Search

Introduction: Homocysteine (Hcy) tissue accumulation occurs in a metabolic disease characterized biochemically by cystathionine β-synthase (CBS) deficiency and clinically by mental retardation, vascular problems, and skeletal abnormalities. Previous studies indicate the occurrence of DNA damage secondary to hyperhomocysteinemia and it was observed that DNA damage occurs in leukocytes from CBS-deficient patients. This study aimed to investigate whether an oxidative mechanism could be involved in DNA damage previously found and investigated the in vitro effect of N-acety-L-cysteine (NAC) on DNA damage caused by high Hcy levels. Methods: We evaluated a biomarker of oxidative DNA damage in the urine of CBS‑deficient patients, as well as the in vitro effect of NAC on DNA damage caused by high levels of Hcy. Moreover, a biomarker of lipid oxidative damage was also measured in urine of CBS deficient patients. Results: There was an increase in parameters of DNA (8-oxo-7,8-dihydro-2’- deoxyguanosine) and lipid (15-F2t-isoprostanes levels) oxidative damage in CBS-deficient patients when compared to controls. In addition, a significant positive correlation was found between 15-F2t-isoprostanes levels and total Hcy concentrations. Besides, an in vitro protective effect of NAC at concentrations of 1 and 5 mM was observed on DNA damage caused by Hcy 50 μM and 200 μM. Additionally, we showed a decrease in sulfhydryl content in plasma from CBS-deficient patients when compared to controls. Discussion: These results demonstrated that DNA damage occurs by an oxidative mechanism in CBS deficiency together with lipid oxidative damage, highlighting the NAC beneficial action upon DNA oxidative process, contributing with a new treatment perspective of the patients affected by classic homocystinuria.

A homocistinúria é um erro inato do metabolismo dos aminoácidos causado principalmente pela deficiência na atividade da enzima cistationina-β-sintase (CBS), resultando em acúmulo de homocisteína (Hcy) e metionina nos fluidos biológicos. As manifestações clínicas incluem retardo mental, ectopia lentis, episódios tromboembólicos e osteoporose. Estudos realizados em modelos animais demonstram um possível papel do estresse oxidativo na fisiopatologia da homocistinúria. Mais recentemente, foram demonstradas alterações em alguns parâmetros de estresse oxidativo em pacientes homocistinúricos. Nesse trabalho, essas investigações foram ampliadas, no intuito de melhor entender os mecanismos fisiopatológicos e a terapêutica da homocistinúria por deficiência de CBS. Dessa forma, o objetivo principal desse trabalho foi avaliar os perfis lipídico, inflamatório e oxidativo, bem como a atividade das enzimas paraoxonase (PON1) e butirilcolinesterase (BuChE) em pacientes homocistinúricos tratados (dieta hipoproteica suplementada com vitamina B6, ácido fólico, betaína e vitamina B12) e não tratados, em comparação com indivíduos saudáveis, e adicionalmente avaliar a indução in vitro de mutagenicidade causada pela Hcy, através do teste de micronúcleos em leucócitos, e ainda avaliar o efeito in vitro do antioxidante N-acetil-L-cisteína na redução do dano ao DNA causado pelas altas concentrações de Hcy. No que se refere ao perfil sérico, foi verificada uma redução nos níveis de colesterol HDL, apolipoproteína A, bem como na atividade da enzima (PON1) em pacientes homocistinúricos tratados e não tratados. A atividade da enzima BuChE e os níveis de interleucina 6 (IL-6) estavam aumentados apenas nos pacientes não tratados. Correlações significativas positivas foram encontradas nos dois grupos de pacientes estudados entre a atividade da PON1 e o conteúdo de sulfidrilas; entre a atividade da PON1 e os níveis de vitamina B12; entre os níveis de HDL e apolipoproteína A1; entre os níveis de apolipoproteína A1 e vitamina B12; e entre os níveis de IL-6 e os níveis de carbonilas. Correlação significativa negativa foi encontrada entre os níveis de ácido fólico e de homocisteína total (tHcy). Em um segundo momento foram avaliados parâmetros de estresse oxidativo e níveis de nitritos na urina dos pacientes. Foram demonstrados níveis aumentados de 15-F2t-isoprostanos, di-tirosina e nitritos na urina de pacientes homocistinúricos tratados. Os níveis de 15-F2t-isoprostanos apresentaram uma correlação significativa positiva com os níveis de tHcy e os níveis de di-tirosina apresentaram correlação significativa negativa com os níveis de sulfidrilas. A atividade da enzima catalase encontrou-se aumentada no sangue de pacientes homocistinúricos tratados. Finalmente, demonstrou-se em estudo in vitro que a Hcy causa um aumento no dano cromossômico, avaliado pelo método de micronúcleos. Além disso, foi observado um efeito in vitro do antioxidante N-acetil-L-cisteína na redução do dano ao DNA causado pelas altas concentrações de Hcy. Avaliados em conjunto, nossos resultados indicam que o estresse oxidativo, acompanhado por alterações nos níveis urinários de nitritos, e por alterações nos perfis inflamatório e lipídico são fatores que possivelmente contribuam para o dano vascular encontrado na homocistinúria. Esses eventos parecem estar interconectados, e parecem ser decorrentes dos altos níveis de tHcy encontrados no sangue dos pacientes. Novas abordagens terapêuticas, além das atualmente utilizadas que incluem ácido fólico e vitamina B12, como o uso de antioxidantes, poderiam ser alternativas para atingir melhores resultados no tratamento de pacientes homocistinúricos. Homocystinuria is an inborn error of metabolism of amino acids primarily caused by deficiency in the activity of cystathionine-β-synthase (CBS), resulting in accumulation of homocysteine (Hcy) and methionine in biological fluids. Clinical manifestations include mental retardation, ectopia lentis, thromboembolic events and osteoporosis. Studies in animal models show a possible role of oxidative stress in the pathophysiology of homocystinuria. More recently, changes in some parameters of oxidative stress have been demonstrated in homocistinuric patients. In this work, we expanded these investigations, in order to understand the mechanisms that lead to the development of clinical manifestations of disease and the therapeutic for homocystinuria due CBS deficiency. Thus, the main objective of this study was to evaluate the lipid, inflammatory and oxidative profiles as well as the activity of paraoxonase (PON1) and butyrylcholinesterase (BuChE) in treated homocistinuric patients (hypoproteic diet supplemented with vitamin B6, folic acid, betaine and vitamin B12) and untreated patients compared with healthy individuals, and to evaluate the in vitro induction of mutagenicity caused by Hcy, through the micronucleus test in leukocytes, and further, to evaluate the in vitro effect of N-acetyl-L-cysteine in reducing DNA damage caused by high concentrations of Hcy. With regard to the serum profile, was observed a reduction in HDL cholesterol, apolipoprotein A, and in enzyme activity (PON1) in both group of CBS-deficient patients. The activity of butyrylcholinesterase and levels of interleukin 6 (IL-6) were increased only in untreated patients. Positive significant correlations were found in both patients groups between PON1 activity and the content of sulfhydryl; between PON1 activity and vitamin B12 levels; between the levels of HDL and apolipoprotein A1; between the levels of apolipoprotein A1 and B12; and between IL-6 levels and levels of carbonyls. Negative significant correlation was found between folic acid levels and total homocysteine (tHcy). In a second moment were evaluated parameters of oxidative stress and the nitrite levels in the urine of patients. Increased levels of 15-F2t-isoprostanes, di-tyrosine and nitrite were demonstrated in the urine of treated homocistinuric patients. The 15-F2t-isoprostanes levels showed a significant positive correlation with tHcy levels; and di-tyrosine levels showed a significant negative correlation with the sulfhydryl levels. The catalase activity was found increased in the blood of treated homocistinuric patients. Finally, it was shown the in vitro effect of Hcy on increase of chromosomal damage assessed by micronuclei method. Furthermore, it was observed the in vitro effect of N-acetyl-L-cysteine antioxidant in reducing DNA damage caused by high concentrations of Hcy. Evaluated together, our results indicate that oxidative stress accompanied by changes in urinary nitrite levels and changes in inflammatory and lipid profiles are factors possibly contributing to vascular damage found in homocystinuria. These events appear to be interconnected, and appear to be due to the high tHcy levels found in the blood of patients. New therapeutic approaches in addition to the currently used which include folic acid and vitamin B12, as the use of antioxidants, could be alternatives to achieve best results in the treatment of homocistinuric patients. Furthermore, an early diagnosis and, consequently, an early treatment, could avoid that the patients remain for a long time subjected to exposure of high concentrations of tHcy.

A homocistinúria é um erro inato do metabolismo dos aminoácidos causado na maioria dos casos pela deficiência na atividade da enzima cistationina-β-sintase. Como resultado da deficiência enzimática, ocorre acúmulo de homocisteína (Hcy) e metionina nos fluidos biológicos, o que leva a uma variedade de manifestações clínicas, envolvendo muitos órgãos e tecidos, mas principalmente os olhos, os ossos, o sistema cardiovascular e o sistema nervoso central. Como demonstrado por estudos em pacientes e em modelos animais, o estresse oxidativo pode estar envolvido na fisiopatologia de vários erros inatos do metabolismo. Essa condição pode ser causada por uma produção aumentada de espécies reativas, por uma falha nas defesas antioxidantes ou por ambos. Como consequência, o dano oxidativo às biomoléculas é gerado. Estudos em modelos animais demonstram que há uma relação entre Hcy e estresse oxidativo, mas poucos estudos existem avaliando o estresse oxidativo em pacientes portadores de homocistinúria. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar importantes parâmetros de estresse oxidativo em pacientes homocistinúricos no momento do diagnóstico, em pacientes homocistinúricos em tratamento e em indivíduos saudáveis. Nós verificamos um aumento significativo nos níveis de grupamentos carbonilas e nos níveis de malondialdeído, bem como uma diminuição significativa de grupamentos sulfidrilas e do status antioxidante total no plasma de pacientes homocistinúricos no momento do diagnóstico, em relação aos controles. Pacientes em tratamento apresentaram uma redução significativa do conteúdo de malondialdeído e das concentrações de Hcy e metionina em relação ao grupo diagnóstico. Além disso, foi demonstrada uma correlação significativa negativa entre os níveis de grupamentos sulfidrilas e as concentrações de Hcy e uma correlação significativa positiva entre os níveis de malondialdeído e as concentrações de Hcy. Posteriormente, foram verificados níveis aumentados de dano ao DNA em pacientes homocistinúricos tratados em relação aos controles. Adicionalmente, foi demonstrado pelo estudo in vitro, um efeito concentração dependente da Hcy sobre o dano ao DNA. Avaliados em conjunto, nossos resultados indicam que o estresse oxidativo pode exercer um papel importante na fisiopatologia da homocistinúria e que isso ocorre provavelmente devido às altas concentrações de Hcy encontradas nesses pacientes. Novas abordagens terapêuticas, como o uso de antioxidantes, poderia ser uma alternativa para atingir melhores resultados no tratamento de pacientes homocistinúricos. Além disso, um diagnóstico precoce e, consequentemente, um tratamento precoce, poderia evitar que os pacientes permanecessem por longo tempo submetidos à exposição de altas concentrações de Hcy. Homocystinuria is an inherited error of metabolism of amino acids caused in most cases by deficiency of cystathionine β-synthase. As result of enzymatic deficiency, occur accumulation of homocysteine (Hcy) and methionine in biological fluids, which leads to a variety of clinical manifestations, involving many organs and tissues, but mainly the eyes, the bones, the cardiovascular system and the central nervous system. As demonstrated by studies involving patients and animal models, the oxidative stress may be involved in pathophysiology of various inherited errors of metabolism. This condition may be caused by an increased production of reactive species, by a fail in antioxidant defense, or both. Consequently, the oxidative damage to biomolecules is generated. Studies in animal models have been shown a relationship between Hcy and oxidative stress, but scarce studies exist evaluating the oxidative stress in homocystinuric patients. Therefore, the aim of this study was to evaluate important parameters of oxidative stress in homocystinuric patients at diagnosis, in homocystinuric patients under treatment and in healthy individuals. We found a significant increase of carbonyl groups and malondialdehyde levels, as well as a reduction of sulfhydryl groups and total antioxidant status in plasma of homocystinuric patients at diagnosis relative to controls. Patients under treatment presented a significant reduction of the content of malondialdehyde, Hcy and methionine concentrations relative to patients at diagnosis. Furthermore, it was demonstrated a significant negative correlation between sulfhydryl group content and Hcy levels and a significant positive correlation between malondialdehyde and Hcy levels. It was demonstrated also increased levels of DNA damage in homocystinuric patients under treatment relative to controls. Additionally, it was verified by in vitro study, a concentration-dependent effect of Hcy on the DNA damage. Taken together, our date indicate that the oxidative stress may play a important role in pathophysiology of homocystinuria, probably due to high Hcy concentrations found in these patients. New therapeutic approaches, as the use of antioxidants, could be an alternative in order to improve the results of therapy in homocystinuric patients. Furthermore, an early diagnosis and, consequently, an early treatment, could avoid that the patients remain for a long time subjected to exposure of high concentrations of Hcy.