnervação Abstract: Short-term muscle denervation is a reproducible model of tissue specific insulin resistance. To investigate the molecular basis of insulin resistance in denervated muscle the downstream signaling molecules of the insulin-signaling pathway were examined in intact and denervated soleus muscle of rats. Short-term denervation induced a significant fall in glucose c1earance rates (62% of control, p

Orientadores: Felix Guillermo Reyes Reyes, Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Vários estudos têm demonstrado que o magnésio desempenha papel importante na homeostase glicêmica. Assim, no presente trabalho foi avaliado o efeito da deficiência de magnésio, da sua duração e da interação entre estes dois fatores na secreção e ação da insulina. Ratos foram alimentados com dieta deficiente em magnésio durante 6 (DF-6) ou 11 (DF-11) semanas e comparados com ratos alimentados com dieta controle durante os mesmos períodos de tempo (CO-6 e CO-11). Os ratos dos grupos DF-6 e DF-lI apresentaram níveis de magnésio sérico mais baixos do que os CO-6 e CO-lI, porém a homeostase glicêmica entre os grupos DF-6, CO-6 e CO-II não foi diferente. Os animais do grupo DF-lI apresentaram maior velocidade de decaimento da glicose (Kg) e redução da área total sob a curva de glicose, quando comparados aos animais dos grupos CO-6, CO11 e DF-6, assim como menor área total sob a curva de insulina quando comparados com os ratos CO-II e DF-6, indicando um aumento da sensibilidade à insulina. Com a finalidade de avaliar o efeito da suplementação de magnésio, ratos alimentados com dieta controle ou com dieta deficiente durante 6 semanas receberam, ao final desse período e durante 5 semanas adicionais, uma dieta suplementada com magnésio (grupos SCO e SDF, respectivamente). No grupo SDF os níveis de magnésio sérico, a velocidade de decaimento da glicose e áreas totais sob as curvas de glicose e insulina, não foram significativamente diferentes daqueles apresentados pelo grupo CO-lI, indicando que a suplementação com magnésio evitou o aumento da sensibilidade à insulina. Não foi verificada diferença na velocidade de decaimento da glicose (Kitt) durante o teste venoso de tolerância à insulina, assim como na sinalização da insulina no músculo e figado dos grupos DF-6 e CO-6. Entre os grupos alimentados durante 11 semanas, o DF-lI apresentou maior velocidade de decaimento da glicose, enquanto que este mesmo parâmetro nos grupos SDF e SCO não se diferenciou dos ratos CO-II. Nenhuma diferença foi observada na sinalização da insulina no músculo dos animais dos grupos CO-11, DF-lI e SDF. No figado de ratos DF-11, o nível protéico e o grau de fosforilação do receptor de insulina e do substrato-I desse receptor apresentaram-se aumentados, assim como verificou-se maior associação entre o substrato-I do receptor e a subunidade p85 do fosfatidilinositol 3-quinase, quando comparados com ratos CO-II. Nenhuma diferença foi encontrada nas etapas iniciais da ação da insulina nos grupos SDF e CO-ll. Estes resultados sugerem que as mudanças nas etapas iniciais da transmissão do sinal insulínico no figado, induzidas por diferentes níveis séricos de magnésio, podem ter um papel fundamental na homeostase glicêmica Abstract: Numerous studies have demonstrated a major role for magnesium in insulin action and secretion. Therefore, we investigated the effect ofMg deficiency, duration of feeding, and the interaction between these factors on the secretion and action of insulin. Rats fed a Mgdeficient diet for 6 (DF-6) or 11 (DF-lI) weeks, and rats fed a control diet for the same periods (CO-6 and CO-ll groups) were compared. DF-6 and DF-lI rats had serum Mg levels lower than the control groups, but no change in glucose homeostasis was observed among DF-6, CO-6 and CO-II rats. DF-lI rats showed a greater glucose desappearance rate (Kg) and a reduced total area under the glucose curve compared to CO-6, CO-II and DF-6 rats, as well as a reduced total area under the insulin curve compared to the CO-ll and DF-6 rats, indicating increased sensitivity to insulin. In order to evaluate the effect of supplementation, rats fed a control or Mg-deficient diet for 6 weeks were then fed a Mgsupplemented diet for 5 weeks (SCO and SDF groups, respectively). In the SDF rats, the serum Mg levels, glucose disappearance rate and total area under the glucose and insulin curves were restored to control values, indicating that the Mg supplementation prevented the increase in sensitivity to insulin. No differences were found in the glucose desappearance rate during an i. v. insulin tolerance test (Kitt), as well as in the insulin signaling in muscle and liver ITom DF-6 and CO-6. Among the groups of rats fed for 11 weeks, the DF-ll group had a significantly greater glucose desappearance rate while the rate of the SDF and SCO groups did not differ ITom CO-II rats. No differences were observed in muscle insulin signaling of rats ITom the CO-ll, DF-lI and SDF. In DF-ll rats, insulin receptor and insulin receptor substrate-I protein and phosphorylation levels were elevated in liver and there was a greater association between the insulin receptor substrate-I and p85 subunit of phosphatidylinositol 3-kinase compared with CO-II rats. No diferences were found in the early steps of insulin action in SDF and CO-II rats. These results suggest that the changes in the early steps of insulin signal transduction in the liver, induced for different serum Mg levels, may play an important role in the glucose homeostasis Doutorado Fisiologia Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Claudio Saddy Rodrigues Coy, Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A retocolectomia total com anastomose do reservatório ileal ao canal anal é a cirurgia de escolha para doentes com retocolite ulcerativa inespecífica (RCUI) refratária ao tratamento clínico e para polipose adenomatosa familiar (PAF), com pólipos retais. A ileíte do reservatório é uma das complicações mais comuns, sendo freqüente nos doentes com RCUI, porém rara na PAF. Objetivo: Avaliar a atividade inflamatória e apoptótica em mucosa de reservatórios ileais endoscopicamente normais pela expressão de IFN-?, STAT-1, IL-10, SOCS-3, Bax, Bcl-2, FADD/Caspase-8 e Apaf-1/Caspase-9 em RCUI e PAF operados. Casuística e Métodos: Estudou-se 18 doentes submetidos à cirurgia com reservatório ileal (RI) em "J", sendo nove doentes com RCUI e nove com PAF. O grupo controle foi constituído por nove doentes com íleo-colonoscopia normal. As biópsias foram congeladas em nitrogênio líquido e as expressões de IFN-?, STAT-1, IL-10, SOCS-3, Bax e Bcl-2 foram avaliadas por meio de imunoblot de extrato protéico total. As expressões de FADD/Caspase-8 e Apaf-1/Caspase-9 foram determinadas por meio de ensaio de imunoprecipitação e imunoblot. Utilizou-se imunoistoquímica para Bax e Bcl-2 e imunofluorescência com Anexina V. Resultados: Expressão de STAT-1 foi maior em RCUI, quando comparada com PAF e controles (p0.05). Expressão de Apaf-1/Caspase-9 foi maior em RCUI comparada à PAF (p0.05). Conclusão: Os doentes com RCUI apresentaram maiores níveis das citocinas pró-inflamatórias na mucosa do RI, sendo estas semelhantes àquelas presentes em mucosa colorretal de RCUI ativa, mesmo na ausência de sinais clínicos e endoscópicos de ileíte do reservatório. Além disso, houve expressão aumentada de proteínas pró-apoptóticas no Grupo RCUI, podendo justificar a maior susceptibilidade dos doentes operados por RCUI a esta complicação. Demonstrou-se também, alteração dos mecanismos de apoptose em PAF, que poderia explicar a diminuição da renovação celular e presuntivamente, o aparecimento de adenomas nesta síndrome. Abstract: Ileal pouch-anal anastomosis is the surgical procedure of choice for patients with refractory ulcerative colitis (UC) and for familial adenomatous polyposis (FAP) with rectal polyps. Pouchitis is the most common complication in UC, while it is quite rare in FAP. Objective: Evaluate the inflammatory and apoptotic activity in endoscopically normal ileal pouch mucosa, by determining the expressions of IFN-?, STAT-1, IL-10, SOCS-3, Bax, Bcl-2, FADD/Caspase-8 and Apaf-1/Caspase-9 in operated patients with UC and FAP. Patients and Methods: Eighteen patients submitted to total retocolectomy and J pouch were evaluated; nine were patients with UC and nine with FAP. The control group consisted of nine individuals with normal ileo-colonoscopy examination. The collected specimens were snap-frozen in liquid nitrogen and expressions of IFN-?, STAT-1, IL-10, SOCS-3, Bax and Bcl-2 were determined by immunoblot of total protein extracts. FADD/Caspase-8 and Apaf-1/Caspase-9 were evaluated by immunoprecipitation and immunoblot. Immunohistochemistry analysis for Bax and Bcl-2, and immunofluorescence with Annexin V assays were applied in all biopsies. Results: STAT-1 expression was increased in patients with UC, when compared with FAP and controls (p0.05). Apaf-1/Caspase-9 expression was increased in UC when compared with FAP (p0.05). Conclusion: Patients with UC had increased pro-inflammatory cytokines levels, even without clinical and endoscopic evidence of pouchitis; these alterations were similar to those of UC disease. Indeed, there was increased pro-apoptotic protein expression in UC. These findings may suggest a higher susceptibility to this complication in operated patients with UC, when it was compared to PAF. In addition, a down-regulation of apoptosis in FAP was observed, possibly explaining the decreased cell turn over and presence of adenomas in this syndrome. Doutorado Cirurgia Doutor em Cirurgia

Orientador: Lício Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A obesidade tornou-se um fenômeno de magnitude epidêmica e populações de muitas regiões do planeta estão enfrentando o aumento da prevalência de varias doenças associadas ao excesso de peso, incluindo doença hepática gordurosa não alcoólica, diabetes mellitus tipo 2, além de alguns tipos de câncer. O excesso de peso resulta essencialmente do desequilíbrio entre ingestão calórica e gasto de energia que compreende o metabolismo basal, a atividade física, e a termogênese adaptativa induzida pela dieta ou pelo frio. No entanto, existem mecanismos metabólicos diversos e complexos que estão envolvidos no controle do peso corporal, e que são na sua maioria, controlados pelo sistema nervoso central. Estudos demonstraram que a obesidade induzida experimentalmente pelo consumo de dieta hiperlipídica é acompanhada da instalação de um processo inflamatório no hipotálamo que leva a resistência a hormônios anorexigênicos como leptina e insulina, e finalmente a uma regulação defeituosa da ingestão alimentar e do gasto energético. Por serem expressas especialmente durante a resposta imune, as quimiocinas estão envolvidas com o processo de inflamação hipotalâmica que é observado já nas primeiras 24 horas de exposição à dieta rica em gordura saturada. Várias quimiocinas atuam no recrutamento de células monocíticas com perfil fenotípico inflamatório. A identificação de fatores inflamatórios que desempenham papel importante no recrutamento de monócitos da periferia pode contribuir para que se obtenham avanços na compreensão dos mecanismos patofisiológicos que levam a obesidade. Assim, o presente estudo teve por objetivo geral avaliar a expressão de quimiocinas durante as primeiras etapas da instalação da inflamação hipotalâmica na obesidade experimental induzida por dieta rica em gordura saturada. Na primeira etapa do estudo, identificamos por meio de um PCR-array, duas quimiocinas, LIF e CCBP2, potencialmente envolvidas na regulação da resposta inflamatória hipotalâmica. Após essa identificação, observamos que animais resistentes à obesidade (OR) alimentados com dieta hiperlipídica apresentam maior expressão gênica da quimiocina LIF. Foram então realizados experimentos de inibição de LIF em animais OR através de imunoneutralização proteica realizada por microinjeção de anticorpo anti-LIF no hipotálamo. Sob inibição do LIF hipotalâmico camundongos OR apresentaram aumento significativo de peso e menor tolerância oral à glicose, assemelhando-se fenotipicamente e metabolicamente aos animais propensos à obesidade (OP). Os animais OR tratados com anti-LIF apresentaram ainda menor atividade espontânea e aumento significativo na expressão gênica das citocinas pró-inflamatórias no hipotálamo após um dia de dieta hiperlipídica. Com relação a CCBP2, realizamos quantificação por PCR em tempo real em camundongos OR e OP e observamos uma menor expressão gênica apenas nos animais OP. Construímos então um lentivírus para superexpressão de CCBP2 no hipotálamo dos camundongos OP. A infecção lentiviral resultou no aumento de CCBP2 no hipotálamo e foi acompanhada de uma redução significativa das citocinas inflamatórias em animais alimentados por 15 com dieta hiperlipídica. O aumento da expressão hipotalâmica da CCBP2 não resultou em modificação do peso, porem melhorou a tolerância à glicose quando comparado aos seus controles Abstract: Obesity has reached epidemic proportions and populations in many regions of the world are facing an increase in the prevalence of a number of its comorbidities such as, non-alcoholic fatty liver disease, type 2 diabetes and some types of cancer. Excessive body mass results from the disequilibrium between caloric intake and energy expenditure, which includes, basal metabolism, physical activity and adaptive thermogenesis induced by diet or environmental temperature. Nevertheless, a number of diverse and complex metabolic mechanisms are involved in the control of body mass and many of them are regulated by the central nervous system. Studies have shown that in diet-induced obesity the hypothalamus can be affected by an inflammatory response induced by dietary fats. This inflammation results in defective response to anorexigenic hormones, such as leptin and insulin, and therefore to an abnormal regulation of food intake and energy expenditure. Chemokines are expected to play an important role in the regulation of the inflammatory response in the hypothalamus, which is observed as early as 24 h after the introduction of a high-fat diet. The chemokines are involved in the recruitment of inflammatory cells to the site of inflammation. We believe that the identification and characterization of factors involved in the early steps of hypothalamic inflammation in obesity may contribute for the understanding of the pathophysiological mechanisms leading to obesity. The objective of this study was to evaluate the expression of hypothalamic chemokines during early experimental obesity induced by the consumption of a high-fat diet. In the first part of the study, we used PRC-array to identify LIF and CCBP2 as two chemokines potentially involved in the regulation of the hypothalamic inflammatory response during early exposure to dietary fats. LIF is increased in the hypothalamus of obese resistant (OR) mice. Upon immunoneutralization of hypothalamic LIF, OR mice presented increased body mass and reduction of glucose tolerance, becoming phenotypically similar to obese prone (OP) mice. In addition, in OR mice treated with the anti-LIF antibody in the hypothalamus, there were reduced spontaneous physical activity and increased expression of inflammatory cytokines in the hypothalamus, as early as one day after the introduction of a high-fat diet. Regarding CCBP2, we determined using real-time PCR that the transcript encoding for this chemokine is reduced in the hypothalamus of OP mice. A letivirus vector was constructed to increase the expression of CCBP2 and this was used to treat OP mice via hypothalamic injection. The increased expression of CCBP2 in the hypothalamus of OP mice was accompanied by reduction of diet-induced expression of inflammatory cytokines in the hypothalamus. This was not accompanied by changes in body mass; however, there was an improvement of whole body glucose tolerance as compared with respective controls Doutorado Clínica Médica Doutora em Ciências FAPESP 2012/20115-4

Orientadores: Lício Augusto Velloso, Marciane Milanski Ferreira Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Dentre os fatores ambientais que contribuem para o desenvolvimento de obesidade, o consumo de dietas ricas em ácidos graxos saturados desempenha o papel mais importante. Estudos recentes realizados por vários grupos, inclusive o nosso, revelam que ácidos graxos saturados presentes na dieta levam ao desenvolvimento de resistência hipotalâmica à ação dos hormônios leptina e insulina, fenômeno este fundamental para que ocorra a quebra no equilíbrio entre ingestão e gasto calórico. Até o momento caracterizaram-se dois mecanismos moleculares potencialmente envolvidos na iniciação do processo que resulta na disfunção hipotalâmica na obesidade, a ativação de TLR4 e a indução de estresse de retículo endoplasmático, ambos levando a uma resposta inflamatória local e, eventualmente, a apoptose neuronal. Estudos recentes têm revelado que frente a situações que oferecem risco de dano celular, ativa-se um mecanismo de controle de tráfico e degradação protéica chamado sistema ubiquitina-proteassoma (UPS). O acúmulo de agregados protéicos positivos para ubiquitina pode gerar toxicidade celular e regular a plasticidade neuronal. Também a modulação de componentes do UPS pode gerar neurodegeneração hipotalâmica e fenótipo obeso em animais experimentais. Neste estudo aventamos a hipótese que durante períodos prolongados de obesidade a ativação anômala do UPS contribuiria para a perpetuação do quadro de obesidade. De fato, os resultados obtidos revelam que roedores com predisposição para a obesidade induzida por dieta mantém, a princípio, a capacidade de regular adequadamente a UPS no hipotálamo. Com o passar do tempo esta capacidade é perdida resultando numa maior dificuldade para perda de peso frente à redução do aporte calórico. Roedores com mutações que os protegem da inflamação, não apresentam distúrbio funcional do UPS quando expostos a dieta rica em ácidos graxos e, são também protegidos da obesidade. Portanto, o defeito funcional do UPS no hipotálamo no curso de obesidade prolongada, constitui-se num fator importante contribuindo para a refratariedade ao tratamento e perpetuação da doença Abstract: The consumption of high-fat diets, especially those rich in saturated fatty acids, plays the most important role in the development of obesity. Recent studies by several groups, including ours, have shown that dietary long-chain saturated fatty acids lead to the development of hypothalamic resistance to leptin and insulin, an important condition contributing for breaking of the balance between caloric intake and energy expenditure. Two molecular mechanisms are currently known to play a triggering role in this process; activation of TLR4 and endoplasmic reticulum stress, both leading to local inflammation and eventually apoptosis of neurons. The ubiquitin-proteasome system (UPS) plays an important role in the control of protein recycling in the cell. The accumulation of ubiquitin-positive protein aggregates can cause cell toxicity and regulate neuronal plasticity. Also the modulation or differential activation of UPS can produce hypothalamic neurodegeneration and obese phenotype in experimental animals. Here, we hypothesized that under prolonged diet-induced obesity, a defect in the UPS in the hypothalamus could contribute for the defective control of energy homeostasis leading to the refractoriness of obesity to caloric restriction. In fact in an obesity-prone rodent strain, prolonged, but not short-term obesity was accompanied by functional abnormality of the UPS in the hypothalamus. In mutants protected from inflammation, resistance to diet-induced obesity was accompanied by stability of the UPS in the hypothalamus. Thus, defect of the UPS in the hypothalamus, during prolonged obesity is an important factor contributing the refractoriness of obesity to caloric restriction Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutora em Fisiopatologia Médica

Orientadores: Laurecir Gomes, Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A obesidade é considerada hoje uma epidemia mundial. A obesidade é um dos maiores problemas de saúde pública em muitas partes do planeta, onde cresce em taxas alarmantes. No Brasil, a diminuição das taxas de desnutrição vieram acompanhadas pelo aumento das taxas de sobrepeso e obesidade. A obesidade pode ser definida como o acúmulo anormal ou excessivo de gordura, que pode prejudicar a saúde. A obesidade aumenta significativamente o risco do desenvolvimento de problemas de saúde como a hipertensão arterial, derrame, problemas respiratórios, diabetes Melitus (Tipo II), incidência de certas formas de câncer, doenças do coração, alterações músculo esqueléticas e osteoartrites das grandes e pequenas articulações. Sendo que a adiposidade está relacionada aos níveis individuais de gordura para cada individuo. A função dos tendões é transmitir a força criada nos músculos aos ossos, possibilitando o movimento articular. Os tendões são constituídos por células (tenócitos e tenoblastos) e por uma matriz extracelular desenvolvida, constituída por macromoléculas que interagem entre si e com a célula que a produz. A matriz extracelular dos tendões é constituída por colágeno, proteoglicanos e proteínas não colagênicas. Este trabalho objetivou analisar as alterações morfológicas, bioquímicas e biomecânicas do tendão do músculo flexor digital profundo em ratos Zucker geneticamente obesos (fa/fa) e dos animais magros (Fa/_). Os ratos Zucker possuem receptores para leptina não funcionais, e devido a isso desenvolvem obesidade. A avaliação histológica não revelou diferenças, assim como os testes imunohistoquímicos para colágeno do tipo III, nos tendões de ambos os grupos. Na análise ultraestutural do tendão de ambos os animais foram observadas gotículas de lipídio ao longo dos feixes de fibrilas de colágeno. Somente os animais obesos apresentaram fibrilas de colágeno desorganizadas, diferente da distribuição típica esperada para o tecido. O diâmetro das fibrilas de colágeno apresentou distribuição e diâmetro de massa-médio diferente entre os dois grupos. Com relação aos parâmetros mecânicos houve diferença significativa com relação ao deslocamento e a deformação máxima. Os animais obesos apresentaram conteúdo maior de hidroxiprolina enquanto os animais magros apresentaram maior quantidade de proteínas não colagênica e de glicosaminoglicanos. Devido ao elevado sobrepeso e as características do tendão dos animais obesos pode ser concluído que a influência da obesidade sobre os tendões provoca alterações na constituição e organização dos componentes da matriz extracelular. Alterações estas que podem ser relacionadas a modificações organizacionais e estruturais dos feixes de colágeno, influenciando as propriedades mecânicas do tendão e a evolução para um estado patológico. Abstract: Obesity is considered a worldwide epidemic, one of the biggest public health problems in many parts of the planet, which grows in alarming rates. In Brazil, the decline in rates of malnutrition has been accompanied by rising rates of overweight and obesity, which can be defined as the accumulation of abnormal or excessive fat which presents a risk to health. Obesity significantly increases the risk of developing health problems as hypertension, stroke, respiratory problems, diabetes, cancer, cardiovascular diseases, skeletal muscle alteration and osteoarthritis. The tendons transmit the strength created in muscles to bones, allowing the joints movement. Tendons consist of cells (tenocyte and tenoblast) and an abundant extracellular matrix composed by collagen, proteoglycans and non-collagenous proteins. This study aimed to analyze the morphological, biochemical and biomechanical alterations of the deep digital flexor tendon in Zucker rats genetically obese (fa/fa) and of lean animals (Fa/_). Histological evaluation and immunohistochemical tests for collagen type III, showed no differences in tendons of both groups. Ultrastructural analysis, showed presence of lipid droplets on the bundles collagen. Only the obese animals showed disorganization in the distribution of fibrils. The diameter of collagen fibrils presented different distribution and mass-average diameter between the two groups, being bimodal in lean rats and unimodal in obese rats. With regard to mechanical parameters significant difference was observed, larger maximum displacement and strain in obese animals. The obese animals presented higher content of hydroxyproline while lean animals showed a larger amount of non-collagenous proteins and glycosaminoglycans. Due to the high overweight of the obese animals can be concluded that the obesity causes changes in the composition and organization of extracellular matrix of the tendon. These alterations may be related to organizational and structural changes of collagen bundles, influencing the mechanical properties of tendon and developments toward a pathological condition. Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, FAculdade de Ciencias Medicas Resumo: O consumo de dietas ricas em gordura é o mais importante fator ambiental que contribui para o aumento da prevalência de obesidade na sociedade moderna. Em modelos animais com obesidade, induzida por dieta, a ativação da resposta inflamatória no hipotálamo produz resistência molecular e funcional aos hormônios anorexigênicos insulina e leptina, o que resulta em defeitos no controle da ingestão alimentar e do gasto energético. Para explorar a hipótese de que ácidos graxos podem desencadear resposta inflamatória e aumentar a expressão de citocinas no hipotálamo por induzir a ativação de TLR2/4 e/ou estresse de RE, ratos foram canulados e submetidos ao tratamento, por via intracerebroventricular (icv), com ácido graxo saturado e em seguida o extrato de proteínas hipotalâmicas foi obtido para determinação da expressão de proteínas por imunoblot. A localização de marcadores inflamatórios foi obtida por imunohistoquímica. Observou-se que ácidos graxos saturados de cadeia longa ativam predominantemente TLR4, o que determina não só a indução da expressão local de citocinas, mas também promove estresse de RE. Ratos alimentados com dieta hiperlipídica rica em ácidos graxos monoinsaturados não desenvolveram resistência hipotalâmica à leptina, enquanto que a mutação com perda da função do TLR4 e a inibição imunofarmacológica do TLR4 protegeu os camundongos da obesidade induzida por dieta. O TLR4 age como um alvo molecular predominante para ácidos graxos saturados no hipotálamo, o que desencadea resposta inflamatória e resistência a sinais anorexigênicos. Assim, conclui-se que ácidos graxos saturados ativam as vias de TLR2/TLR4 e estresse de RE em hipotálamo sendo a ativação mais significativa para TLR4, o que, por sua vez, determina a indução de estresse de RE. O TLR4 é um importante mediador da disfunção hipotalâmica durante o desenvolvimento da obesidade, como esse é um fenômeno importante durante a instalação da obesidade, esse receptor é um alvo terapêutico atrativo para tal condição epidêmica Abstract: In animal models of diet-induced obesity, the activation of an inflammatory response in the hypothalamus produces molecular and functional resistance to the anorexigenic hormones insulin and leptin. The primary events triggered by dietary fats that ultimately lead to hypothalamic cytokine expression and inflammatory signaling are unknown. Here, we test the hypothesis that dietary fats act through the activation of Toll-like receptors 2/4 and endoplasmic reticulum stress to induce cytokine expression in the hypothalamus of rodents. Rats were treated icv with different types of fatty acids and hypothalamic protein extracts were obtained for determination of inflammatory and endoplasmic reticulum stress protein expression by immunoblot. Localization of inflammatory markers were performed by immunohistochemistry. Long-chain saturated fatty acids activate predominantly Toll-like receptor 4 signaling, which determines not only the induction of local cytokine expression but also promotes endoplasmic reticulum stress. Rats fed on a monounsaturated fat-rich diet do not develop hypothalamic leptin resistance, while Toll-like receptor 4 loss-of-function mutation and immunopharmacological inhibition of Toll-like receptor 4 protects mice from diet induced obesity. Toll-like receptor 4 acts as a predominant molecular target for saturated fatty acids in the hypothalamus, triggering the intracellular signaling network that induces an inflammatory response and determines the resistance to anorexigenic signals Doutorado Ciências Básicas Doutor em Clínica Médica

Orientador: Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: O aumento da prevalência de obesidade em várias regiões do planeta é um dos mais importantes fenômenos clínico-epidemiológicos da atualidade. Fatores como a mudança do hábito alimentar e o estilo de vida sedentário, aliados a determinantes genéticos ainda pouco conhecidos desempenham um papel relevante na patogênese dessa doença. Nos últimos quinze anos, desde o descobrimento do hormônio leptina, avanços consideráveis foram obtidos na caracterização dos mecanismos hipotalâmicos do controle da ingestão alimentar e da termogênese. Em um estudo recente demonstrou-se que o consumo de uma dieta rica, em gordura induz a expressão de várias citocinas pró-inflamatórias no hipotálamo e que a inibição da via de sinalização intracelular da serina quinase JNK é capaz de reverter parcialmente algumas das conseqüências clínicas do consumo dessa dieta (De Souza et al, 2005). No presente estudo avaliou-se a importância do receptor 1 de TNF-cc(TNFRI) na gênese do processo inflamatório desencadeado pela dieta rica em gordura. O TNFR1 é responsável pela maioria dos efeitos do TNF-ct, no entanto no contexto da obesidade induzida por dieta, a função desse receptor não está completamente esclarecida. Para tanto, camundongos knockout (KO) para o TNFR1 e seu respectivo background genético, C57BL6, foram tratados por 8 semanas com dieta hiperlipídica e observamos que o TNFR1 KO está protegido da obesidade induzida por dieta por meio de aumento na termogênese. Em ambas as dietas, padrão e hiperlipídica (HF), TNFR1 KO ganha menos peso apesar de aumento na ingestão alimentar. Adiposidade e diâmetro dos adipócitos estão reduzidos, assim como as concentrações sanguíneas de insulina e leptina. TNFR1 KO estão protegidos de resistência hipotalâmica à via da leptina por meio de preservação da sinalização da leptina através de JAK2, STAT3 e FOX01. TNFR1 KO apresentam aumento de termogênese, pelo aumento do consumo de 02, aumento da expressão de UCP-1 e UCP-3, no tecido adiposo marrom e músculo esquelético, respectivamente, e aumento do consumo de O2 de mitocôndrias isoladas de músculo. Isso demonstra que a via de sinalização do TNF-a pelo TNFR1 representa um importante mecanismo envolvido na termogênese deficiente associada à obesidade. Abstract: In diet-induced obesity, hypothalamic and systemic inflammatory factors trigger intracellular mechanisms that lead to resistance to the main adipostatic hormones, leptin and insulin. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) is one of the main inflammatory factors produced during this process and its mechanistic role as an inducer of leptin and insulin resistance has been widely investigated. Most of TNF-a inflammatory signals are delivered by TNFR1; however, the role played by this receptor in the context of obesity-associated inflammation is not completely known. Here, we show that TNFR1 knockout (TNFR1 KO) mice are protected from diet-induced obesity due to increased thermogenesis. Under standard rodent chow or ligh-fat diet, TNFR1 KO gain significantly less body mass in spite of increased caloric intake. Visceral adiposity and mean adipocyte diameter are reduced and Dlood concentrations of insulin and leptin are lower. Protection from hypothalamic eptin resistance is evidenced by increased leptin-induced suppression of food ntake and preserved activation of leptin signal transduction through JAK2, STAT3 jnd FOX01. Under high fat diet, TNFR1 KO mice present a significantly increased expression of the thermogenesis-related neurotransmitter, TRH. Further evidence if increased thermogenesis includes the increased 02 consumption and C02 traduction in respirometry measurements, increased expressions of UCP1 and JCP3 in brown adipose tissue and skeletal muscle, respectively, and increased 02 onsumption by isolated skeletal muscle fiber mitochondria. This demonstrates that 'NF-ct signaling through TNFR1 is an important mechanism involved in obesity-ssociated defective thermogenesis. Doutorado Medicina Experimental Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientador: Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Muitos dos efeitos da leptina no sistema imune dependem de sua capacidade de modular a expressão de citocinas e a apoptose no timo. Surpreendentemente, alguns desses efeitos são dependentes de transdução de sinal através do IRS1/PI3-quinase, mas independentes da ativação da JAK2. Uma vez que todos os efeitos conhecidos da leptina em diferentes tipos celulares e tecidos parecem ser dependentes da ativação da JAK2, nós aventamos a hipótese de que, pelo menos para o controle da função tímica, outra quinase, até então desconhecida, poderia mediar a transdução do sinal da leptina através do ObR e pela cascata de sinalização do IRS1/PI3-quinase. Neste trabalho, mostramos que a tirosina quinase Fyn está constitutivamente associada ao ObR em células tímicas. Após um estímulo agudo por leptina, a Fyn é rapidamente fosforilada em tirosina, ativando-se e associando-se ao IRS1 de forma transiente. Todos estes efeitos são independentes da ativação da JAK2, e com a inibição da Fyn a transdução de sinal através do IRS1/PI3-quinase é abolida. Além disso, a inibição da Fyn modifica significativamente os efeitos da leptina sobra a expressão de citocinas no timo. Sendo assim, no timo, a Fyn atua como uma tirosina quinase que transduz o sinal da leptina independentemente da ativação da JAK2, e medeia alguns dos efeitos imunomodulatórios da leptina neste tecido Abstract: Several effects of leptin in the immune system rely on its capacity to modulate cytokine expression and apoptosis in the thymus. Surprisingly, some of these effects are dependent on signal transduction through the IRS1/PI3-kinase, but not on the activation of JAK2. Since all the well known effects of leptin in different cell types and tissues seem to be dependent on JAK2 activation, we hypothesized that, at least for the control of thymic function, another, unknown kinase could mediate the transduction of the leptin signal from the ObR towards the IRS1/PI3-kinase signaling cascade. Here, we show that the tyrosine kinase Fyn is constitutively associated with the ObR in thymic cells. Following a leptin stimulus, Fyn undergoes an activating tyrosine phosphorylation and a transient association with IRS1. All these effects are independent on JAK2 activation and upon Fyn inhibition the signal transduction towards IRS1/PI3-kinase is abolished. In addition, the inhibition of Fyn significantly modifies the effects of leptin on thymic cytokine expression. Therefore, in the thymus, Fyn acts as a tyrosine kinase that transduces the leptin signal independently of JAK2 activation, and mediates some of the immunomodulatory effects of leptin in this tissue Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientadores: Eliana Pereira de Araújo, Lício Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A obesidade e caracterizada pelo acumulo excessivo de gordura no organismo, podendo resultar em dano a saúde. Mudança socioeconômica, ocorrida nos últimos cinquenta anos tem contribuído para o aumento da prevalência da obesidade, a qual e hoje considerada um dos principais problemas de saúde publica no mundo. O acumulo progressivo de ácidos graxos no tecido adiposo, e eventualmente, em outros sítios anatômicos não especializados na estocagem de energia sob a forma de gordura como, por exemplo, o fígado e o músculo, e associado à ativação de uma resposta inflamatória subclinica que desempenha papel importante na indução da resistência a insulina. Esta, por sua vez, e considerada o mecanismo fisiopatogênico unificador de uma serie de doenças comumente associadas à obesidade, tais como o diabetes mellitus, a aterosclerose, a esteatohepatite nao-alcoolica, entre outros. A inflamação subclinica desempenha um papel central na indução da resistência a insulina em obesos. Atualmente o estresse de reticulo endoplasmático e a ativação da sinalização do TLR4 vêm sendo identificados como potenciais mecanismos ativadores da inflamação sub-clinica associada à obesidade. No ambiente intracelular a ativação dos sinais inflamatórios disparados por ambos, estresse de reticulo endoplasmático ou TLR4, podem associar-se, modulando ou sendo modulado por outros eventos. Um desses eventos e a autofagia que se caracteriza como um processo celular finamente regulado e desempenha um papel importante no controle de varias funções da célula, tais como, reciclagem de organelas, disponibilidade de nutrientes e diferenciação celular. Um estudo recente demonstrou a existência de aumento na atividade autofágica em tecido adiposo de pessoas obesas e propôs a associação causal entre autofagia e resistência a insulina. A redução da adiposidade e o mecanismo mais eficiente para reduzir à resistência a insulina em pessoas obesas. Entretanto, o impacto da redução de adiposidade sobre a regulação da autofagia no tecido adiposo não e conhecido. Neste estudo, a regulação da autofagia no tecido adiposo durante o emagrecimento foi observada em duas etapas distintas. Inicialmente, um modelo animal de obesidade induzida por dieta, submetido posteriormente, a restrição calórica de 40% durante quinze dias. Animais obesos alimentados ad libitum, apresentaram aumento dos marcadores de autofagia no tecido adiposo, o que foi revertido na restrição calórica. De forma diversa, a restrição ocasionou o aumento da autofagia nos animais magros. A reintrodução de alimentação ad libitum foi suficiente para reduzir a autofagia nos animais magros, mas não nos obesos, cuja supra-regulacao da autofagia foi mais uma vez observada. Na segunda parte do estudo, autofagia foi avaliada em fragmentos de tecido adiposo subcutâneo de pacientes obesos selecionados para cirurgia bariátrica colhidos no ato da cirurgia e apos um ano, aproximadamente. Foram incluídos no estudo nove pacientes obesos não-diabeticos e seis pacientes obesos diabéticos. Assim como no modelo animal, obesidade em humanos foi associada a um aumento dos marcadores de autofagia no tecido adiposo os quais foram reduzidos apos a perda de peso. Assim, na vigência da obesidade ocorre uma regulação anômala da autofagia, estando aumentada durante alimentação ad libitum e reduzindo-se com a restrição alimentar Abstract: Obesity, defined as abnormal or excessive fat accumulation that may impair life quality, is one of the major public health problems in modern world. It results from an imbalance between food intake and energy expenditure leading to the progressive accumulation of fatty acids in the adipose tissue and in some tissues that are not specialized in energy storage, such as liver and muscle. Insulin resistance is one of the main outcomes of obesity and is regarded as the main mechanism connecting diseases that are commonly associated with obesity, such as, type 2 diabetes mellitus, atherosclerosis, and non-alcoholic steatohepatitis, among others. Subclinical inflammation plays a major role in the induction of insulin resistance in obesity. Recently, endoplasmic reticulum stress and the activation of TLR4 signaling have been identified as potential triggering mechanisms for obesity-associated subclinical inflammation. At the intracellular environment activation of inflammatory signaling triggered by either endoplasmic reticulum stress or TLR4 signaling can integrate and modulate or be modulated by other cellular events. One such event is autophagy which is a highly regulated process that plays an important role in the control of a wide range of cellular functions such as organelle recycling, nutrient availability and tissue differentiation. A recent study has shown an increased autophagic activity in the adipose tissue of obese subjects, and a role for autophagy in obesity associated insulin resistance was proposed. Body mass reduction is the most efficient approach to tackle insulin resistance in over-weight subjects; however, the impact of weight loss in adipose tissue autophagy is unknown. In this study we used a two-step approach to evaluate adipose tissue autophagy during body mass reduction. First, a mouse model of diet-induced obesity and diabetes was submitted to a fifteen-day, 40% caloric restriction. At base-line, markers of autophagy were increased in obese mice as compared to lean controls. Upon caloric restriction, autophagy increased in the lean mice, while decreasing in the obese mice. The reintroduction of ad libitum feeding was sufficient to rapidly reduce autophagy in the lean mice and increase autophagy in the obese mice. In the second part of the study, autophagy was evaluated in the subcutaneous adipose tissue of nine obese-non-diabetic and six obese-diabetic subjects undergoing bariatric surgery for body mass reduction. Specimens were collected during the surgery, and approximately one year later. As in the mouse model, human obesity was associated with increased autophagy and body mass reduction led to an attenuation of autophagy in the adipose tissue. Thus, while caloric restriction leads to increased autophagy in the adipose tissue in lean subjects, in obesity, autophagy is defectively regulated, being increased during ad libitum feeding and reduced upon caloric restriction Doutorado Clínica Médica Doutora em Ciências

Orientador: Lício Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Em modelos experimentais de obesidade induzida por dieta rica em gordura há desenvolvimento de resistência hipotalâmica à leptina decorrente da ativação de uma resposta inflamatória específica no hipotálamo. Estudos recentes revelaram que além da indução da inflamação, a dieta rica em gordura ativa também vias de sinalização apoptóticas que culminam com a morte de neurônios em regiões hipotalâmicas envolvidas com o controle da fome e do gasto energético. Acredita-se que a perda de sub-populações específicas de neurônios no hipotálamo acarrete em dano dos mecanismos de controle do balanço entre consumo calórico e gasto energético, resultando no desenvolvimento ou perpetuação da obesidade. A composição de ácidos graxos da dieta tem papel central na resposta inflamatória hipotalâmica, sendo os ácidos graxos saturados de cadeia longa os mais lesivos. Por outro lado, em outras regiões do cérebro, alguns ácidos graxos insaturados podem desempenhar papel anti-inflamatório e induzir reparo funcional através da neurogênese. Neste trabalho, nós avaliamos os efeitos dos ácidos graxos poliinsaturados ?-linolênico (ALA C18:3-n3), e docosaexaenoico (DHA 22:6-n3) sobre a indução de neurogênese no hipotálamo de animais com obesidade induzida por dieta rica em gordura (HFD). Nossos resultados mostram que ácidos graxos ômega-3 administrados tanto na dieta ou diretamente no cérebro, são capazes de modular a neurogênese no hipotálamo de camundongos obesos, favorecendo a proliferação de neurônios anorexigênicos POMC, mas sem redução da ingestão alimentar. Embora esses animais não comam menos, eles se movimentam mais e exibem um discreto aumento do gasto energético. A suplementação com ômega-3 em HFD reduz a inflamação e a apoptose no hipotálamo, além de melhorar o metabolismo glicêmico e proteger os animais do ganho de peso. Aparentemente, os neurônios recém-formados surgem a partir da proliferação de células com características de células progenitoras, presentes na parede do terceiro ventrículo. Nesse processo, o receptor de ácidos graxos livres, GPR40, e o fator neurotrófico derivado do cérebro, BDNF, desempenham papel fundamental, mas a participação dessas proteínas em tais eventos parece ser dependente do estado nutricional e metabólico do animal Abstract: In experimental models of high-fat diet (HFD)-induced obesity there is a development of hypothalamic leptin resistance due to the activation of a specific inflammatory responsein the hypothalamus. Recent studies have revealed that besides the induction of inflammation, a fat-rich diet can also activate apoptotic signaling pathways that culminate in neuronal death in hypothalamic areas responsible for the control of feeding and energy expenditure. It is believed that the loss of specific hypothalamic neuronal subpopulations deteriorates mechanisms involved in the control of caloric intake and energy expenditure, resulting in the development and perpetuation of obesity. The fatty acid composition of diet, particularly the saturated fatty acid content, can modulate immune activity in the hypothalamus, inducing an inflammatory response. However, in other regions of the brain, some unsaturated fatty acids can acts as anti-inflammatory agents and induce functional repair through neurogenesis. In this study we evaluated the effects of polyunsaturated fatty acids ?-linolenic (ALA C18:3-n3) and docosahexaenoic (DHA 22:6-n3) on the induction of hypothalamic neurogenesis in HFD-induced obese animals. Our results show that omega-3 fatty acids administered either in the diet or directly into the brain are able to modulate neurogenesis in the hypothalamus of obese mice, leading to the proliferation of anorexigenic POMC neurons. This effect is not accompanied by changes in food intake, but increase unstimulated physical activity resulting in a discrete increase in energy expenditure. In addition, omega-3 supplemented HFD reduces inflammation and apoptosis in the hypothalamus, improve glucose metabolism and protect the mice against body mass gain. Apparently, these newly formed neurons arise from progenitor cell proliferation present in the wall of the third ventricle. In this process, free fatty acid receptor, GPR40, and brain-derived neurotrophic factor, BDNF, play a key role; however, the involvement of these proteins in such events appears to be dependent on the nutritional and metabolic status of the animal Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Ciências

Orientador: Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A obesidade, definida como o acúmulo excessivo ou anormal de gordura que pode causar dano à saúde do indivíduo, é considerada atualmente um dos principais problemas de saúde pública. Ela resulta de um desequilíbrio entre a ingestão alimentar e o gasto de energia. O controle do balanço energético de animais e seres humanos é realizado pelo sistema nervoso central (SNC) através de um sistema endócrino, em que hormônios periféricos circulantes como a leptina e a insulina sinalizam a neurônios especializados do hipotálamo sobre os estoques de gordura do organismo, e induzem respostas apropriadas para a manutenção da estabilidade destes estoques. A maioria dos casos de obesidade se associa a um quadro de resistência central à ação da leptina e da insulina. Em animais de experimentação, a dieta hiperlipídica é capaz de induzir um processo inflamatório no hipotálamo, que interfere com as vias intracelulares de sinalização por estes hormônios, resultando em hiperfagia, diminuição do gasto de energia e, por fim, obesidade. Até o momento não existem evidências de que mecanismos semelhantes possam contribuir para o desenvolvimento de obesidade em seres humanos. Os objetivos deste estudo foram avaliar o impacto da redução de massa corporal sobre a funcionalidade do sistema nervoso central e sobre marcadores de inflamação no líquido cefalorraquidiano (LCR) de pacientes obesos. Para tanto, foram avaliados treze pacientes obesos antes e aproximadamente oito meses após a realização de cirurgia bariátrica, além de oito voluntários com índice de massa corporal normal, através de ressonância magnética funcional e análise do LCR. Os indivíduos obesos apresentaram padrões de atividade funcional distintos em algumas regiões cerebrais, principalmente no hipotálamo, no córtex orbitofrontal e somatossensorial, em relação aos indivíduos eutróficos. Estas alterações foram parcialmente revertidas após a perda de peso induzida pela cirurgia bariátrica. Além disso, observou-se após a perda de peso um aumento dos níveis de IL-6 e IL-10 no LCR, citocinas que exercem ações anti-inflamatórias no SNC. Conclui-se que humanos obesos apresentam alterações da atividade funcional do cérebro em resposta à glicose, e que a redução da massa corporal induzida pela cirurgia bariátrica acompanha-se de uma restauração parcial da atividade neuronal e de um aumento da atividade anti-inflamatória no líquido cefalorraquidiano Abstract: Obesity, defined as abnormal or excessive fat accumulation that may impair life quality, is one of the major public health problems worldwide. It results from an imbalance between food intake and energy expenditure. The control of energy balance in animals and humans is performed by the central nervous system (CNS) through an endocrine system, in which circulating peripheral hormones such as leptin and insulin provide a signal to specialized neurons of the hypothalamus reflecting body fat stores, and induce appropriate responses to maintain the stability of these stores. The majority of obesity cases are associated with central resistance to both leptin and insulin actions. In experimental animals, high-fat diets can induce an inflammatory process in the hypothalamus, which impairs leptin and insulin intracellular signaling pathways and results in hyperphagia, decreased energy expenditure and ultimately obesity. So far, there is no evidence that similar mechanisms may contribute to the development of obesity in humans. The aims of this study were to evaluate the impact of body mass reduction on the functionality of the central nervous system and on markers of inflammation in the cerebrospinal fluid (CSF) of obese patients. To achieve this objective, we evaluated thirteen obese patients before and approximately eight months after bariatric surgery, and eight normal weight volunteers, using functional magnetic resonance imaging and CSF analysis. Obese individuals showed distinct patterns of functional activity in some brain areas, mainly in the hypothalamus, orbitofrontal and somatosensory cortices, as compared to normal weight individuals. These changes were partially reversed after body mass loss following bariatric surgery. Moreover, we observed increases in the CSF levels of IL-6 and IL-10, both known to possess anti- inflammatory actions in the CNS. In conclusion, obese humans present altered functional brain activity in response to glucose, and body mass reduction following bariatric surgery is accompanied by partial restoration of neuronal activity and an increase in anti-inflammatory activity in the cerebrospinal fluid Doutorado Clínica Médica Doutor em Clínica Médica

Orientador: Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: O hormônio angiotensina II (ANGII) através de seu receptor AT1 é capaz de ativar a via de sinalização JAK/STAT. Estudos demonstram que esta via encontra-se hiper-ativada durante o desenvolvimento da hipertensão. Os mecanismos pelos quais esta via é regulada pela ANGII ainda não foram totalmente elucidados. Relatos demonstram que hormônios, citocinas e fatores de crescimento que transduzem seus sinais através da via JAK/STAT, acabam por induzir a expressão de proteínas da família SOCS e que estas, por sua vez, promovem a regulação do sinal de seus indutores. Estudos epidemiológicos demonstram que a hipertensão é um dos mais importantes fatores de risco para o desenvolvimento da resistência à insulina (RI). Embora seja conhecido que a ANGII apresenta importante papel no desenvolvimento da hipertensão e da RI, uma vez que a inibição de sua ação, não somente reduz a pressão sanguínea como também melhora a sensibilidade à insulina em indivíduos hipertensos e resistentes à insulina, muito pouco é conhecido sobre os mecanismos moleculares pelos quais este hormônio pode causar RI. No presente estudo, examinamos o papel da ANGII sobre os mecanismos de ativação e regulação da via JAK/STAT em coração de ratos Wistar adultos (RWA) e em cardiomiócitos ventriculares isolados de ratos neonatos (CVIN). Nossos resultados revelaram que, após a ligação da ANGII ao receptor AT1, ocorre ativação de JAK2 e STAT1 e, subsequentemente, a expressão de SOCS3 é induzida. Verificamos ainda que a ativação da via JAK/STAT e a expressão de SOCS3 são dependentes da ativação de AT1 pela ANGII e que a expressão de c-jun pode ser induzida também pelo receptor AT2. Além disso, observamos que SOCS3 pode participar do mecanismo de desensibilização ou refratariedade do sinal da ANGII através da via JAK/STAT como demonstrado pelo seu bloqueio com oligonucleotídeo antisense contra SOCS3 (AS SOCS3). Também investigamos se a proteína SOCS3, induzida por ANGII, pode participar do cros-talk molecular entre o sinal da ANGII e da insulina. Observamos que o tratamento com ANGII causa queda significativa na atividade de proteínas da via PI 3-K/AKT da insulina e que SOCS3, induzida por ANGII, associa-se a IR, IRS1 e IRS2. O uso de AS SOCS3 restaura os níveis de fosforilação em tirosina de IRS1 e IRS2 induzidos pela insulina, aumenta a associação entre IRS1 e IRS2 com PI 3-K, e a subseqüente atividade desta enzima e da proteína AKT e leva a um aumento na translocação de GLUT4 para a membrana celular. O presente estudo demonstra, pela primeira vez, que o hormônio ANGII é capaz de induzir a expressão de uma proteína supressora da sinalização das citocinas, SOCS3, e que esta proteína, além de participar do controle das ações fisiológicas de seu indutor, também participa do cros-talk negativo entre o sinal de dois hormônios, ANGII e insulina, podendo se constituir, desta forma, em mais um mecanismo de interconexão entre hipertensão arterial e RI e/ou diabetes mellitus tipo II Abstract: Intracellular interactions between different signaling systems may function as mechanisms for enhancing or counter-regulating hormone action. The hormone angiotensin II (ANGII) is involved in the development of both, hypertension and insulin resistance. Several studies demonstrate that in signaling systems that use the JAK/STAT pathway, proteins of the suppressor of cytokine signaling (SOCS) family participate in signal regulation. In the present study we demonstrate that ANGII is able to activate the JAK/STAT pathway and, subsequently, the expression of SOCS3. SOCS3 is constitutively expressed at a low level in the heart of rats and neonatal rat ventricular myocytes. ANGII, at a physiological concentration, enhances the expression of SOCS3 mRNA and protein, mainly via AT1 receptors. After induction, SOCS3 associates with JAK2 and impairs further activation of the JAK2/STAT1 pathway. Pretreatment of rats with a specific phosphorthioate antisense oligonucleotide against SOCS3, reverses the desensitization to angiotensin signaling, as detected by a fall in c-jun expression after repetitive infusions of the hormone. We also demonstrate the interaction of ANGII-induced SOCS3 with the insulin signaling pathway in cardiac tissue in vivo and in isolated cell system. ANGII-induced SOCS3 interacts with the IR, JAK2, IRS1 and IRS2. The inhibition of SOCS-3 expression by antisense oligonucleotide partially restores the ANGII-induced inhibition of insulin-induced IR, IRS- 1 and IRS-2 tyrosine phosphorylation, IRS1 and IRS2 association with p85- phosphatidylinositol 3-quinase and AKT [Ser473] serine phosphorylation. Moreover, the inhibition of SOCS3 expression partially reverses ANGII- induced inhibition of insulinstimulated GLUT-4 translocation to the cell membrane. Thus, ANGII-induced SOCS3 in rat heart and neonatal rat ventricular myocytes may actively participate in the control of the ANGII signaling, and also, as a late event, in the negative cross-talk between ANGII and insulin signaling pathways Doutorado Medicina Experimental Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientador: Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A enzima fosfatidilinositol 3-quinase (PI3-kinase) exerce uma importante função na transdução dos sinais anorexigênicos e termogênicos enviados pela insulina e leptina em primeira ordem aos neurônios do núcleo arqueado no hipotálamo. A cascata de sinais intracelulares gerados pela ativação da PI3-kinase depende da atividade coordenada de inositol-fosfatases específicas. Neste trabalho, mostramos que a phosphoinositide-specific inositol polyphosphate 5-phosphatase IV (5ptase IV) está altamente expressa em neurônios do núcleo arqueado e lateral do hipotálamo. Submetido ao tratamento intracerebroventricular (ICV) com insulina, a 5ptase IV sofre fosforilação em tirosina de acordo com um padrão tempo-dependente, a qual segue os mesmos moldes da sinalização da insulina através do seu receptor (IR), seu substrato-2 (IRS2) e da PI3-kinase. Para avaliar a participação da 5ptase IV na ação da insulina no hipotálamo, trabalhamos com um oligonucleotídeo antisense específico para esta enzima. O tratamento dos ratos com este oligonucleotídeo durante quatro dias reduziu a expressão hipotalâmica da 5ptase IV em aproximadamente 80%. Tal fato foi acompanhado pela redução de 70% na sua fosforilação induzida pela insulina, e ainda pelo aumento na quantidade basal dos inositóis fosforilados no hipotálamo. Finalmente, a inibição da expressão da 5ptase IV no hipotálamo pelo oligonucleotídeo antisense, resultou na redução da ingestão média diária de alimentos, na perda de massa corporal e ainda na redução da ingestão alimentar em 12 horas. Desta forma, a 5ptase IV é um potente regulador da sinalização através da PI3kinase no hipotálamo e pode tornar-se um alvo interessante para a terapêutica da obesidade e para as desordens relacionadas Abstract: The enzyme phosphatidylinositol 3-kinase (PI 3-kinase) exerts an important role in the transduction of the anorexigenic and thermogenic signals delivered by insulin and leptin to first-order neurons of the arcuate nucleus in the hypothalamus. The termination of the intracellular signals generated by the activation of PI 3-kinase depends on the coordinated activity of specific inositol phosphatases. Here, we show that phosphoinositide-specific inositol polyphosphate 5-phosphatase IV (5ptase IV) is highly expressed in neurons of the arcuate and lateral nuclei of the hypothalamus. Upon intracerebroventicular (ICV) treatment with insulin, 5ptase IV undergoes a time-dependent tyrosine phosphorylation, which follows the same patterns of canonical insulin signaling through the insulin receptor, IRS-2, and PI 3-kinase. To evaluate the participation of 5ptase IV in insulin action in hypothalamus, we employed a phosphorthioate modified antisense oligonucleotide specific for this enzyme. The treatment of rats with this oligonucleotide for four days reduced the hypothalamic expression of 5ptase IV by ~80%. This was accompanied by a ~70% reduction of insulin-induced tyrosine phosphorylation of 5ptase IV and by an increase in basal accumulation of phosphorylated inositols in the hypothalamus. Finally, inhibition of hypothalamic 5ptase IV expression by the antisense approach resulted in reduced daily food intake, body weight loss and decreased 12 h spontaneous food intake. Thus, 5ptase IV is a powerful regulator of signaling through PI 3-kinase in hypothalamus and may become an interesting target for therapeutics of obesity and related disorders Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientador: Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A prevalência global de diabetes mellitus do tipo 2 vem aumentando rapidamente em paralelo ao aumento do número de casos de obesidade. Entretanto, os métodos terapêuticos empregados para esta doença permanecem insatisfatórios. Existem drogas potencializadoras das ações da insulina e fármacos que estimulam a secreção de insulina, no entanto nenhum medicamento atualmente disponível é capaz de corrigir simultaneamente todas as disfunções envolvidas na gênese do diabetes mellitus tipo 2, além disso, a maior parte destes, perde a eficácia depois de alguns anos de evolução da doença. Dessa forma os desafios para as novas drogas sensibilizadoras e estimuladoras da secreção de insulina será oferecer uma eficácia equivalente às drogas disponíveis, com menor número de efeitos colaterais e ação mais estável. Estudos recentes têm revelado que o coativador de transcrição gênica PGC-1alfa está associado com a regulação da gliconeogênese hepática e secreção de insulina. Sendo a proteína PGC- 1alfa uma importante co-ativadora de fatores de transcrição, e visto que sua inibição parcial provoca uma melhora geral no quadro de DM2, decidimos investigar os efeitos da inibição de PGC-1alfa em modelos animais de obesidade e DM2. Os resultados mostraram que a inibição de PGC-1alfa, através de um oligonucleotídeo antisense (PGC-1aAS), em animais obesos e diabéticos provoca aumento na secreção de insulina em cultura e in vivo e reduz os níveis glicêmicos sem provocar hipoglicemia. Além disso, há aumento no consumo de glicose, medido por clamp euglicêmicohiperinsulinêmico e redução da produção hepática de glicose. Ainda, a inibição da PGC-1alfa causou reversão da esteatose hepática induzida por dieta e pelo uso de etanol. Isso foi acompanhado pelo aumento da fosforilação e ativação da enzima Akt e pela fosforilação/inativação do fator de transcrição FOXO1 promovendo melhora da ação molecular da insulina no fígado. Assim, concluímos que a inibição da expressão de PGC-1alfa pode ser um método terapêutico de interesse para o tratamento de diabetes mellitus do tipo 2 e condições metabólicas afins. Abstract: Type 2 diabetes mellitus is one of the most prevalent and threatening diseases in modern societies. Nevertheless, the therapeutic approaches currently used are insufficient to promote adequate metabolic control of the disease. There are a number of drugs that increase insulin secretion and also drugs that enhance insulin action. However, no compound currently available is capable of simultaneously correcting insulin secretion and action defects present in diabetes. Recent data has provided evidence for the role of the co-activator of gene transcription, PGC-1alfa, on the control of insulin secretion and hepatic glucose production. Therefore, we have decided to evaluate the effects of an antisense oligonucleotide compound designed to inhibit PGC-1alfa expression, on the control of diabetes mellitus in distinct animal models. Our results show that the inhibition of PGC-1alfa increases insulin secretion in diabetic and obese animals without leading to hypoglycemia. In addition, the compound increased glucose action in peripheral tissues, improved glucose clearance during an euglycemic-hyperinsulinemic clamp and reduced hepatic glucose production. Finally, the inhibition of PGC-1alfa expression improved hepatic steatosis induced by ethanol and high-fat diet, which was accompanied by increased insulin signal transduction through the Akt/FOXO1 signaling pathway. We conclude that the inhibition of PGC-1alfa may be a potentially useful alternative for the treatment of type 2 diabetes mellitus and associated metabolic dysfunctions. Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientador: Lício Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A ativação da sinalização através do toll-like receptor-4 (TLR4) e a indução de estresse de retículo endoplasmático (ERE) são importantes mediadores da resistência à insulina na obesidade e em outras situações nas quais há um excesso de ácidos graxos saturados. Em um estudo recente, demonstrou-se que sinalização através de TLR4 pode, per se, induzir a ativação de ERE, sugerindo que a ativação do TLR4 é o evento inicial para a indução do estresse celular que contribui para o aumento da expressão de genes de resposta inflamatória. No entanto, os mecanismos que conectam essas duas vias distintas são desconhecidos. As chaperonas GRP78 e GRP94 exercem uma função importante no processamento das moléculas recém-traduzidas do TLR4. Além disso, a chaperona GRP94 é responsável por sua translocação e conteúdo na superfície celular. Durante uma ativação prolongada da via de sinalização do TLR4, a demanda por novas moléculas sintetizadas aumenta, e consequentemente, a demanda por novas chaperonas. Por esta razão, nós aventamos a hipótese de que sob uma ativação extrema da via do TLR4, a síntese de proteínas sobrepujaria a expressão de chaperonas, dessa forma induzindo ERE. Para testar essa hipótese, monócitos da linhagem THP-1 foram incubados com LPS e foi avaliada a expressão e ativação de proteínas responsivas ao ERE por real-time PCR, citometria de fluxo, imunoprecipitado e western blot. Em alguns experimentos, as células foram privadas de glicose ou tratadas com siRNA para aumentar ou diminuir, respectivamente, a expressão das chaperonas. Experimentos de time-course revelaram que o LPS induz um aumento de 2,5 vezes na expressão do TLR4, iniciando após 8 h, com um pico após as 24 h e permanecendo significantemente aumentado após 48 h. A expressão de GRP78 foi aumentada em três vezes com um aumento acentuado após 24 h sem aumento às 8 h, enquanto o GRP94 aumenta apenas 1,5 vezes com um pico após 2 h que retorna aos valores basais após 8 h do estímulo. Não houve aumento da expressão protéica das chaperonas após 48 h. A indução de ERE por LPS foi detectada antes de 4 h do estímulo observado pela avaliação da via da PERK/eIF2a, IRE1 e ATF6 e se mantém ativado após 48 h. Adicionalmente, a privação de glicose em células THP-1 aumenta a expressão de GRP94 e GRP78 em 2,5 e 11 vezes, respectivamente. Na ausência de glicose, o tratamento com LPS não induz ERE. A inibição da expressão das chaperonas por siRNA anula o efeito da privação de glicose em proteger as células do desenvolvimento de ERE induzido por LPS. Portanto, a hiperexpressão das chaperonas GRP78 e GRP94 protegem as células do ERE induzido por LPS. Assim, defeito na expressão das chaperonas induzido por TLR4 é um mecanismo envolvido na integração da sinalização do TLR4 e ERE Abstract: TLR4 activation and the induction of endoplasmic reticulum stress (ERS) are two of the most important mechanisms connecting excessive fat with insulin resistance. Recently, it was shown that activation of TLR4 can, per se, induce ERS, suggesting that TLR4 is a primary event in the induction of the cellular stress that contributes to increased inflammatory gene expression. However, the mechanisms linking these molecular events are unknown. The chaperones GRP78 and GRP94 play an important role during the assembly of newly translated TLR4 molecules. In addition, the chaperone GRP94 escorts the protein to the cell membrane. Under prolonged activation, the demand for newly synthesized TLR4 molecules increases, and thus, the demand for new chaperones. Therefore, we hypothesized that under increased activation of TLR4, the synthesis of the protein would not be matched by the expression of chaperones, thus, triggering ERS. To test this hypothesis, the monocyte cell line THP-1 was incubated with LPS and the expression/activation of proteins involved in ERS was determined by real-time PCR, flow-cytometry, immunoprecipitation and immunoblot. In some experiments, cells were deprived of glucose or treated with siRNA to increase or decrease, respectively, the expression of the chaperones. Time-course experiments revealed that LPS led to a 2.5-fold increase of TLR4 expression starting as early as 8h, peaking after 24h and remaining significantly increased after 48h. The expression of GRP78 underwent a 3-fold increase with a sharp rise at 24h (no increase at 8h), while GRP94 increased by only 1.5-fold with a peak at 2h and an early return to base-line levels. None of the chaperones were increased after 48h. LPS-induced ERS was detected as early as 4h after stimulus as detected by the evaluation of PERK/eIF2?, IRE1 and ATF6 pathways. Strong signals of ERS were still present after 48h. The pre-incubation of THP-1 in glucose-deprived medium produced 2.5 and 11-fold increases of GRP94 and GRP78, respectively. Upon glucosedeprivation, LPS could no longer induce ERS. Inhibition of chaperone expression by siRNA completely abrogated the effect of glucose deprivation to protect cells from LPS-induced ERS. Thus, the hyperexpression of GRP78 and GRP94 protect cells from LPS-induced ERS. Defective TLR4-induced chaperone expression is a mechanism involved in the integration of TLR4 signaling and ERS Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientador: Licio Augusto Velloso Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Insuficiência hepática causada por cirrose decorrente da progressão da esteato-hepatite não alcoólica é hoje uma das principais indicações para transplante hepático no mundo. A ingestão de dietas ricas em lípides é uma das principais causas de esteato-hepatite não alcoólica, e, uma vez estabelecida, poderá ou não evoluir para cirrose, dependendo da ativação de uma resposta inflamatória local. Nem todos os indivíduos que desenvolvem esteatose progridem para a esteato-hepatite. Acredita-se que, dentre os fatores que desempenham papel protetor na progressão para a esteato-hepatite e, por conseguinte, para a cirrose, encontra-se o equilíbrio entre a expressão de citocinas pró- e anti-inflamatórias no fígado. Níveis locais elevados da citocina anti-inflamatória IL-10 reduzem a resistência hepática à insulina e diminuem o risco de desenvolvimento de esteato-hepatite. Em estudos recentes observamos que a inibição da atividade da IL-10 em um modelo animal de esteato-hepatite induzida por dieta contribui para a piora da disfunção hepática. Por outro lado, a redução da expressão do co-ativador de transcrição gênica PGC-1a reverte a esteatose hepática induzida por dieta. Tal reversão é acompanhada pela modulação da expressão de IL-10 e de seu receptor, IL-10R. No presente estudo avaliamos se o PGC-1a?interage com dois fatores de transcrição que participam do controle da expressão de IL-10, c-Maf e NF?Bp50. Para tal utilizamos as técnicas de imunoblot, imunoprecipitação, imunocitoquímica, histologia convencional e imunoprecipitação de cromatina. Os nossos resultados revelam que o PGC-1a?se associa a ambos, c-Maf e p50, após estímulo por ácidos graxos saturados e insaturados. Tal associação ocorre em paralelo ao aumento da expressão de IL-10 e se acompanha da migração de todas as três proteínas de uma localização preferencialmente citosólica para o interior do núcleo de hepatócitos. Além disso, sob estímulo por ácidos graxos, as três proteínas se ligam ao DNA do promotor do gene da IL-10, numa região localizada entre as bases -493 e -254, antes do códon iniciador do gene. Pelo menos a associação de PGC-1a?com p-50 e a indução da expressão de IL-10 por ácidos graxos pode ser inibida pela pré-exposição de hepatócitos ao ácido acetil salicílico, um inibidor da enzima ativadora do NF?B. Portanto, PGC-1a?interage com dois fatores de transcrição e com o DNA da região promotora do gene da IL-10 e emerge como potencial regulador da expressão de IL-10 no fígado. Abstract: Interleukin-10 (IL-10) is an endogenous factor that restrains hepatic insulin resistance in diet-induced steatosis. Reducing IL-10 expression increases pro-inflammatory activity in the steatotic liver and worsens insulin resistance. Because in diet-induced steatosis the transcriptional co-activator PGC-1a plays a central role in the dysfunctional hepatocytic activity, we hypothesized that at least part of PGC-1a activity could be mediated by its effect on the transcriptional control of IL-10 expression. Here, we used immunoblot, real-time PCR, immunocytochemistry and ChIP assay to investigate the role of PGC-1a in the control of IL-10 expression in hepatic cells. First, we show that in the intact steatotic liver, the expressions of IL-10 and PGC-1a are increased. Inhibiting PGC-1a expression by antisense oligonucleotide increases IL-10 expression and reduces the steatotic phenotype. In cultured hepatocytes the treatment with saturated and unsaturated fatty acids, increase IL-10 expression. This is accompanied by increased association of PGC-1a with c-Maf and p50-NF?B, two transcription factors known to modulate IL-10 expression. In addition, following fatty acid treatment PGC-1a, c-Maf and p50- NF?B migrate from the cytosol to the nuclei of hepatocytes and bind to the IL-10 promoter region. Inhibiting NF?B activation with salicylate reduces IL-10 expression and PGC-1a association with p50-NF?B. Thus, PGC-1a emerges as a potential transcriptional regulator of the inflammatory phenomenon taking place in the steatotic liver. Mestrado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Licio Augusto Velloso Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A adiponectina é uma adipocina que circula no plasma em altas concentrações desempenhando um papel potencializador da ação da insulina e reduzindo a resistência a esse hormônio em humanos e em modelos experimentais de obesidade. Em paralelo às suas clássicas ações em tecidos periféricos, a insulina desempenha uma importante função como controladora da fome e da termogênese ao agir em conjunto com a leptina no sistema nervoso central. O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos fisiológicos e os mecanismos moleculares de ação da adiponectina no hipotálamo. Especialmente, avaliou-se a sua capacidade de modular vias importantes de sinalização celular envolvidas no controle da fome e da termogênese. Inicialmente a presença dos receptores AdipoR1 e AdipoR2 foi detectada predominantemente nos núcleos arqueado e lateral do hipotálamo. A seguir, observou-se que em ratos tratados por via intracerebroventricular a adiponectina promoveu uma redução de aproximadamente 40 % da ingestão alimentar, o que foi acompanhado pelo aumento da fosforilação em tirosina do IRS1/2, aumento da fosforilação em serina da Akt e FOXO1, da fosforilação em tirosina da ERK, assim como pela ativação da via JAK/STAT. Estes efeitos foram mediados pelo receptor AdipoR1, pois após sua inibição através de injeções intracerebroventriculares de oligonucleotídeos antisenso os efeitos descritos acima foram revertidos, enquanto o bloqueio do receptor AdipoR2 foi ineficaz em neutralizar os efeitos da adiponectina. Assim, conclui-se que a adiponectina, atuando predominantemente através do receptor AdipoR1, diminui a ingestão alimentar e ativa vias de sinalização classicamente envolvidas com a transdução dos sinais da insulina e da leptina Abstract: The adipokine adiponectin is present in high concentration in the bloodstream and acts to enhance insulin actions, partially reverting insulin resistance in humans and in animal models of obesity. In parallel to its classical peripheral effects, insulin acts in concert with leptin to control food intake and thermogenesis. The objective of the present study was to determine the physiological outcomes and the molecular mechanisms of action of adiponectin in the hypothalamus. Initially, the expressions of AdipoR1 and AdipoR2 were mapped to the arcuate and lateral hypothalamic nuclei. The intracerebroventricular injection of adiponectin promoted a 40% reduction of spontaneous food intake. This was accompanied by the increased tyrosine phosphorylation of IRS1/2 and ERK, increased serine phosphorylation of Akt and FOXO1 and by the activation of JAK/STAT signaling. These effects were mediated by AdipoR1 since the inhibition of its expression by intracerebroventricular treatment with a specific antisense oligonucleotide completely reversed the effects described above, while the intracerebroventricular treatment with a specific antisense oligonucleotide to AdipoR2 was ineffective to modify the hypothalamic actions of adiponectin. Thus, we conclude that adiponectin acts predominantly through AdipoR1 in the hypothalamus to control food intake and to activate signal transduction through elements classically involved in insulin and leptin signaling Mestrado Medicina Experimental Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Li Li Min Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Medicações antiplaquetárias e anti-hipertensivas pertencem à primeira linha no tratamento e prevenção das doenças cerebrovasculares e tem sido amplamente prescritas para pacientes com fatores de riscos cardiovasculares. Objetivo: nossa hipótese é de que o uso de ácido acetilsalicílico e de anti-hipertensivos pode, além de reduzir a incidência e recorrência de eventos isquêmicos, reduzir a gravidade do acidente vascular isquêmico quando usados previamentes ao evento. Métodos: este é um estudo transversal realizado em dois hospitais públicos de referência no atendimento de acidente vascular cerebral na cidade de Campinas, São Paulo, com uma amostra consecutivas de pacientes atendidos entre janeiro e dezembro de 2014. Foi utilizado um questionário estruturado para coletar dados de pacientes internados com o diagnóstico nas primeiras 48 horas do início dos sintomas. Verificou-se o uso prévio auto declarado de medicações incluindo os agentes antiplaquetários nos últimos 7 dias e as principais classes de anti-hipertensivos nos últimos 30 dias. A gravidade do evento isquêmico na admissão foi avaliada através da escala National Institute of Heatth Stroke. Nós comparamos os pacientes com uso das medicações com aqueles sem uso anterior. Foi realizada uma análise de regressão linear generalizada para determinar os preditores de admissão de acordo com a escala. Resultados: Entre os 287 pacientes, 91 (31,7%) relataram uso prévio de aspirina e 148 (51,6%) de alguma das classes de anti-hipertensivos. Entre os usuários de aspirina, a escala de gravidade foi significativamente mais baixa (menor gravidade) quando comparados com os não usuários (p.0036). Nao houve diferença na gravidade entre os usuários de anti-hipertensivos. Conclusões: a utilização de ácido acetilsalicílico no prazo de 7 dias anteriores ao início do acidente vascular isquêmica foi associada a redução da sua gravidade Abstract: Antiplatelet and antihypertensive agents are first line prevention and therapy of cerebrovascular diseases and has been widely prescribed for patients with cardiovascular risk factors. Objective: We hypothesize that previous use of aspirin and antihypertensive agents, in addition to in addition to reduction of incidence and recurrence of ischemic events, can reduce the stroke severity. Methods: This cross-sectional study with a consecutive sample of ischemic stroke patients hospitalized in Campinas, Sao Paulo, in two stroke reference hospital, between January 2014 and December 2014. We used a questionnaire to collect data from patients admitted with a diagnosis within 48 hours. Previous use of antiplatelet agents, antihypertensive drugs was inspected. Previous use of antiplatelet drugs was defined as self-report of using aspirin within 7 days from stroke onset and previous use of antihypertensive was defined as self-report of using aspirin within 30 days. Baseline stroke severity was assessed according to the National Institutes of Health Stroke Scale. We compared patients with use of medications to those without previous use. A generalized linear regression analysis was performed to determine the predictors of admission according to the NHISS. Results: Among the 287 patients, 91 (31.7%) reported previous use of aspirin and 148 (51.6%) of any of antihypertensive classes. Among aspirin users, the severity score was significantly lower compared with nonusers (p.0036). There was no difference in severity between the antihypertensive users. Conclusions: The use of aspirin within 7 days before the of ischemic stroke was associated with reduced severity Mestrado Fisiopatologia Médica Mestra em Ciências

Orientador: Lício Augusto Velloso Dissertação (mestrado) - Universidade EStadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Nas últimas décadas, a prevalência da obesidade teve um expressivo aumento no mundo, tornando-se um dos mais importantes fenômenos clínicos-epidemiológicos da atualidade. Fatores como o alto consumo calórico e diminuição no gasto energético, associados a determinantes genéticos, desempenham papel relevante na patogênese desta doença. A taurina (Tau) é conhecida por modular diversos parâmetros metabólicos, como ação e secreção da insulina e os níveis sanguíneos de colesterol. Dados recentes sugerem que Tau também pode reduzir a adiposidade corpórea em C. elegans e roedores. Desde que a adiposidade corpórea é principalmente regulada por neurônios hipotalâmicos responsivos à insulina e envolvidos no controle da fome e termogênese, nós hipotetizamos que algumas das atividades da Tau, relacionadas ao controle da gordura corpórea, pode exercer efeitos através da sua ação direta no hipotálamo de ratos. Aqui, nós mostramos que a infusão intracerebrocentricular de doses agudas de Tau reduzem a ingestão alimentar e ativam a transdução de sinal através das vias de sinalização Akt/FOXO1, JAK2/STAT3 e mTOR/AMPK/ACC. Esses efeitos são acompanhados pela modulação da expressão de NPY. Além disso, Tau pode melhorar o efeito anorexigênico da ação da insulina. Assim, o aminoácido Tau exerce uma potente ação anorexigênica no hipotálamo e melhora o efeito da insulina no controle da ingestão alimentar Abstract: In the last decades, the obesity prevalence have a expressive increase in the world, been one of the most important actual phenomenon clinical-epidemiological. The high caloric intake and decrease of energy expenditure, associated with genetics factors play a relevant role in this disease. Taurine (Tau) is known to modulate a number of metabolic parameters such as insulin secretion and action and blood cholesterol levels. Recent data have suggested that Tau can also reduce body adiposity in C. elegans and in rodents. Since body adiposity is mostly regulated by insulin-responsive hypothalamic neurons involved in the control of feeding and thermogenesis, we hypothesized that some of the activity of Tau in the control of body fat would be exerted through a direct action in rat hypothalamus. Here, we show that the intracerebroventricular injection of an acute dose of Tau reduces food intake and activates signal transduction through the Akt/FOXO1, JAK2/STAT3 and mTOR/AMPK/ACC signaling pathways. These effects are accompanied by the modulation of expression of NPY. In addition, Tau can enhance the anorexigenic action of insulin. Thus, the aminoacid, Tau, exerts a potent anorexigenic action in the hypothalamus and enhances the effect of insulin on the control of food intake Mestrado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Nescient helix-loop-helix-2 (Nhlh2) é um fator de transcrição altamente expresso no hipotálamo onde controla a transcrição do pró-hormônio convertase 1/3, impactando, portanto, no processamento do POMC e, portanto, na homeostase energética de todo o corpo. Estudos experimentais demonstraram que o nocaute do gene Nhlh2 resulta em aumento da massa corporal, redução da atividade física e hipogonadismo. Em humanos, pelo menos um polimorfismo do gene NHLH2 está associado à obesidade; e, na síndrome de Prader-Willi, uma rara condição humana caracterizada por obesidade, hipogonadismo e anormalidades comportamentais, a expressão de NHLH2 é reduzida. Apesar de consideráveis evidências clínicas e experimentais sugerindo que NHLH2 poderia ser um bom alvo para o tratamento da obesidade, nenhum estudo anterior avaliou o impacto de uma superexpressão hipotalâmica de Nhlh2 na obesidade. Aqui, usamos um lentivírus que induziu aumento de 40% na expressão hipotalâmica de Nhlh2 e avaliamos parâmetros metabólicos em um modelo experimental de obesidade induzida por dieta. Em camundongos alimentados com dieta rica em gordura introduzida logo após a injeção intracerebroventricular do núcleo arqueado bilateral do lentivírus, a superexpressão hipotalâmica de Nhlh2 evitou o desenvolvimento de obesidade por um mecanismo dependente predominantemente da redução da ingestão calórica. Quando a superexpressão hipotalâmica de Nhlh2 foi induzida em camundongos previamente obesos, o impacto benéfico no fenótipo associado à obesidade foi ainda maior; assim, houve uma atenuação de 80% no ganho de massa corporal, redução da adiposidade corporal total, aumento da temperatura do tecido adiposo marrom, redução da inflamação hipotalâmica e redução da esteatose hepática. Nesse cenário, o impacto benéfico da superexpressão hipotalâmica de Nhlh2 foi resultado de efeitos combinados na ingestão calórica, gasto de energia e atividade física. Além disso, a superexpressão hipotalâmica de Nhlh2 reduziu o comportamento do tipo ansioso e deprimido associado à obesidade. Assim, este estudo fornece uma prova de conceito experimental que apoia que o Nhlh2 hipotalâmico é um bom alvo para o tratamento da obesidade Abstract: Nescient helix-loop-helix-2 (Nhlh2) is a transcription factor highly expressed in the hypothalamus where it controls the transcription of prohormone convertase 1/3, therefore impacting on the processing of POMC and thus, on whole body energy homeostasis. Experimental studies have shown that knockout of the Nhlh2 gene results in increased body mass, reduced physical activity and hypogonadism. In humans, at least one polymorphism of NHLH2 gene is associated with obesity; and, in Prader-Willi syndrome, a rare human condition characterized by obesity, hypogonadism and behavioral abnormalities, the expression of NHLH2 is reduced. Despite considerable clinical and experimental evidence suggesting that NHLH2 could be a good target for the treatment of obesity, no previous study has evaluated the impact of a hypothalamic overexpression of Nhlh2 in obesity. Here, we used a lentivirus that induced 40% increase in the hypothalamic expression of Nhlh2 and evaluated metabolic parameters in an experimental model of diet-induced obesity. In mice fed a high-fat diet introduced right after the bilateral arcuate nucleus intracerebroventricular injection of the lentivirus, the hypothalamic overexpression of Nhlh2 prevented the development of obesity by a mechanism dependent predominantly on the reduction of caloric intake. When hypothalamic overexpression of Nhlh2 was induced in previously obese mice, the beneficial impact on obesity-associated phenotype was even greater; thus, there was an 80% attenuation in body mass gain, reduced whole body adiposity, increased brown adipose tissue temperature, reduced hypothalamic inflammation and reduced liver steatosis. In this setting, the beneficial impact of hypothalamic overexpression of Nhlh2 was a result of combined effects on caloric intake, energy expenditure and physical activity. Moreover, the hypothalamic overexpression of Nhlh2 reduced obesity-associated anxiety/depression behavior. Thus, this study provides an experimental proof-of-concept supporting that hypothalamic Nhlh2 is a good target for the treatment of obesity Doutorado Fisiopatologia Médica Doutor em Ciências FAPESP 2016/00977-2

Orientador: Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O hipotálamo integra sinais sistêmicos de hormônios e nutrientes em uma complexa rede neural que controla a ingestão alimentar e o gasto energético. A exposição crônica a uma dieta hiperlipídica é capaz de deflagrar uma resposta inflamatória no hipotálamo que dessensibiliza os neurônios POMC aos sinais anorexigênicos e, eventualmente, pode levar a perda neuronal por apoptose. Na primeira parte desta Tese, investigamos o papel da TRIL, uma proteína acessória do TLR4, na inflamação hipotalâmica associada ao consumo de dieta hiperlipídica e na função dos neurônios POMC. Demonstramos que a TRIL está predominantemente expressa em neurônios POMC e que o seu knockdown no núcleo arqueado resulta na redução da inflamação hipotalâmica, na melhora na homeostase glicêmica e na proteção contra a obesidade. Utilizando adenovírus associado Cre-dependente para o knockdown da TRIL especificamente nos neurônios POMC, observamos redução da massa de gordura e melhora na sinalização da leptina nestes neurônios. A sensibilidade neuronal à glicose é fundamental para ativação pós-prandial de neurônios POMC e inibição do apetite por meio de seus sinais anorexigênicos. Na segunda parte desta Tese, examinamos o papel do PPAR? como regulador indireto da ativação de neurônios POMC. Camundongos com deleção do PPAR? em neurônios POMC utilizando CRISPR-Cas9 não exibiram alteração na responsividade destes neurônios aos estímulos de glicose e leptina, no entanto, apresentaram melhora na homeostase sistêmica da glicose. Esta Tese avaliou dois mecanismos potencialmente envolvidos com a disfunção do hipotálamo em obesidade e distúrbios metabólicos. Nossos resultados permitem concluir que a proteína TRIL participa da inflamação hipotalâmica gerada em resposta ao consumo de dieta hiperlipidica enquanto a inibição do PPAR? em neurônios POMC é capaz de melhorar a homeostase sistêmica da glicose sem afetar sua resposta a leptina e glicose Abstract: The hypothalamus integrates peripheral signals to a complex neural circuit that controls feeding and energy expenditure. The consumption of high-fat diet triggers an inflammatory response in the hypothalamus and promotes loss of nutrient sensing and apoptosis of POMC neurons after long-term high-fat diet feeding. Here, we investigated the role of TRIL, an acessory protein of TLR4, in the diet-induced hypothalamic inflammation and POMC neuronal function. We showed that TRIL is predominantly expressed in POMC neurons. After the knockdown of TRIL in the arcuate nucleus of the hypothalamus, there was a reduction in hypothalamic inflammation, improved systemic glucose tolerance and protection against diet-induced obesity. The POMC-specific knowckdown of TRIL using Cre-dependent adeno-associated virus promoted body mass reduction and enhanced leptin signaling. Glucose sensitivity is pivotal for the post-prandial activation and apetite-suppressant effects of POMC neurons. In the second part of this Thesis, we analyzed a putative role for PPAR? as an indirect regulator of POMC neurons. CRISPR-Cas9-mediated deletion of PPAR? in POMC neurons was not sufficient to alter glucose and leptin sensitivity, but reduced glucose intolarance in obese mice. In this Thesis, we evaluated two mechanisms potentially involved in hypothalamic dysfunction in obesity and metabolic disorders. Altogether, our results show that TRIL is involved in the development of diet-induced hypothalamic inflammation whereas POMC PPAR? is involved in the hypothalamic regulation of systemic glucose tolerance Doutorado Fisiopatologia Médica Doutor em Ciências CAPES 001 FAPESP 2016/01245-5

Orientador: Licio Augusto Velloso Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A regulação do balanço energético depende da atividade coordenada de neurônios hipotalâmicos, tais como, POMC/CART e NPY/AgRP, sensores primários dos estoques de energia no organismo. A ativação dos neurônios POMC inibe o consumo alimentar e aumenta o gasto energético, sendo tais respostas dependentes da expressão de proteínas convertases que clivam a POMC nativa resultando na formação de neuropeptídeos ativos. Nutrientes e hormônios são importantes reguladores da função de POMC. Mudanças socioeconômicas nas últimas décadas tiveram influência direta sobre os hábitos alimentares humanos, resultando em aumento do consumo de alimentos ultraprocessados, ricos em açúcares simples e ácidos graxos saturados, como o palmitato. Os efeitos deletérios do palmitato sobre o processamento de POMC ainda não foram completamente elucidados, mas dependem de várias vias de sinalização intracelular. Devido ao seu papel essencial na transcrição de genes importantes para a sobrevivência e plasticidade neuronal, a via da proteína de ligação responsiva ao AMPc (CREB) surge como um alvo potencial para a ação desse ácido graxo. Neste projeto investigamos se o fator de transcrição CREB poderia ser modulada pelo palmitato e dieta hiperlipídica e, dessa maneira, contribuir com o processamento anômalo de POMC. Por meio de diferentes abordagens experimentais (in vivo e ex vivo) confirmamos que PKA, CaMKII e CREB são expressas em neurônios POMC. Em camundongos alimentados cronicamente com uma dieta rica em gordura houve modificação da distribuição anatômica de pCaMKII e pCREB no hipotálamo mediobasal. Em exposição aguda à mesma dieta houve aumento da fosforilação de CREB no hipotálamo de camundongos. Para isolar os efeitos do palmitato daqueles potencialmente desencadeados por outros componentes da dieta, analisamos camundongos alimentados com dieta padrão que receberam uma injeção intracerebroventricular (ICV) de 30 µM de palmitato, e também uma linhagem celular de neurônios POMC tratada com 50 µM do mesmo ácido graxo saturado. O tratamento ICV promoveu uma tendência de aumento na fosforilação de CREB e PKA, e um aumento significativo na fosforilação de CaMKII, confirmando a resposta desta via ao palmitato. Tanto nos animais, como na cultura de células POMC, houve modulação na expressão das proteínas convertases e aumento na expressão de diferentes marcadores inflamatórios. Para confirmar a participação das proteínas CREB e CaMKII sobre a expressão das proteínas convertases, utilizamos partículas lentivirais para reduzir a expressão de ambas no hipotálamo mediobasal de camundongos, que posteriormente foram alimentados com dieta hiperlipídica ou receberam uma injeção intracerebroventricular (ICV) de 30 µM de palmitato. A redução de CREB e CaMKII foi responsável por alterar a expressão de POMC, PC1/3 e PC2, após o estímulo com palmitato e dieta hiperlipídica, além de promover aumento na adiposidade e ingestão alimentar a curto prazo. Esses resultados confirmam que a dieta hiperlipídica e em especial o palmitato, atuam diretamente sobre a expressão de CREB e CaMKII hipotalâmicas, resultando em alteração na expressão de POMC e das proteínas convertases envolvidas no seu processamento e consequentemente nos neuropeptídeos derivados Abstract: Whole-body energy homeostasis depends on the coordinated action of different hypothalamic neurons, such as POMC/CART and NPY/AgRP. The activation of POMC neurons inhibits food consumption and increases energy expenditure. The proper action of POMC depends on its processing, which is catalyzed by several convertases resulting in neuropeptide formation. POMC neurons are responsive to hormones and nutrients. Socioeconomic changes that occurred along the last century impacted on eating habits, increasing the consumption of processed foods, rich in sugars and saturated fats, such as palmitate. The deleterious effects of palmitate on POMC processing are yet to be fully elucidated, depending on several intracellular signaling pathways. Due to its essential role in the transcription of several genes, which are essential for neuronal survival and plasticity, the cAMP-responsive binding protein (CREB) pathway has emerged as a potential target for this fatty acid. CREB is a nuclear protein regulated by phosphorylations catalyzed by PKA and/or CaMKII. In this project, we investigated the transcription factor CREB could be modulated by palmitate and contribute to the anomalous processing of POMC. Through different experimental approaches (in vivo and ex vivo) we initially confirmed that PKA, CaMKII, and CREB are expressed by POMC neurons. Chronic consumption of a high-fat diet modified the anatomical distribution of pCaMKII and pCREB in the mediobasal hypothalamus. Mice fed a high-fat diet for only nine hours increased phosphorylation of CREB in the hypothalamus. To isolate the effects of palmitate from those of other components of the diet, C57BL/6J-Unib mice fed standard chow received an intracerebroventricular injection (ICV) of 30 µM palmitate; in addition, a POMC cell line was treated with 50 µM of palmitate. In mice, ICV palmitate, promoted a significant increase in phosphorylation of CaMKII, confirming the involvement of this pathway in the response to palmitate. Both, mice and cell culture, responded to palmitate by changing the expression of convertase proteins and increasing the expression of different inflammatory markers. To confirm CREB and CaMKII involvement on convertase proteins expression, we employed lentiviral particles to reduce the expression of either protein in the basal middle hypothalamus of mice, which were later fed on a high-fat diet or received an intracerebroventricular injection (ICV) of 30 µM of palmitate. The reduction in CREB and CaMKII expression was responsible for altering the expression of POMC, PC1/3 and PC2, after stimulation with palmitate and a high-fat diet, in addition to promoting an increase in adiposity and food intake. These results confirm that the high-fat diet, and particularly palmitate, act directly on the expression of hypothalamic CREB and CaMKII altering the expression of POMC and convertase proteins, which in turn are essential for the proper processing of this neuropeptide Mestrado Fisiopatologia Médica Mestra em Ciências FAPESP 2019/00330-7 CAPES 001

Orientador: Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A obesidade decorre da associação entre fatores genéticos, metabólicos, hormonais e ambientais. Uma vez estabelecida, favorece o aparecimento de resistência à insulina, doenças cardiovasculares, hipertensão, dislipidemia e alguns tipos de câncer, impactando na qualidade de vida e nas taxas de mortalidade da população. Por proporcionar gastos elevados à saúde pública e por acometer cerca de 650 milhões de indivíduos no mundo, a obesidade é um dos maiores fenômenos clínico-epidemiológicos da atualidade. Estudos recentes mostram que a citocina próinflamatória interleucina 17 (IL-17) está associada à obesidade. Por ser uma citocina produzida por células residentes no intestino, ter sua secreção regulada pela alimentação e pela microbiota intestinal e estar envolvida no desenvolvimento da obesidade, existe possibilidade da IL-17 participar do controle regulatório central da fome. Através de ensaios de PCR quantitativo real time, Western blot, imunofluorescência, caracterizações metabólicas e fotos termográficas do tecido adiposo marrom (BAT), analisamos a modulação da expressão de neurotransmissores e parâmetros metabólicos mediados por esta citocina em camundongos C57BL/6 e em animais transgênicos repórter para POMC, AgRP e IL-17. Foi observada expressão de IL-17 receptor A (IL-17RA) no tecido hipotalâmico, particularmente em neurônios POMC, NPY, AgRP e MCH. Além disso, a administração via intraperitonial (IP) e intracerebroventricular (ICV) de IL-17 aumentou a expressão de POMC, bem como reduziu o consumo alimentar espontâneo. IL-17 via IP modulou a fosforilação de MEK4 e STAT3 hipotalâmicos e aumentou a temperatura do BAT, já a administração via ICV diminuiu o coeficiente respiratório. Esses dados em conjunto demonstram de forma original que a IL-17 desempenha importante papel no controle da homeostase energética hipotalâmica e termogenese Abstract: Obesity results from the association of genetic, metabolic, hormonal and environmental factors. Once established, it favors the development of insulin resistance, cardiovascular diseases, hypertension, dyslipidemia and some types of cancer, impacting on life quality and mortality. Due to its huge impact on the economics of public health and because its prevalence is currently about 650 million people, obesity has grown to become one of the most important clinical and epidemiological problems in the world. Recent studies have provided evidence that interleukin-17 (IL-17) is associated with obesity. IL-17 is produced in the gut in response to changes in the microbiome landscape and food intake, thus, it is possible that it is involved in central the regulation of feeding. Here, we employed real-time PCR, immunoblot, immunofluorescence, metabolic assays, thermographic images, measurement of neurotransmitters to evaluate the actions of IL-17 in C57BL/6 and reporter mice. IL-17 receptor A (IL-17RA) was detected in the hypothalamus, particularly POMC, NPY, AgRP and MCH neurons. Moreover, the intraperitoneal (IP) and intracerebroventricular (ICV) injections of IL-17 resulted in increased POMC expression, which was accompanied by reduced food intake. The IP injection of IL-17 stimulated the phosphorylation of MEK4 and STAT3 in the hypothalamus, increased the brown adipose tissue temperature and its ICV injection resulted in reduction of respiratory quotient. Taken together the results of this original study demonstrate that IL-17 exerts an important function in the regulation of the hypothalamic energy homeostasis and thermogenesis actions Doutorado Fisiopatologia Médica Doutor em Ciências FAPESP 2014/24362-1 CAPES 001

Orientadores: Ariana Campos Yang, Licio Augusto Velloso Dissertação (mestrado profissional) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A Esofagite Eosinofílica (EoE) é uma doença emergente, de característica imuno mediada, caracterizada pelo infiltrado eosinofílico da mucosa esofágica, levando a inflamação crônica, que afeta todas as faixas etárias e apresenta incidência crescente nos últimos anos. Haja vista a morbidade associada a evolução da doença que leva a disfunção esofagiana com disfagia e episódios de impactação alimentar, destaca-se a grande relevância clinica do tratamento e seguimento adequados. Por ser uma doença de caracterização recente, com primeiro relato datado há menos de quatro décadas, existem rápidas mudanças no que diz respeito a caracterização fisiopatológico e tratamento. O presente projeto tem por objetivo elaborar um protocolo que sistematize o processo de investigação, tratamento e seguimento dos pacientes, baseado nas mais recentes evidencias clinicas, por meio de revisão sistemática. A complexidade da doença e necessidade de exames rotineiros, biópsias e eventual necessidade de intervenção endoscópica faz com que o seguimento desses pacientes deva ser realizado em serviço terciário e de referencia, os quais também se constituem em serviços de ensino, com participação de profissionais em treinamento e aprendizado. Como os pacientes podem ser atendidos em diferentes especialidades como gastroenterologia, imunologia clínica e alergia, existe a necessidade de se criarem procedimentos padronizados para homogeneizar o atendimento e as condutas, beneficiando os pacientes, além de propiciar aprendizado aos profissionais em formação que também fazem o acompanhamento ambulatorial dos pacientes Abstract: Eosinophilic Esophagitis (EoE) is an emerging disease, characterized by an immune mediated eosinophilic infiltrate of the esophageal mucosa, leading to chronic inflammation, which affects all age groups and presents an increasing incidence in recent years. In view of the morbidity associated with the evolution of the disease leading to esophageal dysfunction with dysphagia and episodes of food impaction, the clinical relevance of appropriate treatment and follow-up is highlighted. Because it is a newly characterized disease, with a first report dating less than four decades ago, there are rapid changes in regard to pathophysiological characterization and treatment. The present project aims to develop a protocol that systematizes the process of investigation, treatment and follow-up of patients, based on the latest clinical evidence, through a systematic review. The complexity of the disease and the need for routine exams, biopsies and the eventual need for endoscopic intervention mean that the follow-up of these patients should be performed in a tertiary and referral service, which also constitute teaching services, with the participation of professionals in training and learning. As patients can be treated in different specialties such as gastroenterology, clinical immunology and allergy, there is a need to create standardized procedures to homogenize care and behaviors, benefiting patients, as well as providing learning to the professionals in training who also follow up outpatient care Mestrado Qualificação dos Processos Assistenciais Mestra em Ciências

Orientador: Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Obesidade é hoje o principal fator de risco para uma série de doenças e o aumento de sua prevalência é alarmante. A ativação de um processo inflamatório subclínico no hipotálamo desempenha papel central como desencadeador dos distúrbios associados ao ganho de peso, como a resistência à insulina. A ativação do processo inflamatório característico da obesidade decorre da complexa associação entre fatores genéticos e ambientais. O consumo de dietas ricas em ácidos graxos saturados é certamente um dos mais importantes fatores ambientais, levando à inflamação através da ativação de receptores TLR4. A participação do sistema imune inato nessa inflamação hipotalâmica tem sido extensivamente estudada. No entanto, o papel da imunidade adaptativa no curso da obesidade é ainda desconhecido. Em doenças neurodegenerativas, a inflamação do sistema nervoso central é responsável pela atração e ativação de linfócitos T, sendo este evento concomitante ao início da doença. Conhecendo o papel dos ácidos graxos nesse cenário imunológico, nós aventamos a hipótese de que o CD1, proteína que apresenta lipídios a células T, teria papel relevante na resposta imune adaptativa no hipotálamo de camundongos obesos. Neste trabalho, mostramos que com poucos dias de dieta, ocorre um aumento da expressão hipotalâmica de CD1 e modificação de sua distribuição anatômica. A redução da sua expressão utilizando um anticorpo imunoneutralizador acarreta em melhora do perfil glicêmico e redução do ganho de peso enquanto sua ativação no hipotálamo exacerba o fenótipo obeso dos animais, inclusive levando animais resistentes à obesidade a apresentarem um perfil de ganho de peso semelhante a animais propensos. A análise por bioinformártica revelou que a expressão de CD1 no hipotálamo se correlaciona a outros marcadores envolvidos no distúrbio. Dessa forma, o CD1 parece exercer papel relevante na inflamação hipotalâmica frente ao consumo de ácidos graxos saturados Abstract: Obesity is the main risk factor for many comorbidities and its prevalence is rising to astounding numbers. The activation of a subclinic and chronic inflammatory process in the hypothalamus has been shown to be the trigger event leading to several comorbidities, such as insulin resistence and diabetes. This process occurs due to a complex interaction between genetic and envirolmental factors. The consumptions of saturated fatty acid rich diets is one of the most important envirolmental factors, leading to inflammation due to activation of the innate immune receptor, TLR4. The role of innate immune response in the hypothalamic inflammation has been extensively studied. However, the putative role of the adaptive immune response in this scenario is still unknown. In neurodegenative diseases, the inflammation is responsible for the recruitment and activation of T lymphocytes to the brain, which contributes to the emergence of many syptoms of the diseases. As we know that fatty acids trigger an infammatory immune response that disrupts hypothalamic control of food intake and energy homeostases, we hypothesized that CD1, a lipid-presenting protein to lymphocytes, would play a central role in the hypothalamic immune response. In this work, we show that as early as one day of high fat diet, the CD1 expression is higher in the hypothalamus of mice and the distribution in this tissue is also disturbed. The deacrease in CD1 expression leads to improvement of glucose tolerance e reduced weight gain; wheras the increase of CD1 signaling exacerbates the obese phenotype. Bioinformatics analyses showed that the hypothalamic expression of CD1 correlates with other celular mechanisms involved in the pathophysiology of obesity. Therefore, CD1 seems to have a pivotal role in hypothalamic inflammation due to saturated fatty acids consumption Doutorado Fisiopatologia Médica Doutora em Ciências FAPESP 2013/25415-9

Orientador: Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Termogênese adaptativa é um processo por meio do qual o organismo promove modificações no gasto energético frente a mudanças na disponibilidade de substrato energético. Em parte, a termogênese adaptativa depende de alterações da geração de calor por desacoplamento da força próton-motora da cadeia transportadora de elétrons por ação da proteína desacopladora 1 (UCP1), presente na membrana mitocondrial interna dos adipócitos marrons e ativada por ácidos graxos livres liberados no ambiente citosólico por lipólise. A lipólise está condicionada a ativação de uma via simpática induzida pelo frio ou por outros estímulos adrenérgicos. A ativação do receptor ß3-adrenérgico é capaz de promover gasto energético pelo tecido adiposo marrom (BAT) ou mesmo promover indução de adipócitos bege expressando características termogênicas. O recrutamento de células precursoras com potencial genético de se transformar em adipócitos marrons, brancos ou beges depende de sinais ambientais. Estudos recentes têm demonstrado que a sinalização celular tipo 2 através da liberação de interleucina-4 por eosinófilos em resposta ao frio é capaz de controlar a síntese de noradrenalina em macrófagos alternativamente ativados a fim de manter o tônus simpático para o desenvolvimento de adipócitos bege. Assim, a imunidade inata tipo 2 pode controlar o browning. Aqui, nós demonstramos que camundongos deficientes da IL10, citocina imunossupressora chave da imunidade inata, exibiram piora na respiração basal in vivo, bem como menor tolerância ao estresse térmico após teste com 4h de frio, muito embora mantivesse elementos da resposta adaptativa, como a quantidade global de UCP1 per depot. Concomitantemente, recrutamos indivíduos obesos a serem submetidos a cirurgia bariátrica e após a perda de peso, observamos que houve um recrutamento do BAT e que sua atividade estava associada a níveis séricos de IL10. Além disso, demonstramos que mitocôndrias isoladas do BAT de animais knockout para IL10 apresentam respiração no estado 2 diminuída em relação aos animais selvagem, bem como respiração desacoplada e dependente de UCP1 também diminuídas. Por fim, realizamos microscopia eletrônica de transmissão e as mitocôndrias dos camundongos knockout da IL10 apresentam uma desorganização da arquitetura das cristas, além de uma forma arredondada compatível com um estado de maior fissão mitocondrial. Similarmente, em adipócitos marrons imortalizados, a imunoneutralização da IL10 também promoveu aumento da isoforma curta da proteína Opa1, indicando uma proporção aumentada da isoforma associada a fissão mitocondrial. Assim, nós concluímos que a IL10 tem um papel relevante na respiração dependente de UCP1 e na organização estrutural das mitocôndrias Abstract: Adaptive thermogenesis is a metabolic process of heat generation by uncoupling the proton-motor force of the electron transport chain dependent on uncoupling protein 1 (UCP1), present in the internal mitochondrial membrane of brown adipocytes and activated by free fatty acids released in the cytosolic environment by lipolysis. Lipolysis is conditioned by the activation of a sympathetic pathway induced by cold or by other adrenergic stimuli. Activation of the ß3-adrenergic receptor induces energy expenditure by brown adipose tissue (BAT) or promotes induction of beige adipocytes expressing UCP1. Recruitment of precursor cells with genetic potential to turn into brown, white or beige adipocytes depends on environmental cues. Recent studies have shown that type 2 cell signaling through the release of interleukin-4 by eosinophils in response to cold control the synthesis of norepinephrine in alternatively activated macrophages to maintain sympathetic tone for the development of beige adipocytes. Thus, type 2 innate immunity can control browning. Here, we demonstrate that IL10 KO mice, a key immunosuppressive cytokine in the innate immunity, exhibited impaired basal respiration in vivo, as well as decreased tolerance to thermal stress after 4h cold test, although maintaining adaptive response elements such as the overall amount of UCP1 per depot and cold-induced 18F-fluordeoxyglucose uptake. Concomitantly, we recruited obese individuals to undergo bariatric surgery and after weight loss, we observed that there was a BAT recruitment and that its BAT activity was associated with serum Il-10 levels. In addition, we demonstrated that mitochondria isolated from IL10 KO mice BAT present decreased state 2 respiration in relation to wild type mice, as well as UCP1-dependent respiration also decreased. Finally, we performed transmission electron microscopy and IL10 KO mice showed a mitochondrial cristae ultrastructure disruption in addition to a sphere-shaped mitochondria, compatible with a state of greater mitochondrial fission. In addition, we treated immortalized brown adipocyte cell line with either IL10 recombinant or an immunoneutralizing IL10 antibody, which resulted in the increase of the proportion of fusion-deficient formof Opa1. Thus, we conclude that IL10 plays a relevant role in UCP1-dependent respiration and structural organization of mitochondria Doutorado Fisiopatologia Médica Doutor em Ciências FAPESP 2013/07607-8 CAPES

Orientadores: Bruno Geloneze Neto, Lício Augusto Velloso Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O diabetes mellitus tipo 2 é uma das enfermidades cuja prevalência apresenta crescimento mais acelerado no mundo. Isso se deve em parte pelo aumento do número de pessoas obesas. Múltiplas alterações fisiopatológicas estão envolvidas nesse quadro e afetam diferentes órgãos, entre eles o cérebro. O equilíbrio entre comportamento alimentar e gasto energético é um processo biológico coordenado pelo cérebro e com o hipotálamo como principal estrutura envolvida, particularmente o núcleo arqueado, onde duas subpopulações de neurônios, NPY/AgRP e POMC/CART, respondem a sinais periféricos que informam a respeito da disponibilidade de energia no organismo. Variações nos níveis sanguíneos de glicose são rapidamente detectadas por neurônios hipotalâmicos gerando sinais que participam do controle da fome e do gasto energético. Os mecanismos envolvidos na resposta hipotalâmica à glicose ainda são pouco conhecidos, porém acredita-se que seus transportadores de membrana, GLUT e SGLT desempenhem papel importante neste processo. O co-transportador sódio-glicose tipo 2 (SGLT-2) é expresso no rim e no cérebro, incluindo regiões hipotalâmicas envolvidas no controle alimentar. Estudos mostram que a inibição do SGLT-2 acarreta em glicosúria e perda de calorias contribuindo para a diminuição no peso corpóreo. No entanto, não são conhecidos os detalhes mecanísticos deste fenômeno. Nesse trabalho, em camundongos, observamos por imunofluorescência que o SGLT-2 está presente no núcleo arqueado e colocaliza com neurônios POMC e NPY, sugerindo que o SGLT-2 participa do controle alimentar. Camundongos tratados com dapagliflozina apresentaram glicosúria acompanhada de melhora na glicemia de jejum, bem como da menor área sob a curva de glicose durante o teste de tolerância à glicose (GTT). Observamos ainda diminuição no peso corpóreo e discreta redução, porém não significativa, da massa adiposa epididimal. Em mulheres voluntárias eutróficas e normoglicêmicas, tratadas com dapagliflozina 10mg/dia por uma semana, observamos redução numérica, porém não significativa no índice de massa corporal (IMC), da circunferência da cintura e do diâmetro abdominal sagital. Houve melhor eficiência na resposta glicêmica e na sensibilidade à insulina. O uso da dapagliflozina pode alterar as conexões do hipotálamo com outras regiões do cérebro e ter um possível papel no controle da fome. As novas ações do fármaco aqui descritas podem contribuir para o avanço na compreensão de mecanismos hipotalâmicos envolvidos no controle alimentar e do gasto energético e criar novas perspectivas terapêuticas para a obesidade Abstract: Type 2 diabetes mellitus is one of the diseases with the fastest increasing prevalence in the world. This is mostly due to the increased prevalence of obesity. Multiple pathophysiological abnormalities are involved in this problem and affect different organs, including the brain. The balance between eating behavior and energy expenditure is a biological process that is coordinate by the brain and the hypothalamus as the main structure involved, particularly the arcuate nucleus, where two subpopulations of neurons, NPY/AgRP and POMC/CART, respond to peripheral signals that inform about the availability of energy in the body. Variations in blood glucose levels are rapidly detected by hypothalamic neurons generating signals that play a role in the control of hunger and energy expenditure. The mechanisms involved in the hypothalamic response to glucose are still poorly understood, but it is believed that their membrane transporters, GLUT and SGLT play an important role in this process. The sodium-glucose co-transporter type 2 (SGLT-2) is expressed in the kidney and brain, including hypothalamic regions involved in food control. Inhibition of SGLT-2 leads to glycosuria and caloric loss concomitant with a decrease in body weight. However, it is currently unknown the mechanistic details involved in this phenomenon. In this work, in mice, we observed by immunofluorescence that SGLT-2 is present in the arcuate nucleus and colocalize with POMC and NPY neurons, suggesting that SGLT-2 is involved in feeding control. Also, mice treated with dapagliflozin showed glycosuria, which was accompanied by improved fasting glycemia, as well as a reduction in the area under glucose curve during a glucose tolerance test (GTT). We also observed a decrease in body weight and a slight but not significant reduction in epididymal adipose mass. In the clinical intervention in eutrophic and normoglycemic women volunteers treated with 10 mg per day of dapagliflozin for one week, we observed a numerical reduction, although not significant, in body mass index (BMI), waist circumference and sagittal abdominal diameter. In addition, there was a better efficiency in glycemic response and insulin sensitivity. The use of dapagliflozin can alter the connections of the hypothalamus with other regions of the brain and play a possible role in food control. The new actions of the drug described here may contribute to the advancement in understanding the hypothalamic mechanisms involved in food control and energy expenditure and create new therapeutic perspectives for obesity Mestrado Clínica Médica Mestra em Clínica Médica FAPESP 2014/26591-8 CAPES

Orientador: Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A inflamação hipotalâmica induzida pela dieta é um importante mecanismo que leva à disfunção dos neurônios envolvidos no controle da ingestão alimentar e do gasto energético. Várias abordagens farmacológicas e genéticas que reduzem a inflamação no hipotálamo foram utilizadas com sucesso para atenuar os fenótipos obesos e metabólicos associados com o consumo excessivo da gorduras dietéticas. Estudos recentes revelaram que os ácidos graxos poli-insaturados, também podem reduzir a inflamação hipotalâmica. Neste estudo avaliamos a presença e a função da RvD2, uma resolvina produzida a partir do ácido docosahexaenóico, no hipotálamo de camundongos obesos. Todas as enzimas envolvidas na síntese da RvD2 foram detectadas no hipotálamo e foram moduladas em resposta ao consumo de uma dieta rica em gordura, conduzindo a uma redução da RvD2 hipotalâmica. GPR18, o receptor da RvD2, presente em neurônios NPY e POMC, também foi modulado pela gordura dietética. A substituição dietética de ácidos graxos saturados por poli-insaturados resultou num aumento da RvD2 hipotalâmica que foi acompanhada por uma redução da massa corporal e melhor tolerância à glicose. Além disso, o tratamento com ácido docosahexaenóico intracerebroventricular resultou num aumento da expressão das enzimas que sintetizam a RvD2, no aumento da expressão de citocinas anti-inflamatórias e no fenótipo metabólico melhorado. Finalmente, o tratamento com a RvD2 exógena intracerebroventricular resultou em uma redução da adiposidade, melhor tolerância à glicose e aumento da expressão hipotalâmica de citocinas anti-inflamatórias. Em conclusão, a RvD2 é produzida no hipotálamo de camundongos e tanto as enzimas que a biossintetizam quanto o seu receptor são modulados pela gordura dietética. A melhora do perfil metabólico sistémico induzido pela RvD2 exógena coloca essa substância como uma abordagem atraente para tratar a obesidade e suas comorbidades Abstract: Diet-induced hypothalamic inflammation has emerged as an important mechanism leading to the dysfunction of neurons involved in the control of food intake and energy expenditure. A number of pharmacological and genetic approaches that reduce inflammation in the hypothalamus can attenuate the obese and metabolic phenotypes associated with the excessive consumption of dietary fats. Recent studies have shown that polyunsaturated fatty acids can also reduce hypothalamic inflammation. Here, we evaluated the presence and function of RvD2, a resolvin produced from docosahexaenoic acid, in the hypothalamus of obese mice. All enzymes involved in the synthesis of RvD2 were detected in the hypothalamus and were modulated in response to the consumption of dietary fat leading to a reduction of hypothalamic RvD2. GPR18, the receptor for RvD2, which was detected in POMC and NPY neurons, was also modulated by dietary fat. The substitution of saturated by polyunsaturated fatty acids in the diet resulted in increased hypothalamic RvD2, which was accompanied by reduced body mass and improved glucose tolerance. In addition, the intracerebroventricular treatment with docosahexaenoic acid resulted in increased expression of the RvD2 synthetic enzymes, increased expression of anti-inflammatory cytokines and improved metabolic phenotype. Finally, the intracerebroventricular treatment with exogenous RvD2 resulted in reduced adiposity, improved glucose tolerance and increased hypothalamic expression of anti-inflammatory cytokines. In conclusion, RvD2 is produced in the hypothalamus and its receptor and synthetic enzymes are modulated by dietary fat. The improved metabolic outcomes of exogenous RvD2, places this substance as an attractive approach to treat obesity and its comorbidities Doutorado Fisiopatologia Médica Doutora em Ciências FAPESP 2011 50011-3

Orientador: Licio Augusto Velloso Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Ácidos graxos saturados de cadeia longa, presentes na dieta, induzem uma resposta inflamatória muito precoce no hipotálamo, ao ativarem receptores TLR4 e induzirem tanto inflamação, quanto estresse de retículo endoplasmático (ER stress). Estudos recentes sugeriram que alterações na função mitocondrial poderiam também desempenhar um papel patofisiológico durante a instalação da disfunção hipotalâmica na obesidade. Neste estudo avaliamos marcadores de inflamação, estresse de retículo endoplasmático e alterações mitocondriais em etapas iniciais da obesidade induzida por dieta. Os nossos resultados demonstram um aumento precoce, no conteúdo de proteínas relacionadas à inflamação, IL-1'beta', IL-6, IL-10, TNF-'alfa' e fractalkina, em camundongos Swiss submetidos a uma dieta rica em gordura saturada. A exposição dos camundongos a 3 horas de dieta hiperlipídica foi capaz de aumentar significativamente o conteúdo da fractalkina. Com 6 horas de exposição, observamos um aumento da chaperona GRP78, proteína envolvida na resposta às proteínas mal enoveladas (UPR) no retículo endoplasmático, e este aumento se conservou com o passar dos dias enquanto mantida a oferta da dieta hiperlipídica. As proteínas sensoras de distúrbios de enovelamento de proteínas no retículo foram afetadas algum tempo depois da indução da resposta inflamatória, IRE-1'alfa' aumentou com 3 dias e ATF6 no 7º dia de exposição à dieta hiperlipídica. A mitofusina 2, proteína envolvida na dinâmica morfológica mitocondrial, teve redução após 24 horas de exposição à dieta hiperlipidica e aumento após 7 dias. Como essas alterações sugerem mudanças morfológicas nas mitocôndrias, utilizamos a seguir a microscopia eletrônica por meio da qual identificamos variações nos contatos entre as mitocôndrias e o retículo endoplasmático. Entretanto, a exposição à dieta hiperlipídica nestes períodos não alterou a respiração mitocondrial no hipotálamo. Desta forma concluímos que o consumo de dieta hiperlipídica induz rápida resposta inflamatória no hipotálamo de camundongos, o que é seguido de indução de ER stress. Apesar de terem sido detectadas alterações no conteúdo proteico de pelo menos uma proteína envolvida na dinâmica morfológica mitocondrial e no número de contatos entre mitocôndrias com o retículo, tal fato não foi acompanhado de alterações na respiração mitocondrial no hipotálamo Abstract: Long-chain saturated fatty acids present in the diet induce a very early inflammatory response in the hypothalamus through the activation of TLR4 and induction of endoplasmic reticulum stress (ER stress). Recent studies have suggested that changes in mitochondrial function could play a pathophysiological role during the installation of obesity-associated hypothalamic dysfunction. In this study we evaluated inflammatory markers, endoplasmic reticulum stress and mitochondrial alterations in the initial stages of diet-induced obesity. Our results showed an early increase in the expression of proteins related to inflammation, IL-1'beta', IL-6, IL-10, TNF-'alfa' and fractalkine in Swiss mice subjected to a diet rich in saturated fat. The exposure of mice to 3 hours fat diet was capable of increasing the content of fractalkine. Six hours dietary exposure to fat resulted in the increase of the chaperone GRP78, which is involved in the unfolded protein response (UPR) in the endoplasmic reticulum. This increase remained steady as far as the high-fat diet was maintained. The ER stress sensor proteins were affected after the induction of the inflammatory response; thus, IRE-1'alfa' and ATF6 increased 3 and 7 days after dietary fat introduction, respectively. Mitofusin 2, which is involved in mitochondrial morphological dynamics, was reduced after 24 hours exposure and increased after 7 days of dietary fat exposure. Because these changes suggest morphological rearrangements of the mitochondria, we next employed electron microscopy and identified changes in contacts between mitochondria and the endoplasmic reticulum. However, exposure to high-fat diet did not alter the mitochondrial respiration as evaluated in hypothalamic explants. Thus, we conclude that the consumption of a high-fat diet induces rapid inflammatory response in the hypothalamus of mice, which is followed by ER stress. Although we detected changes in the expression of at least one protein involved in mitochondrial morphology and dynamics and on the number of contacts between mitochondria and the endoplasmic reticulum this was not accompanied by changes in mitochondrial respiration in the hypothalamus Mestrado Fisiopatologia Médica Mestre em Ciências FAPESP 2013/26319-3

Orientadores: Rodrigo Ramos Catharino, Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A obesidade é um processo fisiopatológico que se manifesta de forma pandêmica, principalmente nos países ocidentais e industrializados. O consumo excessivo de ácidos graxos possui relações diretas ao desenvolvimento da obesidade e suas comorbidades. A Esteato-hepatite não alcoólica (EHNA) é uma doença associada à obesidade caracterizada pelo acúmulo de gordura no fígado apresentando um quadro inflamatório. Já é bem evidenciado que o azeite de oliva extra virgem possui importantes funções neuroprotetoras, hepatoprotetoras, anti-inflamatórias e antioxidantes. Em nosso trabalho propomos uma dieta suplementada com azeite de oliva extra virgem para avalizar a sua ação sobre a EHNA. Foram utilizados camundongos machos tratados por 16 semanas com três diferentes tipos de dietas isocalóricas: controle (CT), dieta hiperlipídica (HFD) e dieta hiperlipídica suplementada com azeite de oliva extra virgem (HSO). Após tratamento com os diferentes tipos de dietas os fígados foram extraídos para avaliação morfológica, histológica, isolamento de mitocôndrias e análises em espectrometro de massas com ionização electrospray (ESI-MS). Os resultados morfológicos, histológicos e de espectrometria de massas indicaram uma redução do quadro de EHNA no grupo de animais que receberem HFSO quando comparado com o grupo que receberam HFD. Os dados de espectrometria por ESI-MS mostraram a incorporação de alguns compostos provenientes das dietas nos tecidos e na fração mitocondrial hepática dos animais como ácidos graxos e compostos fenólicos. O consumo de azeite de oliva extra virgem demonstrou ações terapêuticas frente à EHNA com a incorporação de importantes compostos fenólicos como a Oleuropeína aglicona na fração mitocondrial. Nossos resultados estão de acordo com a proposição de que o principal fator que influencia diferentes respostas as dietas é a sua composição, e não apenas as calorias especialmente quando se trata de estudos sobre obesidade Abstract: Obesity is a disease that is growing from pandemic in western and industrialized countries. The consumption of large amounts of fatty acids has a direct relationship with the development of obesity and its comorbidities. Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is a disease associated with obesity characterized by accumulation of fat in the liver and an inflammatory condition. It is already known that extra virgin olive oil has important neuroprotective, hepatoprotective, anti-inflammatory and antioxidant functions. In our work we propose a diet supplemented with extra virgin olive oil to evaluate its action on NASH. Male mice treated with three different types of isocaloric diets were used: control (CT), hyperlipid diet (HFD) and hyperlipid diet supplemented with extra virgin olive oil (HSO). After treatment with the different types of diets the livers were removed histological analysis, isolation of mitochondria and mass spectrometry with electrospray ionization (ESI-MS). Morphological, histological, and mass spectrometry results indicated a reduction of NASH in the group of animals receiving HFSO when compared to the group receiving HFD. ESI-MS spectrometry data showed the incorporation of some compounds from the diet into the tissues and in the hepatic mitochondrial fraction of the animals as fatty acids and phenolic compounds. The consumption of extra virgin olive oil demonstrated therapeutic actions against NASH with the incorporation of important phenolic compounds such as Oleuropein aglycone in the mitochondrial fraction. Our results are in line with the proposition that the main factor influencing different responses to diets is their composition, not just the calories, especially when it comes to obesity studies Doutorado Fisiopatologia Médica Doutor em Ciências CAPES CNPQ

Orientadores: Gil Guerra-Junior, Lício Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Na obesidade experimental induzida por dieta, o hipotálamo é afetado por uma resposta inflamatória que altera a função de neurônios envolvidos na regulação da ingestão de calorias e do gasto energético. Em adultos obesos, estudos com ressonância magnética funcional (RNMf) mostraram a existência de uma resposta hipotalâmica alterada para nutrientes e exposição ao frio. Além disso, estudos revelaram por meio de análise de ressonância magnética estrutural a existência de gliose no núcleo médio-basal hipotalâmico (MBH) que aumenta em proporção direta ao índice de massa corporal (IMC). Portanto, avaliações por diferentes abordagens de neuroimagem demonstram a presença de anormalidades no hipotálamo de adultos obesos e em modelos animais. A obesidade infantil é um importante fator de risco para a obesidade e suas comorbidades na idade adulta. No entanto, nenhum estudo anterior avaliou a presença de alterações hipotalâmicas em crianças obesas. Aqui, foram utilizados métodos de neuroimagem funcional e estrutural para estudar o hipotálamo de doze crianças obesas e onze com peso normal. Também foram avaliadas a composição corporal e as dosagens de hormônios da saciedade e marcadores inflamatórios. Nas crianças obesas o MBH apresentou sinais radiológicos sugestivos de gliose, que está diretamente correlacionada com a adiposidade corporal e, particularmente, com a adiposidade visceral. Foi encontrada também correlação entre os sinais de gliose e os níveis séricos de leptina, porém não com os níveis de insulina. Além disso, em estudos funcionais, o hipotálamo das crianças obesas apresentou uma resposta diminuída à ingestão oral de glicose, além de uma menor conectividade entre o hipotálamo e o restante do cérebro, em comparação com os indivíduos eutróficos. Foi encontrada correlação entre os menores sinais funcionais do hipotálamo e a maior presença de gliose no MBH. Este é o primeiro estudo que demonstra que o hipotálamo pode ser funcionalmente e estruturalmente afetado na obesidade infantil Abstract: In experimental diet-induced obesity, the hypothalamus is affected by an inflammatory response that disturbs the function of key neurons involved in the regulation of caloric intake and energy expenditure. In adult obese humans, functional magnetic resonance imaging (fMRI) studies have shown a defective hypothalamic response to nutrients and to cold exposure; moreover, structural MRI analysis provide evidence for the existence of hypothalamic gliosis in the medium basal hypothalamus (MBH) that increases in direct proportion to body mass index. Therefore, hypothalamic abnormalities, as assessed by different approaches, are present in the hypothalamus of obese adults and experimental animals. Childhood obesity is a major risk factor for obesity and its comorbidities during adulthood. However, no previous study has evaluated such abnormalities among obese children. Here, we employed functional and structural neuroimaging methods to study the hypothalamus of twelve obese and eleven lean children. Body composition and satiety hormones and inflammatory markers were also evaluated. Obese children presented radiological signs of hypothalamic gliosis, which is directly correlated with adiposity and particularly with visceral adiposity. Signs of gliosis in the MBH were correlated to plasma leptin concentration, but not to insulin. Moreover, in functional studies, the hypothalamus of obese children showed a decreased response to oral glucose intake, and a lower connectivity with the whole brain gray matter when compared to lean participants. In addition, the decreased hypothalamic functional response to glucose was correlated to increased signs of gliosis in the MBH. This is the first study demonstrating that the hypothalamus can be functionally and structurally affected in childhood obesity Doutorado Saúde da Criança e do Adolescente Doutora em Ciências FAPESP 2009/50809-5 CAPES 3881/15-6

Orientadores: Eliana Pereira de Araujo, Lício Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O consumo de dietas ricas em gorduras saturadas ativa uma resposta inflamatória no hipotálamo e danifica neurônios envolvidos na regulação da ingestão calórica e do gasto energético. Não se sabe a razão pela qual o hipotálamo médio basal é o principal alvo da inflamação cerebral induzida pela dieta rica em gordura. Neste estudo aventamos a hipótese que a barreira hemato-encefálica na eminência mediana é particularmente sensível às gorduras alimentares. Nós mostramos que a exposição à dieta rica em gordura por curtos períodos é suficiente para aumentar a expressão de citocinas inflamatórias e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) na eminência mediana, precedendo alterações em outros órgãos circunventriculares. O consumo de gorduras na dieta leva a uma perda precoce da organização estrutural de tanicitos-?1 nas proximidades da interface entre a eminência mediana e o hipotálamo médio basal. Tal fenômeno se acompanha de uma oscilação dos níveis de expressão do BDNF, que inicialmente se eleva e em seguida se reduz a níveis inferiores aos de base. A imunoneutralização do BDNF acentua os danos estruturais e funcionais induzidos pela dieta na barreira hemato-encefálica da eminência mediana, acompanhado de aumento do ganho de peso e da inflamação hipotalâmica. Assim, a barreira hemato-encefálica na eminência mediana é afetada nos níveis funcional e estrutural logo após a introdução de uma dieta com elevado teor de gordura. O BDNF proporciona uma proteção contra os danos no início, que se perde após a persistência do consumo de grandes quantidades de dietas ricas em gorduras Abstract: The consumption of large amounts of dietary fats activates an inflammatory response in the hypothalamus damaging key neurons involved in the regulation of caloric intake and energy expenditure. It is currently unknown the reason why the medium-basal hypothalamus is the main target for diet-induced brain inflammation. Here, we hypothesized that the medium eminence blood brain barrier is particularly sensitive to dietary fats. We show that as early as one week exposure to large amounts of dietary fats is suficient to increase the expression of inflammatory cytokines and brain-derived neurotrophic factor in the medium eminence, preceding changes in other circumventricular blood-brain barrier regions. The consumption of dietary fats leads to an early loss of the structural organization of ?1-tanycytes nearby the interface between the medium eminence and the medium-basal hypothalamus. This is accompanied by an early increase in the hypothalamic expression of brain-derived neurotrophic factor, which is succeeded by a sharp reduction of its expression after two and four weeks on a high-fat diet. The immunoneutralization of brain-derived neurotrophic factor worsens diet-induced functional damage of the medium eminence blood-brain barrier, increases diet-induced hypothalamic inflammation and increases body mass gain. Thus, the medium eminence blood-brain barrier is affected at the functional and structural levels early after introduction of a high-fat diet. Brain-derived neurotrophic factor provides an early protection against damage, which is lost upon persistence of consumption of large amounts of dietary fats Agência de fomento: Doutorado Clínica Médica Doutora em Ciências CAPES 01P-02208-2012 FAPESP FAEPEX CNPQ

Orientador: Licio Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A recente caracterização da atividade anti-inflamatória atípica exercida pelo receptor de ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa GPR120 tem despertado grande interesse sobre esta classe de receptores, como potenciais alvos para o tratamento da obesidade e distúrbios metabólicos relacionados. Até o momento, a maioria dos estudos realizados tem explorado principalmente os benefícios metabólicos potenciais de uma ativação sistêmica dos receptores GPR120 e GPR40; no entanto, estudos recentes demonstraram que o hipotálamo é afetado logo durante as fases iniciais do desenvolvimento da obesidade desempenhando um papel crucial na patogênese desta doença e de suas comorbidades. Neste trabalho, nós avaliamos a expressão e potenciais ações terapêuticas do GPR120 e GPR40 no hipotálamo de camundongos obesos. Nós observamos que ambos os receptores são expressos no hipotálamo, sendo o GPR120 principalmente presente em células da microglia e o GRP40 preferencialmente expresso em neurônios orexigênicos NPY. Após o tratamento intracerebroventricular com GW9508, um agonista não específico destes receptores, foi observado uma redução da eficiência energética e da expressão de genes inflamatórios no hipotálamo de camundongos obesos. O silenciamento hipotalâmico do GPR120, por meio de lentivírus, aboliu o efeito anti-inflamatório induzido por GW9508 e resultou em maior eficiência energética nos animais tratados. Entretanto, o tratamento intracerebroventricular com os agonistas específicos do GPR120 e GPR40, TUG1197 e TUG905, respectivamente, resultaram em efeitos mais moderados sobre a homeostase energética e inflamação induzida por HFD do que aqueles observados com o GW9508. O TUG1197 atuou reduzindo a inflamação induzida por HFD por meio da redução da expressão das citocinas pró-inflamatórias, TNF? e IL1?, e aumento da expressão das interleucinas anti-inflamatórias, IL10 e IL6. O TUG905 promoveu a redução do peso corporal e da expressão do neuropeptídeo anorexigênico POMC. Em conclusão nosso trabalho demosntrou que os receptores GPR120 e GPR40 de forma coordenada no hipotálamo de roedores reduzindo a eficiência energética e regulando a inflamação associada à obesidade. A ativação de ambos os receptores no hipotálamo levou a melhores desfechos metabólicos se comparada com a ativação de qualquer um dos receptores isoladamente Abstract: The recent characterization of the atypical anti-inflammatory activity exerted by the polyunsaturated fatty acid receptor GPR120 has raised the interest on this class of receptors as potential targets for the treatment of obesity and related disorders. Most studies performed to date have explored the potential metabolic benefits of a systemic activation of GPR120 and GPR40; however, it is currently known that the hypothalamus is affected during the early stages of obesity and plays an important role in the pathogenesis of this disease and its comorbidities. Here, we evaluate the expression and potential therapeutic actions of hypothalamic GPR120 and GPR40 in experimental diet-induced obesity. We show that both receptors are expressed in the hypothalamus; GPR120 is mostly present in microglia, whereas GRP40 is preferentially expressed in NPY neurons. Upon intracerebroventricular treatment, GW9508, a non-specific agonist of both receptors, reduced energy efficiency and the expression of inflammatory genes in the hypothalamus. Reducing GPR120 hypothalamic expression using a lentivirus approach resulted in the loss of the anti-inflammatory effect of GW9508 and increased energy efficiency. The intracerebroventricular treatment with GPR120 and GPR40 specific agonists, TUG1197 and TUG905, respectively, resulted in milder effects than those produced by GW9508. TUG1197 acted predominantly controlling inflammation reducing the expression of TNF? and IL1? while increasing IL10 and IL6. Conversely, TUG905 acted reducing body mass and increasing the expression of POMC. We conclude that GPR120 and GPR40 act in concert in the hypothalamus to reduce energy efficiency and regulate the inflammation associated with obesity. The combined activation of both receptors in the hypothalamus results in better metabolic outcomes than the isolated activation of either alone Doutorado Fisiopatologia Médica Doutora em Ciências FAPESP

Orientador: Lício Augusto Velloso Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Abstract: Resumo: A interleucina-17 (IL17) está envolvida na resposta imune contra agentes patogénicos intestinais, e a sua expressão anómala no intestino pode ocorrer em condições tais como diabetes do tipo 1 (DM1), encefalomielite auto-imune e doença de Crohn. Fatores dietéticos podem alterar a microbiota intestinal desencadeando doenças metabólicas. Nossa hipótese é de que IL17 poderia ser diretamente modulada por nutrientes e pode desempenhar um papel na obesidade e diabetes tipo 2 (DM2). Aqui, nós demonstramos que as gorduras da dieta induzem a expressão IL17, predominantemente no íleo. In vivo, ilhotas pancreáticas isoladas estimuladas com IL17 apresentaram um aumento na secreção de insulina quando comparado a ilhotas não estimuladas, enquanto que a sua inibição sistémica resultou em intolerância à glicose. Animais knockout para o receptor de IL17 (IL17RA) eram intolerantes à glucose devido ao desenvolvimento embrionário anómalo das ilhotas pancreáticos, que eram menores e foram depletados de células produtoras de insulina. Nos seres humanos, os níveis circulantes de IL17 aumentaram após uma refeição. Este aumento foi significativamente maior nos indivíduos obesos normoglicêmicos do que em indivíduos obesos com diabetes. Semelhantes aos roedores, as ilhotas humanos também foram estimulados a secretarem insulina na presença de IL17. Assim nós identificamos a IL17 como um sensor intestinal de gorduras alimentares, que exerceram um efeito semelhante a hormônios incretínicos. Além disso, a presença IL17RA é importante para o desenvolvimento normal das ilhotas pancreáticas. Abstract: Interleukin-17 (IL17) is involved in the immune response against intestinal pathogens, and its anomalous expression in the gut can occur in conditions such as type 1 diabetes (T1D) 1, autoimmune encephalomyelitis 2 and Crohn¿sdisease 3. Because dietary factors can change the gut microbiota, impacting metabolic diseases 4, we hypothesized that IL17 could be directly modulated by nutrients and might play a role in obesity and type 2 diabetes (T2D). Here, we show that dietary fats induced IL17 expression, predominantly in the ileum. Both in vivo and in isolated pancreatic islets, IL17 stimulated insulin secretion, while its systemic inhibition resulted in glucose intolerance. Mice KO for the main IL17 receptor (IL17RA) were glucose intolerant due to anomalous embryonic development of the pancreatic islets, which were smaller and were depleted of insulin-producing cells. In humans, blood IL17 increased following a meal. This increase was significantly higher in obese normoglycemic individuals than in obese subjects with diabetes. Similar to those of rodents, human islets were also stimulated to secrete insulin in the presence of IL17. Thus, we identified IL17 as a gut sensor of dietary fats, which exerted an incretin-like effect. In addition, the presence IL17RA was important for normal development of the pancreatic islets Doutorado Fisiopatologia Médica Doutora em Ciências