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Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2018. Os principais receptores ? opioides (?ORs) já descritos (?1ORs e ?2ORs) são expressos em regiões cerebrais envolvidas no processamento de memórias aversivas, incluindo o hipocampo dorsal (HD). No entanto, o papel dos HD?ORs na consolidação e reconsolidação de memórias aversivas, com intensidades e especificidades variadas, ainda não está claro. Assim, o presente estudo teve como objetivo investigar essa questão utilizando agentes farmacológicos em ratos submetidos a um protocolo de condicionamento aversivo contextual (CAC) fraco, moderado ou forte. A hipótese desse trabalho foi de que o antagonista dos HD?ORs potencializa a consolidação e a reconsolidação de memórias aversivas contextuais mais intensas e generalizadas em ratos, ao passo que o agonista dos ?ORs exerce um papel oposto sobre essas mesmas etapas, sendo a intensidade da experiência associativa aversiva crítica para o envolvimento desses receptores. Em relação à consolidação da memória, o antagonismo de HD?ORs com a nor-binaltorfimina (nor-BNI) imediatamente após um CAC moderado, mas não 6 h após, aumentou a expressão do comportamento de congelamento durante a reexposição ao contexto pareado, o que indica que a ativação dos HD?ORs tem um papel inibitório na consolidação de uma memória aversiva. Um aumento da imunomarcação dos HD?ORs foi observado 1 h e 3 h após o CAC moderado. Essa suprarregulação estava ausente em animais que foram apenas expostos ao contexto ou apenas ao choque, indicando que esse fenômeno requer um pareamento choque-contexto para ocorrer. A microinfusão de nor-BNI também aumentou os níveis de BDNF no HD 90 min após o CAC moderado, sugerindo uma possível via pela qual o antagonismo dos HD?ORs levou à potencialização da consolidação da memória. Além disso, a nor-BNI não induziu alterações sobre o comportamento de congelamento no protocolo de CAC fraco, mas foi capaz de aumentar a expressão do comportamento de congelamento em um contexto novo e não pareado após um CAC forte, indicando que os HD?ORs também modulam a consolidação de uma memória mais intensa e generalizada. Por outro lado, a microinfusão intra-HD do agonista dos ?2ORs, o GR 89696, mas não do agonista dos ?1ORs (U-69593), reduziu a expressão de congelamento no contexto pareado no protocolo de CAC forte. Este efeito parece estar relacionado aos menores níveis de BDNF encontrados no HD 90 min após a microinfusão intra-HD de GR 89696. O pré-tratamento com uma dose subefetiva de nor-BNI preveniu os efeitos do GR 89696 sobre a expressão do comportamento de congelamento. Em relação à reconsolidação da memória, a microinfusão intra-HD de nor-BNI (antagonista ?OR) imediatamente após a reativação da memória, mas não 6 h após, foi capaz de aumentar a expressão de congelamento no contexto novo e não pareado no protocolo de CAC forte, indicando que os HD?ORs também modulam a reconsolidação dessa memória. Nenhum efeito foi observado quando a nor-BNI foi administrada no protocolo de CAC moderado. Além disso, a microinfusão intra-HD de GR 89696 (agonista ?2OR) imediatamente após a reativação da memória, mas não 6 h após, reduziu a expressão de congelamento no contexto pareado no protocolo de CAC forte. Adicionalmente, o comportamento de congelamento não foi reinstalado no grupo GR 89696 após um choque lembrete, indicando que a ativação dos HD?2ORs prejudicou a reconsolidação da memória aversiva. Por outro lado, o efeito do GR 89696 foi prevenido pelo pré-tratamento com uma dose subefetiva de nor-BNI. Em conjunto, as evidências experimentais supracitadas indicam que os HD?ORs regulam negativamente a consolidação e a reconsolidação de memórias aversivas contextuais em ratos com intensidade e especificidade variadas. Abstract : The main ? opioid receptors (?ORs) already described (?1ORs and ?2ORs) are expressed in brain regions involved in aversive memory processing, including the dorsal hippocampus (DH). However, the role of DH ?ORs in the consolidation and reconsolidation of aversive memories with varied intensity and specificity is still uncertain. The present study aimed to investigate this question using pharmacological agents in rats subjected to weak, moderate or strong contextual aversive conditioning (CAC) protocol. The hypothesis of this work was that DH ?ORs antagonist potentiates the consolidation and reconsolidation of more intense and generalized contextual aversive memories in rats, whereas that DH ?ORs agonist plays an opposite role on these same memory stages, being the degree of intensity of the aversive associative experience critical for the involvement of these receptors. In memory consolidation investigation, antagonism DH ?ORs with nor-binaltorphimine (nor-BNI), immediately after, but not 6 h later, a moderate CAC increased freezing behavior expression during the reexposure to the paired context, indicating that DH ?ORs activation have an inhibitory role in the consolidation of an aversive memory. Increased DH ?ORs immunoblotting content was observed 1 h and 3 h after the moderate CAC. This up-regulation was absent in animals only exposed to the context or to the shock, indicating that this phenomenon requires a shock-context pairing to occur. Nor-binaltorphimine infusion also increased BDNF levels in DH 90 min after CAC moderate, suggesting a possible pathway by which DH ?OR antagonism led to the potentialization of memory consolidation. Moreover, nor-BNI induced no changes in freezing behavior following a weak CAC, but it was able to increase the expression of freezing in novel and unpaired context after a strong CAC, indicating that DH ?ORs also modulate the consolidation of a more intense and generalized memory. On the other hand, infusing the ?2ORs agonist GR 89696, but not the ?1ORs agonist U-69593, into the DH reduced the conditioned freezing expression in the strong CAC protocol. This effect seems to be related to the lower levels of BDNF founded in DH 90 min after intra-DH GR 89696 infusion. Nor-binaltorphimine pretreatment in a sub-effective dose prevented the GR 89696 effects on freezing behavior expression. In memory reconsolidation investigation, intra-DH nor-BNI (?OR antagonist) infusion immediately after, but not 6 h later, memory reactivation was able to increase the expression of freezing behavior in novel and unpaired context in the strong CAC protocol, indicating that DH ?ORs also modulate the reconsolidation of this memory. No effect was observed when nor-BNI was administered in moderate CAC protocol. Moreover, infusing the GR 89696 (?2OR agonist) into the DH immediately after, but not 6 h later, memory reactivation reduced the conditioned freezing expression in the strong CAC protocol. In addition, freezing behavior did not show reinstatement in the GR 89696 group after a reminder shock, indicating that DH ?2ORs activation impaired the reconsolidation of the aversive memory. On the other hand, GR 89696 effect was prevented by pretreatment with a sub-effective dose of nor-BNI. Altogether, the above experimental evidence indicates that DH ?ORs negatively regulate the consolidation and reconsolidation of contextual aversive memories in rats with varied intensity and specificity.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2014. A dor clínica possui um caráter multidimensional, mas a sua dimensão afetiva é pouco explorada nos testes de nocicepção. Sendo assim, o presente trabalho objetivou comparar os modelos de nocicepção persistente cutânea e articular, através da observação comportamental e da manipulação farmacológica (morfina, midazolam e pentilenotetrazol), buscando um modelo mais preditivo para o desenvolvimento de fármacos analgésicos. Para tanto, foram utilizados ratos Wistar machos (250-300 g), submetidos à administração intraplantar ou intra-articular de formalina 2%. Foram mensurados comportamentos nocifensivos e demais comportamentos habituais afetados pela nocicepção ? o interesse pelo ambiente, evidenciado pela exploração vertical, e o interesse por si próprio, evidenciado pela autolimpeza. Um perfil distinto de respostas nocifensivas foi observado nos dois modelos. O lamber/morder de pata foi o comportamento induzido pela formalina intraplantar que demonstrou maior semelhança temporal com o levantar sustentado do membro, induzido pela formalina intra-articular. A formalina intraplantar suscitou comportamento proativo, enquanto a formalina intra-articular produziu comportamento passivo. Ainda, a formalina intra-articular promoveu maior redução da exploração vertical, enquanto que ambos os estímulos atenuaram a expressão da autolimpeza de maneira semelhante. A morfina (1,0 e 4,0 mg/kg) reduziu a expressão dos comportamentos de lamber/morder a pata (modelo intraplantar) e levantar sustentado de membro (modelo intra-articular) em ambas as fases do teste da formalina. Além disso, a morfina reduziu a exploração vertical nos animais do modelo intraplantar (0,4, 1,0 e 4,0 mg/kg) e intra-articular (4,0 mg/kg), além da autolimpeza nos animais de ambos os modelos (4,0 mg/kg). O midazolam (0,5 mg/kg) e pentilenotetrazol (15 mg/kg) atenuaram somente a resposta nocifensiva de lamber/morder a pata, enquanto que a autolimpeza e a exploração vertical foram atenuadas, respectivamente, apenas no modelo intraplantar. Assim, este estudo sugere que a formalina intra-articular pode se correlacionar melhor com a dor clínica em humanos, por induzir comportamento mais relacionado à depressão e, portanto, poderia ser uma plataforma mais preditiva para o desenvolvimento de fármacos analgésicos. Sugerimos que a restauração dos comportamentos normais de atenção ao ambiente e consigo próprio seriam propriedades desejáveis em um analgésico, porém, nenhum fármaco utilizado aqui restaurou estes comportamentos. Curiosamente, o analgésico padrão ? morfina ? acentuou o efeito depressivo da nocicepção sobre estes comportamentos. Abstract : Clinical pain has a multidimensional character, but its affective dimension of pain is underexplored in nociceptive tests. Therefore, this study aimed to refine the models of persistent cutaneous and articular nociception through behavioral and pharmacological (morphine, midazolam and pentylenetetrazole) approaches seeking a more predictive model for the development of analgesic drugs. For this purpose, male Wistar rats (250-300 g) were subjected to administration of formalin 2% in to the hindpaw or knee-joint. Subsequently, nocifensive behaviors, as well as ordinary behaviors affected by nociception  the attention to the environment, as evidenced by the rearing, and the attention to itself, as evidenced by the grooming. A distinct profile of nocifensive responses was observed in the two models. The licking/biting behavior induced by formalin in the hindpaw showed temporal similarity to the lifting of hindlimb induced by formalin in the knee-joint. Further, animal undergoing paw injection of formalin exhibited a proactive coping behavior, while the ones receiving knee-jointinjection showed a passive coping behavior. The knee-joint formalin administration determined a greater reduction of rearing, while both kinds of stimuli reduced similarly the grooming expression. The administration of morphine (1.0 and 4.0 mg/kg) reduced both the expression of licking/biting paw (hindpaw model) and sustained lifting of hindlimb behaviors (knee-joint model) in both phases of the formalin test. Furthermore, the morphine reduced the rearing differently between animals of the hindpaw (0.4, 1.0 and 4.0 mg/kg) and knee-joint models (4.0 mg/kg) besides reducing the grooming similarly in animals of both models (4.0 mg/kg). Both, midazolam (0.5 mg/kg) and pentylenetetrazole (15 mg/kg), attenuated the licking/biting behavior, but each reduced grooming and rearing, respectively, in hindpaw model only. Thus, these results suggest that knee-joint model may be a better correlate to the human pain and could be a more predictive model for the development of analgesic drugs. We also suggest that the restoration of normal attentional behaviors either to the environment or to itself, are desirable properties for a painkiller, however, no drug used herein restored these behaviors. Interestingly, the standard analgesic morphine accentuated the depressive effect of nociception on these behaviors.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2021. Duas importantes linhas de pesquisa da atualidade dedicam-se ao estudo do papel dos opioides nos transtornos de estresse e nas memórias aversivas. Dados da literatura têm demonstrado que a resposta ao estresse envolve a ativação do sistema opioide em regiões cerebrais associadas à regulação do estresse e ao processamento da memória aversiva. No entanto, o papel do sistema opioide na consolidação de memórias aversivas ainda não está claro. Além disso, os dados obtidos da literatura são baseados quase que exclusivamente no uso de animais machos. A hipótese deste trabalho é que a administração intraperitoneal de um agonista opioide, prejudica a consolidação de uma memória aversiva contextual em ratas. Assim, o presente estudo teve como objetivo investigar essas questões utilizando a morfina (agonista opioide) e a naltrexona (antagonista opioide) em ratas submetidas a um protocolo de condicionamento aversivo contextual (CAC). Nossos resultados mostraram que a administração sistêmica de morfina 1,0 mg/kg, imediatamente após a sessão de condicionamento forte, mas não 6 h após, reduz a expressão da resposta de congelamento, sugerindo que a ativação de receptores opioides prejudica a consolidação da memória. O efeito da morfina foi prevenido pela administração prévia de uma dose sub-efetiva de naltrexona (10 mg/kg). A administração isolada de naltrexona nas doses de 1,0 e 5,0 mg/kg, imediatamente após a sessão de condicionamento fraco, foi capaz de atenuar a resposta de congelamento, indicando que a naltrexona foi capaz de prejudicar a consolidação da memória. Em conjunto, as evidências experimentais desse trabalho indicam que os receptores opioides regulam a consolidação de memórias aversivas contextuais em ratas com intensidade e especificidade variadas. Abstract: Two important fields of current research are dedicated to the study of the role of opioids in stress disorders and aversive memories. Literature data have shown that the stress response involves the activation of the opioid system in brain regions associated with stress reduction and aversive memory processing. However, the role of the opioid system in consolidating aversive memories remains unclear. Furthermore, data obtained from the literature are based almost exclusively on the use of male animals. The working hypothesis is that the intraperitoneal administration of an agonist opioid impairs the consolidation of aversive contextual memory in female rats. Thus, the present study aimed to investigate these issues using morphine (agonist opioid) and naltrexone (antagonist opioid) in female rats submitted to contextual aversive conditioning (CAC) protocol. Our results showed that systemic administration of 1.0 mg/kg morphine immediately after a strong conditioning session, but not 6 h later, reduces the expression of the freezing response, suggesting that activation of opioid receptors impairs memory consolidation. The effect of morphine was prevented by prior administration of a sub-effective dose of naltrexone (10 mg/kg). The isolated administration of naltrexone at doses of 1.0 and 5.0 mg/kg, immediately after a session of weak conditioning, was able to attenuate the freezing response, indicating that naltrexone was able to impair memory consolidation. Taken together, the experimental evidence from this work indicates that opioid receptors regulate the consolidation of contextual aversive memories in female rats with varying intensity and specificity.