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Made available in DSpace on 2018-12-11T17:26:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-11-04 Made available in DSpace on 2018-12-11T17:26:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-11-04 Background: 14-3-3 proteins comprise a family of eukaryotic multifunctional proteins involved in several cellular processes. The Pb14-3-3 of Paracoccidioides brasiliensis seems to play an important role in the Paracoccidioides-host interaction. Paracoccidioides brasiliensis is an etiological agent of paracoccidioidomycosis, which is a systemic mycosis that is endemic in Latin America. In the initial steps of the infection, Paracoccidioides spp. synthetizes adhesins that allow it to adhere and invade host cells. Therefore, the aim of this work was to perform a functional analysis of Pb14-3-3 using Saccharomyces cerevisiae as a model. Results: The functional analysis of Pb14-3-3 was performed in S. cerevisiae, and it was found that Pb14-3-3 partially complemented S. cerevisiae proteins Bmh1p and Bmh2p, which are recognized as two yeast 14-3-3 homologues. When we evaluated the adhesion profile of S. cerevisiae transformants, Pb14-3-3 acted as an adhesin in S. cerevisiae; however, Bmh1p did not show this function. The influence of Pb14-3-3 in S. cerevisiae ergosterol pathway was also evaluated and our results showed that Pb14-3-3 up-regulates genes involved in ergosterol biosynthesis. Conclusions: Our data showed that Pb14-3-3 was able to partially complement Bmh1p and Bmh2p proteins in S. cerevisiae; however, we suggest that Pb14-3-3 has a differential role as an adhesin. In addition, Pb-14-3-3 may be involved in Paracoccidioides spp. ergosterol biosynthesis which makes it an interest as a therapeutic target. Laboratório de Micologia Clínica - Núcleo de Proteômica Faculdade de Ciências Farmacêuticas- Unesp Campus Araraquara Brazil, Rodovia Araraquara - Jaú Km 1 Laboratório de Biologia Molecular Faculdade de Ciências Farmacêuticas- Unesp Campus Araraquara Brazil, Rodovia Araraquara - Jaú Km 1 Laboratório de Micologia Clínica - Núcleo de Proteômica Faculdade de Ciências Farmacêuticas- Unesp Campus Araraquara Brazil, Rodovia Araraquara - Jaú Km 1 Laboratório de Biologia Molecular Faculdade de Ciências Farmacêuticas- Unesp Campus Araraquara Brazil, Rodovia Araraquara - Jaú Km 1

Made available in DSpace on 2013-08-12T18:39:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-04-01 Made available in DSpace on 2013-09-30T18:06:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-04-01 Submitted by Vitor Silverio Rodrigues (vitorsrodrigues@reitoria.unesp.br) on 2014-05-20T13:24:16Z No. of bitstreams: 0 Made available in DSpace on 2014-05-20T13:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-04-01 Eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A) is a protein that is highly conserved and essential for cell viability. This factor is the only protein known to contain the unique and essential amino acid residue hypusine. This work focused on the structural and functional characterization of Saccharomyces cerevisiae eIF5A. The tertiary structure of yeast eIF5A was modeled based on the structure of its Leishmania mexicana homologue and this model was used to predict the structural localization of new site-directed and randomly generated mutations. Most of the 40 new mutants exhibited phenotypes that resulted from eIF-5A protein-folding defects. Our data provided evidence that the C-terminal alpha-helix present in yeast eIF5A is an essential structural element, whereas the eIF5A N-terminal 10 amino acid extension not present in archaeal eIF5A homologs, is not. Moreover, the mutants containing substitutions at or in the vicinity of the hypusine modification site displayed nonviable or temperature-sensitive phenotypes and were defective in hypusine modification. Interestingly, two of the temperature-sensitive strains produced stable mutant eIF5A proteins - eIF5A(K56A) and eIF5A(Q22H,L93F)- and showed defects in protein synthesis at the restrictive temperature. Our data revealed important structural features of eIF5A that are required for its vital role in cell viability and underscored an essential function of eIF5A in the translation step of gene expression. Univ Estadual Paulista, Fac Ciencias Farmaceut, Dept Biol Sci, Sch Pharmaceut Sci, BR-14801902 São Paulo, Brazil Natl Inst Dent & Craniofacial Res, Oral & Pharyngeal Canc Branch, NIH, Bethesda, MD USA Univ São Paulo, Inst Phys, Dept Phys & Informat, Ctr Struct Mol Biotechnol, BR-05508 São Paulo, Brazil Univ Estadual Paulista, Fac Ciencias Farmaceut, Dept Biol Sci, Sch Pharmaceut Sci, BR-14801902 São Paulo, Brazil

Submitted by Guilherme Lemeszenski (guilherme@nead.unesp.br) on 2014-02-26T17:19:33Z No. of bitstreams: 1 WOS000222434200023.pdf: 392582 bytes, checksum: eb50adacff00ab5cc37867f0de853492 (MD5) Made available in DSpace on 2014-02-26T17:19:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 WOS000222434200023.pdf: 392582 bytes, checksum: eb50adacff00ab5cc37867f0de853492 (MD5) Previous issue date: 2004-07-01 Submitted by Vitor Silverio Rodrigues (vitorsrodrigues@reitoria.unesp.br) on 2014-05-20T13:50:12Z No. of bitstreams: 1 WOS000222434200023.pdf: 392582 bytes, checksum: eb50adacff00ab5cc37867f0de853492 (MD5) Made available in DSpace on 2014-05-20T13:50:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 WOS000222434200023.pdf: 392582 bytes, checksum: eb50adacff00ab5cc37867f0de853492 (MD5) Previous issue date: 2004-07-01 We report the results of a transcript finishing initiative, undertaken for the purpose of identifying and characterizing novel human transcripts, in which RT-PCR was used to bridge gaps between paired EST Clusters, mapped against the genomic sequence. Each pair of EST Clusters selected for experimental validation was designated a transcript finishing unit (TFU). A total of 489 TFUs were selected for validation, and an overall efficiency of 43.1% was achieved. We generated a total of 59,975 bp of transcribed sequences organized into 432 exons, contributing to the definition of the structure of 211 human transcripts. The structure of several transcripts reported here was confirmed during the course of this project, through the generation of their corresponding full-length cDNA sequences. Nevertheless, for 21% of the validated TFUs, a full-length cDNA sequence is not yet available in public databases, and the structure of 69.2% of these TFUs was not correctly predicted by computer programs. The TF strategy provides a significant contribution to the definition of the complete catalog of human genes and transcripts, because it appears to be particularly useful for identification of low abundance transcripts expressed in a restricted Set of tissues as well as for the delineation of gene boundaries and alternatively spliced isoforms. Univ São Paulo, Inst Quim, BR-05513970 São Paulo, Brazil Ludwig Inst Canc Res, BR-01509010 São Paulo, Brazil Univ São Paulo, Dept Epidemiol, Sch Publ Hlth, BR-01246904 São Paulo, SP, Brazil Univ Ribeirao Preto, Dept Quim Informat Bioinformat, BR-14096380 Ribeirao Preto, Brazil Univ São Paulo, Fac Med Ribeirao Preto, Centro Terapia Celular, Hemocentro, BR-14051140 Ribeirao Preto, SP, Brazil Univ São Paulo, Fac Med Ribeirao Preto, Dept Clin Med, BR-14051140 Ribeirao Preto, SP, Brazil Inst Ludwig, Lab Biol Computacional, BR-01509010 São Paulo, SP, Brazil Univ São Paulo, Lab Genet Cardiol Mol, Inst Coracao, BR-05403000 São Paulo, SP, Brazil Univ Fed São Paulo, Bioinform Lab, Hlth Informatics Dept, BR-04039032 São Paulo, Brazil Univ Estad Campinas, Dept Clin Med, Fac Ciências Med, BR-13083970 Campinas, SP, Brazil Univ Fed São Paulo, Rheumatol Div, BR-04113001 São Paulo, Brazil Univ São Paulo, Dept Histol Embriol, Inst Ciências Biomed, BR-05508900 São Paulo, Brazil Univ Fed São Paulo, Dept Microbiol Immunol Parasitol, BR-04023062 São Paulo, Brazil Univ São Paulo, Lab Cellular Mol Endocrinol, Sch Med, BR-01246903 São Paulo, Brazil Univ Fed São Paulo, Dept Med, Disciplina Endocrinol, Lab Endocrinol Mol, BR-04039002 São Paulo, Brazil Univ São Paulo, Inst Ciências Biomed, Lab Transferencia Genica, BR-05508900 São Paulo, Brazil Univ São Paulo, Fac Med Ribeirao Preto, Dept Biol Celular Mol Bioagentes Patogenicas, BR-14049900 Ribeirao Preto, SP, Brazil Univ Estadual Paulista, Lab Biol Mol, Hemocentro, Fac Med, BR-18618970 Botucatu, SP, Brazil Univ Fed Sao Carlos, Dept Genet Evol, BR-13565905 Sao Carlos, SP, Brazil Univ São Paulo, Fac Ciências Farmaceuticas Ribeirao Preto, BR-14040903 Ribeirao Preto, SP, Brazil Univ São Paulo, Fac Filosofia Ciências Letras Ribeirao Preto, Ribeirao Preto, SP, Brazil Univ São Paulo, Dept Patol, Fac Med Vet Zootecnia, BR-05508000 São Paulo, Brazil Univ Estadual Campinas, Dept Genet Med, Fac Ciências Med, BR-13081970 Campinas, SP, Brazil Univ São Paulo, Fac Med Ribeirao Preto, Dept Genet, BR-14040900 Ribeirao Preto, SP, Brazil Univ São Paulo, Dept Bioquim, Inst Quim, BR-05599970 São Paulo, Brazil Univ São Paulo, Dept Neurol, Fac Med, BR-01246903 São Paulo, Brazil Univ Estadual Campinas, Lab Genoma Funcional, Centro Biol Mol Engenharia Genet, BR-13083970 Campinas, SP, Brazil Univ Estadual Campinas, Dept Genet Evol, Inst Biol, Campinas, SP, Brazil Univ São Paulo, Dept Radiol, Disciplina Oncol, Fac Med, BR-01246903 São Paulo, Brazil Univ Vale Paraiba, Inst Pesquisa Desenvolvimento, BR-12244000 Sao Jose Dos Campos, SP, Brazil Univ São Paulo, Inst Biociencias, Centro Estudios Genoma Humano, Dept Biol, BR-055508900 São Paulo, Brazil Univ Fed São Paulo, Lab Mol Gynecol, Dept Gynecol, BR-04039001 São Paulo, Brazil São Paulo State Univ, Sch Pharmacol, Dept Biol Sci, BR-14801902 Araraquara, SP, Brazil Univ São Paulo, Discipl Genet, Fac Odontol, BR-14040900 Ribeirao Preto, SP, Brazil Univ Fed São Paulo, Dept Biofisica, BR-04023062 São Paulo, Brazil Univ Estadual Paulista, Dept Biol, Inst Biociencias Letras Ciências Exatas, BR-15054000 Sao Jose do Rio Preto, SP, Brazil Univ Estadual Paulista, Dept Genet, Inst Biociencias, BR-18618000 Botucatu, SP, Brazil Univ São Paulo, Dept Bioquim Imunol, Fac Med Ribeirao Preto, BR-14049900 Ribeirao Preto, SP, Brazil Univ Estadual Campinas, Lab Genet Mol Cancer, Dept Clin Med, Fac Ciências Med, BR-13083970 Campinas, SP, Brazil Univ Estadual Campinas, Dept Patol Clin, Fac Ciências Med, BR-13083970 Campinas, SP, Brazil Univ São Paulo, Setor Vetores Virals, Lab Cardiol Mol, Inst Coracao, BR-15403000 São Paulo, Brazil Univ Estadual Paulista, Lab Biol Mol, Hemocentro, Fac Med, BR-18618970 Botucatu, SP, Brazil São Paulo State Univ, Sch Pharmacol, Dept Biol Sci, BR-14801902 Araraquara, SP, Brazil Univ Estadual Paulista, Dept Biol, Inst Biociencias Letras Ciências Exatas, BR-15054000 Sao Jose do Rio Preto, SP, Brazil Univ Estadual Paulista, Dept Genet, Inst Biociencias, BR-18618000 Botucatu, SP, Brazil

Submitted by ANGÉLICA HOLLUNDER KLIPPEL null (angelicahklippel@yahoo.com.br) on 2017-10-03T18:02:47Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Angélica Hollunder Klippel_ repositório.doc: 34816 bytes, checksum: 73436168e63b674c7897cf716f5f4f68 (MD5) Rejected by Monique Sasaki (sayumi_sasaki@hotmail.com), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: A versão do trabalho submetida ao Repositório Institucional UNESP deve conter o texto completo. A equipe do Repositório se encarregará de disponibilizar apenas o conteúdo parcial que segundo a Portaria UNESP 396 de 10 de setembro de 2015 consiste em: Artigo 3º V - conteúdo parcial: as páginas pré-textuais (a folha de rosto, a dedicatória, os agradecimentos, a epígrafe, o resumo na língua vernácula, o resumo em língua estrangeira, as listas de ilustrações, de tabelas, de abreviaturas, de siglas e de símbolos e o sumário), a introdução, a conclusão ou as considerações finais e as referências do trabalho. Lembrando que: é necessário informar no formulário de submissão que a versão do trabalho a ser disponibilizada deve ser a parcial e indicar em quanto tempo a versão integral deverá ser disponibilizada, ao atingir a data limite o sistema automaticamente disponibilizará a versão completa do trabalho. Caso necessite prorrogar o prazo para disponibilização do texto completo, de acordo com o artigo 6º da Portaria UNESP 396: A data para a disponibilização do conteúdo integral poderá ser prorrogada por até mais 2 (dois) anos mediante a apresentação, via ofício, de justificativa pelo Autor ao programa de pós-graduação com no mínimo 90 (noventa) dias de antecedência à data informada para a disponibilização do conteúdo integral. A versão final da dissertação/tese deve ser submetida no formato PDF (Portable Document Format). O arquivo PDF não deve estar protegido e a dissertação/tese deve estar em um único arquivo, inclusive os apêndices e anexos, se houver. Corrija estas informações e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2017-10-03T18:28:53Z (GMT) Submitted by ANGÉLICA HOLLUNDER KLIPPEL null (angelicahklippel@yahoo.com.br) on 2017-10-03T19:10:41Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Angélica Hollunder Klippel Depósito.pdf: 4077140 bytes, checksum: 24b0981f59b42809900ce573e066499a (MD5) Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-10-04T19:53:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 klippel_ah_me_arafcf_par.pdf: 1063725 bytes, checksum: d51927cf546bf2bd668ee8ba81d8343c (MD5) Made available in DSpace on 2017-10-04T19:53:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 klippel_ah_me_arafcf_par.pdf: 1063725 bytes, checksum: d51927cf546bf2bd668ee8ba81d8343c (MD5) Previous issue date: 2017-09-04 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) O fator de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) é altamente conservado em arqueas e eucariotos e sofre uma modificação pós-traducional única e essencial chamada hipusinação. Embora tenha sido sugerida inicialmente uma função para eIF5A no início da tradução, foi na etapa de elongação que sua função foi melhor demonstrada. Estudos prévios mostraram que eIF5A tem algum papel na translocação de proteínas pela via co-traducional e que mutantes desse fator possuem níveis aumentados de proteínas envolvidas com o estresse de retículo endoplasmático (RE). Desta forma, nesse trabalho, foi estudada a correlação entre eIF5A e a via de resposta ao estresse de RE (Unfolded Protein Response - UPR). Considerando que o fator de transcrição Hac1 é um elemento essencial da via UPR em Saccharomyces cerevisiae, foi inicialmente verificado se eIF5A afetava o splicing citoplasmático do mRNA de HAC1, o qual é dependente da ativação de Ire1, um sensor de proteínas desenoveladas no interior do RE. Para isto, foi realizada a quantificação dos níveis de mRNA maduro e imaturo de HAC1 por meio de ensaios de qPCR e RT-PCR semiquantitativa, análises estas que não revelaram qualquer diferença de comportamento do mutante hyp2-3 de eIF5A em relação ao selvagem. Por outro lado, diferentes mutantes de eIF5A mostraram sensibilidade a DTT e resistência a tunicamicina, um comportamento ainda não descrito na literatura e que difere de mutantes da via de SRP (via co-traducional de translocação de proteínas para o RE). Além disso, este comportamento de mutantes de eIF5A não foi modificado pela superexpressão dos componentes de SRP. Ainda, o fenótipo de mutantes de eIF5A frente ao DTT e à tunicamicina difere daquele de linhagens que apresentam nocaute de proteínas ribossomais, nocaute de um fator de biogênese de ribossomo ou de um mutante dominante-negativo de eEF2 (translation elongation factor 2). Assim, estes resultados sugerem que a sensibilidade ao DTT e a resistência à tunicamicina, com a diminuição da função de eIF5A, não esteja diretamente relacionada com a via de SRP ou a um defeito geral na tradução. Também foi demonstrado que o fenótipo de resistência a tunicamicina dos mutantes de eIF5A não depende de Ire1 ou Hac1. Para entender melhor estes fenótipos dos mutantes de eIF5A, foi realizada uma determinação do perfil proteômico (utilizando a estratégia de Synthetic Genetic Array e a coleção GFP de S. cerevisiae) do mutante hyp2-3 na presença de DTT, tunicamicina ou na condição controle sem tratamento. A análise destes resultados revelou proteínas que estão diminuídas no mutante hyp2-3 em relação ao selvagem e que podem contribuir para explicar os fenótipos observados. Por fim, a análise deste perfil proteômico, assim como de outros dados obtidos nesse trabalho, não sugerem uma pré-ativação de UPR perante a diminuição da função de eIF5A em S. cerevisiae, como observado em um trabalho recente com células HeLa. The eukaryotic translation factor 5A (eIF5A) is highly conserved in archaea and eukaryotes and undergoes a unique and essential post-translational modification called hypusination. Although a function for eIF5A was initially suggested at the initiation of translation, it was in the elongation step that its function was best demonstrated. Previous studies have shown that eIF5A has a role in protein translocation by the co-translational pathway and that mutants of this factor have increased levels of proteins involved with endoplasmic reticulum (ER) stress. Therefore, in this work, the correlation of eIF5A with the stress response pathway of ER (the Unfolded Protein Response - UPR) was studied. Considering that the Hac1 transcription factor is an essential element of the UPR pathway in Saccharomyces cerevisiae, it was first verified whether eIF5A affects the cytoplasmic splicing of the HAC1 mRNA, which is dependent on the activation of Ire1, a sensor of unfolded proteins in the RE. To test it, we did the quantification of the mature and immature mRNA levels of HAC1 by means of qPCR and semi-quantitative RT-PCR assays, which did not reveal any difference in the behavior of the eIF5A mutant hyp2-3 in comparison to the wild-type. On the other hand, different mutants of eIF5A show sensitivity to DTT and resistance to tunicamycin, a behavior not yet described in the literature and that differs from mutants of the SRP pathway (co-translocation pathway for RE) and also this behavior of eIF5A mutants was not modified by overexpression of SRP. In addition, the eIF5A mutant phenotype in DTT and tunicamycin differs from that of knockout strains of ribosomal proteins, knockout of a ribosome biogenesis factor or a dominant-negative mutant of eEF2 (translation elongation factor 2). Thus, these results suggest that the sensitivity to DTT and resistance to tunicamycin upon decreased eIF5A function is not an effect related to the SRP pathway or a general translation defect. Furthermore, the tunicamycin resistance phenotype of the eIF5A mutants has been shown to be Ire1 or Hac1 independent. To better understand these UPR-related eIF5A phenotypes, we determined the proteome profile (using the Synthetic Genetic Array strategy and the S. cerevisiae GFP colection) of the hyp2-3 mutant on treatment with DTT, tunicamycin or in the untreated control condition. Analysis of these results revealed proteins that are decreased in hyp2-3 when compared to the wild-type and that could contribute to explain the phenotypes observed for this mutant. Finally, analysis of this proteomic profile and other data from this study do not suggest a pre-activation of UPR with the decrease of eIF5A function, as observed in a recent work using HeLa cells. FAPESP: 2015/07728-5

Submitted by PAULO EDUARDO GONÇALVES BOLDRIN null (pegboldrin@hotmail.com) on 2016-03-14T18:26:30Z No. of bitstreams: 1 TESE FINAL c: anexos.pdf: 5512231 bytes, checksum: 99b09119b7d64dcafe2c06ebd9fbe3e9 (MD5) Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-03-15T13:37:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 boldrin_peg_dr_arafcf_par.pdf: 771168 bytes, checksum: e96622919f6c7d1dd57f6fc2e0e72185 (MD5) Made available in DSpace on 2016-03-15T13:37:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 boldrin_peg_dr_arafcf_par.pdf: 771168 bytes, checksum: e96622919f6c7d1dd57f6fc2e0e72185 (MD5) Previous issue date: 2016-02-22 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) O fator de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado e essencial para a viabilidade celular. eIF5A é a única proteína conhecida que sofre uma modificação pós-traducional que gera um resíduo de hipusina, essencial para sua função. Apesar de eIF5A já ter sido envolvida em diferentes vias celulares, estudos mais recentes reforçam seu papel no processo de síntese proteica, mais especificamente na etapa de elongação da tradução. Resultados do nosso grupo revelaram uma relação funcional entre eIF5A e o Fator de Elongação da Tradução 2 (eEF2). No intuito de melhor compreender o papel de eIF5A com o processo de elongação da tradução, o presente trabalho buscou aprofundar os estudos de interação física entre eIF5A e eEF2. Foi mostrado que eIF5A não interage fisicamente de forma direta com eEF2 e que a interação física destes dois fatores é dependente de complexos ribossomais. Ainda, foi revelado que eIF5A e eEF2 não estão presentes no ribossomo simultaneamente ou não ocupam o mesmo ribossomo por muito tempo. Além disso, como foi mostrado que o homólogo de eIF5A em bactéria, EF-P, interage físicamente com a proteína ribossomal L1, foi investigada a relação funcional entre eIF5A e L1 em levedura. Os resultados obtidos mostraram uma forte interação genética entre estes fatores e uma possível dependência da presença de L1 para a ligação de eIF5A no ribossomo. Por fim, como foi mostrado que eIF5A é necessária para a tradução de sequências de prolinas, as quais causam stalling do ribossomo durante a tradução, e que outros tipos de stalling do ribossomo recrutam e ativam o complexo Ribossome Quality Control (RQC), foi estudada também a interação funcional entre o eIF5A e os fatores do RQC, Ltn1 e Tae2. Apesar de ter sido identificada interação genética entre mutantes de eIF5A e destes fatores do RQC, não foi possível evidenciar que o complexo RQC seja recrutado pelo ribossomo parado em sequências de poliprolinas. Porém, eIF5A se mostrou importante para a formação de agregados proteicos causados por sequências de polilisinas. Adicionalmente, foi revelada uma correlação entre a expressão normal de eIF5A e a presença de Sis1 e Cdc48 nesses agregados, sugerindo uma possível interação funcional entre eIF5A e o RQC. The translation factor 5A (eIF5A) is highly conserved and essential for cell viability. eIF5A is the only protein known to contain the essential amino acid residue hypusine, generated by a post-translational modification. Although eIF5A has been involved in different cellular pathways, recent studies have strengthened its role in protein synthesis, more specifically in the translation elongation step. Results of our group revealed a functional correlation between eIF5A and the Translation Elongation Factor 2 (eEF2). To further investigate the role of eIF5A in translation elongation, we carried out new experiments to study the physical interaction between eIF5A and eEF2. eIF5A does not interact directly with eEF2 and their physical interaction is dependent on ribosomal complexes. Moreover, eIF5A and eEF2 do not bind simultaneously to the same ribosome or they do not occupy the same ribosome for a long time. Additionally, as it was shown that the homolog of eIF5A in bacteria, EF-P, interacts physically with the Large Ribosome Protein 1 (L1). We evaluated a functional interaction between eIF5A and L1. The results demonstrated a strong genetic interaction between these factors and a possible dependency of L1 in the eIF5A ribosome binding. Finally, as eIF5A was recently involved in translation of polyproline stretches, which cause ribosome stalling, and other types of ribosome stalling recruit and activate the Ribosome Quality Control (RQC) complex, we also investigated the functional interaction between eIF5A and the RQC factors Ltn1 and Tae2. Although it was identified genetic interaction between mutants of eIF5A and mutants of these RQC factors, ribosome stalled at polyproline residues does not recruit the RQC complex. Curiously, it was observed that eIF5A is important for the formation of cellular aggregates caused by polylysines. Additionally, it was shown a correlation between normal levels of eIF5A in the cell and the presence of Sis1 e Cdc42 in the aggregates, suggesting a possible functional interaction between eIF5A and the RQC complex. FAPESP: 2012/02305-0 FAPESP: 2013/25261-1

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:24:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-20. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:30:27Z : No. of bitstreams: 1 000854092.pdf: 4152129 bytes, checksum: 2349bde07b4af6efb99d75bc7ad08203 (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Programa de Apoio ao Desenvolvimento Científico (PADC) da Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP O fator da tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado em arqueas e eucariotos e essencial para a viabilidade celular. eIF5A é a única proteína conhecida que contém o aminoácido essencial hipusina, gerado através de uma modificação pós-traducional conhecida como hipusinação e que ocorre em duas etapas enzimáticas catalisadas pelas enzimas desoxi-hipusina sintase (Dys1) e desoxi-hipusina hidroxilase (Lia1). Apesar de eIF5A ter sido relacionada recentemente com a etapa da elongação da tradução, a função específica de eIF5A nesse processo, bem como o papel do resíduo de hipusina ainda não estão descritos. Com esse intuito, este trabalho aprofundou inicialmente a caracterização do mutante dys1-1, mutante condicional da enzima desoxi-hipusina sintase. Os resultados revelaram que o mutante dys1-1 apresenta defeito no perfil polissomal característico de fatores que atuam na etapa da elongação da tradução, diminuição da ligação de eIF5A nos polissomos e redução dos níveis de síntese proteica total. Além disso, foram realizadas análises de interação genética envolvendo eIF5A e dirigidas por hipóteses, à partir de dados já publicados ou resultados obtidos previamente pelo laboratório. Nestas análises foi identificada letalidade sintética entre mutantes de ASC1 e o mutante dys1-1, assim como interações genéticas negativas (synthetic sick) entre o mutante tif51A-1 e mutantes de genes relacionados com secreção, mais especificamente com a translocação de proteínas para o retículo endoplasmático pela via co-traducional. Finalmente, foram realizados rastreamentos de interações genéticas em larga escala por Synthetic Genetic Array (SGA), utilizando diferentes mutantes de eIF5A e duas coleções de linhagens mutantes de S. cerevisiae (linhagens nocautes e mutantes sensíveis a temperatura). Os resultados revelaram, respectivamente, 338 e 239 genes das coleções de linhagens nocautes e mutantes... The translation factor 5A (eIF5A) is highly conserved in arqueas and eukaryotes and essential for cell viability. eIF5A is the only protein known to contain the essential amino acid hypusine, generated by a post-translational modification known as hypusination which occurs in two enzymatic steps catalyzed by the enzymes deoxyhypusine synthase (DYS1) and deoxyhypusine hydroxylase (Lia1) enzymes. Although eIF5A has been implicated with the elongation step of translation, its specific function and the role of the hypusine residue is still unknown. For this purpose, this work further characterized the dys1-1 mutant, a conditional mutant of the deoxyhypusine synthase. The results revealed that the dys1-1 mutant shows a polysome profile defect characteristic of translation elongation factors, decrease of eIF5A binding to the polysome fractions and reduction of the total protein synthesis rate. Furthemore, genetic interaction analyses of eIF5A driven by hypotheses, from published and previous data obtained in our laboratory, were performed and revealed synthetic lethality between ASC1 mutants and the dys1-1 mutant and negative genetic interactions (synthetic sick) between the tif51A-1 mutant and mutants of genes related with secretion, specifically those involved with the co-translational translocation of proteins into the endoplasmic reticulum. Finally, high throuput genetic interaction analyses by Synthetic Genetic Array (SGA) were carried out using different eIF5A mutants and two S. cerevisiae mutant strain collections (deletion strains and temperature-sensitive mutants). The results showed, respectively, 338 and 239 genes of the deletion mutant and the temperature-sensitive mutant collections interacting with eIF5A mutants. A total of 577 positive and negative genetic interactions were observed. Moreover, the gene ontology analysis revealed genes involved with cell cycle (53%), DNA repair (18%), translation (16%) and vesicular trafficking/... FAPESP: 11/50801-4

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:10:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-31. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:27:00Z : No. of bitstreams: 1 000841959_20160430.pdf: 1456029 bytes, checksum: a82333720180e2665bc8f93ef58ec406 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-05-04T13:08:27Z: 000841959_20160430.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-05-04T13:09:32Z : No. of bitstreams: 1 000841959.pdf: 3389984 bytes, checksum: fa56680174d460303861986c6b6865ed (MD5) eIF5A é uma proteína altamente conservada entre arqueas e eucariotos e apresenta uma modificação pós-­‐traducional única e essencial para sua função, chamada de hipusinação. eIF5A foi inicialmente identificado como um fator de início de tradução (eukaryotic translation Initiation Factor 5A) porém foi demonstrado que eIF5A atua na elongação da tradução. Recentemente foi demonstrado que eIF5A seja mais importante na tradução específica de proteínas contendo resíduos consecutivos de prolina. No intuito de aprofundar o conhecimento da participação de eIF5A no processo de tradução, o presente trabalho de doutorado estudou a relação funcional entre eIF5A e o tRNA de alanina (tRNAAla), revelada como uma interação genética em Saccharomyces cerevisiae, assim como avaliou a relação de eIF5A com eventos da síntese proteica como Programmed Ribosomal Frameshifting (PRF), misincorporation e readthrough, utilizando repórteres de duas luciferases. Primeiramente, foi analisada a especificidade alélica da supressão em alto número de cópias ocasionada por tRNAAla e a capacidade de tRNAs para outros aminoácidos suprimirem o fenótipo de crescimento de mutantes de eIF5A, e os resultados mostraram que esta supressão não se dá de maneira alelo específica e curiosamente, dentre os outros tRNAs testados, apenas o tRNAiMet é capaz de suprimir o fenótipo de crescimento do mutante tif51AK56A de eIF5A. A supressão observada por estes tRNAs não reflete na melhora do defeito no perfil polissomal, para ambos os casos. Foi testada também a interação física direta entre eIF5A e o tRNAAla, utilizando o sistema de triplo-­‐híbrido, no entanto, nenhuma interação foi detectada, sugerindo que a interação observada entre eIF5A e o tRNA em complexo com 80S seja dependente do ribossomo. Os experimentos de Programmed Ribosomal Frameshifting (PRF) revelaram um aumento na taxa de PRF para... eIF5A is highly conserved between archaea and eukaryotes and has a unique and essential postranslational modification, called hypusination. eIF5A was initially described as a translation initiation factor (eukaryotic Initiation Factor 5A) but it was shown that eIF5A engaged in translation elongation. Recently findings demonstrated that eIF5A is most important for specific translation of proteins containing consecutive proline residues. In order to deepen the knowledge of function of eIF5A during the translation process, this research studied the functional correlation between eIF5A and the alanine tRNA (tRNAAla), revealed as a genetic interaction in Saccharomyces cerevisiae, and also evaluated the effect of eIF5A in events of protein synthesis as Programmed Ribosomal frameshifting (PRF), misincorporation and readthrough using dual luciferase reporters. First, the allele specificity of the high copy suppression caused by tRNAAla and the ability of tRNAs for other amino acids to suppress the growth of eIF5A mutants were analyzed, and the results showed that this deletion does not occur in an allele specific manner and interestingly, among other tRNAs tested, only tRNAiMet is able to suppress the growth phenotype of the eIF5A mutant tif51AK56A. The suppression induced by these tRNAs does not reflect in improvement of the mutant defect in polysomal profile, for both cases. It was also tested direct physical interaction between eIF5A and tRNAAla using three-­‐hybrid system, however, no interaction was detected, suggesting that the interaction observed between eIF5A and tRNA in the 80S complex is dependent on the ribosome. The Programmed Ribosomal frameshifting (PRF) experiments showed an increase in PRF numbers for the signals of the virus LA and HIV-­‐1 in eIF5A mutant strains, demonstrating that eIF5A function interferes with mRNA recoding events. Furthermore, the same mutants showed an increase...

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-09-05Bitstream added on 2014-12-02T11:21:05Z : No. of bitstreams: 1 000777406_20141231.pdf: 641973 bytes, checksum: 588137dce1974a2914edd3aadb3736f1 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-01-05T11:00:55Z: 000777406_20141231.pdf,Bitstream added on 2015-01-05T11:01:50Z : No. of bitstreams: 1 000777406.pdf: 2095617 bytes, checksum: c1c25558e3e61efd44b8465985d10f95 (MD5) A proteína MxA humana é membro da superfamília de GTPases dinaminas. De maneira geral, as chamadas proteínas Mx estão presentes na grande maioria dos organismos vertebrados, estudados até o momento, e possuem dois domínios estruturais, chamados GTPase e CID-GED (stalk), além da capacidade de homooligomerização e associação com membranas intracelulares. Além disso, as proteínas Mx são produzidas unicamente após a sensibilização celular por interferons do tipo I e III. Entre as propriedades funcionais de MxA, destaca-se a sua vasta atividade contra diferentes vírus de RNA e DNA, incluindo o vírus influenza e membros da família dos buniavírus. Além disso, o silenciamento gênico de MxA está associado ao fenótipo de imortalização celular em uma série de neoplasias. Assim, MxA desperta o interesse por ser uma das proteínas chave nas respostas mediadas por interferons e por estar envolvida no controle da proliferação celular. Recentemente, por meio de rastreamento de duplo-híbrido, utilizando uma biblioteca de cDNA preparada a partir de cérebro fetal humano, foi possível mostrar que MxA interage com fatores envolvidos no processo de SUMOilação de proteínas e na formação de corpúsculos nucleares denominados PMLNB e com uma série de proteínas relacionadas com o controle da transcrição e apoptose. Neste estudo, foi investigada a interação entre MxA e as proteínas envolvidas nos processo de SUMOilação. Assim, foi possível confirmar a interação física entre a proteína MxA e os ligantes Ubc9 e SUMO1, por ensaios de coimunoprecipitação. A seguir, através de ensaios de duplo-híbrido, foi possível determinar que a região EIL (E67-interacting Loop) de SUMO1 e o domínio CID-GED de MxA estão envolvidos na interação entre essas proteínas e que esta interação independe de sequências SIM (SUMO-interacting motif) presentes em MxA. Ainda, foi possível determinar que Ubc9 interage diretamente com ... The human MxA protein is a member of the superfamily of GTPases dynamins. The so called Mx proteins are present in the majority of the vertebrate organisms investigated so far and contain two structural domains, named GTPase and CID-GED (stalk), besides the capabilities of homo-oligomerization and association with intracellular membranes. Moreover, the Mx proteins are strictly produced upon cell sensibilization with type I and III interferons. The vast antiviral activity against RNA and DNA viruses, including the Influenza virus and members of the bunyaviridae family, is among the functional properties of MxA. Moreover, MX1 epigenetic silencing is associated with cellular immortalization in neoplasias. Therefore, the study of MxA is of great interest as it is a key component of the Interferon-mediated pathways and cell proliferation control. Recentely, in a two-hybrid screen using a fetal brain cDNA library, it was possible to reveal that MxA interacts with proteins related to the post-translational modification process named SUMOylation and to the assemble of the nuclear bodies named PML-NBs and with proteins implicated in the control of transcription and apoptose. In this study, it was investigated the interaction between MxA and the components of the protein SUMOylation pathway. It was possible to confirm the physical interaction between MxA and Ubc9 and SUMO1, using co-immunopreciptation assay. Then, using the yeast two-hybrid system, it was possible to determine that the EIL (E67-interacting loop) region on SUMO1 interacts with the CID-GED domain of MxA without the requirement of the SIM sequences (SUMO-interacting motif) present in MxA. Moreover, it was determined that Ubc9 interacts with the GTPase domain of MxA and that MxA homo-oligomerization is important for its interaction with SUMO1 and Ubc9. Also, we were able to demonstrate for the first time that the protein MxA undergoes SUMOylation by SUMO1, SUMO2 and SUMO3. Finally, it ...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-03-13Bitstream added on 2014-06-13T19:50:21Z : No. of bitstreams: 1 rossi_d_dr_arafcf.pdf: 2120534 bytes, checksum: dbb516cdc2b1f35d02ea48dd40da8886 (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) O fator de início de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado em arqueas e em eucariotos e sofre uma modificação pós-traducional única e essencial chamada hipusinação. Este fator já foi relacionado com início de tradução, transporte nucleocitoplasmático, decaimento de mRNA e proliferação celular. Resultados recentes colocam essa proteína novamente no cenário da síntese proteica, mais especificamente na etapa de elongação da tradução. Estudos que relacionam eIF5A com proliferação celular e transição G1/S do ciclo celular e via secretória sugerem seu envolvimento com tradução específica de proteínas que atuam na progressão do ciclo celular. No intuito de avaliar a hipótese da participação de eIF5A na tradução de um subgrupo específico de mRNAs, envolvidos na via secretória e proliferação celular, este trabalho estudou inicialmente, o envolvimento de eIF5A na translocação de proteínas para o RE. Os resultados revelam que eIF5A não atua na via pós-traducional, mas sugere que desempenhe um papel na translocação pela via co-traducional. A análise proteômica realizada com um mutante de Dys1, que apresenta redução de eIF5A ativa, revelou diversas proteínas diferencialmente presentes, as quais participam dos processos de biogênese de ribossomo e regulação da tradução, ciclo celular, organização de membrana e via secretória. A proteína Asc1 foi selecionada para análises adicionais por ser uma proteína amplamente envolvida no controle traducional, por diversos mecanismos. Foram realizados ensaios de interação genética entre Asc1, Dys1 e eIF5A, e os resultados obtidos sugerem que essas proteínas participam, conjuntamente, da regulação do processo de tradução por afetar a tradução de grupos de... The translation initiation factor 5A (eIF5A) is highly conserved in archaea and eukaryotes and undergoes an unique and essential posttranslational modification named hypusination. This factor has been associated with translation initiation, nucleocytoplasmic transport, mRNA decay and cell proliferation. Recent results place this protein back in the protein synthesis scenario, acting specifically at the elongation step of translation. Studies that correlate eIF5A with cell proliferation, cell cycle and the secretory pathway suggest its involvement in the translation of specific mRNAs that act on cell cycle progression. In order to evaluate this hypothesis, this study has investigated the involvement of eIF5A in protein translocation into the ER. The results have shown that eIF5A does not act in the post-translational pathway, but suggest that it plays a role in protein translocation via the co-translational pathway. The proteomic analysis performed with a mutant of Dys1, which shows a reduction of active eIF5A, revealed many proteins differentially present, that participate in the process of ribosome biogenesis and regulation of translation, cell cycle, organization of membrane and secretory pathway. The protein Asc1 was chosen for futher analysis due to its involvemet in several mechanisms at translational control. We performed genetic interaction assays with Asc1, Dys1 and eIF5A, and the results suggest that these proteins coordinately... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-22Bitstream added on 2014-06-13T19:01:10Z : No. of bitstreams: 1 avacacrusca_js_dr_araiq.pdf: 1227782 bytes, checksum: 71826e714e84f8d90d13d72683afcd0a (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) O provável fator de início de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado de arqueas a mamíferos e sofre uma modificação pós-traducional única e essencial, em que uma lisina específica é convertida em um resíduo de hipusina. Este fator já foi relacionado ao transporte nucleocitoplasmático, à degradação de mRNA e à proliferação celular. Dados recentes restabelecem uma função para eIF5A na tradução e sugerem a sua atuação na etapa de elongação ao invés de início, como originalmente proposto. Uma vez que o envolvimento de eIF5A com o degradação de mRNA ainda não foi elucidado, tornou-se interessante estudar qual a natureza desta relação. O metabolismo de mRNA é um processo complexo que envolve as etapas da tradução (mRNAs nos polissomos), repressão da tradução (mRNAs acumulados em grânulos de estresse) e degradação de mRNA (mRNAs nos P bodies). Os componentes da maquinaria de degradação de mRNA acumulam-se nos P bodies e, neste trabalho, foi verificado que eIF5A não se localiza nestes corpúsculos. Ainda, foi avaliada a formação de P bodies no mutante tif51A-3, na temperatura não permissiva (38ºC), e foi verificada uma inibição na formação de P bodies. Outros mutantes com defeitos na elongação da tradução, como cca1-1 e eft2H699K, também apresentaram defeito na agregação dos P bodies. Foi avaliada a existência de interação genética sintética entre os mutantes tif51A-1 e tif51A-3 e mutantes de fatores envolvidos com a repressão da tradução e/ou degradação de mRNA. Foi revelada uma supressão parcial do fenótipo de termossensibilidade com nocautes dos genes SBP1, DHH1 e PAT1, que codificam fatores ativadores da remoção do capacete e repressores da tradução. Por outro lado, uma interação sintético doente entre os mutantes tif51A-1 e xrn1Δ foi... The putative translation initiation factor 5A (eIF5A) is highly conserved from archaea to mammals and undergoes an unique and essential post-translational modification, in which a specific lysine residue is converted into a hypusine residue. This factor has been involved in several cellular processes such as nucleocytoplasmic transport, mRNA decay and cell proliferation. Recent data have re-established a function for eIF5A in translation and suggests a role in elongation rather than initiation as originally proposed. Since the involvement of eIF5A with mRNA decay has not been elucidated it has become interesting to study the aspects of this relationship. mRNA metabolism is a complex process that involves the steps of translation (mRNAs on the polysomes), translation repression (mRNAs accumulated in granules) and mRNA degradation (mRNAs in P bodies). The mRNA degradation machinery accumulates in P bodies and in this study we have verified that eIF5A is not localized inside them. P bodies assembly was evaluated in the tif51A-3 mutant at non-permissive temperature and this aggregation was inhibited. Other mutant strains with defects in translation elongation, such as cca1-1 e eft2H699K, also presented defective P body assembly. The existence of synthetic genetic interactions between the eIF5A mutants, tif51A-1 and tif51A-3, and translation repression and/or mRNA decay mutants was evaluated. A partial suppression of the temperature sensitive phenotype of the eIF5A mutants was revealed when SBP1, DHH1 and PAT1 genes were deleted. Since those proteins are decapping activators and translational repressors these interactions reveal a putative function for eIF5A as an inhibitor of translation repression. However, a synthetic sick phenotype between tif51A-1 and xrn1Δ mutants was observed. Finally, stress granules... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-01-22Bitstream added on 2014-06-13T18:41:22Z : No. of bitstreams: 1 dias_cao_dr_araiq.pdf: 1123564 bytes, checksum: ea894f973e080c3d5cae0ce5cf5f2c2e (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) O fator de início de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado de arqueas a mamíferos e é essencial para a viabilidade celular. Este fator tem sido associado com o início da tradução, proliferação celular, transporte nucleocitoplasmático e decaimento de mRNA. Estudos recentes associam eIF5A com a elongação, ao invés do inicio da tradução. eIF5A é a única proteína conhecida que contém o aminoácido essencial hipusina, gerado pelas enzimas desoxihipusina sintase e desoxihipusina hidroxilase. O objetivo deste estudo foi a caracterização estrutural e funcional de eIF5A de S. cerevisiae. Primeiramente, a estrutura terciária de eIF5A foi determinada por cristalografia e foi demonstrada a sua dimerização em solução, independentemente do resíduo hipusina. Foram obtidos e caracterizados 40 mutantes novos de eIF5A, dos quais 19 não complementaram o nocaute do gene selvagem, 13 apresentaram fenótipo de termossensibilidade e 8 não apresentaram nenhuma alteração nos fenótipos investigados. A maioria dos mutantes novos tem seus fenótipos resultantes da degradação da proteína eIF5A. Curiosamente, este é o primeiro estudo que sugere que a α-hélice presente no C-terminal de eIF5A é essencial para a manutenção da sua estrutura. Descrevemos também, que a extensão N-terminal de eIF5A, presente apenas em eucariotos, não é essencial para estrutura e função dessa proteína. Além disso, os mutantes contendo substituições na alça onde está localizado o aminoácido hipusina são inviáveis ou termossensíveis. Embora estes mutantes produzam eIF5A, inclusive na temperatura não permissiva, a proteína produzida não é hipusinada. Finalmente, dois mutantes termossensíveis (tif51AK56A e tif51AQ22H/L93F) produzem a proteína eIF5A estável na temperatura não permissiva, no entanto, apresentam... The translation initiation factor 5A (eIF5A) is highly conserved from archae to mammals and is essential for cell viability. This factor has been associated with translation initiation, cell proliferation, nucleocytoplasmatic transport and mRNA decay. Recent studies show eIF5A involved in elongation, rather than translation initiation. eIF5A is the only protein known to contain the essential amino acid residue hypusine, generated by the enzymes deoxyhypusine synthase and deoxyhypusine hydroxylase. The main goal of this study was the structural and functional characterization of S. cerevisiae eIF5A. First of all, the tertiary structure of eIF5A was determined by crystallography and this protein was defined as a dimer in solution, independently of the hipusine residue. We obtained and characterized 40 new mutants, which 19 cannot complement tif51A knockout cells, 13 are temperature-sensitive and 8 show no detectable phenotype. The phenotypes of most mutantes are caused by protein folding defects. Interestingly, this is the first study suggesting that the C-terminal -helix present in yeast eIF5A may be an essential structural element. Moreover, we describe that the eIF5A N-terminal extension present only in eukaryotic homologues is not essential in yeast. Furthermore, the mutants containing substitutions surrounding the hypusine modification site showed unviable or temperature-sensitive phenotypes. Although these mutant proteins were stable, they were defective in hypusine modification. Finally, two of the temperature-sensitive mutant strains (tif51AK56A and tif51AQ22H/L93F) produced stable eIF5A protein but showed defects in growth and protein synthesis and these mutants revealed polysome profile defect similar to that described for mutations in factors involved in translation... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-12-15Bitstream added on 2014-06-13T18:09:16Z : No. of bitstreams: 1 carvalho_ceb_me_araiq.pdf: 1957153 bytes, checksum: b0ae4e0d1fb8956ef357b8e5d40d4f21 (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) A metilação de ilhas CpG em regiões regulatórias de vários genes tem sido descrita como um processo importante no silenciamento de genes supressores de tumor e diretamente envolvida no processo de carcinogênese de uma série de tumores. O estudo desses genes afetados pela metilação em tumores visa identificar possíveis marcadores moleculares para o diagnóstico, prognóstico e tratamento de tumores, além de possibilitar a descoberta de fatores importantes no processo biológico do câncer. Neste sentido, ao estudar o perfil diferencial de metilação de genes em carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço, o gene MX1 foi identificado como diferencialmente expresso. Correlação também foi encontrada entre o silenciamento de ADAM23 e estágios tardios da progressão tumoral neste tipo de câncer. Dessa forma, o presente estudo envolveu a identificação de ligantes celulares das proteínas ADAM23 e MX1 por meio de rastreamentos de duplo- híbrido, usando bibliotecas de cDNA de cérebro fetal humano. Inicialmente, foi realizado rastreamento com os domínios desintegrina e rico em cisteína (DIS-ACR) de ADAM23, com um total de 5,1x105 transformantes obtidos, dos quais somente 1 foi confirmado pelo ensaio de “plasmid linkage”. O candidato confirmado pelo “plasmid linkage”, identificado como SPRY1, foi considerado como falso positivo por ser uma proteína estritamente citoplasmática, não podendo, portanto, interagir fisicamente com os domínios DIS-ACR de ADAM23, que são extracelulares. Ainda, foi realizado rastreamento com a proteína MX1, que resultou em aproximadamente 1,0x106 transformantes, dos quais 74 foram confirmados pelo ensaio de duplo- híbrido e codificam para 9 ligantes já conhecidos e 21 ligantes prováveis de MX1. Entre esses ligantes prováveis estão proteínas que já haviam sido descritas como ligantes de MX1, incluindo a própria proteína MX1,... The methylation of CpG islands at regulatory regions of various genes has been described as an important process for the silencing of tumor suppressor genes and is directly involved in the carcinogenesis of a series of tumors. The study of these methylation-affected genes in tumors aims at identifying possible molecular markers for diagnostic, prognostic and treatment of such tumors, besides making possible the discovery of factors important for cancer biology. On this purpose, the study of differential pattern of gene methylation in head and neck squamous cell carcinoma identified the gene MX1 as differentially methylated. Together with this result, it was found a correlation between ADAM23 silencing and late stages of tumor progression in this type of cancer. In order to identify cellular ligands of ADAM23 and MX1, we performed two-hybrid screenings using fetal brain cDNA libraries. Initially, a screening with the disintegrin and cystein rich (DIS-ACR) domains of ADAM23 was accomplished, with an amount of 5,1x105 transformants obtained, out of which just one was confirmed by plasmid linkage assay and identified as SPRY1. However, it was considered a false positive since this protein is restricted to the cytoplasmatic compartment and, therefore, it may not physically bind the DIS-ACR domains of ADAM23, known to be extracellular. Additionally, a screening with the MX1 protein was performed, resulting in approximately 1.0x106 transformants, out of which 74 were confirmed by two-hybrid assay and revealed 9 already known and 21 putative ligands of MX1. Among the putative ligands there are proteins previously described as MX1 ligands, including MX1 itself, corroborating the results obtained in our screening. Moreover, most of the identified ligands are factors involved in protein SUMOylation, PML-NB assembly and proteins that are related to transcriptional control and apoptosis. The results ... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-01-25Bitstream added on 2014-06-13T18:41:25Z : No. of bitstreams: 1 cano_vsp_dr_araiq.pdf: 7066563 bytes, checksum: 8a9c3624091ccc481f0a5993a6d2b85a (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Em um rastreamento por duplo-híbrido, dois parceiros físicos de eIF5A foram identificados: Dys1 e Lia1 (Ligante de eIF5A). Lia1 foi identificada mais tarde como desoxihipusina hidroxilase. As interações físicas evidenciadas por duplo-híbrido foram confirmadas por copurificação. Mapeamento do sítios de ligação de eIF5A revelou que ambos os domínios N- e C-terminal podem ligar-se a Dys1, enquanto que o domínio Cterminal é suficiente para a ligação com Lia1. Pela primeira vez foi demonstrado in vivo que a estrutura secundária em -hélice, presente na extremidade N-terminal da proteína Dys1, pode modular a atividade da enzima através do impedimento estérico da entrada do substrato eIF5A no sítio ativo. Experimentos de inativação gênica mostraram que, em contraste com eIF5A e Dys1, Lia1 não é essencial para a viabilidade celular. Superexpressão do gene LIA1 não suprime o fenótipo temperatura-sensível de mutantes condicionais de eIF5A. Além disso, os alelos de TIF51A não são sinteticamente letais com a deleção de LIA1. Assim como previamente demonstrado para a enzima humana DOHH, o ferro também é essencial para a atividade hidroxilásica de Lia1. O sítio ativo de Lia1 é compreendido pelos resíduos de aminoácidos H79, E80, H112, E113, E116, H237, E238, H270 e E271. A proteína recombinante é uma mistura de formas ligada e não ligada ao metal, as quais foram separadas por gel nativo ou gel filtração, sugerindo um raio hidrodinâmico maior para a apoenzima. A forma mais alongada adotada por Lia1 na ausência do metal foi confirmada por ensaios de “quenching” da fluorescência do triptofano por acrilamida e SAXS. Além da alteração conformacional e inativação da enzima, a perda do metal levou à maior instabilidade de Lia1 na desnaturação térmica ou química. Os resultados obtidos em conjunto mostram que, além de manter a estabilidade da proteína... In a two-hybrid screen, two eIF5A binding partners were identified: Dys1 and Lia1 (Ligand of eIF5A). Lia1 was further identified as deoxyhypusine hydroxylase. The two-hybrid interactions were confirmed by GST pulldown. Mapping binding sites for these proteins revealed that both eIF5A domains can bind to Dys1, whereas the C-terminal domain is sufficient to bind Lia1. We demonstrate for the first time in vivo that the N-terminal α-helix of Dys1 can modulate enzyme activity by impairing eIF5A interaction. Gene disruption studies showed that, in contrast to the essential nature of eIF5A and Dys1, Lia1 is not essential for cell viability. Overexpression of LIA1 gene does not suppress temperature-sensitivity of eIF5A mutants. Moreover, these TIF51A alleles are not synthetically lethal with a knockout strain of LIA1. Recently, It was shown that LIA1 encodes the enzyme responsible for the final step of hypusine formation, the metalloenzyme deoxyhypusine hydroxylase. As the hydroxylation step in hypusine synthesis is not required for eIF5A activity, lack of genetic interactions between these two genes is expected. As previously demonstrated for the human enzyme DOHH, iron is also essential for Lia1 hydroxylase activity. Lia1 active site is formed by aminoa cid residues H79, E80, H112, E113, E116, H237, E238, H270 and E271. The recombinat protein is a mixture of iron-bound and iron-free forms, which were separated by native gel or gel filtration, suggesting a bigger hydrodynamic radius for the apoenzyme. The elongated shape adopted by Lia1 in the absence of the metal was confirmed by acrylamide quenching of tryptophan intrinsic fluorescence and SAXS. In addition to the conformational change and enzyme inactivation, loss of iron led to higher instability of Lia1 during thermal or chemical unfolding. Taken together, the results show that, besides the ability of iron to keep the stability of the protein...(Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-30Bitstream added on 2014-06-13T20:41:05Z : No. of bitstreams: 1 apponi_lh_dr_araiq.pdf: 2630425 bytes, checksum: bd39235826e1f6c4a56f84fffab81fff (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) A expressão gênica pode ser regulada em eucariotos em diversas etapas dometabolismo de mRNA, como transcrição, processamento, tradução e degradação. A estabilidade de mRNA é modulada por elementos presentes no transcrito e por proteínas ligantes de RNA associadas a esses elementos. Pub1 de S. cerevisiae é uma proteína citoplasmática capaz de estabilizar transcritos contendo elementos ricos em AU (ARE e ARE-like) ou elementos estabilizadores (STE). O presente trabalho identificou num rastreamento de duplo-híbrido a proteína Nab2 como ligante de Pub1. Nab2 é uma proteína nucleocitoplasmática essencial que regula o comprimento da cauda poli(A) e a exportação nuclear de mRNA. A interação entre Pub1 e Nab2 foi confirmada por co-purificação e ensaio de interação in vitro. Foi demonstrado também que essa interação é mediada pelo domínio de dedos de zinco presente na região C-terminal de Nab2. A análise da relação funcional entre essas duas proteínas revelou que Nab2, assim como Pub1, é capaz de modular a estabilidade de mRNA. A estabilidade do transcrito de RPS16B, mensageiro contendo sequência ARE-like e regulado por Pub1, é diminuída nos mutantes nab2- 1 e nab2-67. No entanto, a estabilidade do transcrito de GCN4, mensageiro contendo STE e também regulado por Pub1, não é afetada nos mesmos mutantes. Resultados semelhantes foram observados para outros transcritos contendo sequências ARE-like ou STE. Ainda, dados obtidos com um mutante da via NMD (?upf1) mostraram que esta via de decaimento não está envolvida com o mecanismo de estabilização de RPS16B mediada por Pub1 e Nab2. Uma análise mais profunda mostrou que a sequência ARE-like presente no mensageiro de RPS16B é necessária para a estabilização mediada por Nab2. A proteína Pub1 e seus domínios isolados foram produzidos e purificados, mas não foi possível a obtenção de cristais para... Regulation of gene expression can occur at different levels of mRNA life cycle, including transcription, processing, translation and degradation. mRNA stability is modulated by elements in the mRNA transcript and their cognate RNA-binding proteins. Poly(U)-binding protein 1 (Pub1) is a cytoplasmic S. cerevisiae mRNA binding protein that stabilizes transcripts containing AU-Rich Elements (ARE and ARE-like) or Stabilizer Elements (STE). In a yeast two-hybrid screen, we identified Nuclear poly(A)-binding protein 2 (Nab2) as a Pub1-interacting protein. Nab2 is an essential nucleocytoplasmic shuttling mRNA binding protein that regulates poly(A) tail length and mRNA export. The interaction between Pub1 and Nab2 was confirmed by co-purification and in vitro binding assays. The interaction is mediated by the Nab2 zinc finger domain. Analysis of the functional link between these proteins reveals that Nab2, like Pub1, can modulate the stability of specific target mRNA transcripts. We find that the half-life of the RPS16B transcript, an ARE-likecontaining Pub1 target, is decreased in both nab2-1 and nab2-67 mutants. In contrast, GCN4, an STE-containing Pub1 target, is not affected. Similar results were obtained with other ARE- and STE-containing Pub1 target transcripts. Additionally, results obtained with a mutant of the NMD pathway (?upf1) showed that this pathway is not involved in the mechanism of RPS16B stabilization mediated by Pub1 and Nab2. Further analysis reveals that the ARE-like sequence is necessary for Nab2- mediated transcript stabilization. Full-length Pub1 and isolated domains were produced and purified, however, it was not possible to obtain protein crystals for tertiary structure determination. Taken together, these results suggest that Nab2 acts together with Pub1 to modulate mRNA stability and strengthen a model where nuclear events involved in mRNA biogenesis...(Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-27Bitstream added on 2014-06-13T20:01:23Z : No. of bitstreams: 1 frigieri_mc_dr_araiq.pdf: 1480583 bytes, checksum: 81dab6a7f6da1d10c98a3b59c3b167fd (MD5) O Poli ácido glutâmico (PAG) é um poliaminoácido sintético formado por unidades repetitivas de glutamato, que apresentam grupos carboxilas ao longo de sua cadeia principal. A preparação de eletrodos de carbono vítreo modificados com filmes de PAG foi investigada utilizando-se três diferentes procedimentos: eletropolimerização do ácido glutâmico (MONO); deposição direta de poli ácido glutâmico (PAG) e poli ácido glutâmico:glutaraldeído (PAG:GLU) seguida de secagem a temperatura ambiente. Após secagem, o eletrodo modificado foi submetido a ciclos sucessivos entre -0,8 a +2,0 V sob velocidade de varredura de 100 mV s-1. O ácido ascórbico foi usado como composto modelo para os eletrodos modificados, os quais apresentaram um efeito eletrocatalítico na oxidação do mesmo. Os eletrodos modificados foram caracterizados por microscopia de força atômica (AFM) e espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS). O recobrimento sobre a superfície pela adição de PAG apresentou a melhor performance exibindo filmes nanoestruturados e uniformes com baixa resistência à transferência de carga. Os eletrodos modificados por filmes PAG foram usados para estudar a oxidação do flavonóide rutina. Os resultados mostraram um par de picos redox em +0,46/+0,43 V, usado para a pré-concentração da rutina. Uma curva analítica foi obtida no intervalo de 0,9 a 9,0 μmol L-1 e o método proposto foi aplicado para análise do antioxidante em formulação farmacêutica. Os eletrodos modificados por filmes PAG foram também usados para determinação de ácido cafêico. Um par de pico redox reversível em +0,42/+0,45 V foi obtido para o ácido cafêico em tampão B-R pH 3,5. O método foi aplicado para a determinação de ácido cafêico em amostra de vinho tinto, detectando nível de concentração de 34,8μg mL-1 sem tratamento prévio da amostra. Os filmes de PAG:GLU foram... The poly glutamic acid (PAG) is a syntetic poliamonacid composed by repetitive glutamate units that shows carboxylic groups in the long of the principal chain. Films of PAG on the glassy carbon electrode was investigated by three diferents procedures: glutamic acid eletropomelimerization (MONO), direct deposition of the poly glutamic acid (PAG) and poly glutamic acid:glutaraldehyde (PAG:GLU), followed by drying at room temperature. After solvent evaporation, the modified electrode was submitted by cycles sucessives from -0.8 to +2.0 V at scan rate of 100 mV s-1. The ascorbic acid was used as a model compound in the modified electrodes, which presented an electrocatitic effect in the oxidation of the ascorbic acid. The modified electrodes were characterized by atomic force microscopy (AFM) and electrochemistry impedance spectroscopy (EIS). Coantings by poly glutamic acid onto the surface presented best performance by addition of PAG films that exhibits films nanostructured and uniforms with lower resistance to charge transfer. The modified electrode by PAG films were investigated to oxidation of rutin flavonoid. The results showed a redox pair of peaks at +0.46/+0.43 V, and linear analytical curve at 0.9 to 9.0 x 10-6 mol L-1. The method proposed was successful applied for rutin determination in pharmaceutical formulation. The modified electrode by PAG films was also used to determine cafeic acid. A reversible redox peak pair at +0.42/+0.45 V was obtained for cafeic acid at B-R buffer pH 3,5. The method was applied for cafeic acid determination in the red wine, where the concentration of the 34,8 μg mL-1 was obtained, without any pre-treatment of the sample. The PAG:GLU films onto the glass carbon electrode were also efficient to pre-concetrate and to determine amoxycilin (AMX) and doxorubicin (DXR) in human urine sample. Linear calibration graphs were obtained from 2,0 a 25,0 x 10-6 mol L-1...(Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-05-29Bitstream added on 2014-06-13T19:40:42Z : No. of bitstreams: 1 pandolfi_jrc_dr_araiq.pdf: 716701 bytes, checksum: 707d1bc6d263e145f12c4e53feeae657 (MD5) O presente trabalho evidencia os esforços realizados na tentativa de se aperfeiçoar a técnica de MIRU (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units). Esta utiliza como marcadores, diferenças em fragmentos de DNA não codificadores específicos do Mycobacterium tuberculosis e vem sendo empregada para o estudo epidemiológico da tuberculose, pela facilidade de execução. A técnica de MIRU possibilita uma comparação entre linhagens de diferentes áreas geográficas e permite o rastreamento da movimentação de linhagens individuais. Na otimização os seguintes parâmetros foram determinados: 1. protocolos de purificação de DNA; 2. estratégias de amplificação pela PCR; 3. comparações entre um kit de PCR (PCR Master Mix - PROMEGA) e a utilização da PCR da maneira convencional; 4. testes de variadas condições de amplificação utilizando o kit e os reagentes convencionais de PCR; 5. determinação de protocolos de ciclagem para a amplificação dos fragmentos desejados; 6. teste de amplificação sem a prévia extração de DNA das amostras utilizadas. Após a padronização a metodologia foi utilizada na tipagem de 82 amostras de M. tuberculosis que se encontravam divididas em dois grupos, sendo o primeiro com 49 amostras, provenientes de pacientes do Serviço Especial de Saúde de Araraquara (SESA - USP, Araraquara) e o segundo, composto de 33 amostras de bactérias com perfil de resistência a pirazinamida e a outras drogas, provenientes de Maringá. Nesta etapa foram realizados: 7. PCR para a confirmação de gênero e espécie para M. tuberculosis nas 82 amostras analisadas. 8. Aplicação da técnica de MIRU e análise manual de todas as amostras provenientes de pacientes; 9. Emprego de ferramentas de bioinformática (programa PAST Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis) para a análise das amostras... The present work shows efforts to improve the MIRU (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units) assay. This methodology, that has been exploited for fingerprinting the Mycobacterium tuberculosis in molecular epidemiological studies, allows for direct and reliable comparison of results between laboratories and the development of large-scale epidemiological studies. In the optimization of MIRU assay, some parameters were defined: DNA purification protocols and PCR strategies were compared, to select the most practical and economical among them. After the standartization, 82 M. tuberculosis strains, from two different groups were analised. The 49 bacteria strains from the first group were sensible and the 33 from the second one were resistant to pyrazinamide and another drugs as isoniazide and/or rifampicin. To stablish the allelic studies the samples were first confirmed as M. tuberculosis by PCR. Then the MIRU assay was applied and the genetic profile was determined. These results generated dendrograms, obtained by bioinformatic tools. This study showed that any kind of DNA purification and even the use of fresh bacterial culture directly into the PCR tube can be used. When the PCR strategies were compared the utilization of the PCR kit seemed to be more practical and to avoid some mistakes that can happens during the home-made PCR mixture preparation. Furthermore, it allows some dilutions higher than those recommended by the manufacturer. In the same way, the home-made mixture in amounts smaller than those suggested can be used. These experiments indicated that only two annealing temperatures can be used to the PCR with the twelve primer pairs, always in the same MgCl2 concentration, allowing the amplification of more samples at the same time. To generate dendrograms with the allelic data from clinical samples... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-03-08Bitstream added on 2014-06-13T21:01:42Z : No. of bitstreams: 1 zanelli_cf_dr_araiq.pdf: 5712697 bytes, checksum: 1977a3ae4700587d216d3af5de0d62a1 (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) O fator de início de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) é uma proteína altamente conservada desde arquebactérias a mamíferos e sofre uma modificação póstraducional única, necessária para sua maturação funcional, chamada de hipusinação. Apesar do grau de conservação de eIF5A, e da essencialidade de sua função nos organismos estudados, seu papel no metabolismo celular ainda se encontra indeterminado. Vários mutantes condicionais de eIF5A, sensíveis ao aumento de temperatura, têm sido isolados e caracterizados na levedura Saccharomyces cerevisiae. Utilizando um desses mutantes de eIF5A, o alelo tif51A-1, foi isolado o gene PKC1 como um supressor em alto número de cópias do fenótipo de sensibilidade a temperatura deste mutante. O entendimento de como se dá esta interação genética foi um dos enfoques deste trabalho. Foi mostrado que a via de MAP quinases que atua abaixo de Pkc1 não é responsável pela supressão deste mutante e a identificação dos novos supressores do mutante tif51A-1, GIC1 e ZDS1, levou à sugestão de uma nova via de sinalização a partir de Pkc1. Com a realização de experimentos subsequentes, foi confirmado que a nova via Pkc1-Zds1-Gic1 é responsável pela supressão do mutante tif51A-1 promovida por PKC1. Além disso, estes três supressores são importantes para a polaridade celular em S. cerevisiae, um processo essencial para a progressão no ciclo celular deste organismo, e, interessantemente, os mutantes tif51A-1 e tif51A-3 de eIF5A evidenciaram defeitos na polarização do citoesqueleto de actina na temperatura não permissiva. Esses dados evidenciam uma correlação de eIF5A com progressão no ciclo celular de S. cerevisiae. The eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A) is a highly conserved protein from archaebacteria to mammals and undergoes hypusination, an essential unique post-translational modification. Despite the high degree of conservation of eIF5A and its essential function in the studied organisms, its cellular role remains unclear. Several temperature-sensitive eIF5A mutants have been isolated and characterized in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Using one of these mutants, the tif51A-1 allele, PKC1 was identified as a high-copy suppressor of the temperature-sensitive phenotype shown by this mutant. The understanding of this genetic interaction was one of the aims of this work. It was shown that the MAP kinase cascade downstream Pkc1 is not responsible for this phenotypic suppression and the identification of the new tif51A-1 suppressors, GIC1 and ZDS1, suggested a new signaling pathway branching from Pkc1. Further analysis confirmed that Pkc1-Zds1-Gic1 constitute a new pathway that is responsible for tif51A-1 mutant suppression promoted by PKC1. Moreover, these three suppressors are important for cell polarity in S. cerevisiae, an essential process for cell cycle progression in yeast, and, interestingly, the eIF5A mutants tif51A-1 and tif51A-3 showed defects in actin cytoskeleton polarization at the restrictive temperature. These data supported a connection between eIF5A and cell cycle progression in S. cerevisiae. As eIF5A was originally implicated in the process of translation, in order to better investigate the specific function of this factor, polysomal profiling analysis was performed and it was demonstrated that eIF5A interacts with monosomes in a tranlation dependent manner and, besides that, eIF5A mutants show altered polysomal distribution suggesting a possible defect in the elongation step of translation.