Search

Over the years, anthropogenic factors have led to cadmium (Cd) accumulation in the environment causing various health problems in humans. Although Cd is not a Fenton-like metal, it induces oxidative stress in various animal models via indirect mechanisms. The degree of Cd-induced oxidative stress depends on the dose, duration and frequency of Cd exposure. Also the presence or absence of serum in experimental conditions, type of cells and their antioxidant capacity, as well as the speciation of Cd are important determinants. At the cellular level, the Cd-induced oxidative stress either leads to oxidative damage or activates signal transduction pathways to initiate defence responses. This balance is important on how different organ systems respond to Cd stress and ultimately define the pathological outcome. In this review, we highlight the Cd-induced oxidant/antioxidant status as well as the damage versus signalling scenario in relation to Cd toxicity. Emphasis is addressed to Cd-induced pathologies of major target organs, including a section on cell proliferation and carcinogenesis. Furthermore, attention is paid to Cd-induced oxidative stress in undifferentiated stem cells, which can provide information for future therapies in preventing Cd-induced pathologies. The authors apologize to any researcher whose work is not cited here due to limitations of space and scope. This work was supported by Hasselt University [BOF (Bijzonder onderzoeksfonds) projects; BOF08G01] through PhD grants for Ambily Ravindran Nair and Olivier DeGheselle. Additional funding came from tUL-impulsfinanciering (project toxicology), and Methusalem project (08M03VGRJ).

The aim of this thesis was to contribute to the next step in the implementation of these new biomarkers for AKI. In chapter 2 and chapter 3, we focused on the determination of the most ideal collection and storage conditions prior to the biomarker measurements. In chapter 4 the goal was to establish reference values for these novel biomarkers for healthy subjects with special attention for age and gender. In the following chapters we investigated the utility of these biomarkers in different clinical settings. Chapter 5 was attributed to the research we conducted on the association between KIM-1 and urinary cadmium concentrations. Finally, in chapter 6 we investigated a panel of novel biomarkers in an attempt to detect AKI after cardiac surgery requiring a cardiopulmonary bypass. Momenteel is het vroegtijdig opsporen van acuut en chronisch nierfalen gebaseerd op de stijging van de creatinine concentratie in het serum in combinatie met een daling in urine volume. Deze detectiemethode heeft het nadeel dat de vermelde veranderingen pas enkele uren tot dagen na het eigenlijk ontstaan van het nierprobleem waargenomen kunnen worden. Er is dan ook nood aan nieuwe, snellere detectiemethoden of biomerkers. Via proteomische onderzoeksmethoden werden een aantal eiwitten in het bloed en de urine ontdekt, die mogelijkerwijze als biomerker voor nierschade kunnen dienen. Deze eiwitten blijken in experimenten bij dieren en mensen immers verhoogd tot expressie te komen in geval van nierschade. Deze nieuwe biomerkers dienen echter gevalideerd te worden: er moet nagegaan worden op welke wijze ze het best gemeten worden, wat normale waarden zijn bij gezonde mensen en bij welke pathologieën en in welke patiëntengroepen ze verhoogd zijn. In deze doctoraatsthesis hebben we ons gericht op het validatieproces van enkele nieuwe biomerkers voor nierschade, nl. KIM-1, NGAL, NAG en Cystatine C. We hebben vooreerst aangetoond dat KIM-1, gemeten in de urine, niet afhankelijk is van de pH van de urine, maar de commerciële kit die gebruikt wordt voor de meting wel. Het is dan ook van belang om urinestalen voor de meting van KIM-1 op een pH rond 7 te brengen (hoofdstuk 2). Enkele andere verzamel- en opslagspecificaties voor de urinestalen waarin de biomerkers gemeten worden (zoals het toevoegen van protease inhibitoren, centrifugatie, maximale duur voor invriezen en de invriestemperatuur en –periode) zijn vervolgens onder de loep genomen, en richtlijnen hieromtrent zijn uitgewerkt (hoofdstuk 3). In het volgende deel van ons onderzoeksproject, hebben we urinestalen van verondersteld gezonde proefpersonen van alle leeftijden verzameld om zo referentiewaarden voor KIM-1, NGAL, Cystatine C en NAG op te stellen (hoofdstuk 4). Uit dierproeven van andere onderzoeksgroepen werd een positieve associatie afgeleid tussen de blootstelling aan het zware metaal cadmium, waarvan geweten is dat het schadelijke effecten heeft op de nier enerzijds en verhoogde KIM-1 concentraties in de urine anderzijds. We onderzochten een proefgroep van oudere personen die wonen in de omgeving van een industrieterrein met gekende verhoogde cadmiumwaarden in de bodem en de lucht en dus gedurende een lange periode blootgesteld zijn aan cadmium. Eenzelfde associatie werd aangetoond tussen cadmium en KIM-1 in de urine van deze proefpersonen (hoofdstuk 5). In het laatste deel van dit doctoraat werd onderzocht of de nieuwe biomerkers een rol kunnen spelen in de vroege detectie van acuut nierfalen, na het ondergaan van cardiale chirurgie waarbij extracorporele circulatie noodzakelijk is. Hierbij werden de concentraties van de urinaire biomerkers voor en op verschillende tijdstippen na de operatie vergeleken tussen volwassen patiënten die acuut nierfalen hadden ontwikkeld of niet. Voor elke gemeten biomerker (urinair KIM-1, NGAL, cystatine C en serum cystatine C) kon een associatie met acuut nierfalen gevonden worden op tenminste één tijdstip. Alleen serum Cystatine C bleek echter een voorspellende meerwaarde te hebben bovenop een klinisch model, dat werd samengesteld uit klinische parameters die momenteel reeds gebruikt worden in de detectie van AKI in het ziekenhuis (hoofdstuk 6).

Cadmium (Cd) indirectly induces reactive oxygen species (ROS) by (1) a displacement of redox-active metals, (2) depletion of redox scavengers, (3) inhibition of anti-oxidant enzymes and (4) inhibition of the electron transport chain. This ultimately results in mitochondrial damage leading to loss of function or cell death in multiple organs. A disturbance of the redox balance by Cd at the cellular level has been studied repeatedly in different experimental set-ups including differentiated cells at the whole animal level (including humans), tissue level, primary cell cultures and/or cell lines as well as non-differentiated cells. However the outcome of these results as to where the oxidative balance gets compromised at the cellular level and leads to pathologies at the level of the organ depends on a multitude of experimental and environmental conditions. It is important to keep in mind that the comparison of results from different experiments should be done with caution as many studies use high concentrations of Cd that might cause an effect in cell lines, but are irrelevant in terms of environmentally realistic exposures in animals. Several parameters that are inherently connected to the experimental set-up such as the route of Cd administration, the speciation of Cd applied and different cell types to be studied all determine the final outcome of Cd toxicity. In my study, research on kidney cell lines for example, results in direct exposure of Cd on these cells, while an oral or sub-cutaneous administration of Cd to rats in vivo results in Cd absorption by blood and other organs before it reaches the kidney resulting in changes of initial Cd speciation and concentration applied. Nevertheless, in terms of translational toxicology, it is highly interesting to compare the effects of Cd exposure levels in vitro to those in vivo, when Cd concentrations are determined for both experimental set-ups in a comparable manner. Cadmium has a half-life of 15-30 years in the kidney, and considerable damage is mostly confined to the apical domain of the proximal tubular cells (PTCs). These cells possess large amounts of mitochondria, an important source of ROS, but also a highly sensitive organelle to increased ROS levels. As such, mitochondrial alterations are involved in both damaging as well as adaptation responses. This makes the WKPT-0293 cell line derived from the S1 segment of PTCs of the rat a good model to study Cd toxicity, as they also possess transporters and receptors for Cd. The mechanism of Cd-induced ROS production in association with mitochondrial alterations leading to adaptation responses or cell death is not fully elucidated, allthough it is known that Cd can directly damage mitochondria. In general, the aim of this study was to investigate and compare the molecular and cellular responses in renal cells in vitro and in vivo exposed to different doses of Cd in an acute respectively subchronic way. The study specifically focused on the role of oxidative stress and mitochondria, and how they modulate different defense strategies and help cells to acclimate to Cd stress. Gene expression analyses of antioxidant genes and mitochondrial genes formed the core technology of this study and therefore it was very important that the results obtained from qPCR are accurate and reliable. For this purpose, an additional analysis to select appropriate reference genes was performed in both cell lines and kidney tissues of in vitro and in vivo experiments respectively. The choice of reference genes for gene quantification is an important pre-requisite for carrying out new studies. From a set of eight commonly used reference genes, it was found that glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Gapdh), tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, zeta polypeptide (Ywhaz) and beta-actin (Actb) were the most stable reference genes in the in vitro experimental set-up, while Gapdh, Ywhaz and peptidylprolyl isomerase A /cyclophilin A (Ppia) were the stable set in vivo. It was shown that the stability and hence selection of reference genes varied between both experimental set-ups even when both the cells/tissues originated from rat. Subsequently all the qPCR results of transcripts analyzed in vitro or in vivo were normalized to their respective set of stable reference genes. The in vitro experiment made use of Cd free medium and of 1, 10 and 30 μM of Cd concentrations that caused low, moderate or high amounts of damage to PTCs. In this case, cells without or with visible alterations were obtained to study the antioxidant signature and role of mitochondria during Cd exposure and/or subsequent adaptation. It was shown that at lower Cd concentrations (1 μM CdCl2), mitochondrial DNA (mtDNA) content and anti-apoptotic gene expression increased with a decrease in reduced glutathione (GSH) content. At higher concentrations (10 and 30 μM CdCl2), there was an increase in hydrogen peroxide (H2O2) and glutathione disulfide (GSSG) content, metallothionein (MT) transcript levels, pro-apoptotic gene induction together with loss of mitochondrial DNA content and function as well as depletion of GSH. From these observations, we noticed that alterations in the balance between the pro- and anti-oxidant status of the cell can lead to cell signalling for survival or damage to cells, called the oxidative challenge. With increasing ROS and thereby cell stress, the mitochondrial system can collapse, leading to further damage of mitochondria and ROS production culminating in apoptosis and/or necrosis. Both mitochondrial abundance and a shift from GSH to GSSG as a response to Cd induced oxidative stress are probably involved in the final outcomes towards long-term exposure and were explored in more detail in the in vivo study. In the in vivo study, when rats were treated for 13 days with sub-chronic Cd exposure (1 mg CdCl2/kg bw), the GSSG/GSH ratio remained the same indicating the maintenance of the cellular redox state. Superoxide dismutase 2 and GSH immunohistochemical stainings together with gene expression analyses of antioxidants revealed their up-regulated activities, which points towards the cell’s attempt to defend, and adapt to the Cd-induced oxidative challenge. It is clear that under Cd stress, a new redox equilibrium is installed in the PTCs. The increased expression of genes responsible for regulation and biogenesis of mitochondria indicates a positive regulation for mitochondrial biogenesis. This was also reflected in terms of increased mtDNA content in Cd-treated animals as compared to control animals, which might be the result of an increasing energy demand of the cell necessary for adaptive and or survival mechanisms under Cd stress. Whereas increased caspase activity in Cd-treated animals points towards enhanced apoptosis under Cd stress, the simultaneous up-regulation of both pro- and antiapoptotic genes might represent the varying activities of damaged and undamaged cells present in the heterogeneous kidney tissue. Overall, the in vivo experimental results suggested a clear and obvious involvement of mitochondria in defending against the Cd-induced oxidative stress during long-term subchronic exposure. In conclusion, a comparison of the oxidative stress signature between acute in vitro versus sub-chronic in vivo Cd exposure shows a clear shift in terms of defense and acclimation. It was shown that GSH is a first line of defense in Cd toxicity both in vitro and in vivo due to its chelating and antioxidant properties. There is also a parallel activation of mitochondrial biogenesis in order to meet the increasing energy demand of the cells under stress. Other acclimation strategies i.e. chelation by MTs and antioxidant defense mechanisms come into play during exposure to higher Cd concentrations or prolonged exposure. Once the Cd stress is beyond the withholding limit, these mechanisms fail and the cell enters a point of no return leading to irreversible damage and eventually Cdinduced pathologies. Cadmium (Cd) veroorzaakt het ontstaan van ROS (reactive oxygen species) op een indirecte manier door (1) het verdringen van redox-actieve metalen, (2) de depletie van antioxidatieve metabolieten, (3) de inhibitie van antioxidatieve enzymen en (4) de inhibitie van de elektronentransportketen. Dit resulteert uiteindelijk in schade aan de mitochondriën, wat leidt tot functieverlies, en uiteindelijk celdood in verschillende organen. Een verstoring van de redoxbalans door Cd op cellulair niveau werd al herhaalde malen bestudeerd in verschillende experimentele set-ups zoals gedifferentieerde cellen in dier (en mens), op weefselniveau, in primaire celculturen en/of in cellijnen en ook in nietgedifferentieerde cellen. Nochtans, of en waar de oxidatieve balans al dan niet in het gedrang komt en leidt tot pathologieën t.h.v. de organen hangt af van allerlei experimentele alsook omgevingsfactoren. Het is belangrijk de vergelijking van resultaten uit verschillende experimenten met de nodige omzichtigheid uit te voeren en rekening te houden met het feit dat vele studies hoge concentraties van Cd gebruiken, die wel een effect kunnen hebben op cellijnen, maar irrelevant zijn in termen van de reële blootstelling aan Cd van mens en dier in het milieu. Verschillende parameters in een bepaalde experimentele set-up, zoals de blootstellingsroute, de gebruikte Cd speciatie, het soort celtype zijn allen van invloed op de uiteindelijke uitkomst en op de gemeten Cd toxiciteit. In mijn studie, in het onderzoek op renale cellijnen bij voorbeeld werden cellen direct blootgesteld aan Cd, terwijl - na oraal of subcutaan toedienen van Cd aan ratten in vivo - Cd eerst in het bloed en in andere organen wordt opgenomen, vooraleer het de nier bereikt. Dit veroorzaakt een wijziging in de speciatie van Cd en van de concentratie, waaraan de niercellen uiteindelijk worden blootgesteld. Nochtans is het - in termen van translationele toxicologie – erg interessant om de effecten van het niveau van Cd blootstelling in vitro en in vivo te vergelijken, wanneer de Cd concentraties in beide experimentele set-ups vergelijkbaar zijn. Cadmium heeft een halfleven van 15-30 jaar in de nier. Aanzienlijke schade is meestal beperkt tot het apicale gedeelte van de proximale tubuluscellen (PTCs). Deze cellen beschikken over een groot aantal mitochondriën, een belangrijke bron van ROS, maar zelf ook erg gevoelig aan een verhoogde aanwezigheid van ROS. Veranderingen in de mitochondriën zijn betrokken bij zowel het veroorzaken van schade als in aanpassingsreacties. De WKPT-0293 cellijn, afgeleid van het S1 segment van PCTs van de rat, is een goed model voor de studie van Cd toxiciteit, want de cellen beschikken over transporters en receptoren voor Cd. Het mechanisme van Cd-geïnduceerde ROS productie en de samenhang met mitochondriale veranderingen, die tot adaptatie leiden, werden nog niet helemaal opgehelderd, al is wel al geweten dat Cd de mitochondriën rechtstreeks kan beschadigen. Kort samengevat, was het doel van deze studie om de moleculaire en cellulaire responsen te bestuderen en te vergelijken van niercellen in vitro en in vivo en dit bij blootstelling aan verschillende dosissen van Cd op een acute en een sub-chronische manier. De focus van de studie lag op de rol van oxidatieve stress en van de mitochondriën en hoe deze verschillende verdedigingsstrategiën moduleren om cellen te helpen om zich aan te passen aan Cd stress. De belangrijkste techniek, gebruikt in deze studie, betrof analyses van genexpressie van antioxidante en mitochondriale genen. Het was dus erg belangrijk om accurate en betrouwbare qPCR resultaten te bekomen. Om die reden werd een voorafgaande analyse gedaan van nier cellijnen en van nierweefsel in vitro en in vivo, dit om de best geschikte referentiegenen op te sporen. Een juiste keuze van referentiegenen om andere genen te kunnen kwantificeren is erg belangrijk, wanneer men een nieuwe studie aanvat. Van de acht genen die meestal gebruikt worden als referentiegenen waren het vooral glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (Gapdh), tyrosine 3- monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activatie proteine, zeta polypeptide (Ywhaz) en beta-actine (Actb) die het meest stabiel waren in de in vitro set-up, terwijl Gapdh, Ywhaz en peptidylprolyl isomerase A /cyclophilin A (Ppia) stabiel waren in de in vivo experimenten. We konden aantonen dat de stabiliteit en dus de selectie van de referentiegenen verschilde tussen beide experimentele set-ups, ook al was de rat telkens de bron van de cellen of weefsels. Alle qPCR resultaten van gentranscripten, die in vitro en in vivo werden geanalyseerd, werden vervolgens genormaliseerd naar hun respectievelijke set van stabiele referentiegenen. In de in vitro experimenten werden, naast Cd-vrij medium ter controle, concentraties van 1, 10 en 30 μM Cd toegepast. Deze concentraties brachten respectievelijk lage, middelmatige en hoge schade toe aan de PTCs. Op die manier werden cellen bekomen zonder en met zichtbare veranderingen, die we konden gebruiken om de antioxidatieve respons en de rol van de mitochondriën te bestuderen gedurende de Cd blootstelling en/of de daarop volgende adaptatie. Bij lagere Cd concentraties (1 μM CdCl2) steeg de hoeveelheid mitochondriaal DNA (mtDNA) en de expressie van anti-apoptotische genen verhoogde, terwijl het niveau van gereduceerd glutathion (GSH) verlaagd was. Bij hogere concentraties (10 en 30 μM CdCl2) was er een stijging van de hoeveelheid waterstof peroxide (H2O2) en van glutathiondisulfide (GSSG), van het metallothioneïne (MT) transcriptie niveau en was er een verhoogde inductie van pro-apoptotische genen, tezamen met een verlies aan mitochondriale DNA inhoud en functie, evenals een depletie van GSH. Uit deze resultaten werd duidelijk dat veranderingen in de pro- en anti-oxidant status van de cel kunnen leiden tot celsignalisatie, met als gevolg ofwel het overleven van de cel, ofwel celschade, de zogenaamde ‘oxidative challenge’. Bij verhoogde ROS en dus cel stress kan het mitochondriaal systeem falen, waardoor verdere schade van de mitochondriën ontstaat en verdere ROS productie, resulterend in apoptose en/of necrose van cellen. Zowel de hoeveelheid mitochondriën, als een verschuiving van GSH naar GSSG als respons op de Cd-geïnduceerde oxidatieve stress zijn waarschijnlijk betrokken bij het uiteindelijk resultaat bij lange termijn blootstelling en werden meer in detail bestudeerd in de in vivo studie. In de in vivo studie werden ratten gedurende 13 dagen sub-chronisch blootgesteld aan 1mg Cd/kg lichaamsgewicht. De GSSG/GSH ratio bleef constant, wat betekent dat de cellulaire redox status werd gehandhaafd. Superoxide dismutase 2 en GSH immunohistochemische kleuringen, gecombineerd met analyse van genexpressie van antioxidanten toonden aan dat de activiteit verhoogd was, wat wijst op een poging van de cel om zich te verdedigen en zich aan te passen aan de Cd-geïnduceerde toxiciteit. Het is duidelijk dat er bij Cd stress een nieuw redox evenwicht ontstond in de PTCs. De verhoogde expressie van genen, verantwoordelijk voor de regeling en biogenese van mitochondriën een gunstige bijsturing van de biogenese van mitochondrën. De verhoogde mtDNA inhoud in dieren behandeld met Cd, vergeleken met controledieren, wees in dezelfde richting. Mogelijkerwijze wijst dit op een verhoogde behoefte aan energie, nodig voor de aanpassings- en/of de overlevingsmechanismen van de aan Cd-blootgestelde cellen. Terwijl de verhoogde caspase activiteit in de aan Cd-blootgestelde dieren wijst op een verhoogde apoptose, kan de gelijktijdige op-regulatie van zowel pro- als anti-apoptotische genen te wijten zijn aan de heterogeniteit van het nierweefsel en bijgevolg de aanwezigheid van zowel beschadigde als niet beschadigde cellen. In elk geval wijzen de in vivo resultaten op een duidelijke rol van de mitochondriën in de verdediging tegen Cd-geïnduceerde oxidatieve stress bij sub-chronische, langdurige blootstelling. Tenslotte kunnen we besluiten dat de vergelijking van de oxidatieve stress respons in in vitro versus sub-chronische in vivo Cd blootstelling wijst op een duidelijke verschuiving voor wat betreft verdediging en aanpassing. Er werd aangetoond dat GSH, door zijn bindende en zijn antioxidatieve eigenschappen, de eerste lijnsdefensie vertegenwoordigt zowel in vitro als in vivo. Er was ook een parallelle activatie van mitochondriale biogenese om aan de verhoogde energiebehoefte van cellen onder stress te kunnen voldoen. Andere aanpassingsstrategieën zoals binding door MTs en antioxidatieve verdedigingsmechanismen beginnen een rol te spelen bij blootstelling aan hogere Cd concentraties of bij langere blootstelling. Eens de Cd stress voorbij de grens van deze mechanismen gaat, bereiken de cellen een ‘point of no return’, wat eindigt in irreversibele schade en uiteindelijk in Cd-geïnduceerde pathologiën.

Over the years, a large number of in vitro models ranging from renal cell lines to isolated perfused tubules have been established. However, epithelial cell lines had to undergo a number of genetic changes in order to survive indefinitely in vitro. On the other hand, the isolated perfused tubule is a complex system to study. As a consequence, primary epithelial cell culture systems are needed to check the physiological significance of studies done with established cell lines and in some cases they might be the only way to study specific tubular cell function characteristics in particular (patho)physiological and pharmacological conditions. Furthermore, the increasing use of transgenic and knock-out mouse models should be supported by an in vitro model to study the cellular phenotype. Major inherent technical advantages of cultured cells for the study of epithelial transport include their ability to be studied in a controlled environment without systemic neurons and hormonal influences, and their easy accessibility for electrophysiological and imaging techniques. However, primary cell culture also has its limitations such as incomplete differentiation of cells or a limited lifespan, among others. The objective of this thesis was to establish a primary cell culture of mouse proximal tubule cells. The primary cells were extensively characterized for their proximal tubule origin. To correlate our findings in primary cell cultures with data in the literature, a detailed description of proximal tubule cell morphology and ( electro-) physiology is given in section l. 2, l. 3 and 1.4. Finally, we used our cell cultures as a model for the study of renal tubulointerstitial fibrosis. The mechanisms involved in tubulointerstitial fibrosis are described in section 1.5. At the end of this chapter, the different aims of this thesis are summarized.

The objectives of this work were: To study some functional properties of the midgut. 1) First of all some essential information was needed on the electrophysiologica l properties of the midgut of 0. cincta. la) To start with, an elemental analysis of 0. cincta hemolymph was performed and an adequate physiological saline was composed, based on the hemolymph composition. lb) Furthermore we wanted to study the electrical potential differences at the basolateral and the apical membrane, i.e. to assess the importance of the conductance of the basolateral membrane for K+ and to make an estimate of the relative basolateral versus apical membrane resistance. If the basolateral resistance is lower than the apical resistance Vbi approximates Ebi (see chapter 1.2.4 ). If the basolateral resistance can be increased, for instance by the application of Ba2+, we could take advantage of this situation to learn more about the electrical events at the apical membrane. (electrogenic pumping mechanisms or conductances of other ions). lc) The measurement of pH in the hemolymph, in the cell and in the lumen, should allow to calculate the electrochemical gradient across the basolateral and the apical membranes. This is important information because pH is an important factor either regulating transporters or offering a gradient across the cell membrane, energizing secondary active transport. The items la, lb and le are covered in chapter IA. 2) to determine the specific transepithelial resistance (Rte) of the midgut epithelium. Despite its small size, the midgut of Orchesella cincta must fulfill all needs of digestion and uptake of nutrients. Inevitably, the composition of the food composition changes as a consequence of digestion and uptake of food, while it moves through the midgut. Transport processes in the epithelium might therefore be adapted to a gradual change in the luminal content at different sites along the midgut. Consequently the Rte might be unequally distributed along the midgut. Because of t he small size of the animal t he Rte had to be determined with cable analysis. One assumption of cable analysis is, that the Rte is uniformly distributed along the tissue. 2a) Because this may not necessarily be the case, we tried to evaluate, whether it is nevertheless possible to find a good estimate of the true Rte if it changes along the midgut and 2b) whether it is possible to distinguish between artifacts due to electrical leakage in the set-up and a true unequal distribution of R,, along the midgut. The items outlined in 2), 2a) and 2b) are covered in chapter IB. 3) Furthermore, a technique for direct measurement of Cd2+ fluxes was introduced at the lab to explore the possibility of a simple self-referencing ion-selective electrode set-up to detect Cd2+ fluxes at the basolateral side of the midgut, which is known to accumulate cadmium.

The Malpighian tubules of the forest ant, F. polyctena, have been studied for many years now by the research group physiology of the Limburgs Universitair Centrum (Diepenbeek, Belgium). In insects these tubules are responsible for the primary urine production. The latter is achieved via secretion, driven by the active transport of KCI from hemolymph to lumen, and passive diffusion of substances. Initially the transport mechanisms involved in this active transport have been investigated. In a subsequent phase the factors involved in the regulation of this active transport were investigated, i.e. the presence of endogenous factors with a direct effect on the primary urine production by the Malpighian tubules was investigated. Both diuretic and antidiuretic factors were found to be present in body extracts of the ants. Some of these factors, i.e. a diuretic peptide (Fop-DP I) and two myotropic peptides (Fop-TK I en Fop-TK II), could be purified. In the present study we tried to further complete this picture. Different factors, both diuretic (Fop-DP and Fop-GP) and antidiuretic (FopADF), were shown to be present in body extracts of the ant and some could be identified. The antidiuretic factor, purified from an abdomen extract, was shown to block the Transport mechanisms involved in the active transport of K+ through the cells of the Malpighian tubules (see chapter 1). The signal transduction pathway used by FopADF could not be clarified. The involvement of adenylate cyclase and / or an increase in intracellular cAMP could clearly be excluded (see chapter 2). A cross-reactivity of Tenebrio molitor Malpighian tubules towards FopADF could be demonstrated by Dr. S. Nicolson (see Note after chapter 1) and a similar antidiuretic factor was shown to be present in an abdomen extract of the honeybee, Apis mellifer (see chapter 4). The diuretic factors, both purified from head/ thorax extracts, were shown to be peptides. For Fop-DP approximately 35% of the amino acid sequence could be determined. Fop-DP acted via an increase in intracellular calcium (see Chapter 3). A Fop-DP related factor was also demonstrated to be present in a head extract of the honeybee (see chapter 4). The second diuretic factor, Fop-cGP, was fully characterized. It is a peptide of 30 amino acids which exerts its diuretic effect in Locust, via an increase in cAMP (see Chapter 6). The purification of Fop-cGP followed a preliminary study trying to establish the presence of CRF-related peptides in the forest ant. The latter were shown to be present in a head / thorax extract of the ant by means of chromatography and an ELISA based on polyclonal antisera to CRF-related peptides from other insects (see Chapter 5). Fop-cGP had the activity of a CRF-like factor but not the amino acid composition. Another factor having a CRF-like structure may be present but still awaits further purification and characterization. Below we tried to give a brief overview of the relevant results for each chapter. A table, added as bookmarker, summarizes the results and is intended as a reader guide. The factors involved in the endocrine regulation of the primary urine production of the forest ant is compared to the situation known for other insects.