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Orientador: Alvaro S. Costa Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Em células do parênquima fotossintetizante de folhas de soja {Glycine max (L.) Merr.}, invadidas sistematicamente pelo vírus do mosaico comum de soja ('soybean mosaic virus'), foi observado que uma importante fração das inclusões lamelares (IL) induzidas pelo vírus aparecem em contato com os peroxisomas. Esta organela foi identificada pela reação da diaminobenzidina para localização citoquímica da catalase. Os peroxisomas são deformados pelo contrato com as inclusões. Não ocorre aumento desta atividade enzimática nas folhas inoculadas, nas quais não foi observada a associação entre inclusões e peroxisomas. A peroxidase, uma enzima não peroxisomal, é incrementada tanto nas folhas inoculadas como nas invadidas sistemicamente. Na variedade de soja Santa Rosa, muito suscetível ao VMCS, foi observado um decréscimo aparente no número de peroxisomas visíveis ao microscópio óptico, por corte de células, nas folhas infectadas. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: Most cytoplasmic inclusions induced by soybean mosaic virus were observedassociated with peroxisomes in mesophyll cells of systemically infected leaves of soybean {Glycine max (L.) Merr.}. Peroxisomes, identified by the diaminobenzidine reaction for catalase, become misshapen because of deep invaginations at the region of contact with the lamellar inclusions. Aggregates ofperoxisomes, formed around the lamellar inclusions, are frequent. The catalase activity, a peroxisomal enzyme, increases in leaves with systemi symptoms, apparently as a result of the peroxisome-inclusin association. Catalase activity was not increased in inoculated leaves, nor them. The peroxidase activity, which is not localized in the peroxisome, is increased in either systemic or locally infected leaves. ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations Mestrado Mestre em Biologia Vegetal

Orientador: Jorge Vega Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Foi estudado um vírus, preliminarmente considerado da família Potyviridae, infectando em condições naturais duas espécies de crotalária, nas quais induz sintomas de mosaico. O vírus foi denominado vírus do mosaico da crotalaria (VMCr). Foram analisados os seguintes aspectos: círculo de hospedeiras, propriedades "in vitro", transmissão por afídeos e pela semente, formas de transmissão mecânica, citopatologia, purificação, relações serológicas com outros potyvirus e massa da proteína do capsídeo. O círculo de hospedeiras ficou restrito a espécies da família Legumínosae, sendo uma das hospedeiras características Phaseolus vulgarís. 'Preto G-2', espécie na qual induz necrose local seguida de necrose sistêmica. As propriedades in vitro apresentaram valores dentro da faixa dos potyvirus. Foi demonstrada a transmissão pelos afídeos Aphis gossypíi, Myzus persicae e M. nicotíanae e com menor eficiência por lámina cortante. A transmissão mecânica convencional teve eficiência de cerca de 80%. Não foi observada transmissão pela semente. Foram observadas inclusões através de microscopia de luz, e caracterizada por microscopia eletrônica: elas são formadas por estruturas do tipo "cata-vento" e feixes ou rolos características dos potyvirus. O protocolo de purificação empregado apresentou baixo rendimento. Na comparação serológica através do teste de EllSA foi verificada relação com o vírus do endurecimento dos frutos do maracujá isolado no Brasil (VEFM). Utilizando anti-soro para esse vírus foi detectado o VMCr pela técnica PTA-ELlSA e western-blot. Através deste último método foi estimada a massa molecular relativa da proteína capsidial em 37 kDa. Considera-se que o VMCr seja um isolado do VEFM que tem evoluído no sentido de infectar principalmente leguminosas. Dados recentes da literatura indicam que o VEFM isolado no Brasil seria mais próximo ao vírus do maracujá isolado em África do Sul, diferente do VEFM. Isto provavelmente explicaria a divergência dos resultados aquI apresentados, no referente à morfologia das inclusões citoplasmáticas, dos relatados para o VEFM em outros países Abstract: A virus isolated from Grata/aria species showing the mosaic symptom, preliminarily identified as a potyvirus, was studied. The virus was named Crotalaria mosaic virus. The characteristics studied were: host range, "in vitro" properties, transmission by aphids, seed transmission and different meehanieal transmission methods, eytopathology, serologieal relation with other potyviruses and molecular mass of the capsid protein. The host range is limited to speeies of the Leguminosae family and one eharacteristie host is Phaseo/us vulgaris 'Preto G-2', whieh shows local neerosis followed by systemie neerosis. The "in vitra" properties parameters were similar to the values reported for most potyviruses. Transmission of the virus by Aphis gossypíi, Myzus persicae e M. nicotíanae was demonstrated. Mechanieal transmission was effieient (80% transmission), and transmission by knife blade also was possible but with lowefficieney. Seed transmission was not observed. intracellular inelusions observed by light and electron microscopy were pinwheel and seroll type. The purifieation of the virus was possible with the proeedure used but virus yield was poor. Comparisons by PT A-ELlSA tests showed serologieal relation with the Brazilian isolate of passion-fruit woodiness virus (PWV). Using antiserum against PWV was possible to deteet erotalaria mosaie virus by PT A-ELlSA and western-blot. The relative molecular mass of the capsid pratein was estimated to be 37 kDa. Probably erotalaria mosaie virus is a strain of PWV that evolved toward a narrow host range of speeies mainly belonging to the Leguminosae family. Reeent reports indicate that most Brazilian isolates of PV'N are more related to the South African Passion-fruit virus, differing from standard type PWV. This fact may explain the differences observed in the morphology of cytoplasmic inclusions from data reported for PV Mestrado Mestre em Biologia Vegetal

Orientador:Jorge Vega Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As plantas defendem-se continuamente contra ataques de bactérias, vírus, fungos, invertebrados e de outras plantas. O estresse oxidativo é um tipo de resposta fisiológica da planta após o reconhecimento do patógeno, podendo resultar em sintomas nas plantas dependendo da sensibilidade do hospedeiro, e também relacionada à mecanismos de defesa. Foram analisadas plantas de soja cultivares BRS132 (muito sensível) e IAC17 (pouco sensível) infectadas pelo Cowpea mild mottle virus (CPMMV) e plantas de feijoeiro cultivar BT2 infectado pelo Cowpea aphid-borne virus (CABMV). O trabalho teve como objetivos avaliar a concentração de peróxido de hidrogênio, analisar a resposta antioxidante das plantas à infecção viral quanto às variações na atividade da superóxido dismutase, catalase, ascorbato peroxidase, guaiacol peroxidase e siringaldazina peroxidase e verificar as localizações dos vírus e das peroxidases em diferentes tecidos das plantas. O CPMMV induziu uma doença aguda, com sintomas severos e culminando com a morte da planta de soja 'BRS132'. Na soja 'IAC17', o vírus induziu uma doença crônica com mosaico leve a partir da segunda folha trifoliolada. As concentrações de peróxido de hidrogênio e as atividades da catalase, ascorbato peroxidase, guaiacol peroxidase e siringaldazina peroxidase foram maiores nas plantas infectadas, tanto na soja 'BRS132' como na soja 'IAC17', em relação às plantas sadias. O CPMMV foi localizado nos tecidos do pecíolo e do caule, na soja 'BRS132' nas regiões periféricas e medula, e na soja 'IAC17' principalmente nas regiões periféricas. No feijoeiro cultivar BT2, o CABMV induziu resposta aguda na primeira folha foram maiores nas plantas infectadas, exceto a atividade da superóxido dismutase, que apresentou valores similares nas plantas infectadas e nas sadias. O CABMV foi localizado nas regiões periféricas e medula dos tecidos do pecíolo, e no caule a invasão foi limitada à região periférica. As peroxidases e a siringaldazina peroxidase foram localizadas nas mesmas regiões do pecíolo onde foram detectados o CPMMV e o CABMV. No feijoeiro 'BT2', a infecção viral induziu uma resposta semelhante à observada na soja 'BRS132', com algumas diferenças relacionadas ao fato de que neste caso, a infecção pelo CABMV não resultou na morte da planta de feijoeiro. Também se observou aumento expressivo de atividade da siringaldazina peroxidase no 7º dia após inoculação, diferente da soja 'BRS132' em que este aumento ocorreu mais tarde. A invasão generalizada dos vírus no pecíolo foi semelhante em feijoeiro 'BT2' e soja 'BRS132', principalmente nos dias em que começou a ocorrer abscisão dos folíolos. Já a invasão do caule foi generalizada em soja 'BRS132' e limitada à região periférica em feijoeiro. Possivelmente, o aumento precoce de atividade da siringaldazina peroxidase em feijoeiro, já no 7º dia após inoculação, limitou a invasão do vírus aos tecidos periféricos do caule. Isto explicaria o fato de o feijoeiro 'BT2' não sofrer morte da gema apical e da planta. trifoliolada, apresentando sintomas de mosaico, maior rugosidade, lesões necróticas nas nervuras e folíolos ''fechados''. Nesta cultivar, todos os parâmetros avaliados. Abstract: Plants defend themselves from attacks of bacteria, fungi, viruses, invertebrate and other plants. Oxidative stress is a kind of physiological response of the plant related to defense mechanisms after recognition the pathogen, which may result in disease symptoms depending on host sensitivity. In this work, plants of two varieties of soybean infected by Cowpea Mild Mottle Virus (CPMMV), one highly sensitive (BRS132) and other with low sensitivity (IAC17) to the virus, were analyzed. Also, responses of bean plants (cv. Black Turtle 2, BT2) to Cowpea Aphid-Borne Mosaic Virus (CABMV) were examined. The parameters assessed included peroxide content (as hydrogen peroxide, H2O2), and activity of the following enzymes: superoxide dismutase, catalase, ascorbate peroxidase, guayacol peroxidase and syringadazine peroxidase. Distribution of virus and peroxidases in different tissues was also examined. In soybean cv BRS132, CPPMV induced an acute disease with severe symptoms finally resulting in plant death. In the less sensitive soybean cv IAC17, CPMMV induced a chronic disease with mild mosaic which was only visible in the second trifoliate and later leaves. Peroxide content and activity of guayacol and syringaldazine peroxidases were higher in infected plants of both cultivars. The virus was immuno-localized in stem and petiole cross sections, appearing in peripheral tissues and pith in cv BRS132, whereas in cv IAC17 it was localized mainly in the peripheral portion. In bean cv BT2, CABMV induced a acute response in the first trifoliate leaf, which presented a rough mosaic, necrotic lesions in veins and a "wilted" aspect. In this species all the assessed parameters showed higher values in the infected plants. Only the activity of superoxide dismutase was similar in healthy and infected plants. The vírus was localized in the pith and peripheral tissues of bean petioles, and only in the peripheral region of stems. Peroxidase and syringaldazine peroxidase activities were localized in the same tissues of the petiole where the CPMMV was localized in soybean plants and CABMV in bean plants. The response to CABMV observed in bean cv BT2 was similar to the response of soybean BRS132 to CPMMV, with some differences, since in bean the virus infection did not induce plant death. A significant rise in syringadazine activity was detected seven days after inoculation (DAI) in beans, while in soybean this increase occurred one day later. Both species also showed similar pattern of invasion of petiole tissues by the virus, mainly at the moment of abscission of leaflets. However, the virus invasion of stem was generalized in soybean BRS132 and contrastingly, limited to the peripheral tissues in bean. One possibility is that the early increase in syringaldazine activity observed in bean 7 DAI is indicative of some type of restriction to the spread of the virus, limiting it to the stem peripheral tissues. Probably this restricted spread of the virus in the stem underlies the survival of the apical meristem in bean cv BT2 in contrast to the death of the meristem in soybean cv BRS132. Doutorado Doutor em Biologia Vegetal

Orientador: Jorge Vega Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Com o objetivo de estudar o efeito quimioterápico de Virazole (1-ß-Dribofuranosil -1,2,4 - triazol-3 - carboxamida) in vitro sobre vírus de plantas, dois modelos de estudo foram realizados. No primeiro utilizou-se calos de videira Vitis vinifera, Seibel 2, infectados com o vírus do enrolamento da folha da videira (VEFV), e calos de fumo Nicotiana tabacum "TNN" e Gomphrena globosa L. infectados com o vírus do anel do pimentão (VAP). No segundo, foi utilizado um modelo aplicado, visando a obtenção de plantas de limoeiro Galego Citrus aurantifolia (Christm.) Swing) livres do vírus da tristeza dos citros "citrus tristeza virus" (CTV). Os objetivos específicos foram: 1) Testar o efeito do Virazole em calos cultivados in vitro, comparando: a) diferentes tipos de vírus (closterovirus e tobravirus) e b) efeito do. Virazole sobre um mesmo vírus em duas espécies de plantas hospedeiras. 2) Avaliar a possibilidade do uso de Virazole para obtenção de plantas cítricas livres do CTV por minienxertia realizada in vitro. Os resultados mostraram que o Virazole inibiu a multiplicação dos 3 vírus em estudo (VEFV, VAP e CTV), pertencentes a dois grupos distintos: closterovirus (VEFV e CTV) e tobravirus (V AP). A utilização de calos infectados com vírus e tratados com Virazole in vitro, mostrou ser um modelo de estudo eficiente para avaliar o efeito desse composto quimioterápico sobre vírus de planta. A indexação serológica; das amostras coletadas a cada subcultura dos calos permitiu acompanhar a evolução do conteúdo de vírus no decorrer de várias subculturas sucessivas. Os resultados mostraram de modo geral, que a quantidade de vírus presente varia muito pouco nas culturas de calos mantidas em ausência de Virazole. As concentrações mais baixas utilizadas não inibiram a multiplicação dos vírus, ao passo que concentrações mais altas do produto provocaram uma diminuição progressiva da concentração de vírus a cada subcultura até que as partículas virais não foram mais detectadas nos testes serológicos. O desenvolvimento da cultura foi afetado por concentrações altas de Virazole, sendo que algumas concentrações foram fitotóxicas, dependendo da planta e do tecido tratado. Em calos de videira infectados com VEFV o significativa a replicação do vírus. A inibição foi proporcional Virazole inibiu de maneira à concentração do produto utilizada. À 50 ppm não foram detectadas partículas virais nos testes serológicos. O Virazole atuou rapidamente em diminuir a concentração do VEFV à um nível baixo em calos em proliferação, porém, um longo período de incubação foi necessário para obter completa supressão dos vírus. Esses resultados são consistentes com a possibilidade de que a atividade antiviral do Virazole se manifesta por sua ação na síntese de novas partículas mais do que uma inativação direta dos vírus existentes. O Virazole foi capaz de inibir a multiplicação do V AP em calos de fumo, mas não em calos de G. globosa. Em fumo a concentração de 200 ppm eliminou os vírus presentes nos calos, enquanto que em calos de G. globosa o Virazole não foi efetivo em nenhuma das concentrações testadas. Possivelmente essas plantas apresentam vias metabólicas alternativas para a replicação do RNA viral ( e não aquela inibida pelo Virazole). A eficiência do Virazole em eliminar o V AP foi também dependente do estágio de desenvolvimento dos tecidos tratados. O Virazole inibiu a multiplicação de vírus quando pedaços de folhas foram utilizados como explantes, porém, ocorreu pouca ou nenhuma inibição quando células de calos não organizados foram tratadas com Virazole. O Virazole inibiu a multiplicação do CTV à concentração de 200 ppm. Essa inibição foi verificada pela ausência de sintomas específicos do vírus da tristeza nas plantas obtidas. As plantas cresceram tão bem quanto as plantas sadias. O Virazole não foi efetivo à 100 ppm. Nessa concentração o vírus provocou paralisação do crescimento das plantas e as folhas apresentaram sintomas de palidez das nervuras, específicos da doença. Esses resultados foram confirmados por ELISA e "Western-blot". Com bases nesses resultados, conclui-se que o Virazole é um quimioterápico eficiente para a obtenção de plantas livres de vírus, dependendo da espécie vegetal, do vírus envolvido e das condições de tratamento Mestrado Fisiologia Vegetal Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Jorge Vega Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia Resumo: Este trabalho teve como objetivo contribuir a um melhor conhecimento da moléstia do Enrolamento da Folha da Videira (EFV) presente no Brasil, e em todos os países vitícolas. Diversas evidências indicam a etiologia viral do EFV, entre elas a capacidade de transmissão por enxertia e a sensibilidade do patógeno à termoterapia. Além dessas características, diferentes partículas de vírus (alongadas e isométricas) têm sido isoladas de plantas de videira afetadas pelo EFV. o método aceito para diagnosticar a moléstia, consiste na enxertia do material a ser testado em variedades indicadoras para o enrolamento da folha, porém a leitura confiável dos sintomas induzidos na planta indicadora é realizada num período de 2-3 anos após a enxertia. Usando técnicas ligadas à serologia, pode-se melhorar as condições para o diagnóstico deste vírus, por testes mais rápidos que os de indexação por enxertia em variedades indicadoras. Durante o desenvolvimento deste trabalho, observou-se através de testes de microscopia eletrônica, uma maior concentração do vírus em tecido caloso de videira, obtido in vitro, em relação à concentração encontrada nas folhas e hastes da própria planta. A fim de se obter dados que contribuíssem para um melhor conhecimento da moléstia do EFV presente no Brasil e facilitar as condições de diagnóstico, foram estudados os seguintes aspectos: 1) possibilidade do uso de tecido caloso obtido in vitro a partir de tecidos de videira com EFV, como modelo, para estudo e manutenção do vírus; 2) citopatologia do tecido caloso à nível de microscopia eletrônica; 3) avaliação da relação serológica existente entre as partículas virais do tipo closterovirus detectadas em calos de videira com enrolamento da folha através de testes de microscopia eletrônica de imunoadsorção utilizando anti-soros preparados para o Vírus do Enrolamento da Folha da Videira (VEFV) e para o Vírus da Tristeza dos Citros (VTC); 4) detecção de partículas virais do tipo closterovirus em amostras semipurificadas de folhas de videira em variedades indicadoras (Pinot Noir e LN-33) e não-indicadora do EFV (Seibel 2) e 5) tentativas de transmissão mecânica do vírus do enrolamento da folha da videira para a hospedeira herbácea Nicotiana benthamiana. Outro aspecto estudado neste trabalho se refere à perpetuação do vírus através da cultura in vitro ao longo de várias repicagens do calo. Condições diferentes de temperatura e luminosidade também foram avaliadas, visando estabelecer diferenças no desenvolvimento do calo e na concentração do vírus. Os resultados deste estudo mostraram que o vírus detectado, associado ao EFV, se multiplica ativamente nas células do tecido caloso de videira. A citopatologia observada nos calos de videira afetadas pelo EFV é característica de infecção por closterovirus. O estudo das partículas virais associadas ao EFV pela técnica de tecido caloso in vitro mostrou-se útil devido à rapidez da formação do tecido caloso, diminuição do risco de contaminação das amostras, e especialmente pela baixa atividade de oxidases das células do calo. Para manutenção do vírus por períodos prolongados não se mostrou eficiente. Com relação ao efeito da luminosidade e temperatura, não foram observadas diferenças significativas no desenvolvimento do calo e na concentração do vírus. Os testes de transmissão mecânica para hospedeira herbácea Nicotiana benthamiana foram negativos. A técnica de ISEM feita com materiais semipurificados de folhas, mostrou ser um teste adequado e rápido para o diagnóstico da doença, quando comparada com a indexação por enxertia em variedades indicadoras. Os resultados das técnicas de ISEM, decoração e do teste de F(ab')2 ELISA, mostraram que o isolado do VEFV estudado neste trabalho é predominantemente do tipo IH. Os anti-soros preparados para os isolados tipos I e H somente reagiram nos testes de ISEM e decoração, indicando uma relação serológica muito fraca com o vírus estudado. Pôde-se concluir que o EFV é uma doença complexa, onde parecem estar envolvidos vários componentes virais, sendo que um deles mostrou relação serológica com o VTC, como observado nos testes de ISEM com decoração Mestrado Biologia Vegetal Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Jorge Vega Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As plantas podem ficar sistemicamente protegidas contra diversas moléstias através de uma inoculação prévia com patógenos causadores de necrose. Este fenômeno é conhecido como resistência sistêmica adquirida. O envolvimento de vários mecanismos na indução da resistência adquirida tem sido sugerido. Entre eles estão a resposta de hipersensibilidade, aumento na atividade da peroxidase, e o aumento no conteúdo de ácido salicílico nas folhas resistentes. Esta tese teve como objetivos caracterizar o fenômeno da resistência adquirida em plantas de feijoeiro Moruna nc inoculadas com o vírus VMFS-EUA, quanto à ocorrência da reação de hipersensibilidad e; efeito do número de lesões necróticas necessárias para a indução da resistência; efeito de condições ambientais (radiação e temperatura), duração do fenômeno e efeito da nodulação por Rhizobium tropici; avaliar os processos bioquímicos envolvidos na resistência adquirida, tais como peroxidação de lipídeos, atividade enzimáticas (catalase, peroxidase e fenilalanina amônia-liase) e o envolvimento do ácido salicílico; e estudar o efeito da aplicação de citocininas, ácido salicílico e benzotiadiazole sobre a resposta de hipersensibilidade e a expressão da resistência sistêmica adquirida. Para tanto, na maioria dos experimentos (exceção aos experimentos em que foi estudada a influência do número de lesões ocorridas na indução na expressão da resistência), o feijoeiro Moruna nc foi inoculado na folha primária com o vírus VMFS-EUA purificado, na concentração de 10 ~glmL. Geralmente a reação de hipersensibilidade ocorreu 72 horas após esta inoculação (inoculação de indução). A planta inoculada recebeu outra inoculação ( de desafio) com a mesma concentração de VMFS-EUA, na 23 folha trifoliolada. Quatro dias após esta última inoculação, foram realizados os ensaios enzimáticos e as outras determinações bioquímicas em ambas as folhas, induzi da e desafiada. Nos experimentos em que foi estudada a influência do número de lesões ocorridas na indução na expressão da resistência adquirida, verificou-se que o aumento na concentração viral de 1,7 para 20 JlglrnL durante a inoculação de indução resultou em menos lesões ocorridas no desafio, tanto nos experimentos realizados em casa de vegetação como em câmara de crescimento. As mudanças realizadas experimentalmente na radiação luminosa incidente não resultaram em alterações na expressão da resistência adquirida. No entanto, a aumento na temperatura de 20°C para 30°C causou uma redução no número e tamanho de lesões ocorridas no desafio. De um modo geral, a resistência adquirida teve duração de 13 a 22 dias após a indução da mesma. Não foi observado efeito da nodulação na expressão da resistência adquirida. Malondialdeído, um produto da peroxidação de lipídeos, esteve relacionado com a resposta de hipersensibilidade. Não foi observado aumento na atividade da enzima catalase em relação à ocorrência de resistência adquirida. A atividade da peroxidase aumentou de aproximadamente 3 para 15 unidades (expressas em Mbs4701min.g massa fresca) durante a expressão da resistência sistêmica adquirida. A enzima fenilalanina amônia-liase (P AL) também apresentou aumento de atividade nas plantas que estavam expressando resistência (uma média de 7 UA.2901h. g massa fresca x100. nas folhas não induzi das e 27 U.A.290/h.g massa fresca x 100 nas folhas com resistência adquirida). O conteúdo de ácido salicílico nasfolhas com resistência induzida aumentou mais de 30 vezes durante a ocorrência da resistência no feijoeiro Moruna nc. O tratamento de aplicação de citocinina permitiu maior replicação viral, monitorada pelo teste PT A-ELISA, tanto nas plantas de uma variedade que permite a invasão sistêmica (cultivar Jalo), como na variedade Moruna nc. Já as folhas tratadas com ácido salicílico apresentaram redução na replicação viral. A aplicação do ácido salicílico induziu resistência sistêmica a partir de doze horas após sua aplicação, evidenciada pela redução de 15lesõeslcm2 de folha, no controle, para 2 lesõeslcm2 de folha nas folhas tratadas. O benzotiadiazole (sob a forma do produto comercial BION), produto indutor de resistência análogo ao ácido salicílico, induziu resistência nos feijoeiros quando aplicado nas doses de 2,5 e 5 g/100L. Doses maiores do produto causaram sintomas de toxidez nas plantas. Peroxidase teve sua atividade aumentada nas plantas tratadas com o produto, mas a enzima P AL não apresentou tal comportamento. O produto conferiu resistência às plantas durante o período de nove dias. O trabalho permite concluir que o número e tamanho das lesões causadas pelo VMFS EUA na indução foram afetados pela temperatura, e foram fatores determinantes para a ocorrência da resistência adquirida. As enzimas peroxidase e P AL foram associadas aos processos bioquímicos que possibilitaram a ocorrência da resistência sistêmica. O ácido salicílico também esteve envolvido na expressão de resistência sistêmica adquirida em plantas de feijoeiro Moruna nc inoculadas com VMFS-EUA Abstract: Plants can be systemically protected against diseases by prior inoculation with necrotizing pathogens or physiologicallbiochemical stresses. This phenomenon has been tenned systemic acquired resistance (SAR). Several mechanisms have been suggested to contribute to plant induced resistance. They inc1ude the hypersensitive response (HR), enhanced systemic extracellular peroxidase activity, and the involvement of salicylic acid. The purposes of this work were to characterize SAR in Moruna bean inoculated with Southern Bean Mosaic Vírus (SBMV) in relation to the HR occurrence; study the effect of lesion number necessary to induce SAR; study the effects of light radiation and temperature; evaluate time extension and effect of Rhizobium tropici nodulation; study biochemical processes involved with SAR, such as lipid peroxidation, enzymatic activities (catalase, peroxidase, and P AL) and the involvement of salicylic acid; and finally study the effects of cytokinin, salicily acid and benzothiadiazole application in the HR and SAR expression. In most of the experiments (except for those where the effect of lesion number necessary to induce SAR was studied) Moruna bean was inoculated on the primary leaves with purified SBMV at the concentration of 1 O ~g/rnL. lt usually showed HR 72 hours after this inoculation. Inoculated plants were challenged with the same concentration of SBMV on the second trifoliate leaf. Four days after challenge, enzymatic assays and other biochemical assays were performed on both induced and challenged leaves. In the experiments where the effect of lesion number necessary to induce SAR was studied, increasing SBMV concentration ftom 1.7 to 20 ~glmL as the inducing inoculum resulted in the development of fewer lesions at cha1lenge in both greenhouse and growth chamber experiments. Changes in incident light radiation did not modify the pattem of SAR expression, but increase of temperature ftom 20°C to 30°C caused a reduction in both number and lesion size at challenge. In general, SAR was expressed during 13 to 22 days. No nodulation etfects were observed on the expression of SAR. Malondialdehyde, a product oflipid peroxidation, was associated with HR. No changes in catalase activity were observed in relation to SAR. Peroxidase activity increased ftom approximately 3 to 15 units (expressed in ~AbS4701min.g ftesh weight) during SAR expression. Phenylalanine ammonia-Iyase (P AL) also showed enhanced activity in the induced leaves (an average of7 U.A.2901 h. g ftesh weight xl00 in non-induced leaves, and 27 U.A.2901 h. g ftesh weight x 100 in SAR expressing leaves). Salicylic acid content on the induced leaves increased up to 30 fold during SAR expression in Moruna bean. Leaves treated with cytokinin showed increased virus replication, measured by PT A ELISA, both for plants that permit systemic spread (Jalo) as for Moruna nc. On the other hand, leaves sprayed with salicylic acid presented less virus replication. Treatment with salicylic acid induced systemic resistance after 12 hours, showing a reduction ftom 15 lesions/cm2 (control) to 2lesionslcm2 (treated leaves). Benzothiadiazole (which commercial product is called BION), an analog of salicylic acid, induced resistance in bean when it was applied at 2.5 and 5 g/100 L. Higher amounts of this product were toxic to the plants. Peroxidase activity was higher in plants treated with BTH than in the control, but PAL did not show this increase in activity. Plants treated with BTH remained resistant to SBMV during 9 days. We conclude that number and lesion size caused by SBMV at induction were atfected by temperature, and were important for SAR occurrence. Extracellular peroxidase and P AL were associated with the biochemica1 processes leading to resistance. Salicylic acid was also related to induced resistance ofMoruna bean plants inoculated with SBMV Doutorado Doutor em Biologia Vegetal

Orientador: Jorge Vega Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O vírus do amarelecimento foliar da cana-de-açúcar, Sugarcane yellow leaf vírus (ScYL V) constitui atualmente um grande problema nos principais países produtores de cana-de-açúcar. Este vírus possui diversas características físicas e biológicas, como tamanho e morfologia da partícula, reações serológicas, alterações morfológicas no hospedeiro e aspectos de transmissão, comuns aos membros da família Luteovírídae. As informações da sequência genõmica do isolado brasileiro obtidas nesse trabalho, referentes às regiões codificantes para capa protéica do vírus (CP), proteína de movimento (17 kOa ou MP) e parte da RNA polimerase dependente de RNA (RdRp), mostram um alto grau de identidade e similaridade de aminoácidos com sequências de luteovirus conhecidos. Isso permite estabelecer o ScYLV como um membro definitivo da família Luteovíridae. Análises filogenéticas empregando as sequências deduzidas de aminoácidos da CP e da região C-terminal da RdRp do ScYL V sugerem diferentes afinidades taxonõmicas desse vírus dentro da família Luteovírídae, de maneira similar ao que acontece com o Soybean dwarf vírus (SOV). Análises comparativas de seqüência entre o isolado brasileiro e um isolado norte-americano revelaram diferenças de apenas dois nucleotídeos nas posições 4201(G por T) e 4232 (A por C) do genoma do ScYLV, correspondentesrespectivamente à região codificadora da proteína P17 e CP. Os dados de seqüência obtidos neste trabalho foram usados no desenvolvimento de um método sensível de diagnóstico baseado na combinação da técnica de amplificação isotérmica de ácidos nucléicos NASBA (nucleic acid sequence based amplification) e "molecular beacons", denominado AmpliOet RNA. Esse sistema de detecção foi altamente específico e ofereceu uma sensibilidade de aproximadamente 100 fg de vírus purificado, permitindo a detecção em plantas com baixos níveis de infecção viral e em um único pulgão virulífero. Os membros da família Luteoviridae são transmitidos por afídeos de uma maneira circulativa e não-propagativa. Após a aquisição, o vírus permanece no corpo do inseto por várias semanas, graças a associação com a proteína GroEL, produzida por um endossimbionte primário do pulgão. As partículas de vírus purificadas apresentam dois tipos de proteína, a proteína principal da capa protéica de 22 kDa e menores quantidades de outro componente do capsídeo, a proteína de transleitura ou "readthrough" (RTD) de 54 kDa. A protéina RTD contém determinantes responsáveis pela transmissão e acúmulo do vírus em plantas agroinfectadas. O Potato leafroll vírus (PLRV) é uma espécie do gênero Polerovirus dentro da família /,..uteoviridae. Clones infectivos de cDNA do PLRV e um mutante deletério da proteína RTD foram usados para estudar as interações moleculares entre esse luteoviruse seu afídeo vetor Myzus persicae. O mutante do PLRV, no qual a proteína RTD estava inteiramente ausente, não foi transmissível por M. persicae e não se ligou a proteína GroEL. Adicionalmente, esse mutante mostrou-se significativamente menos persistente na hemolinfa do afídeo do que as partículas não modificadas do vírus Abstract: Sugarcane yellow leaf vírus (ScYL V) is widely distributed in Brazil and other sugarcane producing countries causing significant yield losses. This virus shares biological features typical of the luteovirids. Comparisons of the coat protein (CP), 17 kDa protein and C-terminus of the RNA-dependent RNA polymerase coding regions showed that the deduced amino acid sequences of the Brazilian isolate share a considerable degree of identity and similarity with corresponding sequences of known luteovirids, thus clearly establishing ScYL V as a member of the family Luteovíridae. Phylogenetic analyses also suggest that the 5' and 3' coding blocks of the ScYLV genome possess different taxonomic affinities within the Luteovíridae family, as for the genome of Soybean dwarf vírus (SDV). Our results were published simultaneously as the sequence of a North American strain of ScYL V. Comparative analyses between the deduced peptides of Brazilian and North American strains revealed two nucleotide substitutions at positions 4201 (G_ T) and 4232 (A_C) of the ScYLV genome, corresponding to P17 and CP proteins coding regions, respectively. Our sequence data were used to develop a highly sensitive detection method based on the combination of isothermic nucleic acid sequence based amplification (NASBA) and molecular beacons, named AmpliDet RNA. This system offered a sensitivity of about 100 fg of purified virus and could detect ScYL V in plant samples with low virus titer and in one single aphid. Members in the Luteovírídae are transmitted by aphids in a circulative, nonreplicative manner. After acquisiton, luteovirus particles persist in the aphid's hemolymph for several weeks in association with a GroEL homolog, produced by the primary endosymbiont of the aphid. Luteovirus purified particles contain two types of proteins; a major 22 kDa coat protein (CP) and the minor capsid component of 54 kDa, the readthrough protein (RTD). The RTD contains determinants responsible for virus transmission and accumulation in agroinfected plants. Potato leafroll virus (PLRV) is a member of the genus Po/erovírus in the family Luteovíridae. An infectious cDNA fuI! length clone of PLRV and a mutant devoid of the RTD were used to study and better understanding the molecular interactions between this luteovirus and its aphid vector Myzus persícae. The PLRV mutant lacking the entire RTD protein was not transmissible by M. persícae and did not bind to Buchnera GroEL. Furthermore, the mutant was significantly less persistent in the aphid's hemolymph than the wild type virus. These data corroborate previous observations with Beet westem yellow vírus (BWYV) and Bar/ey ye//ow dwarf vírus (BYDV) that the RTD domain is involvedin luteovirus transmission and persistence in the aphid's body Doutorado Doutor em Biologia Vegetal

Orientador: Jorge Vega Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Esta tese teve como objetivos caracterizar as alterações histológicas e fisiológicas induzidas em plantas de laranja 'Pera¿ e limão 'Galego', inoculadas com isolados fracos (Pera IAC e Isolado 50) e severos (Pera Rio e Barão B) do vírus da tristeza dos citros (CTV); estudar as respostas das plantas à infecção pelo CTV quanto à variação de atividades enzimáticas envolvidas na reação da planta (PAL, CAD, Peroxidases ligadas à parede celular POX-lig); obter dados sobre a localização a nível morfo-histológico de peroxidases ligadas à parede celular; obter dados sobre isoenzimas de peroxidases envolvidas na resposta à infecção pelo CTV; caracterizar a resposta das plantas à infecção pelo CTV quanto a alterações no conteúdo de ácido salicílico total. Para tanto, plantas de laranja 'Pera¿ e limão 'Galego¿ foram inoculadas por união de tecido com borbulhas de plantas infectadas com os isolados do vírus. Como controle foram usadas plantas enxertadas com borbulhas sadias. As plantas foram mantidas em casa de vegetação. Nos experimentos onde determinou-se a atividade das enzimas PAL,CAD e Pox-lig foi verificado, com exceção da enzima CAD, que plantas infectadas pelos isolados severos do CTV apresentaram um aumento significativo na atividade dessas enzimas, enquanto que as plantas infectadas pelos isolados fracos do virus diminuíram a atividade ou não a modificaram. Quando guaiacol e siringaldazina, substratos específicos para determinar a atividade de peroxidases foram usados, observou-se que a atividade de guaiacol peroxidase não apresentou correlação com a severidade do isolado do CTV. As diferenças observadas na atividade de siringaldazina peroxidase foram de tal magnitude que poderiam ser consideradas na prática como um parâmetro na diferenciação entre isolados fracos e severos do CTV. A enzima CAD não foi estimulada pela infecção com os diferentes isolados do CTV, não foram observadas diferenças nas atividades entre a plantas infectadas com vírus e plantas sadias. Assim como na Pox -lig e P AL, o conteúdo de ácido salicilico foi mais elevado somente nas plantas infectadas pelos isolados severos do vírus. Plantas infectadas pelo isolado severo Barão B apresentaram teores de SA duas vezes mais elevados que as plantas sadias e 2,7 e 4,4 vezes o valor de plantas infectadas com os isolados Pera IAC e Galego 50, respectivamente. Nos experimentos de eletroforese as isoperoxidases foram separadas em gel ácido (pH 4,5) e gel alcalino (pH 8,3). Em gel alcalino utilizando carbazole como substrato genérico para peroxidases, observou-se duas bandas peroxidases citoplasmáticas nos materiais infectados com isolados severos, enquanto que com o isolado fraco e plantas sadias apresentaram apenas uma banda. Em pH ácido, utilizando siringaldazina como substrato, apenas uma peroxidase de parede celular foi detectada em plantas infectadas pelos isolados severos do CTV. Plantas sadias e infectadas com isolados fracos do vírus não apresentaram atividade. A análise da atividade de guaiacol peroxidase através de fracionamento por HPLC mostrou que as plantas infectadas com o isolado severo do CTV apresentaram dois picos de atividade, sendo o primeiro aos 16-17 minutos de eluição com atividade em tomo de 0,02 ?Abs / mino e o segundo pico, aos 19,5 mino de eluição, com atividade bem maior, em tomo de 0,09 ?Abs / min. Por outro lado, plantas sadias e plantas infectadas com isolado fraco do vírus apresentaram apenas um pico de atividade aos 20 mino de eluição com atividade ao redor de 0,04 e aos 21 min. de eluição com atividade ao redor de 0,06 ?Abs / min, respectivamente. Nos ensaios de microscopia de fluorescência, plantas de limão' Galego' infectadas pelo isolado severo Barão B apresentaram depressões no xilema que foram visualizadas quando utilizou-se excitação com luz UV (Fig. 13 a). O material apresentou fluorescência amarela com excitação por luz azul (Fig. 13 b). Em plantas sadias e plantas infectadas pelo isolado fraco Galego 50 não foram observadas alterações na fluorescência na região do floema e do câmbio vascular (Fig. 13 c,d, respectivamente). Em plantas de laranja 'Pera' infectadas pelos isolados severos Barão B e Pera Rio, foi observado um acúmulo de material fluorescente verde na região do câmbio vascular. o trabalho permite concluir que a atividade de peroxidase associada à lignificação (Pox-lig) pode ser considerada como um parâmetro bastante significativo para a diferenciação de isolados fracos e severos do CTV. Os isolados severos do vírus causam aumento na atividade de enzimas envolvidas nas reações de defesa das plantas, concomitante com o aumento no teor de SA, que atua como molécula sinalizadora. Plantas infectadas pelos isolados severos apresentam disfunção do floema, na região do câmbio vascular e também o aparecimento de uma proteína com atividade peroxidásica que pode ocorrer através de síntese de novo (ativação gênica) ou por ativação de proteína preexistente Abstract: The present work had as objective the characterization of physiological and histological alterations induced in 'Pera' sweet orange and 'Mexican' lime plants infected by severe (Pera Rio and Barão B) or mild (pera IAC and Isolado 50) isolates of citrus tristeza virus (CTV). The response of plants to CTV infection was examined in relation to changes in enzymatic activities associated with the reaction of the plant to virus infection: P AL, CAD and cell wall-associated peroxidase (Pox-lig). Also examined were the content of salicylic acid, the histological localization of cell wall-associated peroxidases and their electrophoretic characteristics. All the experiments were conducted in 'Pera' orange and 'Mexican' lime plants, graft-inoculated with the different CTV isolates. As healthy controls, plants graft inoculated with healthy scions were used. The plants were kept in the greenhouse during the experiments. Two enzymes, P AL and cell wall-associated peroxidase, have their activity significantly increased in plants infected by severe CTV isolates. These enzyme activities were reduced or not changed by infections with mild isolates, as compared to healthy controls. This correlation between activity and severity of the virus isolate was not observed when guaiacol was used as generic substrate in the peroxidase assay. However, using syringaldazine as substrate for cell wall-associated peroxidase (Pox-lig), the correlation was evident. The differences in syringaldazine-peroxidase and in P AL activities were of such magnitude that they may be useful as a parameter in differentiating mild and severe isolates. The activity of the enzyme CAD was not changed by CTV infection, whether of severe or mild isolates. Paralleling the activity of Pox-lig, the content of salicylic acid was also increased only in plants infected by severe CTV isolates. 'Pera' oranges infected with the severe isolate "Barão B" had 2,7 and 4,4 times greater content of SA than plants infected with "Pera IAC" or "Galego 50" mild isolates, respectively. Using non-denaturing PAGE electrophoresis at an alkaline pH (pH 8.3) an additional band was detected only in plants infected with severe isolates. At acid pH (pH 4.5) it was possible to detect one band with syringaldazine-peroxidase activity only in plants infected with severe isolates. Separation of isoenzymes by HPLC showed an additional peak of guayacol activity (0.02 ?Abs /min) eluting at 16-17 minutes, which was absent in healthy or mild isolate-infected materiais. At 19.5-21 minutes eluted a peak of greater activity (0.09 ?Abs /min) that was common to infected and healthy materiais. Fluorescence microscopy of stem tips of 'Mexican' lime plants, infected with the severe isolate Barão B, showed depressions in the xylem, visualized using UV excitation light. With blue light excitation it was possible to visualize a yellow fluorescing material within the xylem depressions (Figs. 13 a and b). In healthy or mild isolate (Galego 50) materials, fluorescence alterations were not observed in the cambium zone. In 'Pera' orange plants infected with severe isolates (Barão B and Pera Rio) the accumulation of green-fluorescent material was observed in the cambium zone when UV excitation was used. It may be concluded that peroxidase activity associated with lignification can be considered as a significant parameter to differentiate severe from mild isolates of CTV. Severe isolates of CTV induce increases in enzyme activities involved in plant defense mechanisms, paralleling the increase of salicylic acid content, which functions as signaling molecule. Plants infected by severe isolates show disfunctional phloem and an altered cambium zone. They also show the appearance of a new band with peroxidasic activity that may arise from de novo synthesis (gene activation) or from activation of a pre-existing protein Doutorado Doutor em Biologia Vegetal

Orientador: Paulo Mazzafera Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Em 2004, Silvarolla e colaboradores descobriram três plantas (AC1, AC2 e AC3) de Coffea arabica, provenientes da Etiópia, com baixa quantidade de cafeína nas sementes. Esta pequena concentração (0,76 mg/g) em AC1, quando comparada com grãos de C. arabica com cafeína (em torno de 12 mg/g), foi verificada ser de origem constitutiva da planta, sendo esta denominada como naturalmente descafeinada. Neste trabalho a planta de AC1 foi estudada, já que esta é a mais adequada para a transferência genética do traço "sem cafeína" para cultivares com alta produtividade. Ao analisar o desenvolvimento das sementes de AC1, foi observado que endospermas maduros da planta com baixas quantidades de cafeína perderam menos massa do que os de Mundo Novo (MN) e que estes, no final do desenvolvimento, eram maiores do que os de AC1. Entretanto, apesar deste fato, os conteúdos de aminoácidos, açúcares solúveis, ácidos orgânicos, ácidos clorogênicos e trigonelina foram similares nas sementes de frutos de MN e AC1. Foi constatado que em todos os estádios fenológicos as sementes de AC1 apresentaram baixas quantidades de cafeína. Além disso, foi observado que não só sementes e folhas apresentaram esta característica, mas também flores e internódios. Experimentos com o fornecimento de [2-14C] adenina e análises enzimáticas de teobromina sintase e cafeína sintase nas sementes de AC1 confirmaram que, assim como em folhas, a síntese de cafeína é bloqueada na metilação de teobromina a cafeína, acumulando altas taxas de teobromina. Experimentos de análise de expressão gênica indicaram que, apesar dos genes responsáveis pela síntese das três metiltransferases envolvidas na síntese de cafeína ser expressos nos endospermas de AC1, suas expressões são menores se comparadas com o controle MN, principalmente ao analisar a expressão do gene CCS1, que codifica para a cafeína sintase. Os compostos fenólicos apresentaram valores próximos ao longo de todo o desenvolvimento do endosperma, sendo que a quantidade equivalente encontrada nestes grãos parcialmente explica a atividade antioxidante similar encontrada nos grãos maduros de MN e AC1. Análises de proteínas de reserva em endospermas maduros foram similares em MN e AC1 Abstract: In 2004, Silvarolla and co-workers discovery three plants (AC1, AC2 and AC3) of Coffea arabica, originated from Ethiopia, with low amount of caffeine in the seeds. This low concentration (0,76 mg/g) was found to be constitutive plant origin, this being referred to as naturally decaffeinate. In this work only the seeds of AC1 were studied, since this plant has shown to be the most suitable for gene transfer trace "without caffeine" for cultivars with high productivity. By analyzing the development of the seed AC1, it was observed that the mature endosperm of the plant with low amounts of caffeine lost less weight than those of MN, and also at the end of development, they were greater than those of AC1. However, despite this fact, the contents of amino acids, organic acids, chlorogenic acids and trigonelline were similar to MN and AC1 seeds and fruits. Soluble sugars were also similar in most part of the development despite the sucrose in the endosperm AC1 cherry stage, having it's significantly less than the one found in the endosperm MN at the stage. It was found that in all growth stages seeds AC1 presented low amounts of caffeine. Furthermore, it was observed that not only seeds and leaves showed this characteristic, but also flowers and internodes. Experiments with the supply of [2-14C] adenine and enzymatic analyzes of theobromine synthase and caffeine synthase in AC1 seeds confirmed that as leaves, caffeine synthesis are blocked in the methylation of theobromine to caffeine, accumulating high levels of theobromine. Experiments of the gene's expression analysis indicated that, although the genes responsible for the synthesis of the three methyltransferases involved in caffeine synthesis are expressed in AC1 endosperm, presented minor expressions compared to the control MN, especially when analyzing the expression of the gene CCS1, which synthesizes caffeine synthase. Phenolic compounds had similar values throughout the development of the endosperm, the equivalent amount found in these grains partly explains the similar antioxidant activity found in the MN and AC1 mature grains. The reserve proteins assays of mature endosperms were also similar in both endosperms Doutorado Biologia Vegetal Doutora em Biologia Vegetal

Orientador: Jorge Vega Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo:A aplicação de determinados reguladores de crescimento em plantas pode resultar na indução de resistência contra ataques subseqüentes de patógenos. Este fenômeno é conhecido como resistência sistêmica adquirida (SAR) e vários mecanismos estão envolvidos, entre eles a resposta de hipersensibilidade (HR), o aumento na atividade das enzimas peroxidases (POX) e da fenilalanina amônia-liase (PAL) nos tecidos resistentes. A fim de se detenninar o efeito do ácido salicílico (AS) e de um brassinolídeo (BR 16) na resposta hipersensível, plantas de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.), cultivar Moruna (nc) foram tratadas com estes reguladores de crescimento e inoculadas com o Southern bean mosaic virus (SBMV). Detenninou-se o número de lesões necróticas das folhas primárias e a atividade das enzimas guaiacol peroxidases (g-POX) e PAL. Houve uma redução significativa no número de lesões necróticas nas plantas tratadas com ambos os reguladores de crescimento e um aumento significativo na atividade das g-POX, mas nenhum efeito na atividade da PAL. O efeito da aplicação de AS e BR 16 na resposta suscetível foi verificado através da aplicação destes reguladores de crescimento em plantas de feijoeiro da cultivar lalo, inoculadas com o SBMV. Os tratamentos promoveram uma redução significativa na concentração viral na sa folha trifoliolada, 28 dias após a inoculação das folhas primárias. Os resultados indicam que as aplicações de ácido salicílico e do brassinolídeo BR 16 podem ter promovido uma indução de resistência tanto local quanto sistêmica, em plantas de feijoeiro. O aumento na atividade das enzimas g-POX, envolvidas nos processos de detoxificação de espécies reativas de oxigênio, promovido pelo tratamento com ambos os reguladores de crescimento, sugere uma participação destas na redução do número de lesões necróticas das plantas inoculadas com o SBMV Abstract: The use of certain growth regulators in plants can result in the induction of resistance against attacks of some plant pathogens. This phenomenon is known as Systemic Acquired Resistance (SAR) and several mechanisms are involved in the induction of SAR.,among them are the Hypersensitive Reaction (HR), the increase in the activity of some enzymes like peroxidases (POX) and Phenylalanine ammonia-Iyase (PAL). Two different growth regulators (salicylic acid "SA" and a brassinosteroid "BR 16") were used in order to determine the induction of local resistance in bean plants (Phaseolus vulgaris L.) of cultivar Moruna (nc). Afier the application, the plants were mechanically inoculated with Southern bean mosaic virus (SBMV), genus Sobemovirus. The number of necrotic lesion was determined in the the primary leaves and the activity of the enzymes guaiacol peroxidases (g-POX) and Phenylalanine ammonia-Iyase (pAL) were also measured. There was a significant reduction in the number of necrotic lesions in the treated plants with both growth regulators and a significant increase in the activity ofthe g-POX, but there was no effect in the PAL activity. The effect ofthe application of SA and BR 16 in the induction of systemic resistance was verified through the application of these growth regulators in bean plants cultivar Jalo, inoculated with SBMV. The treatments promoted a significant reduction in the viral concentration in the SIDleaf, 28 days afier the inoculation of the primary leaves. The results indicated that the applications of SA and of the BR 16 promoted both local and systemic resistances. The increase in the activity of the guaiacol peroxidases, enzymes involved in the scavenning of reactive oxygen species, caused by the treatment with both growth regulators, suggested a contribution in the reduction of the number of necrotic lesions in the plants inoculated with SBMV. The use of SA and BR 16 did not change the activity of PAL, enzyme involved in the lignification process and in the mechanisms of plant defense against infections Doutorado Doutor em Biologia Vegetal

Orientador: Jorge Vega Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Foram estudadas três variedades de cana-de-açúcar com diferentes graus de sensibilidade à infecção pelo vírus do amarelecimento foliar (VAFCA). As plantas mais sensíveis quando infectadas pelo VAFCA apresentam amarelecimento da nervura principal na parte abaxial, e quando o sintoma está em estádio avançado, também mostram o avermelhamento na parte adaxial da mesma nervura. Quando as variações ambientais são maiores, principalmente quando há queda da temperatura, a intensidade de sintomas é significantemente maior. A infecção viral também causa a diminuição no crescimento da planta. Análises com microscopia de epifluorescência mostraram que em algumas amostras infectadas havia um acúmulo de material fluorescente no interior do floema, sítio de localização do VAFCA. A análise comparativa entre as variedades mostrou que este material fluorescente aparecia quase que exclusivamente em folhas com sintomas da variedade sensível, SP 71-6163. Testes histoquímicos usando o reagente de Neu indicaram que o material fluorescente presente no floema é rico em flavonóides, e provavelmente insolúvel. Sabe-se que um dos mecanismos acionados na defesa de plantas contra patógenos é o aumento da atividade de peroxidases. Em testes quantitativos de três enzimas peroxidásicas diferentes foi verificado aumento significativo na atividade da siringaldazina peroxidase (SPX) apenas em plantas sensíveis, da variedade SP 81-3250, infectadas pelo VAFCA. Quanto às outras enzimas, guaiacol peroxidase (GPX) e ascorbato peroxidase (APX), as atividades sofreram poucas modificações nas variedades estudadas. Também foram feitos testes de localização da SPX, com siringaldazina como substrato e de peroxidases genéricas, com o 4-cloro-naftol como substrato. Nestes testes foi verificado que há atividade da SPX no interior do floema e nas células epidérmicas e subepidérmicas, em plantas sadias e infectadas da variedade SP 81-3250, e em folhas com e sem sintoma da SP 71-6163. Já na variedade tolerante, SP 70-1143, a atividade desta enzima foi baixa e às vezes nula. Quanto às peroxidases genéricas, houve também atividade no tecido floemático e nas células epidérmicas e subepidérmicas, mas a atividade foi similar em todas as folhas analisadas estando elas sadias ou infectadas com ou sem sintoma. Foi possível fazer uma correlação nas diferentes variedades entre concentrações de vírus e prováveis mecanismos de defesa estudados. Plantas tolerantes apresentaram muitos feixes infectados, nunca apresentam material fluorescente no floema e possuem baixa atividade SPX. Já a variedade mais sensível possui poucos feixes infectados, acúmulo de material fluorescente em folhas com sintoma, e atividade relativamente alta de SPX. Esta resposta provavelmente representa a ativação de mecanismos de defesa, que embora limitem o espalhamento do vírus na hospedeira, desencadeiam um processo que no final é mais danoso para a planta, induzindo o amarelecimento e reduzindo o crescimento Abstract: Three varieties of sugarcane with different degrees of sensibility to infection by sugarcane yellow leaf virus (ScYLV) were studied. ScYLV belongs to the Luteovirus family. By definition they are confined to phloem tissue and one of the symptoms that can appear is the yellowing of the leaves. The more sensitive plants show the yellowing of the mid-rib on the abaxial face when infected by the ScYLV and red coloring on the same rib on the adaxial face at advanced stages. During larger environmental changes, especially temperature decreases, the symptoms may be considerably intensified. The virus infection also dimished plant growth. Epifluorescence microscopy analyses demonstrated that in some infected materials the accumulation of fluorescence material occurred inside the phloem, where the ScYLV was located. A comparative study of different varieties revealed that the fluorescent material appeared almost exclusively in leaves of the sensitive variety, SP 71-6163, showing symptoms of infection. Histochemicals testes using Neu¿s reagent indicated the fluorescent material present in the phloem to be rich in flavonóide, and probably insoluble. It is know that one of plant¿s defense mechanisms against pathogenic agents is the increase of peroxidases activities. Three different peroxidases were assayed: guaiacol peroxidase (GPX), syringaldazine peroxidase (SPX) and ascorbato peroxidase (APX). A significant increase in the SPX activity was found only in sensitive plants of the variety SP 81-3250, infected by ScYLV. The other peroxidase activities did not show significant variations in the varieties studied, probably because the plant infection was chronic. Tests to localize the SPX were made with syringaldazine as substrate and for the generic peroxidases with 4-chloro-naftol as substrate. Localization tests showed the existence of activities of SPX in the phloem, epidermis and subepidermis, in healthy and infected plants of the variety SP 81-3250. the same situation was observed in leaves of SP 71-6163 with and without symptoms. On the other hand, in the tolerant variety, SP 70-1143, the activity of SPX was low and sometimes null. The generic peroxidase activity was also localized in phloem tissue as well as in cells of the epidermis and subepidermis, but the activity was similar in all types of leaves analyzed healthy or infected with or without symptoms. It was possible to relate the quantity of virus to the probable defense mechanisms for the different varieties studied. Tolerant plants showed many infected vascular bundles, never presented fluorescent material in the phloem and possessed low activity of SPX. The most sensitive variety showed few infected vascular bundles, accumulation of fluorescent material ion the phloem of leaves with symptoms and high PX activity. This response probably represents the activation of defense mechanisms that limit the spread of the virus in the host. However, these mechanisms also trigger a process that is more harmful to the plant, inducing yellowing and growth reduction Mestrado Biologia Vegetal Mestre em Biologia Vegetal

Orientador: Jorge Vega Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A Síndrome do Amarelecimento Foliar da Cana-de-Açúcar é atualmente uma das principais preocupações da cultura canavieira no Brasil e em todos os países produtores desta gramínea. Em função da importância deste problema, muitos estudos foram realizados na tentativa de se descobrir o agente causal desta síndrome, originando controvérsias sobre a sua origem. A fim de se obter dados que contribuíssem para um melhor conhecimento do problema, foram estudados neste trabalho a caracterização do seu agente causal, as formas de transmissão do agente causador, seu círculo de hospedeiras e alguns aspectos do comportamento fisiológico das variedades infectadas. Os sintomas típicos da doença, que se iniciam com o amarelecimento da nervura, foram reproduzidos quando um vírus foi transmitido de plantas infectadas para plantas sadias de cana-de-açúcar, pelos afideos Melanaphis sacchari e Rhopalosiphum maidis, indicando ser este vírus o agente causador da doença. Das espécies de plantas testadas com estes afideos, apenas Saccharum sp. mostrou-se como hospedeira conhecida do vírus. Uma vez comprovada a etiologia viral desta doença, foi então identificado um luteovirus associado a esta síndrome e identificado como Vírus do Amarelecimento Foliar da Cana-de-Açúcar (Sugarcane Yellow Leal Virus - Sc YL V). Testes de transmissão mecânica do vírus foram negativos. As propriedades das partículas virais foram obtidas através da purificação do vírus, cuja metodologia também foi estudada neste trabalho. Após otimização do método de purificação, as partículas virais mostraram um diâmetro aproximado de 25 a 28 nm, quando observadas ao microscópio eletrônico e contrastadas com ácido fosfotúngstico, pH 5,0, apresentando uma densidade de 1,30 glcm3 em gradiente de CS2SO4, e um genoma de 5,8 kb (ssRNA). A proteína do capsídeo viral apresentou uma massa molecular relativa aproximada de 27 kDa e não era glicosilada. Anticorpos policlonais contra o Sc YL V foram produzidos em coelhos e detectaram eficientemente o vírus homólogo. Este mesmo anti-soro não detectou nenhum dos outros luteovirus utilizados, BYDV (Barley Yellow Dwarf Virus), PLRV (Potato Leafroll Virus), BWYV (Beet Western Yellows Virus) e BLRV (Bean Leafroll Virus), através dos testes serológicos de ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) e ISEM (ImmunoSorbent Electron Microscopy). Do mesmo modo, quando anti-soros preparados para estes luteovirus foram testados em plantas de cana-de-açúcar infectadas pelo Sc YL V, os resultados também foram negativos. No entanto, além de sua detecção pelo anti-soro homólogo nos testes de ELISA e ISEM, o Sc YL V também pôde ser detectado nos testes de Westem-blot utilizando-se de anti-soro preparado para o isolado RPV do BYDV, sugerindo um grau limitado de relação serológica entre estes luteovirus. Foi concluído então, que o ScYLV é um luteovirus biologicamente e serologicamente distinto dos outros membros do grupo já descritos. Utilizando-se do anticorpo policlonal aqui produzido, a técnica de DAS-ELISA pôde então ser padronizada e usada rotineiramente para diagnóstico, após a produção específica de conjugado homólogo para este Vírus. Em relação à manifestação dos sintomas induzidos pela doença, foi observado que a expressão destes varia de acordo com a variedade infectada e com fatores climáticos. Foi estabelecido então, uma classificação provisória das variedades estudadas, baseada na manifestação dos sintomas apresentados, sendo: a) susceptíveis ou sensíveis à infecção pelo vírus, exibindo os sintomas da doença, b) tolerantes à infecção, podendo ou não apresentar sintomas e c) resistentes à infecção. Esta última categoria se referiu a plantas nas quais não foram detectadas partículas virais e que não apresentaram os sintomas da doença. Dois métodos para detecção do vírus foram comparados, um serológico (DAS-ELISA) e outro molecular (RT-PCR), quando se observou que a especificidade e sensibilidade de ambos eram muito semelhantes. Em decorrência disto foi adotado então, o teste de DAS ELISA, por ser este o de maior simplicidade. A relação entre a concentração de partículas virais e a manifestação dos sintomas também foi avaliada, onde se verificou a inexistência de uma relação direta entre a primeira e a segunda. Um estudo complementar a este foi feito, para determinar a concentração de partículas virais em duas partes da folha, separando-se a nervura principal da lâmina foliar. O vírus foi detectado nestes tecidos através de DAS-ELISA, mostrando haver uma maior concentração na nervura, onde foram encontrados valores de absorbância até cinco vezes maiores, quando comparados com os valores de absorbância da lâmina foliar. Os teores de açúcares solúveis foram analisados e observou-se um acúmulo destes, em especial da sacarose, mas somente em folhas de plantas infectadas pelo vírus e que expressavam os sintomas da doença, sendo que em plantas sadias ou infectadas sem sintomas este acúmulo não ocorreu. Visando esclarecer em qual parte da folha ocorreu o acúmulo de açúcares, análises cromatográficas da lâmina foliar e da nervura principal também foram feitas, onde foi observado que o acúmulo ocorreu principalmente na nervura. Algumas alterações fisiológicas induzidas nas plantas pelo vírus, foram determinadas através da comparação da atividade enzimática de peroxidases, grupo de enzimas geralmente envolvido nas reações das plantas após a infecção por patógenos. Os resultados mostraram um claro aumento na atividade de peroxidases em plantas infectadas e exibindo os sintomas da doença, enquanto que as plantas sadias ou infectadas sem sintomas não diferiram entre si Abstract: A luteovirus was associated with the yellow leaf syndrome (YLS), a widespread disease of sugarcane (Saccharum sp.). The virus was named Sugarcane Yellow Leaf Virus (Sc YL V), and was identified in major sugarcane-producing areas of the world. Typical disease symptoms were reproduced when Sc YL V was transmitted by Melanaphis sacchari or Rhopalosiphum maidis from infected to healthy sugarcane, indicating that this virus is the causal agent of the YLS. The virus was only transmitted between sugarcane plants. Virions of SeYLV were 25 to 28 nm in diameter in sodium phosphotungstate at pH 5,0, had a buoyant density of 1,30 glcm3 in CS2SO4 and contained a 5,8 Kb genomic ssRNA. The capsid protein had an estimated relative molecular mass of 27 kDa and was not glycosylated. A polyclonal rabbit antiserum raised against Se YL V did not detect any of four other luteoviruses by enzyme-linked immunosorbent assay or immunosorbent electron microscopy, but in immunoblot assays, antibodies to the RPV serotype of Barley Yellow DwarfVirus detected the Sc YL V. It was conc1uded that Se YL V is a luteovirus that is biologically and serologically distinct from other members of the group and is the causal agent of the YLS of sugarcane. Levels of soluble sugars, especially sucrose, were significantly increased in the leaves of infected and symptomatic plants but never in symptomless infected ones. Two enzymes, guaiacol-peroxidase and syringaldazine-peroxidase had their activity significantly increased in plants infected by Se YL V and showing the disease symptoms. In contrast, no alterations in peroxidase activities were observed in healthy plants or in infected ones without symptoms Doutorado Doutor em Biologia Vegetal

Orientador: Jorge Vega Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A síndrome do amarelecimento foliar da cana-de-açúcar constitui hoje uma preocupação mundial para a produtividade da cultura. Contudo, controvérsias ainda são levantadas sobre a sua origem e principalmente sobre a natureza do agente causal da moléstia. Visando contribuir para o estabelecimento da etiologia da doença, o presente trabalho apresenta a purificação do luteovirus identificado em plantas com sintomas e a tentativa de produção de um anti-soro policlonal para o estabelecimento de um método seguro de diagnóstico. As alterações na fisiologia da planta provocadas pelo patógeno, refletindo ou não em sintomas visíveis, foram estudadas por monitoramento da eficiência fotossintética e dos conteúdos de pigmentos fotossintetizantes e carboidratos fotoassimilados. O método de purificação avaliado ofereceu uma boa eficiência, sendo obtidas razões A260/A280=1, 8 e concentrações de 100µg/ml de partículas virais de formato isométrico de ca. 25nm. Os anti-soros policlonais produzidos, porém, não foram úteis para detecção serológica do vírus, sendo constatada uma forte reação cruzada com plantas sadias em testes PTA-ELISA, DASI-ELISA e "Tissue-Blotting". Foram encontradas reduções nos teores de pigmentos fotossintetizantes e na razão Cla/Clb, indicando alterações na estrutura e função dos cloroplastos em plantas infectadas. Ocorreu diminuição da atividade fotossintética, em termos da taxa de troca líquida de CO2, principalmente sob altos níveis de radiação fotossinteticamente ativa. As plantas infectadas também apresentaram fotoinibição e alterações em algumas etapas do transporte eletrônico no PSII durante o preenchimento do "pool" de PQ. Houve acúmulo de açúcares nas folhas de plantas infectadas, provavelmente devido à presença do vírus nas células do floema foliar. O açúcar de maior acúmulo foi a sacarose, devido à interferência no seu carregamento e/ou transporte no floema. Essas alterações nas relações fonte dreno aliadas à queda na eficiência fotossintética foram interpretadas como os principais responsáveis pela quebra de produção da cultura Abstract: PARTIAL CHARACTERIZATION OF SUGARCANE LEAF YELLOWING ASSOCIATED LUTEOVIRUS AND PHYSIOPATHOLOGICAL ASPECTS OF THE HOST PLANT. The sugarcane yeIIow Ieaf disease has become a serlous problem in most sugarcane growing countries. In recent studies, Iuteovirus-like particIes present in the phIoem companion cells have been found in symptomatic paints (VEGA et al., 1997). This work was intended to obtain adequate amounts of purified particIes to immunize animaIs against the virus, aIong with additional studies for its characterization. Polyclonal antisera were obtained by injecting rabbits and chickens with purified virus. Physiological aspects of the infected plants were also studied by monitoring photosynthetic processes using chIorophyll fIuorescence and gas exchange analysis, changes in photosynthetic pigment levels and carbohydrate determinations in the Ieaves. The best purifications were obtained using a final centrifugation for 3 hours at 35000 rpm in density gradients of 5 and 10% sucrose, 5,10,15 and 20% CS2SO4 in a 10% sucrose solution. Concentration of particles were around 100µg/ml and the 260/280 ratio of 1,8. Absorbance spectra at UV, after fractionating, presented curves characteristic of polyhedral particles with peaks at 260nm. Electron microscopy of fractions with higher A260 showed a great number of isometric isometric particles of ca. 25nm. Antisera obtained did not offer a good tool for diagnosis, since cross-reaction against healthy plants were frequently found in PTA-ELISA, DASI-ELISA and Tissue-Blotting. Levels of chlorophylls a and b, and carotenoids were reduced in infected plants as well as the ratio chla/chlb. It seems likely that these alterations are partially responsible for the reductions found in net rates of gas exchanges, by the photoinhibition and modifications on redox state of primary and secondary electron acceptors of photosystem II, QA and QB, during the filling up of the plastoquinone pool , (PQ) . Accumulations of carbohydrates, especially sucrose, were found in the leaves. The presence of the virus in phloem cells is thought to impair the loading and/or transport of sugars in the phloem, inducing their accumulations in the leaves Mestrado Mestre em Ciências Biológicas