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[ES] La modificación N-6-metiladenosina (m6A) del RNA es la más abundante en mRNAs de eucariotas. Esta modificación está regulada por proteínas que incorporan el grupo metilo (metiltransferasas, conocidas como escritoras), proteínas que lo eliminan (desmetilasas, conocidas como borradoras) y proteínas que lo reconocen (conocidas como lectoras). La modificación m6A ejerce su función al ser reconocida por estas proteínas lectoras, que poseen un dominio de unión a m6A, y mediante la alteración indirecta de la estructura del RNA. En estudios recientes se ha puesto de manifiesto que esta modificación se realiza también sobre virus de RNA y que el estado de metilación del genoma viral repercute en gran medida sobre el ciclo infectivo del virus. Sin embargo, el conocimiento sobre los mecanismos de actuación de la maquinaria de m6A frente a infecciones virales en plantas son aún muy limitados. Entender la relevancia biológica de esta modificación sobre la patogenicidad, resultaría de gran importancia para permitir el desarrollo de estrategias de control de virus de plantas, dado que estos representan una grave amenaza para la economía y la seguridad alimentaria. Por lo tanto, en este Trabajo Final de Máster se ha pretendido ampliar el estudio de la modificación m6A en virus de plantas que no se habían analizado antes, como TRV, TCV y TuMV; también se ha comprobado si m6A es un mecanismo regulador universal y se ha estudiado el papel de las desmetilasas ALBKH9B, ALKBH10B y las proteínas lectoras ECT2/ECT5. Por último, se ha modificado una sección del genoma de AMV, insertando una etiqueta HA, para permitir su posterior detección y la identificación de nuevos factores que participen en la interacción virus-huésped., [EN] The N-6-methyladenosine (m6A) modification of RNA is the most abundant in eukaryotic mRNAs. This modification is regulated by proteins that incorporate the methyl group (methyltransferases, known as writers), proteins that remove it (demethylases, known as erasers) and proteins that recognize it (known as readers). The m6A modification exerts its function by being recognized by these reader proteins, which possess an m6A-binding domain, and by indirectly altering the RNA structure. Recent studies have shown that this modification is also carried out on RNA viruses and that the methylation status of the viral genome has a major impact on the infectious cycle of the virus. However, knowledge about the mechanisms of action of the m6A machinery against viral infections in plants is still very limited. Understanding the biological relevance of this modification on pathogenicity would be of great importance to enable the development of plant virus control strategies, given that plant viruses represent a serious threat to the economy and food security. Therefore, in this Master's thesis we have aimed to extend the study of the m6A modification in plant viruses that had not been analyzed before, such as TRV, TCV and TuMV; we have also tested whether m6A is a universal regulatory mechanism and we have studied the role of the demethylases ALBKH9B, ALKBH10B and the ECT2/ECT5 reader proteins. Finally, a section of the AMV genome has been modified by inserting an HA tag to allow its subsequent detection and the identification of new factors involved in virus-host interaction.

[ES] La N6-metiladenosina (m6A) es una modificación generalizada en los ARN celulares de diferentes organismos que puede afectar muchos procesos y vías celulares. En las plantas, ocurre mediante un complejo de metilación que contiene varias proteínas: MTA, MTB, FIP37, VIR y HAKAI. Esta modificación es eliminada por desmetilasas de la familia AlkB, mientras que los miembros de la familia ETC son las proteínas mejor descritas que reconocen y procesan los ARN m6A-modificados. Estudios de epitransciptómica viral han revelado un papel igualmente importante de m6A durante la infección por virus; sin embargo, no existe una función pro- o antiviral de m6A generalizada. El laboratorio donde se ha llevado a cabo este trabajo ha sido pionero en el estudio del efecto de m6A en la interacción planta-virus, utilizando como virus modelo el AMV. El AMV pertenece a la familia Bromoviridae, y su genoma está formado por tres (+)ssARN. Los ARN1/2 codifican las subunidades de replicasa (P1 y P2), mientras que el ARN3 codifica la proteína de movimiento (MP) y sirve como molde para la síntesis del sgARN4, que codifica la proteína de cubierta (CP). Al comienzo de esta tesis, nuestro laboratorio ya había informado sobre: la presencia de supuestos motivos m6A en el 3'UTR/RNA3, una región crítica para la replicación de AMV, la primera m6A-desmetilasa de Arabidopsis (ALKBH9B), la relevancia funcional de ALKBH9B para mantener niveles adecuados de m6A/A para la correcta replicación de AMV, la capacidad de la CP de AMV para interactuar con ALKBH9B, posiblemente para usurpar la actividad de ALKBH9B, y la capacidad de las proteínas de Arabidopsis ECT2/3/5 para interactuar con el ARNv de AMV que contienen m6A. Dada la relevancia funcional de m6A en la biología de AMV, en esta tesis se decidió profundizar en el conocimiento de las implicaciones del mecanismo de regulación de m6A en el ciclo infeccioso viral de AMV. Para ello, se decidió: profundizar en la comprensión funcional de la m6A-desmetilasa ALKBH9B, evaluar la función in vivo de los supuestos dos sitios m6A presentes en el 3'UTR/ARN3, y explorar una posible implicación de algunas m6A metiltransferasas en la infección causada por AMV. El mapeo de los subdominios funcionales de atALKBH9B determinó la presencia de IDRs en la región N-terminal, dentro del dominio interno similar a AlkB y en la región C-terminal. Alrededor del 78% del RBD identificado en ALKBH9B está contenido en el IDR C-terminal. Debido a que las IDRs se localizan con frecuencia en proteínas que se someten a LLPS, un proceso que probablemente contribuye a la formación y estabilidad de los gránulos de ARN, es posible que las IDR y la RBD de ALKBH9B puedan actuar de manera cooperativa para promover la formación de gránulos de ARN. El análisis de los putativos motivos DRACH localizados en el bucle de hpB y en el tallo inferior de hpE del 3'UTR/ARN3 de AMV demostró que son sitios críticos involucrados en la replicación in vivo de AMV. La identidad de los residuos 2012A, 2013A y 2014A en el bucle hpB parece ser un requisito estructural clave para la replicación y/o acumulación de AMV. Con respecto a hpE, nuestros resultados determinaron que el supuesto residuo de m6A (1902A), así como el apareamiento de bases del tallo inferior de hpE, también son requisitos esenciales para la síntesis in vivo de ARNs de cadena positiva en AMV. Hasta donde sabemos, esta es la primera evidencia en AMV que muestra que el bucle de hpB y el tallo inferior de hpE están involucrados en la replicación/acumulación viral y la síntesis de ARNs de cadena positiva, respectivamente. Finalmente, en cuanto al estudio de la influencia de las m6A-metiltransferasas en el ciclo de infección viral de AMV, no se determinó un efecto proviral y/o antiviral en el complejo m6A-ARNm metiltransferasa conformado por atMTA:atMTB, ni en el putativo complejo m6A- ARNr metiltransferasa conformado por atMETTL5-like:atTRMT112-like sobre la biología de AMV., [CA] La N6-metiladenosina (m6A) és una modificació generalitzada en els ARN cellulars de diferents organismes que pot afectar molts processos i vies cellulars. En les plantes, ocorre mitjançant un complex de metilació que conté diverses proteïnes: MTA, MTB, FIP37, VIR i HAKAI. Aquesta modificació és eliminada per desmetilasas de la família AlkB, mentre que els membres de la família ETC són les proteïnes més ben descrites que reconeixen i processen els ARN m6A-modificats. Estudis de epitransciptómica viral han revelat un paper igualment important de m6A durant la infecció per virus; no obstant això, no existeix una funció pro- o antiviral de m6A generalitzada. El laboratori on s'ha dut a terme aquest treball ha sigut pioner en l'estudi de l'efecte de m6A en la interacció planta-virus, utilitzant com a virus model el AMV. El AMV pertany a la família Bromoviridae, i el seu genoma està format per tres (+) ssARN. Els ARN1/2 codifiquen les subunitats de replicasa (P1 i P2), mentre que l'ARN3 codifica la MP i serveix com a motle per a la síntesi del sgARN4, que codifica la CP. Al començament d'aquesta tesi, el nostre laboratori ja havia informat sobre: la presència de suposats motius m6A en el 3'UTR/RNA3, una regió crítica per a la replicació de AMV, la primera m6A-desmetilasa de Arabidopsis (ALKBH9B), la rellevància funcional d'ALKBH9B per a mantindre nivells adequats de m6A/A per a la correcta replicació de AMV, la capacitat de la CP de AMV per a interactuar amb ALKBH9B, possiblement per a usurpar l'activitat d'ALKBH9B, i la capacitat de les proteïnes de Arabidopsis ECT2/3/5 per a interactuar amb el ARNv de AMV que contenen m6A. Donada la rellevància funcional de m6A en la biologia de AMV, en aquesta tesi es va decidir aprofundir en el coneixement de les implicacions del mecanisme de regulació de m6A en el cicle infecciós viral de AMV. Per a això, es va decidir: aprofundir en la comprensió funcional de la m6A-desmetilasa ALKBH9B, avaluar la funció in vivo dels supòsits dos llocs m6A presents en el 3'UTR/ARN3, i explorar una possible implicació d'algunes m6A metiltransferasas en la infecció causada per AMV. El mapatge dels subdominis funcionals de atALKBH9B va determinar la presència de IDRs a la regió N-terminal, dins del domini intern similar a AlkB i a la regió C-terminal. Al voltant del 78% del RBD identificat en ALKBH9B està contingut en el IDR C-terminal. Pel fet que les IDRs es localitzen amb freqüència en proteïnes que se sotmeten a LLPS, un procés que probablement contribueix a la formació i estabilitat dels grànuls d'ARN, és possible que les IDR i la RBD d'ALKBH9B puguen actuar de manera cooperativa per a promoure la formació de grànuls d'ARN. L'anàlisi dels putatius motius DRACH localitzats en el bucle de hpB i en la tija inferior de hpE del 3'UTR/ARN3 de AMV va demostrar que són llocs crítics involucrats en la replicació in vivo de AMV. La identitat dels residus 2012A, 2013A i 2014A en el bucle hpB sembla ser un requisit estructural clau per a la replicació i/o acumulació de AMV. Respecte a hpE, els nostres resultats van determinar que el suposat residu de m6A (1902A), així com l'aparellament de bases de la tija inferior de hpE, també són requisits essencials per a la síntesi in vivo de ARNs de cadena positiva en AMV. Fins on sabem, aquesta és la primera evidència en AMV que mostra que el bucle de hpB i la tija inferior de hpE estan involucrats en la replicació/acumulació viral i la síntesi de ARNs de cadena positiva, respectivament. Finalment, quant a l'estudi de la influència de les m6A-metiltransferasas en el cicle d'infecció viral de AMV, no es va determinar un efecte proviral i/o antiviral en el complex m6A-ARNm metiltransferasa conformat per atMTA:atMTB, ni en el putatiu complex m6A-ARNr metiltransferasa conformat per atMETTL5-like:atTRMT112-like sobre la biologia de AMV., [EN] N6-methyladenosine (m6A) is a widespread modification on cellular RNAs of different organisms that can impact many cellular processes and pathways. In plants, m6A-methylation is mainly installed by a methylation complex containing several proteins: MTA, MTB, FIP37, VIR, and HAKAI. This modification is removed by demethylases of the AlkB family, and members of the ECT family are the best described proteins that recognize and process m6A-modified RNAs. Studies of viral epitransciptomics have revealed an equally important role of m6A during virus infection; however, there is no global pro- or antiviral role of m6A that can be generalized. The laboratory where this work was carried out has been a pioneer in the study of the effect of m6A on plant-viruses, using AMV as a model-virus. AMV belongs to the Bromoviridae family and, as the rest of the members of this family, its genome consists of three (+)ssRNAs. RNA1 and RNA2 encode the replicase subunits (P1 and P2), whereas RNA 3 encodes the MP and serves as a template for the synthesis of sgRNA 4, which encodes CP. At the beginning of this thesis, our laboratory had already reported on: the presence of putative m6A-motifs in the 3'UTR RNA3, a critical region for AMV replication, the first Arabidopsis m6A-demethylase (ALKBH9B), the functional relevance of ALKBH9B to maintain adequate m6A/A levels for correct AMV replication, the ability of AMV-CP to interact with ALKBH9B, possibly to usurp ALKBH9B activity, and the capability of Arabidopsis ECT2/3/5 to interact with m6A-containing AMV vRNAs. Given the functional relevance of m6A on the biology of AMV, in this thesis it was decided to deepen the knowledge of the implications of the m6A regulation mechanism on the viral infectious cycle of AMV. For this, it was decided: deepen the functional understanding of the m6A-demethylase ALKBH9B, evaluate the in vivo function of the putative two m6A-sites present in the 3'UTR-RNA 3, and explore a possible involvement of some m6A-methyltransferases in infection caused by AMV. We mapped functional subdomains in the atALKBH9B m6A-demethylase required for its binding to the vRNA and to the CP of AMV. Remarkably, it was observed the presence of IDRs in the N-terminal region, within the internal domain like AlkB and in the C-terminal region. About 78% of the RBD identified in ALKBH9B is contained in the C-terminal IDR. In this context, it has been proposed that the capability to specifically target different RNAs in RBPs containing IDRs is due to conformational flexibility as well as the establishment of extended conserved electrostatic interfaces with RNAs. Additionally, due that IDRs are frequently localized in proteins that undergo LLPS, a process that likely contributes to the formation and stability of RNA granules, it's possible that the IDRs and the RBD of ALKBH9B could act cooperatively to promote RNA granule formation. The analysis of the putative DRACH-motifs located in the hpB loop and the lower-stem of hpE in the 3'UTR RNA 3 present hot sites involved in AMV replication in vivo. The identity of residues 2012A, 2013A and 2014A in the hpB loop appears to be a key structural requirement for AMV replication and/or accumulation. Regarding hpE, our results determined that the putative m6A-residue 1902A, as well as the base pairing of the lower-stem of hpE, are also essential requirements for the in vivo plus-strand synthesis in AMV. To our knowledge, this is the first evidence in AMV to show that the hpB loop and the lower-stem of hpE are involved in viral replication/accumulation and plus-strand synthesis, respectively. Finally, regarding the study of the influence of m6A-methyltransferases on the viral infection cycle of AMV, a non-proviral and/or antiviral effect was determined in the m6A-mRNA methyltransferase complex made up of atMTA:atMTB, nor of the putative m6A-rRNA methyltransferase complex made up of atMETTL5-like:atTRMT112-like on the biology of AMV.

Made available in DSpace on 2021-06-25T10:25:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2021-01-01 BACKGROUND: Brevipalpus yothersi mite is the main vector of Citrus leprosis virus (CiLV), the causal agent of citrus leprosis disease. The acaricide spirodiclofen has been widely used to control this mite. However, failures in control using spirodiclofen have been frequently reported by citrus growers. In this study, we estimated the diagnostic concentration to monitor the resistance to spirodiclofen of B. yothersi populations collected in nine citrus groves in Brazil. We then selected the B. yothersi population that showed lowest mortality with the estimated diagnostic concentration of spirodiclofen to characterize the frequency of resistant individuals, as well as demographic and life table parameters. RESULTS: Variability was higher between populations in terms of susceptibility to spirodiclofen. The frequency of resistant eggs between populations ranged from 0.7% to 85.8%. The resistance ratio of B. yothersi to spirodiclofen was low to moderate. Survival rates of the immature stage, total adult longevity, oviposition days, and female fecundity were lower in the resistant strain. Furthermore, net reproduction rate, intrinsic rate of increase, finite rate of increase, and mean length of a generation were also lower in the R strain. CONCLUSION: Although variations in resistance to spirodiclofen were observed between populations, the resistance ratio was low to moderate. Such data can be useful in the development of resistance management strategies for B. yothersi in Brazilian citrus groves. Department of Agricultural Sciences São Paulo State University (UNESP) - College of Agricultural and Veterinary Sciences Department of Entomology and Acarology University of São Paulo (ESALQ/USP) Department of Agricultural Sciences São Paulo State University (UNESP) - College of Agricultural and Veterinary Sciences

Tomato chlorosis virus (ToCV) is a whitefly-transmitted crinivirus that causes yield losses, mainly in tomato (Solanum lycopersicum) and potato (S. tuberosum) crops. In this work, a polyclonal antiserum for detecting the virus using a dot-blot immunoassay was developed and the responses of crinivirus-infected potato genotypes were evaluated. The virus was purified using infected tomato leaves and the antiserum was obtained by intramuscular injection of purified viral preparations in rabbit. Tomato and potato tissue samples were used to validate the polyclonal antiserum for detection of ToCV, previously analyzed by RT-PCR. A total of 81 tomato and potato samples were analyzed by RT-PCR and dot-blot immunoassay (DBIA). All samples were positive in RT-PCR, but three of them did not react in DBIA, showing of 96.3% efficiency compared with that in RT-PCR. All potato genotypes inoculated with ToCV by Bemisia tabaci MEAM1 were susceptible to infection. Potato plants of cv. Camila infected by ToCV showed the lowest virus titer and were asymptomatic.

Made available in DSpace on 2021-06-25T10:46:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2021-05-01 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Bemisia tabaci is important in agriculture worldwide, mainly because it is a vector of numerous plant viruses, probably the most important of which are members of the genus Begomovirus. Dozens of begomoviruses have been reported to infect tomato plants in Brazil, although tomato severe rugose virus (ToSRV) predominates in tomato crops. ToSRV, found so far only in Brazil, is efficiently transmitted by B. tabaci MEAM1. However, no studies have assessed the occurrence of vertical and horizontal transmission of the virus in the insect, which may have epidemiological consequences affecting disease management. This study evaluated the possibility of transmission of ToSRV between whiteflies during copulation and transovarial transmission from viruliferous females of B. tabaci MEAM1 to their progeny. Transmission of ToSRV did not occur during mating between males and females of B. tabaci MEAM1. Aviruliferous males and females confined with viruliferous insects of the opposite sex were also unable to transmit the virus to tomato plants. ToSRV was detected, by PCR, in the ovaries of viruliferous females of B. tabaci MEAM1 but not in eggs, nymphs, or adults of the progeny of viruliferous females. Adult progeny of viruliferous females also did not transmit ToSRV to tomato plants. Together, the results indicate that vertical and horizontal transmission of ToSRV by B. tabaci MEAM1 is unlikely. Sustainable management of the tomato golden mosaic disease caused by ToSRV should continue to focus on using resistant varieties, managing sources of inoculum around tomato fields, and rational chemical control of the vector. Departamento de Fitopatologia e Nematologia Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz Universidade de São Paulo (USP) Departamento de Proteção de Plantas Faculdade de Ciências Agronômicas Universidade Estadual Paulista (UNESP) Departamento de Proteção de Plantas Faculdade de Ciências Agronômicas Universidade Estadual Paulista (UNESP) FAPESP: 2012/51771-4 FAPESP: 2018/01633-0 FAPESP: 2018/18274-3

This work reports the genome sequence, host responses and transmission assays of two isolates of catharanthus mosaic virus (CatMV) from plants of Mandevilla sp. in the state of Sao Paulo, Brazil. The complete genome sequences of CatMV isolates, M1 and M2, comprised 9593 and 9711 nucleotides, respectively. The deduced polyprotein showed 99% (M1) and 84% (M2) identities with the corresponding amino acid sequence of a CatMV from Australia. CatMV-M2 isolate was mechanically transmitted and systemically infected Nicotiana benthamiana and Catharanthus roseus. It also caused local lesions on inoculated leaves of Chenopodium amaranticolor and C. quinoa. This isolate was transmitted by Myzus persicae to plants of Mandevilla sp. CatMV-M1 isolate, however, did not infect any of the above plants when mechanically inoculated, neither was transmitted by M. persicae. Use of virus-free mother plants of Mandevilla sp. for seedling production is recommended for disease management.

[ES] En plantas, una de las respuestas antivirales más eficientes está basada en el proceso de silenciamiento por RNA que es disparado por RNAs de doble cadena virales y que, en última instancia, conduce a la degradación del RNA del virus invasor. Los virus han desarrollado estrategias para contrarrestar este proceso entre las que destaca la producción de proteínas que actúan como supresores de la ruta de silenciamiento (VSRs), al interferir con distintas etapas de la misma. Estos VSRs están siendo objeto de intensa investigación ya que están sirviendo como herramientas para desentrañar rutas de silenciamiento endógenas de las plantas (implicadas tanto en lucha antiviral como en regulación génica), porque constituyen dianas atractivas para el control de virosis y porque, además, presentan gran potencial biotecnológico. Este trabajo se centrará en el estudio de la proteína P0 codificada por el PeVYV-5, cuya actividad como VSR ha sido corroborada recientemente en el laboratorio. El objetivo general será el de obtener datos acerca de su mecanismo de acción, incluyendo la identificación de motivos relevantes y el análisis de su localización subcelular., [EN] In plants, one of the most efficient antiviral responses is based on the RNA silencing process, that is triggered by viral double-stranded RNAs and ultimately leads to the degradation of the RNA of the invading virus. Viruses have developed strategies to counteract this process, including the production of proteins that act as suppressors of the silencing pathway (RSV), by interfering with different stages of it. These VSR are the subject of intense research as they serve as tools to unravel endogenous silencing pathways in plants (involved in both antiviral control and gene regulation), because they are attractive targets for virosis control and because, in addition, they present great biotechnological potential. This work will focus on the study of the P0 protein encoded by PeVYV-5, whose activity as VSR has recently been confirmed in the laboratory. The main objective will be to obtain data about its mechanism of action, including the identification of relevant motifs and the analysis of its subcellular location.

Mites of the Brevipalpus genus are economically important due to their role as vectors of plant viruses. Among them, B. yothersi is well studied because it is the recognized main vector of the citrus leprosis virus C (CiLV-C), the causal agent of citrus leprosis, which is one of the most damaging viral diseases in the citrus crops. However, studies of several aspects of the biology of B. yothersi are still scarce, including its embryology. We performed a descriptive embryonic development study of B. yothersi, utilizing light and scanning electron microscope to obtain biological information of this particular phytovirus vector. Distinct events were recorded, such as centering of the nucleus, mitotic divisions for primitive body formation and appendages, as well as the presence of channels inside the egg and their possible association with the respiratory tract. Here we provide the first notes about embryonic development of this important mite vector in the Americas.

Maize striate mosaic virus (MSMV; genus Mastrevirus) was recently reported in maize plants in Brazil and also detected by metagenomic analyses in the corn leafhopper, Dalbulus maidis (DeLong & Wolcott). Although these findings suggested that D. maidis is a potential vector, no transmission studies have been performed. Here, we tested the transmission of MSMV by D. maidis from field-collected infected plants and plants infected with MSMV via leafhopper-mediated transmission in the laboratory; all plants were confirmed positive for MSMV by PCR. In each one of three transmission replicates, aviruliferous D. maidis nymphs and adults were confined together on a source plant during a 4-day acquisition access period (AAP) and subsequently transferred to healthy maize seedlings (10 individuals per test plant) in a series of 4-day inoculation access periods (IAPs). We also tested transmission by the corn aphid, Rhopalosiphum maidis (Fitch) and by mechanical inoculation of healthy maize seedlings. Only D. maidis transmitted MSMV, with overall transmission rates of 29.4 and 39.5% on field-collected infected plants and 18.5% on infected plants in laboratory. D. maidis transmitted MSMV until the third (8 to 12 days after the AAP) or fourth successive IAP (12 to 16 days), with gradual loss in transmission efficiency and rate of viruliferous insects over time, suggesting a persistent but nonpropagative mode of transmission. Infected test plants showed mottling symptoms with mild chlorotic streaks and height reduction. This is the first report of transmission of a mastrevirus by D. maidis, facilitating the completion of Koch’s postulate for MSMV.

An increasing number of plant species have been recognized or considered likely reservoirs of viruses transmitted by Brevipalpus mites. A tiny fraction of these viruses, primarily those causing severe economic burden to prominent crops, have been fully characterized. In this study, based on high-throughput sequencing, transmission electron microscopy analyses of virions in plant-infected tissues, viral transmission experiments, and the morphoanatomical identification of the involved Brevipalpus mites, we describe molecular and biological features of viruses representing three new tentative species of the family Kitaviridae. The genomes of Solanum violifolium ringspot virus (SvRSV, previously partially characterized), Ligustrum chlorotic spot virus (LigCSV), and Ligustrum leprosis virus (LigLV) have five open reading frames (ORFs) > 500 nts, two distributed in RNA1 and three in RNA2. RNA1 of these three viruses display the same genomic organization found in RNA1 of typical cileviruses, while their RNA2 are shorter, possessing only orthologs of genes p61, p32, and p24. LigCSV and LigLV are more closely related to each other than to SvRSV, but the identities between their genomic RNAs were lower than 70%. In gene-by-gene comparisons, ORFs from LigCSV and LigLV had the highest sequence identity values (nt sequences: 70–76% and deduced amino acid sequences: 74–83%). The next higher identity values were with ORFs from typical cileviruses, with values below 66%. Virions of LigLV (≈ 40 nm × 55 nm) and LigCSV (≈ 54 nm × 66 nm) appear almost spherical, contrasting with the bacilliform shape of SvRSV virions (≈ 47 nm × 101 nm). Mites collected from the virus-infected plants were identified as Brevipalpus papayensis, B. tucuman, and B. obovatus. Viruliferous B. papayensis mites successfully transmitted LigCSV to Arabidopsis thaliana. SvRSV, LigCSV, and LigLV seem to represent novel sub-lineages of kitaviruses that descent on parallel evolutionary branches from a common ancestor shared with the tentative cile-like virus hibiscus yellow blotch virus and typical cileviruses. Biological and molecular data, notably, the phylogenetic reconstruction based on the RdRp proteins in which strong support for monophyly of the family Kitaviridae is observed, mark an advance in the understanding of kitavirids.

Plant viruses transmitted by mites of the genus Brevipalpus are members of the genera Cilevirus, family Kitaviridae, or Dichorhavirus, family Rhabdoviridae. They produce non-systemic infections that typically display necrotic and/or chlorotic lesions around the inoculation loci. The cilevirus citrus leprosis virus C (CiLV-C) causes citrus leprosis, rated as one of the most destructive diseases affecting this crop in the Americas. CiLV-C is vectored in a persistent manner by the flat mite Brevipalpus yothersi. Upon the ingestion of viral particles with the content of the infected plant cell, virions must pass through the midgut epithelium and the anterior podocephalic gland of the mites. Following the duct from this gland, virions reach the salivary canal before their inoculation into a new plant cell through the stylet canal. It is still unclear whether CiLV-C multiplies in mite cells and what mechanisms contribute to its movement through mite tissues. In this study, based on direct observation of histological sections from viruliferous mites using the transmission electron microscope, we posit the hypothesis of the paracellular movement of CiLV-C in mites which may involve the manipulation of septate junctions. We detail the presence of viral particles aligned in the intercellular spaces between cells and the gastrovascular system of Brevipalpus mites. Accordingly, we propose putative genes that could control either active or passive paracellular circulation of viral particles inside the mites.

Pepper yellow mosaic virus on Petunia hybrida, bean yellow mosaic virus on Viola odorata and Narcissus yellow stripe virus on Narcissus cyclamineus were identified in Brazil using RT-PCR. Serology, mechanical transmission, host range, and electron microscopy were used to study the viruses further.

In Brazil, Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV), which causes rhizomania in red table-beet (Beta vulgaris subsp. vulgaris), was first reported in 2015. This study evaluated the pathogenic effects of the disease on biomass production of red table-beet plants under field conditions. The effect of rhizomania infection depended on the season when the experiment was conducted. BNYVV infection had no effect on dry weight of aerial parts of plants growing in autumn, and a marginal effect on storage roots, reducing the weight by 27.5%. In spring, rhizomania significantly reduced the dry weight of aerial parts by 48% and the storage-root weight by 64.6%. The presence of the possible vector Polymyxa betae was confirmed by PCR and subsequent nucleotide sequencing. The near-complete genome of a BNYVV isolate from Brazil was determined using high-throughput sequencing; the homologous sequence of the RNA-5 genome segment was not identified. The BNYVV genome of the Brazilian isolate was very similar to the type BNYVV-S isolate.

The begomovirus Tomato severe rugose virus (ToSRV) and the crinivirus Tomato chlorosis virus (ToCV), in single and co‐infections, are very common in tomato crops in Brazil. Both viruses are transmitted by the whitefly Bemisia tabaciMEAM1 (biotype B). The objective of this study was to analyse the interaction between ToSRV and ToCV in tomato plants of cultivars Santa Clara and Kada. Plants at 15, 30 and 45 days after emergence were inoculated with 30 viruliferous B. tabaci per plant. The following treatments were compared: plants inoculated with ToSRV, ToCV, ToSRV + ToCV, and healthy (control). The interaction between these viruses was analysed by measuring the virus titre by qPCR and the fresh and dry weights of the aerial parts of the tomato plants. Based on two independent assays, no significant effects for co‐infection of ToSRV and ToCV on virus titres and plant development were observed compared to single infections. The dry weight of tomato plants of both cultivars infected with ToSRV, ToCV, or co‐infected did not differ significantly. However, the dry weight of Santa Clara tomato plants infected with ToSRV, ToCV and ToSRV + ToCV showed mean reductions of 21.5%, 25.5% and 32%, respectively, compared to healthy plants, and mean reductions for Kada were 31.7%, 37.5% and 38%, respectively.

Tomato severe rugose virus (ToSRV) and Tomato chlorosis virus (ToCV) are among the major viruses that affect tomato (Solanum lycopersicum) development and yield in Brazil. ToSRV and ToCV are transmitted in a persistent circulative and semipersistent manner, respectively, by the whitefly Bemisia tabaci Middle East-Asia Minor 1, considered the main vector of these viruses. In this study, the kinetics of systemic invasion and the latent and incubation periods of ToSRV and ToCV were evaluated in singly and doubly infected tomato plants. Both viruses moved systemically into tomato plants as early as 1 day after inoculation. The mean ToCV latent periods in single infections and co-infections with ToSRV were 13 and 11 days, respectively, while incubation periods in single and co-infections were, on average, 30 and 31 days, respectively. For ToSRV, the mean latent period was 7 days in single infections and 6 days in co-infections with ToCV. Incubation periods were, on average, 18 and 17 days in single and co-infections, respectively. Because latent periods for both viruses were shorter than their respective incubation periods, field-infected tomato plants may act as sources of inocula soon after infection and before onset of symptoms.

Orientador:Jorge Vega Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As plantas defendem-se continuamente contra ataques de bactérias, vírus, fungos, invertebrados e de outras plantas. O estresse oxidativo é um tipo de resposta fisiológica da planta após o reconhecimento do patógeno, podendo resultar em sintomas nas plantas dependendo da sensibilidade do hospedeiro, e também relacionada à mecanismos de defesa. Foram analisadas plantas de soja cultivares BRS132 (muito sensível) e IAC17 (pouco sensível) infectadas pelo Cowpea mild mottle virus (CPMMV) e plantas de feijoeiro cultivar BT2 infectado pelo Cowpea aphid-borne virus (CABMV). O trabalho teve como objetivos avaliar a concentração de peróxido de hidrogênio, analisar a resposta antioxidante das plantas à infecção viral quanto às variações na atividade da superóxido dismutase, catalase, ascorbato peroxidase, guaiacol peroxidase e siringaldazina peroxidase e verificar as localizações dos vírus e das peroxidases em diferentes tecidos das plantas. O CPMMV induziu uma doença aguda, com sintomas severos e culminando com a morte da planta de soja 'BRS132'. Na soja 'IAC17', o vírus induziu uma doença crônica com mosaico leve a partir da segunda folha trifoliolada. As concentrações de peróxido de hidrogênio e as atividades da catalase, ascorbato peroxidase, guaiacol peroxidase e siringaldazina peroxidase foram maiores nas plantas infectadas, tanto na soja 'BRS132' como na soja 'IAC17', em relação às plantas sadias. O CPMMV foi localizado nos tecidos do pecíolo e do caule, na soja 'BRS132' nas regiões periféricas e medula, e na soja 'IAC17' principalmente nas regiões periféricas. No feijoeiro cultivar BT2, o CABMV induziu resposta aguda na primeira folha foram maiores nas plantas infectadas, exceto a atividade da superóxido dismutase, que apresentou valores similares nas plantas infectadas e nas sadias. O CABMV foi localizado nas regiões periféricas e medula dos tecidos do pecíolo, e no caule a invasão foi limitada à região periférica. As peroxidases e a siringaldazina peroxidase foram localizadas nas mesmas regiões do pecíolo onde foram detectados o CPMMV e o CABMV. No feijoeiro 'BT2', a infecção viral induziu uma resposta semelhante à observada na soja 'BRS132', com algumas diferenças relacionadas ao fato de que neste caso, a infecção pelo CABMV não resultou na morte da planta de feijoeiro. Também se observou aumento expressivo de atividade da siringaldazina peroxidase no 7º dia após inoculação, diferente da soja 'BRS132' em que este aumento ocorreu mais tarde. A invasão generalizada dos vírus no pecíolo foi semelhante em feijoeiro 'BT2' e soja 'BRS132', principalmente nos dias em que começou a ocorrer abscisão dos folíolos. Já a invasão do caule foi generalizada em soja 'BRS132' e limitada à região periférica em feijoeiro. Possivelmente, o aumento precoce de atividade da siringaldazina peroxidase em feijoeiro, já no 7º dia após inoculação, limitou a invasão do vírus aos tecidos periféricos do caule. Isto explicaria o fato de o feijoeiro 'BT2' não sofrer morte da gema apical e da planta. trifoliolada, apresentando sintomas de mosaico, maior rugosidade, lesões necróticas nas nervuras e folíolos ''fechados''. Nesta cultivar, todos os parâmetros avaliados. Abstract: Plants defend themselves from attacks of bacteria, fungi, viruses, invertebrate and other plants. Oxidative stress is a kind of physiological response of the plant related to defense mechanisms after recognition the pathogen, which may result in disease symptoms depending on host sensitivity. In this work, plants of two varieties of soybean infected by Cowpea Mild Mottle Virus (CPMMV), one highly sensitive (BRS132) and other with low sensitivity (IAC17) to the virus, were analyzed. Also, responses of bean plants (cv. Black Turtle 2, BT2) to Cowpea Aphid-Borne Mosaic Virus (CABMV) were examined. The parameters assessed included peroxide content (as hydrogen peroxide, H2O2), and activity of the following enzymes: superoxide dismutase, catalase, ascorbate peroxidase, guayacol peroxidase and syringadazine peroxidase. Distribution of virus and peroxidases in different tissues was also examined. In soybean cv BRS132, CPPMV induced an acute disease with severe symptoms finally resulting in plant death. In the less sensitive soybean cv IAC17, CPMMV induced a chronic disease with mild mosaic which was only visible in the second trifoliate and later leaves. Peroxide content and activity of guayacol and syringaldazine peroxidases were higher in infected plants of both cultivars. The virus was immuno-localized in stem and petiole cross sections, appearing in peripheral tissues and pith in cv BRS132, whereas in cv IAC17 it was localized mainly in the peripheral portion. In bean cv BT2, CABMV induced a acute response in the first trifoliate leaf, which presented a rough mosaic, necrotic lesions in veins and a "wilted" aspect. In this species all the assessed parameters showed higher values in the infected plants. Only the activity of superoxide dismutase was similar in healthy and infected plants. The vírus was localized in the pith and peripheral tissues of bean petioles, and only in the peripheral region of stems. Peroxidase and syringaldazine peroxidase activities were localized in the same tissues of the petiole where the CPMMV was localized in soybean plants and CABMV in bean plants. The response to CABMV observed in bean cv BT2 was similar to the response of soybean BRS132 to CPMMV, with some differences, since in bean the virus infection did not induce plant death. A significant rise in syringadazine activity was detected seven days after inoculation (DAI) in beans, while in soybean this increase occurred one day later. Both species also showed similar pattern of invasion of petiole tissues by the virus, mainly at the moment of abscission of leaflets. However, the virus invasion of stem was generalized in soybean BRS132 and contrastingly, limited to the peripheral tissues in bean. One possibility is that the early increase in syringaldazine activity observed in bean 7 DAI is indicative of some type of restriction to the spread of the virus, limiting it to the stem peripheral tissues. Probably this restricted spread of the virus in the stem underlies the survival of the apical meristem in bean cv BT2 in contrast to the death of the meristem in soybean cv BRS132. Doutorado Doutor em Biologia Vegetal

Orientador: Carlos Francisco Sampaio Bonafe Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Investigou-se o efeito de alta pressão combinado com baixa temperatura na ausência e presença de uréia no Vírus do Mosaico do Tabaco (TMV). O estado de agregação e o processo de desnaturação foram analisados através de medidas espectroscópicas. A incubação a '0 GRAUS¿C e 2,6 kbar induziu dissociação significativa, sem ocorrência de desnaturação. Nas diferentes concentrações virais o valor de 'p IND. ½¿ (pressão na qual 50% do vírus está dissociado) foi 1,2 kbar, indicando a não dependência de concentração de TMV na curva de dissociação por pressão. Isso pode ser explicado através da heterogeneidade do TMV quanto à energia livre de associação. A entalpia e entropia aparentes de dissociação ('delta¿¿H POT. *, IND. dis¿ e T¿delta¿¿S POT. *, IND. dis¿) foram ¿6,9 e ¿15,3 kcal/mol de subunidade, respectivamente, indicando que a associação do TMV é um processo entropicamente dirigido. A energia livre aparente de estabilização dada pela presença de RNA foi ¿1,7 kcal/mol de subunidade. A alta pressão induziu desnaturação significativa do TMV em presença de 2,5 M de uréia, causando uma variação de volume aparente de desnaturação de ¿105,0 mL/mol. A entalpia e entropi aparente de desnaturação ('delta¿¿H POT. *, IND. den¿ e T¿delta¿¿S POT. *, IND. den¿) por uréia 1,75 M em 2,5 kbar foi ¿11,1 e ¿10,2 kcal/mol, respectivamente, portanto com energia livre de desnaturação perto de zero... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: We investigated the effect of low temperature and urea combined with high pressure on Tobacco Mosaic Virus (TMV). The evaluation of its aggregation state and denaturation process was studied using spectroscopic methods. The incubation at 2.5 kbar and '0 DEGREES¿C induced significative dissociation. Under such conditions extensive denaturation did occur. At different TMV concentrations the 'p IND. ½¿ was 1.2 kbar. This result shows absence of concentration dependence of TMV dissociation by pressure, that can be explained by the TMV association energy heterogeneity. The apparent enthalpy and entropy of dissociation ('delta¿¿H POT. *, IND. dis¿ and 'delta¿¿S POT. *, IND. dis¿) were ¿6,9 and ¿15,3 kcal/mol of subunit respectively, indicating that the TMV association is an entropicaly driven process. The apparent free energy of stabilization given by the presence of RNA is at least ¿1,7 kcal/mol of subunit. High pressure induced remarkable TMV denaturation in the presence of 2.5 M urea, with a volume change of ¿105 mL/mol of denaturated subunit. The apparent enthalpy and entropy of denaturation ('delta¿¿H POT. *, IND. den¿ and T¿delta¿¿S POT. *, IND. den¿) by 1.75 M urea at 2.5 kbar was ¿11.1 and ¿10.2 kcal/mol of subunit, respectively, demonstrating that the TMV protein coat presents an apparent free energy of denaturation by urea close to zero... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations Mestrado Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Jorge Vega Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Com o objetivo de estudar o efeito quimioterápico de Virazole (1-ß-Dribofuranosil -1,2,4 - triazol-3 - carboxamida) in vitro sobre vírus de plantas, dois modelos de estudo foram realizados. No primeiro utilizou-se calos de videira Vitis vinifera, Seibel 2, infectados com o vírus do enrolamento da folha da videira (VEFV), e calos de fumo Nicotiana tabacum "TNN" e Gomphrena globosa L. infectados com o vírus do anel do pimentão (VAP). No segundo, foi utilizado um modelo aplicado, visando a obtenção de plantas de limoeiro Galego Citrus aurantifolia (Christm.) Swing) livres do vírus da tristeza dos citros "citrus tristeza virus" (CTV). Os objetivos específicos foram: 1) Testar o efeito do Virazole em calos cultivados in vitro, comparando: a) diferentes tipos de vírus (closterovirus e tobravirus) e b) efeito do. Virazole sobre um mesmo vírus em duas espécies de plantas hospedeiras. 2) Avaliar a possibilidade do uso de Virazole para obtenção de plantas cítricas livres do CTV por minienxertia realizada in vitro. Os resultados mostraram que o Virazole inibiu a multiplicação dos 3 vírus em estudo (VEFV, VAP e CTV), pertencentes a dois grupos distintos: closterovirus (VEFV e CTV) e tobravirus (V AP). A utilização de calos infectados com vírus e tratados com Virazole in vitro, mostrou ser um modelo de estudo eficiente para avaliar o efeito desse composto quimioterápico sobre vírus de planta. A indexação serológica; das amostras coletadas a cada subcultura dos calos permitiu acompanhar a evolução do conteúdo de vírus no decorrer de várias subculturas sucessivas. Os resultados mostraram de modo geral, que a quantidade de vírus presente varia muito pouco nas culturas de calos mantidas em ausência de Virazole. As concentrações mais baixas utilizadas não inibiram a multiplicação dos vírus, ao passo que concentrações mais altas do produto provocaram uma diminuição progressiva da concentração de vírus a cada subcultura até que as partículas virais não foram mais detectadas nos testes serológicos. O desenvolvimento da cultura foi afetado por concentrações altas de Virazole, sendo que algumas concentrações foram fitotóxicas, dependendo da planta e do tecido tratado. Em calos de videira infectados com VEFV o significativa a replicação do vírus. A inibição foi proporcional Virazole inibiu de maneira à concentração do produto utilizada. À 50 ppm não foram detectadas partículas virais nos testes serológicos. O Virazole atuou rapidamente em diminuir a concentração do VEFV à um nível baixo em calos em proliferação, porém, um longo período de incubação foi necessário para obter completa supressão dos vírus. Esses resultados são consistentes com a possibilidade de que a atividade antiviral do Virazole se manifesta por sua ação na síntese de novas partículas mais do que uma inativação direta dos vírus existentes. O Virazole foi capaz de inibir a multiplicação do V AP em calos de fumo, mas não em calos de G. globosa. Em fumo a concentração de 200 ppm eliminou os vírus presentes nos calos, enquanto que em calos de G. globosa o Virazole não foi efetivo em nenhuma das concentrações testadas. Possivelmente essas plantas apresentam vias metabólicas alternativas para a replicação do RNA viral ( e não aquela inibida pelo Virazole). A eficiência do Virazole em eliminar o V AP foi também dependente do estágio de desenvolvimento dos tecidos tratados. O Virazole inibiu a multiplicação de vírus quando pedaços de folhas foram utilizados como explantes, porém, ocorreu pouca ou nenhuma inibição quando células de calos não organizados foram tratadas com Virazole. O Virazole inibiu a multiplicação do CTV à concentração de 200 ppm. Essa inibição foi verificada pela ausência de sintomas específicos do vírus da tristeza nas plantas obtidas. As plantas cresceram tão bem quanto as plantas sadias. O Virazole não foi efetivo à 100 ppm. Nessa concentração o vírus provocou paralisação do crescimento das plantas e as folhas apresentaram sintomas de palidez das nervuras, específicos da doença. Esses resultados foram confirmados por ELISA e "Western-blot". Com bases nesses resultados, conclui-se que o Virazole é um quimioterápico eficiente para a obtenção de plantas livres de vírus, dependendo da espécie vegetal, do vírus envolvido e das condições de tratamento Mestrado Fisiologia Vegetal Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Jorge Vega Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia Resumo: Este trabalho teve como objetivo contribuir a um melhor conhecimento da moléstia do Enrolamento da Folha da Videira (EFV) presente no Brasil, e em todos os países vitícolas. Diversas evidências indicam a etiologia viral do EFV, entre elas a capacidade de transmissão por enxertia e a sensibilidade do patógeno à termoterapia. Além dessas características, diferentes partículas de vírus (alongadas e isométricas) têm sido isoladas de plantas de videira afetadas pelo EFV. o método aceito para diagnosticar a moléstia, consiste na enxertia do material a ser testado em variedades indicadoras para o enrolamento da folha, porém a leitura confiável dos sintomas induzidos na planta indicadora é realizada num período de 2-3 anos após a enxertia. Usando técnicas ligadas à serologia, pode-se melhorar as condições para o diagnóstico deste vírus, por testes mais rápidos que os de indexação por enxertia em variedades indicadoras. Durante o desenvolvimento deste trabalho, observou-se através de testes de microscopia eletrônica, uma maior concentração do vírus em tecido caloso de videira, obtido in vitro, em relação à concentração encontrada nas folhas e hastes da própria planta. A fim de se obter dados que contribuíssem para um melhor conhecimento da moléstia do EFV presente no Brasil e facilitar as condições de diagnóstico, foram estudados os seguintes aspectos: 1) possibilidade do uso de tecido caloso obtido in vitro a partir de tecidos de videira com EFV, como modelo, para estudo e manutenção do vírus; 2) citopatologia do tecido caloso à nível de microscopia eletrônica; 3) avaliação da relação serológica existente entre as partículas virais do tipo closterovirus detectadas em calos de videira com enrolamento da folha através de testes de microscopia eletrônica de imunoadsorção utilizando anti-soros preparados para o Vírus do Enrolamento da Folha da Videira (VEFV) e para o Vírus da Tristeza dos Citros (VTC); 4) detecção de partículas virais do tipo closterovirus em amostras semipurificadas de folhas de videira em variedades indicadoras (Pinot Noir e LN-33) e não-indicadora do EFV (Seibel 2) e 5) tentativas de transmissão mecânica do vírus do enrolamento da folha da videira para a hospedeira herbácea Nicotiana benthamiana. Outro aspecto estudado neste trabalho se refere à perpetuação do vírus através da cultura in vitro ao longo de várias repicagens do calo. Condições diferentes de temperatura e luminosidade também foram avaliadas, visando estabelecer diferenças no desenvolvimento do calo e na concentração do vírus. Os resultados deste estudo mostraram que o vírus detectado, associado ao EFV, se multiplica ativamente nas células do tecido caloso de videira. A citopatologia observada nos calos de videira afetadas pelo EFV é característica de infecção por closterovirus. O estudo das partículas virais associadas ao EFV pela técnica de tecido caloso in vitro mostrou-se útil devido à rapidez da formação do tecido caloso, diminuição do risco de contaminação das amostras, e especialmente pela baixa atividade de oxidases das células do calo. Para manutenção do vírus por períodos prolongados não se mostrou eficiente. Com relação ao efeito da luminosidade e temperatura, não foram observadas diferenças significativas no desenvolvimento do calo e na concentração do vírus. Os testes de transmissão mecânica para hospedeira herbácea Nicotiana benthamiana foram negativos. A técnica de ISEM feita com materiais semipurificados de folhas, mostrou ser um teste adequado e rápido para o diagnóstico da doença, quando comparada com a indexação por enxertia em variedades indicadoras. Os resultados das técnicas de ISEM, decoração e do teste de F(ab')2 ELISA, mostraram que o isolado do VEFV estudado neste trabalho é predominantemente do tipo IH. Os anti-soros preparados para os isolados tipos I e H somente reagiram nos testes de ISEM e decoração, indicando uma relação serológica muito fraca com o vírus estudado. Pôde-se concluir que o EFV é uma doença complexa, onde parecem estar envolvidos vários componentes virais, sendo que um deles mostrou relação serológica com o VTC, como observado nos testes de ISEM com decoração Mestrado Biologia Vegetal Mestre em Ciências Biológicas

Orientador : Alvaro Santos Costa Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Partículas longas e curtas do vírus do anel do pimentão ? VAP ? (?Brazilian tobacco rattle vírus?) foram visualizadas em tecidos foliares e de anteras de tomateiros (Lycopersicon esculentum Mill.) infectados. De modo característico, o VAP apareceu formando agregados de partículas sempre associados externamente a mitocôndrias, com exceção para micrósporos e grãos de pólen maduros, onde também foram encontrados agregados de partículas não associados com essa organela celular e partículas livres no citoplasma. Algumas vezes, partículas longas e curtas do VAP aparecem associadas numa extremidade a uma mitocôndria e na outra ao tonoplasto. O VAP foi localizado em todos os estágios de maior duração da mitocrosporogênese de tomateiros infectados, ou seja, estágio pré-meiótico, estágio meiótico, estágio de micrósporo pré-mitótico e estágio de grão de pólen maduro. Em grãos de pólen maduros partículas longas e curtas do VAP foram encontradas tanto nas células vegetativas como nas generativas. Em nenhum caso foram identificados vírions do VAP no núcleo celular, nem associação das partículas virais com paredes celulósicas, paredes de calose ou parede envolvente dos grãos de pólen. A quantidade relativamente pequena do vírus em células-mães dos grãos de pólen e micrósporos pré-mitóticos e o acúmulo de partículas longas e curtas em grãos de pólen maduros, levam-nos a acreditar que ocorre síntese do VAP durante o período de amadurecimento dos grãos de pólen... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: Long and short particles of the Brazilian tobacco rattle virus (BTRV) were visualized in leaf cells and in cells of the various anther tissues of infected tomato plants. The BTRV appeared mostly as aggregates of parallel particles associated on both ends to mitochondria, though isolated aggregates and individual particles were seen in microspores and mature pollen grains. In a few cases particle aggregates were observed associated with a mitochondria on one end and to the tonoplast of a vacuole on the other end. The BTRV particles could be seen in the cytoplasm of infected cells during the various phases of microsporogenesis from the stage of pre-meiotic cells until mature pollen grains. ln these the short and long particles could be seen in the cytoplasm of both the vegetative and generative cells. No virus particle was ever seen in the nuclei of infected cells; neither associated with the cellulose or callose walls, nor on the outside wall of pollen grains. The small number of virus particles present in the pollen mother cells and pre-mitotic microspores on one side, and the great number of short and long particle aggregates in the mature pollen grains on the other, indicate that virus increase must occur during pollen grain maturation and is not the result of only distribution... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations Mestrado Mestre em Ciências Biológicas

Orientador : Octavio Henrique de Oliveira Pavan Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Neste estudo verificaram-se os efeitos de passagens seriadas do Virus de poliedrose Nuclear de Anticarsia gemmalis (VPNAg) e do Vírus de poliedrose Nuclear de Trichoplusiani (VPNTn) sobre o hospedeiro alternativo, Diatraea saccharalis, uma das principais pragas da cana-de-açúcar em toda a América. Para cada um desses experimentos foram analisados individualmente mais de 5000 largatas de D. saccharalis. Pode-se observar através dos valores de DL50 que ocorreu um aumento substancial na virulência destes dois baculovírus após terem sido submetidos ao processo de passagem seriada nas brocas de cana. Na 1ª passagem seriada do VPNag o valor de DL50 foi de 7,87 X 105 cristais/largata enquanto que na 10ª passagem esse valor foi reduzido a 6,65 X 103 cristais/lagarta mostrando que o vírus após ter sido submetido a dez passagens seriadas tornou-se cerca de cem vezes mais virulento para es-ses insetos. O VPNTn apresentou na 1ª passagem seriada o valor de DL50 de 9,68 X 104 cristais/lagarta ao passo que na 11ª passagem seriada o valor de DL50 foi reduzido a 1,20 X 102 cristais/lagarta. Após onze passagens seriadas o VPNTn teve sua virulência aumentada em cerca de oitocentas vezes para as lagartas de D.saccharalis. Verificou-se que o isolado do VPNAg adaptado ao no-vo hospedeiro exibiu uma redução da virulência no hospedeiro original, Anticapvia gemmatalic.Os resultados do presente trabalho não representa-ram o limite das possibilidades de seleção desses vírus (VPNAg e VPNTn) mas demonstraram claramente seu potencial e a necessidade de continuação destes estudos visando uma melhor compreensão do problema. O VPNAg e o VPNTn melhoraram significativamente a sua eficiência através do método de passagem seriada que além de ser um método simples apresenta um baixo custo. Por outro lado, verificou-se ainda nesse trabalho o efeito da inoculação do Vírus de Granulose de Diatraea saccharalis (VGDs) associado aos dois VPN acima referidos. Foram utilizados três tipos de inóculos mistos: 1) VPNAg + VPNAg 2) VPNAg + VGDs e 3) VPNTn + VGDs nas lagartas de D. saccharalis Para esses experimentos foram usadas _ais de 3500 lagar-tas de D. saccharalis. Observou-se que apesar do VPNAg e do VPNTn isoladamente inoculados terem exibidos picos de mortalidade ao redor de 10 dias, o inoculo misto resultante da mistura desses dois vírus (VPNAg e VPNTn) mostrou uma nítida dispersão por volta de 10 a 50 dias. Os dois inóculos mistos resultantes da associação de um VPN e um VG (VPNAg + VGDs e VPNTn + VGDs) apresentaram um nítido pico de mortalidade ao redor de 10 dias e picos menores após 20 dias, com picos principais em torno de 30 e 40 dias. O primeiro pico pode ser relacionado ao efeito do VPNAg e do VPNTn e os picos de mortalidade após 20 dias ao efeito do VGDs. Pode-se observar que o inóculo de VGDs foi mais vi-rulento do que o inóculo de VPNTn que por sua vez foi mais virulento do que o in6culo de VPNAg para as lagartas de D. saccharalis e verificou-se que o mesmo quando em associação essa ordem de patogenicidade foi mantida. Os resultados desse estudo demonstraram de modo quantitativo que ocorreu o fenômeno de interferência ou anta-gonismo nos três tipos de inóculos mistos, visto que, nas várias doses utilizadas, a resposta de mortalidade resultante dos inóculos mistos não foi maior do que essa produzida pela ação de um só vírus nas lagartas de D. saccharalis dos mostram que o VPNAg, VPNTn e o VGDs não podem ser consor-ciados em um mesmo inóculo misto para fins práticos. De modo geral observamos, que os Baculovírus aqui analisados podem ser manipulados geneticamente e que ao serem associados há uma interferência recíproca como se estivessem competindo por mesmos tecidos e recursos no inseto. Essa interferência indicaria uma homologia de sistemas que se manifesta com vírus diferentes e procedentes de famílias diferentes. Podemos concluir que nossos dados sugerem haver uma homologia muito grande nesse grupo de vírus de inseto e que através de métodos relativamente simples tais como de passagem seriada podemos manipular geneticamente estes importantes patógenos Abstract: The effects of serial passages of the Nuclear Polyhedrosys Virus of Anticarsia gemmalis (AgNPV) and the Nuclear Polyhedrosys Virus of Trichoplusia ni (VPNTn) through the alternate host, Diatraea saccharalis one of the main pests of sugar cane throughout America, was studied. For each of these experiments more than 5000 larvae of D. saccharalis were individually analysed. It was noted through the reduction of DL50 values that a substantial increase in the virulence of these two baculovírus occurred after being submitted to serial passages through the D. saccharalis. On the first serial passage of the AgNPV the DL50 value was 7,87 X 105) PIBS/larva whereas on the thent passage that value was reduced to 6,65 X 103 PIBs/larva showing that the virus became about one hundred times more virulent to these insects after being submitted times more virulent to these insects after being submitted to ten serial passages. The TnNPV presented in the first serial passage the DL50 value of 9,68 x 104 PIBs/larva whereas in the eleventh serial passages the TnNPV had its virulence increased about eight hundred times when comparted to the original isolate. It was noted that the isolate of the AgNPV adapted to the new host exhibited a reduction of its virulence to the original host, Anticarsia gemmatalis. The isolate of the TnNPV was not tested against its original host, Trichoplusia ni. The results of the present work do not represent the limit of possibilities of selection of these virus (AgNPV and TnNPV), in fact they gave clear evidence of their potential and of the necessity of continuation of these studies aiming a better comprehension of the subject. The AgNPV and the TnNPV had and an expressive improvement of its efficiency by the serial passage method, which represents a simple and low cost method. A study of the effect of the inoculation of the Granulosis Virus of Diatraea aacaharalin (DsGV) associated to both NPV above mentioned was also object of this work. Three types of mixed inocula were used: 1) AgNPV + TnNPV 2) AgNPV + DsGV and 3) TnNPV + DSGV on D. saccharalis larvae. For these experiments more than 3500 larvae of D. saccharalis were individually analysed. Its was observed that, when individually inoculated AgNPV and TnNPV exhibited peaks at around 10 days after ingestion. The inoculum resulting from association of these two viruses (AgNPV + TnNPV) showed a clear dispersion of these peaks from to 10 to 50 days after the inoculation. The two mixed inocula resulting from the association of one NPV and one GV (AgNPV + DsGV and TnNPV + DsGV) presented a clear mortality peak at around 10 days, and other peaks after 20 days with main peaks present at around 30 and 40 days after inoculation. The first mortality peak can be related to the effect of the AgNPV and TnNPV and the peaks after 20 days of inoculation to the effect of DsGV. It was observed that the DsGV is more virulent that TnNPV which, in turn, is more virulent to the larvae of D. saccharalis than the AgNPV; and it was verified that even when in association this pathogenicity order was maintained. The resu1ts of this study demonstrated in a quantitative manner that the interference or antagonism phenomenon occurred in the three types of mixed inocula. For the various combinations of virus and dosagens the resulting mortality response from the associated virus was not higher than that produced on the larvae of D. saccharalis from the action of a single virus. This demonstrates that for practical purposes the AnNPV, TnNPV and the DsGV should not be associated for this type of pest control. Our results showed that the baculovirus here analysed can be genetically manipulated and once associated they show a reciprocal interference as if they were competing for the same tissues and resources of the insect. This interference indicates a homology of systems manifesting in different viruses originated from hosts coming from different Families. In conclusion, our data sugest the existence of great homology in this insect virus group, and that probably due to this fact we can genetically manipulate these important pathogens through relatively simple methods Mestrado Mestre em Biologia

Orientador: Marcos Antonio Machado Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Estudos preliminares sobre a localização de epítopos na proteína do capsídeo (CP) de três isolados de CTV ('Pêra IAC', 'Pêra CB-22' e 'Pêra CB-104') foram realizados em três etapas. Na primeira, foi realizada a amplificação de oito regiões distintas do gene da CP, codificantes para três regiões Nterminais (aa 1 até 70; aa 1 até 120; aa 1 até 170), três regiões C-terminais (aa 70 até 223; aa 120 até223; aa 170 até 223) e duas regiões internas da CP (aa 37 até 67 e aa 64 até 94) onde haviam sido determinadas diferenças significativas entre as CPs dos três isolados. Na segunda etapa, foram avaliadas duas estratégias para expressão dos peptídeos de interesse: clonagem em vetor de expressão através de ligação AT (vetor Pinpoint TM Xa-1 T, Promega) e clonagem das seqüências alvo em vetores do sistema de expressão pET. O vetor Pinpoint TM Xa-1 T, carreando como inserto o gene inteiro da CPCTV, obtido como produto de PCR após amplificação do cDNA dos três isolados, transformou células competentes de E. coli JM109, mas após indução com IPTG, não houve expressão da proteína de fusão esperada. Os vetores do sistema pET, após ligação das seqüências alvo, não transformaram células competentes de E. coli BL21(DE3)pLysS. Na terceira etapa, três proteínas recombinantes (MBP-CPCTV, CB-22 e CB-104) produzidas a partir da expressão do gene da CP-CTV dos três isolados, foram clivadas com brometo de cianogênio. Os produtos de clivagem foram avaliados através de '¿Western Blotting¿ contra anticorpos monoclonais específicos para CTV. O monoclonal IC-04.6, desenvolvido contra a proteína recombinante CB-22 detectou epítopos, numa reação intensa, em peptídeos com massa estimada em 27 kDa e 18 kDa, originários da CB-22; o monoclonal 39-08, desenvolvido contra a proteína recombinante CB-104 detectou epítopos, numa reação moderada, em peptídeos com massa estimada de 28 kDa e 14 kDa, originários qa CB-104; o monoclonal MCA-13, desenvolvido contra um isolado da Florida, detectou epítopos em peptídeos originários das proteínas recombinantes MBP-CPCTV e CB-104; o monoclonal 3DF1, desenvolvido contra isolados de CTV espanhóis, detectou epítopos em peptídeos originários da CB-22 e CB-104 e o monoclonal 3CA5, desenvolvido contra isolados espanhóis de CTV, detectou epítopos apenas num peptídeo com massa estimada de 18 kDa presente na CB-22. Estes resultados sugerem que diferentes epítopos são reconhecidos pelos cinco monoclonais avaliados e que serão necessárias novas estratégias para avaliá-los Abstract: Preliminary studies about the epitopes location in the capside protein of the isolates of the citrus tristeza virus of three isolate ('Pêra IAC', 'Pêra CB-22' and 'Pêra CB-104') were accomplished. In the first phase, the amplification was accomplished with specific direct and reverse primers of eight different regions of the CP gene, coding for three N-terminal peptides (aa 1 to 70, aa 1 to 120 and aa 1 to 170), three C-terminal peptides (aa 70 to 223, aa 120 to 223 and aa 170 to 223) and two internal peptides of CP (aa 37 to 64 and aa 64 to 90). In the second phase they were appraised two strategies for expression of the peptides: cloning in expression vector through AT cloning site (vector Pinpoint TM Xa-1 T promega), and cloning of the coding sequences in vectors of the system pET. Vector Pinpoint TM Xa-1, containing as insert the whole gene of CP, obtained as PCR's product after amplification of the three isolates' cDNA, transformed competent cells E. coli JM109, but after induction with IPTG there was not expression of the peptides of interest. The vectors of the pET system didn't transform competent cells E. coli BL21 (DE3)pLysS. In the third phase, three recombinant proteins (MBP-CPC1V, CB-22 and CB-104), produced from the expression of the CP-C1V gene of the three isolates, they were broken with cyanogen bromide. The break products were evaluated through "Western Blotting" against monoclonal antibodies specific for CTV. The monoclonal IC-04.6, developed against the recombinant protein CB-22 detected epitopes, in an intense reaction, in peptides with mass esteemed in 27 kDa and 18 kDa, original of CB-22; the monoclonal 39-08, developed against the recombinant protein CB-104 detected epitopes, in a moderate reaction, in peptides with esteemed mass of 28 kDa and 14 kDa, original of CB-104; the monoclonal MCA-13, developed against the T-36 isolate from Florida, detected epitopes in original peptides of the recombinants proteins MBP-CPCTV and CB-104; the monoclonal 3DF1, developed against Spanish isolates of CTV, detected epitopes in original peptides of CB-22 and CB-104 and the monoclonal 3CA5, developed against Spanish isolates of C1V, just detected epitopes in a peptide with esteemed mass of 18 kDa present in CB-22. These results suggest that the five monoclonal recognizes different epitopes and that will be necessary new strategies to evaluate them Mestrado Bioquímica Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Carlos Francisco Sampaio Bonafe Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Mestrado

Orientador: Jorge Vega Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O vírus do amarelecimento foliar da cana-de-açúcar, Sugarcane yellow leaf vírus (ScYL V) constitui atualmente um grande problema nos principais países produtores de cana-de-açúcar. Este vírus possui diversas características físicas e biológicas, como tamanho e morfologia da partícula, reações serológicas, alterações morfológicas no hospedeiro e aspectos de transmissão, comuns aos membros da família Luteovírídae. As informações da sequência genõmica do isolado brasileiro obtidas nesse trabalho, referentes às regiões codificantes para capa protéica do vírus (CP), proteína de movimento (17 kOa ou MP) e parte da RNA polimerase dependente de RNA (RdRp), mostram um alto grau de identidade e similaridade de aminoácidos com sequências de luteovirus conhecidos. Isso permite estabelecer o ScYLV como um membro definitivo da família Luteovíridae. Análises filogenéticas empregando as sequências deduzidas de aminoácidos da CP e da região C-terminal da RdRp do ScYL V sugerem diferentes afinidades taxonõmicas desse vírus dentro da família Luteovírídae, de maneira similar ao que acontece com o Soybean dwarf vírus (SOV). Análises comparativas de seqüência entre o isolado brasileiro e um isolado norte-americano revelaram diferenças de apenas dois nucleotídeos nas posições 4201(G por T) e 4232 (A por C) do genoma do ScYLV, correspondentesrespectivamente à região codificadora da proteína P17 e CP. Os dados de seqüência obtidos neste trabalho foram usados no desenvolvimento de um método sensível de diagnóstico baseado na combinação da técnica de amplificação isotérmica de ácidos nucléicos NASBA (nucleic acid sequence based amplification) e "molecular beacons", denominado AmpliOet RNA. Esse sistema de detecção foi altamente específico e ofereceu uma sensibilidade de aproximadamente 100 fg de vírus purificado, permitindo a detecção em plantas com baixos níveis de infecção viral e em um único pulgão virulífero. Os membros da família Luteoviridae são transmitidos por afídeos de uma maneira circulativa e não-propagativa. Após a aquisição, o vírus permanece no corpo do inseto por várias semanas, graças a associação com a proteína GroEL, produzida por um endossimbionte primário do pulgão. As partículas de vírus purificadas apresentam dois tipos de proteína, a proteína principal da capa protéica de 22 kDa e menores quantidades de outro componente do capsídeo, a proteína de transleitura ou "readthrough" (RTD) de 54 kDa. A protéina RTD contém determinantes responsáveis pela transmissão e acúmulo do vírus em plantas agroinfectadas. O Potato leafroll vírus (PLRV) é uma espécie do gênero Polerovirus dentro da família /,..uteoviridae. Clones infectivos de cDNA do PLRV e um mutante deletério da proteína RTD foram usados para estudar as interações moleculares entre esse luteoviruse seu afídeo vetor Myzus persicae. O mutante do PLRV, no qual a proteína RTD estava inteiramente ausente, não foi transmissível por M. persicae e não se ligou a proteína GroEL. Adicionalmente, esse mutante mostrou-se significativamente menos persistente na hemolinfa do afídeo do que as partículas não modificadas do vírus Abstract: Sugarcane yellow leaf vírus (ScYL V) is widely distributed in Brazil and other sugarcane producing countries causing significant yield losses. This virus shares biological features typical of the luteovirids. Comparisons of the coat protein (CP), 17 kDa protein and C-terminus of the RNA-dependent RNA polymerase coding regions showed that the deduced amino acid sequences of the Brazilian isolate share a considerable degree of identity and similarity with corresponding sequences of known luteovirids, thus clearly establishing ScYL V as a member of the family Luteovíridae. Phylogenetic analyses also suggest that the 5' and 3' coding blocks of the ScYLV genome possess different taxonomic affinities within the Luteovíridae family, as for the genome of Soybean dwarf vírus (SDV). Our results were published simultaneously as the sequence of a North American strain of ScYL V. Comparative analyses between the deduced peptides of Brazilian and North American strains revealed two nucleotide substitutions at positions 4201 (G_ T) and 4232 (A_C) of the ScYLV genome, corresponding to P17 and CP proteins coding regions, respectively. Our sequence data were used to develop a highly sensitive detection method based on the combination of isothermic nucleic acid sequence based amplification (NASBA) and molecular beacons, named AmpliDet RNA. This system offered a sensitivity of about 100 fg of purified virus and could detect ScYL V in plant samples with low virus titer and in one single aphid. Members in the Luteovírídae are transmitted by aphids in a circulative, nonreplicative manner. After acquisiton, luteovirus particles persist in the aphid's hemolymph for several weeks in association with a GroEL homolog, produced by the primary endosymbiont of the aphid. Luteovirus purified particles contain two types of proteins; a major 22 kDa coat protein (CP) and the minor capsid component of 54 kDa, the readthrough protein (RTD). The RTD contains determinants responsible for virus transmission and accumulation in agroinfected plants. Potato leafroll virus (PLRV) is a member of the genus Po/erovírus in the family Luteovíridae. An infectious cDNA fuI! length clone of PLRV and a mutant devoid of the RTD were used to study and better understanding the molecular interactions between this luteovirus and its aphid vector Myzus persícae. The PLRV mutant lacking the entire RTD protein was not transmissible by M. persícae and did not bind to Buchnera GroEL. Furthermore, the mutant was significantly less persistent in the aphid's hemolymph than the wild type virus. These data corroborate previous observations with Beet westem yellow vírus (BWYV) and Bar/ey ye//ow dwarf vírus (BYDV) that the RTD domain is involvedin luteovirus transmission and persistence in the aphid's body Doutorado Doutor em Biologia Vegetal

Orientador : Elliot W. Kitajima Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Não informado Abstract: Not informed. Doutorado Imunologia Doutor em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Jorge Vega Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Esta tese teve como objetivos caracterizar as alterações histológicas e fisiológicas induzidas em plantas de laranja 'Pera¿ e limão 'Galego', inoculadas com isolados fracos (Pera IAC e Isolado 50) e severos (Pera Rio e Barão B) do vírus da tristeza dos citros (CTV); estudar as respostas das plantas à infecção pelo CTV quanto à variação de atividades enzimáticas envolvidas na reação da planta (PAL, CAD, Peroxidases ligadas à parede celular POX-lig); obter dados sobre a localização a nível morfo-histológico de peroxidases ligadas à parede celular; obter dados sobre isoenzimas de peroxidases envolvidas na resposta à infecção pelo CTV; caracterizar a resposta das plantas à infecção pelo CTV quanto a alterações no conteúdo de ácido salicílico total. Para tanto, plantas de laranja 'Pera¿ e limão 'Galego¿ foram inoculadas por união de tecido com borbulhas de plantas infectadas com os isolados do vírus. Como controle foram usadas plantas enxertadas com borbulhas sadias. As plantas foram mantidas em casa de vegetação. Nos experimentos onde determinou-se a atividade das enzimas PAL,CAD e Pox-lig foi verificado, com exceção da enzima CAD, que plantas infectadas pelos isolados severos do CTV apresentaram um aumento significativo na atividade dessas enzimas, enquanto que as plantas infectadas pelos isolados fracos do virus diminuíram a atividade ou não a modificaram. Quando guaiacol e siringaldazina, substratos específicos para determinar a atividade de peroxidases foram usados, observou-se que a atividade de guaiacol peroxidase não apresentou correlação com a severidade do isolado do CTV. As diferenças observadas na atividade de siringaldazina peroxidase foram de tal magnitude que poderiam ser consideradas na prática como um parâmetro na diferenciação entre isolados fracos e severos do CTV. A enzima CAD não foi estimulada pela infecção com os diferentes isolados do CTV, não foram observadas diferenças nas atividades entre a plantas infectadas com vírus e plantas sadias. Assim como na Pox -lig e P AL, o conteúdo de ácido salicilico foi mais elevado somente nas plantas infectadas pelos isolados severos do vírus. Plantas infectadas pelo isolado severo Barão B apresentaram teores de SA duas vezes mais elevados que as plantas sadias e 2,7 e 4,4 vezes o valor de plantas infectadas com os isolados Pera IAC e Galego 50, respectivamente. Nos experimentos de eletroforese as isoperoxidases foram separadas em gel ácido (pH 4,5) e gel alcalino (pH 8,3). Em gel alcalino utilizando carbazole como substrato genérico para peroxidases, observou-se duas bandas peroxidases citoplasmáticas nos materiais infectados com isolados severos, enquanto que com o isolado fraco e plantas sadias apresentaram apenas uma banda. Em pH ácido, utilizando siringaldazina como substrato, apenas uma peroxidase de parede celular foi detectada em plantas infectadas pelos isolados severos do CTV. Plantas sadias e infectadas com isolados fracos do vírus não apresentaram atividade. A análise da atividade de guaiacol peroxidase através de fracionamento por HPLC mostrou que as plantas infectadas com o isolado severo do CTV apresentaram dois picos de atividade, sendo o primeiro aos 16-17 minutos de eluição com atividade em tomo de 0,02 ?Abs / mino e o segundo pico, aos 19,5 mino de eluição, com atividade bem maior, em tomo de 0,09 ?Abs / min. Por outro lado, plantas sadias e plantas infectadas com isolado fraco do vírus apresentaram apenas um pico de atividade aos 20 mino de eluição com atividade ao redor de 0,04 e aos 21 min. de eluição com atividade ao redor de 0,06 ?Abs / min, respectivamente. Nos ensaios de microscopia de fluorescência, plantas de limão' Galego' infectadas pelo isolado severo Barão B apresentaram depressões no xilema que foram visualizadas quando utilizou-se excitação com luz UV (Fig. 13 a). O material apresentou fluorescência amarela com excitação por luz azul (Fig. 13 b). Em plantas sadias e plantas infectadas pelo isolado fraco Galego 50 não foram observadas alterações na fluorescência na região do floema e do câmbio vascular (Fig. 13 c,d, respectivamente). Em plantas de laranja 'Pera' infectadas pelos isolados severos Barão B e Pera Rio, foi observado um acúmulo de material fluorescente verde na região do câmbio vascular. o trabalho permite concluir que a atividade de peroxidase associada à lignificação (Pox-lig) pode ser considerada como um parâmetro bastante significativo para a diferenciação de isolados fracos e severos do CTV. Os isolados severos do vírus causam aumento na atividade de enzimas envolvidas nas reações de defesa das plantas, concomitante com o aumento no teor de SA, que atua como molécula sinalizadora. Plantas infectadas pelos isolados severos apresentam disfunção do floema, na região do câmbio vascular e também o aparecimento de uma proteína com atividade peroxidásica que pode ocorrer através de síntese de novo (ativação gênica) ou por ativação de proteína preexistente Abstract: The present work had as objective the characterization of physiological and histological alterations induced in 'Pera' sweet orange and 'Mexican' lime plants infected by severe (Pera Rio and Barão B) or mild (pera IAC and Isolado 50) isolates of citrus tristeza virus (CTV). The response of plants to CTV infection was examined in relation to changes in enzymatic activities associated with the reaction of the plant to virus infection: P AL, CAD and cell wall-associated peroxidase (Pox-lig). Also examined were the content of salicylic acid, the histological localization of cell wall-associated peroxidases and their electrophoretic characteristics. All the experiments were conducted in 'Pera' orange and 'Mexican' lime plants, graft-inoculated with the different CTV isolates. As healthy controls, plants graft inoculated with healthy scions were used. The plants were kept in the greenhouse during the experiments. Two enzymes, P AL and cell wall-associated peroxidase, have their activity significantly increased in plants infected by severe CTV isolates. These enzyme activities were reduced or not changed by infections with mild isolates, as compared to healthy controls. This correlation between activity and severity of the virus isolate was not observed when guaiacol was used as generic substrate in the peroxidase assay. However, using syringaldazine as substrate for cell wall-associated peroxidase (Pox-lig), the correlation was evident. The differences in syringaldazine-peroxidase and in P AL activities were of such magnitude that they may be useful as a parameter in differentiating mild and severe isolates. The activity of the enzyme CAD was not changed by CTV infection, whether of severe or mild isolates. Paralleling the activity of Pox-lig, the content of salicylic acid was also increased only in plants infected by severe CTV isolates. 'Pera' oranges infected with the severe isolate "Barão B" had 2,7 and 4,4 times greater content of SA than plants infected with "Pera IAC" or "Galego 50" mild isolates, respectively. Using non-denaturing PAGE electrophoresis at an alkaline pH (pH 8.3) an additional band was detected only in plants infected with severe isolates. At acid pH (pH 4.5) it was possible to detect one band with syringaldazine-peroxidase activity only in plants infected with severe isolates. Separation of isoenzymes by HPLC showed an additional peak of guayacol activity (0.02 ?Abs /min) eluting at 16-17 minutes, which was absent in healthy or mild isolate-infected materiais. At 19.5-21 minutes eluted a peak of greater activity (0.09 ?Abs /min) that was common to infected and healthy materiais. Fluorescence microscopy of stem tips of 'Mexican' lime plants, infected with the severe isolate Barão B, showed depressions in the xylem, visualized using UV excitation light. With blue light excitation it was possible to visualize a yellow fluorescing material within the xylem depressions (Figs. 13 a and b). In healthy or mild isolate (Galego 50) materials, fluorescence alterations were not observed in the cambium zone. In 'Pera' orange plants infected with severe isolates (Barão B and Pera Rio) the accumulation of green-fluorescent material was observed in the cambium zone when UV excitation was used. It may be concluded that peroxidase activity associated with lignification can be considered as a significant parameter to differentiate severe from mild isolates of CTV. Severe isolates of CTV induce increases in enzyme activities involved in plant defense mechanisms, paralleling the increase of salicylic acid content, which functions as signaling molecule. Plants infected by severe isolates show disfunctional phloem and an altered cambium zone. They also show the appearance of a new band with peroxidasic activity that may arise from de novo synthesis (gene activation) or from activation of a pre-existing protein Doutorado Doutor em Biologia Vegetal

Orientador: A. S. Costa Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Testes de transmissão mostraram que sete espécies de afídios podem atuar como vectoras do VNAC nos trigais do Rio Grande do Sul e de Santa Catarina: Acyr-thosiphon dirhodum, Macrosiphum avenae, Rhopalosiphum maidis, R. padi, R. rufiabdorinalis, Schizaphis graminum e Sipha flava. Aphis gossvpii, Hysteroneura setariae e Myzus persicae foram encontradas esporadicamente em trigo, mas o comportamento delas como vectoras não foi estabelecido, Asiphonella dactylonii e Geoica sp. foram encontradas em gramíneas hospedeiras do VNAC, mas também não foi ainda estabelecido se são ou não vectoras do vírus. Observações feitas em tribais e exame de amostras de alados migrantes coletadas em armadilhas amarelas de água mostraram que das sete espécies vectoras, Rhopalosiphum maidis e Sipha flava foram de importância mínima; das cinco restantes, Acyrthosiphon dirhodum superou em importância como vectora e como praga na cultura do trigo todas as demais juntas. Acyrthosiphon dirhodum foi coletada em maior número nas armadilhas de água pintadas de amarelo do que nas de verde-amarelo, laranja-amarelo, laranja, vermelho, preto, verde grama, alumínio, azul celeste e branco neve. A coleta em armadilha colocada sobre o solo sem vegetação foi maior e diminuiu à medida que se aumentou a altura da armadilha em relação ao solo. A coleta da espécie foi maior no período de 7:30-10:30 do que de 16:30-18:30, mas nos dois casos superior à feita em outros períodos do dia. Observações de campo e testes de colonização em insetário mostraram que Acyrthosiphon dirhodum foi capaz da colonizar gramíneas cultivadas e espontâneas das seguintes espécies: Avena sativa, A. sterilis, A. strigosa, Chloris gayana, Dactulis glomerata, Festuca arundinacea, F. rubra, Hordeum vulgares, Lolium multiflorum, L. perenne, Paspalum notatum, Phalaris canariensis, P. tubernacea, P. tuberosa, Poa annua, P.pratensis, Secale cereale, Setaria sphacelata, Triticales, Triticum aestivum e T. duvum. Levantamentos feitas em culturas e coletas de Acyrthosiphon dirhodum em armadilhas distribuídas em 13 zonas do Rio Grande do Sul e de Santa Catarina mostraram que durante o período de 1967 a 1972, as populações desta espécie principiaram a atingir níveis populacionais significativos na primeira quinzena de agosto, formando infestações maiores na segunda metade do inverno e primeira da primavera. Excetuou-se a zona de Chapecó onde níveis populacionais significativos já foram atingidos durante o mês de julho. Testes e observações efetuadas indicaram que os alados migrantes de Acyrthosiphon dirhodum foram muito importantes na disseminação do VNAC de fora para dentro nas culturas de trigo; alados que voam a pequena distância, ápteros adultos e ninfas nos últimos estágios que também podem ser dispersos pelo ar auxiliam a disseminação dentro da plantação, sendo também de importância aquela efetuada por insetos que caem ao solo e migram por caminhamento para plantas sadias das proximidades. Dados de dois experimentos efetuados mostraram que ápteros dispersos por caminhamento podem infetar plantas localizadas a 1,7m da fonte do vírus. Observações feitas em coleções de mais de 900 variedades de trigo e em culturas de mais de 30 variedades comerciais mostraram que apenas a IAS 51, IAS 54, IAS 59 e Nobre (S 31) apresentaram comparativamente menores infestações de Acyrthosiphon dirhodum. Essa fato é considerado como uma indicação de que possuem certa resistência em campo à colonização por assa espécie de afídio. Experimentos em que se aplicou um inseticida granulado sistêmico na ocasião da semeadura e a intervalos durante o ciclo da cultura de trigo, mostraram resposta positiva, aumentando a produção de grãos dos lotes tratados. O aumento variou de 30% nas culturas precoces e 43% nas semeadas na época normal, alcançando 750% para o trigo semeado tardiamente. Os resultados experimentais foram confirmados por numerosas observações feitas em lavouras tratadas e não tratadas, nas quais a aplicação de inseticidas com efeito residual prolongado provocou resposta satisfatória na produção de grãos. Calculou-se que os prejuízos causados pelos afídios nos trigais sulinos foram superiores a 20% da produção de grãos do 1967 a 1972, o que representa mais de 1.400.000 t, com um valor superior a Cr$ ......700.000.000 , 00 (setecentos milhões de cruzeiros). Para evitar que os afídios causem prejuízos maiores nos cultivos de trigo é recomendável a aplicação de aficidas de efeito residual prolongado. As aplicações devem ser feitas quando a observação indicar que 10 a 15% das plantas estão com início de colonização por esses insetos, o que geralmente ocorre a partir da primeira quinzena de agosto para a maioria das zonas do Rio Grande do Sul e de Santa Catarina; para a zona de Chapecó isso pode dar-se com antecedência de um mês em relação às outras zonas. Reaplicações dos aficidas devem ser feitas sempre que o efeito residual da preparação estiver prestes a terminar. Ela deverá ser feita assim que forem observadas umas poucas colônias de ninfas do primeiro estágio, sobre as plantas inspecionadas Abstract: Twelve aphid species were encountered on small grains and grass plants in southern Brazil (states of Rio Grande do Sul and Santa Catarina). Seven species, Acyrthosiphon dirhodum, Macrosiphum avenae, Rhopalosiphum maidis, R. padi, R. rufiabdominalis, Schizaphis graminum and Sipha flava transmitted the barley yellow dwarf virus (BYDV). A. dirhodum, as a vector of BYDV in wheat, aquals in importance all the other species togethe. Winged migrants of Acyrthosiphon dirhodum were collected in greater numbers in yellow water traps than in traps painted with nine other different colors. Yellow traps placed on the soil surface collected more than when placed higher, the number of insects decreasing as the trap distance from the soil increased. Migrants were collected in higher numbers from 7:30 to 10:30 and from 16:30 to 18:30 than in other periods of the day. Field observations and tests carried out in insectaries indicated that Acyrthosiphon dirhodum breeds on the following species: Avena sativa, A. sterilis, A. strigosas, Chloris gayana, Dactylis glomerata, Festuca arundinacea, F. rubra, Hordeum vulgare, Lolium multiflorum, L. perenne, Paspalum notatum, Phalaris canariensis, P. Tubernacea, P. tuberosa, Poa annua, P. pratensis, Secale cereale, Setaria snhaeelata, Tritioale, F&itieum aestivum and T. durum. Field surveys carried out from 1967 to 1972 and winged aphid col lections Cyellow watsr traps) from 13 localities in the states of Rio Grande do Sul and Santa Catarina made in 1971 and 1972 indicated that Acyrthosiphon dirhodum first appeared in significant numbers in wheat plantings early in August and attained peak populational levels in the months of September and October. Viruliferous winged migrants of Acyrthosiphon dirhodum are responsible for the initial introduction of the BYDV into the wheat plantings, winged or .vjtarous adult females or nymphs can be dispersed by air or crawl to short distances, spreading the disease within the crop. Experimental data showed that crawling nymphs can spread BYDV to plants located at 1.7m from the virus source. Field observations carried out in wheat plantings or collections, involving more than BOO different types, indicated that only IAS 51, IAS 54, IAS 59 and Nobre (531) showed a certain degree of resistance to infestation by Acvrthosiphon dirhodum. Experiments with wheat gave a positive response to the application of a granulated systemic insecticide at sowing time and later, at intervals, during the vegetative cycle of the plant. Yield increases due to aphid control were 30% for the plots planted early; 43% for plots sown during the period usually recommended for wheat, and reached 750% for wheat planted late, although the yields in this case were comparatively low. Experimental results were confirmed by field observations comparing the yields of wheat plantings in which aphid control had been made with those of untreated plantings, which indicated a satisfactory response from the treatment. Losses induced by aphid infestation alone, in wheat plantings in Rio Grande do Sul and Santa Catarina, were conservatively estimated in more than 1,400 ,000 t for the period 1967 through 1972. This represents a loss of at least U.S. $ 100,000,000. Although BYHV cannot be prevented by application of insecticides, the control of aphids to reduce the losses that these insects induce as pests is recommended. It is preferable to apply insecticides with long residual effects and the treatment be starded when initial aphid infestation is present in 10 to 15% of plants in samples examined. This usually occurs in the first part of August for the wheat belt in Rio Grande do Sul and Santa Catarana, but might be somewhat earlier for the Chapeco area. Renewed applications of the insecticides have to be made as soon as a few small colonies of first instar nymphs are noticed in the plantings Doutorado Doutor em Ciências Biológicas

Submitted by Eduardo Silva Gorayeb (eduardo.gorayeb@unesp.br) on 2021-06-24T20:02:45Z No. of bitstreams: 1 Thesis UNESP Eduardo Gorayeb.pdf: 1690247 bytes, checksum: 1f88b41e0a4def2dbdaa935006da41e3 (MD5) Approved for entry into archive by Ana Lucia de Grava Kempinas (ana.kempinas@unesp.br) on 2021-06-25T00:18:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gorayeb_es_dr_botfca_par.pdf: 639501 bytes, checksum: bfca3b42de3acdb6f9586178c15a47e5 (MD5) Made available in DSpace on 2021-06-25T00:18:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gorayeb_es_dr_botfca_par.pdf: 639501 bytes, checksum: bfca3b42de3acdb6f9586178c15a47e5 (MD5) Previous issue date: 2021-06-07 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Os insetos Bemisia tabaci (Gennadius) e Frankliniella occidentalis (Pergande) são pragas que conseguiram se disseminar e se estabelecer em diversas regiões do mundo. Os principais danos associados a essas pragas estão relacionados à transmissão de vírus de plantas, com destaque para os Begomovirus e Orthotospovirus. Visando contribuir com informações chave para o desenvolvimento de estratégias de manejo dessas pragas nas culturas do Tomate, Pepino e Pimentão, a presente tese contempla dois estudos envolvendo as espécies crípticas de B. tabaci Middle East-Asia Minor 1 (MEAM1) e Mediterranean (MED) no Brasil (capítulos 1 e 2), e um estudo de levantamento de tripes e orthotospoviroses na região de Arica y Parinacota, Chile (Capítulo 3). No capítulo 1, o potencial das plantas invasoras Datura stramonium e Nicandra physaloides como hospedeiras alternativas de MEAM1 e MED e do vírus Tomato severe rugose virus (ToSRV) foi estudado, mostrando que invasora N. physaloides foi uma ótima hospedeira alternativa do vírus quando associada à MEAM1, enquanto que D. stramonium contribuiu mais para a reprodução das moscas brancas. No capítulo 2, as causas relacionadas à recentes infestações de MED em pepineiro nos estados de São Paulo e Paraná foram investigadas por meio de ensaios de comparação do desempenho biológico e a preferência por hospedeiros de MEAM1 versus MED em cultivares comerciais de pepino, mostrando que a melhor performance de MED em quase todas as cultivares comerciais testadas, é um fator chave para a predominância dessa mosca no pepineiro. No capítulo 3, o Pepper necrotic spot virus, um novo vírus tentativa relacionado com o gênero Orthotospovirus é descrito na região metropolitana de Santiago (Chile), e finalmente, no capítulo 4, um levantamento de orthotospoviroses e tripes associadas foi realizado em plantas de tomate, pimentão e pimenta, na região de Arica y Parinacota (Norte do Chile), que atualmente sofre com uma epidemia de “vira-cabeça” em pimentão; mostrando a ocorrência de uma provável estirpe de Tomato spotted wilt virus capaz de infectar plantas com o gene de resistência TSW e da espécie tentativa de orthotospovirus Pepper necrotic spot virus no Chile, ambas provavelmente associadas a F. occidentalis, com ocorrência em todas as regiões amostradas. The insects Bemisia tabaci (Gennadius) and Frankliniella occidentalis (Pergande) are pests that have managed to spread and establish in different regions of the world, disseminating several viruses, such as begomoviruses and orthotospoviruses. In order to contribute with key information for the development of management strategies for these pests in tomato (Solanum lycopersicum L.), cucumber (Cucumis sativus L.), and pepper (Capsicum spp.) crops, this thesis contemplates two studies involving the cryptic species of B. tabaci Middle East-Asia Minor 1 (MEAM1) and Mediterranean (MED) in Brazil (chapters 1 and 2), and two studies of orthotospoviruses and thrips in Chile (Chapter 3 and 4). In chapter 1, the potential of invasive plants Datura stramonium and Nicandra physaloides L. (Gaertn.) as alternative hosts of MEAM1 and MED and for the tomato severe rugose virus (ToSRV) was studied, showing N. physaloides as a great alternative host of the virus when associated with MEAM1, whereas D. stramonium contributed more with the whitefly reproduction. In chapter 2, the causes related to recent MED infestations in cucumbers observed on São Paulo and Paraná states were investigated by means of comparison of biological performance and preference tests comparing MEAM1 vs. MED in commercial cucumber cultivars, showing that MED performed better in almost all commercial cultivars tested and that the performance is a key factor for the predominance of this whitefly in cucumber plants. In chapter 3, the putative new orthotospovirus Pepper necrotic spot virus was reported for the first time in Chile, infecting bell pepper fruits, suggesting its presence in northern production areas from Chile. Finally, in chapter 4, a survey of orthotospoviruses and associated thrips was carried out on tomato, bell pepper, and chili pepper plants in Arica y Parinacota (Northern Chile), where cases of the “spotted wilt” are increasing. The results showed the occurrence of an isolate of tomato spotted wilt virus, capable of infecting plants with the Tsw resistance gene, and the putative orthotospovirus pepper necrotic spot virus in Chile, both probably associated with F. occidentalis, occurring in all sampled locations. 001

[EN] Although citrus leprosis disease has been known for more than a hundred years, one of its causal agents, citrus leprosis virus C2 (CiLV-C2), is poorly characterized. This study described the association of CiLV-C2 movement protein (MP) and capsid protein (p29) with biological membranes. Our findings obtained by computer predictions, chemical treatments after membrane fractionation, and biomolecular fluorescence complementation assays revealed that p29 is peripherally associated, while the MP is integrally bound to the cell membranes. Topological analyses revealed that both the p29 and MP expose their N- and C-termini to the cell cytoplasmic compartment. The implications of these results in the intracellular movement of the virus were discussed., This work was supported by Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP), proc. 2014/0845-9, 2017/50222-0, 2015/10249-1 and 2017/19898-8. This work was also supported by grant BIO2017-88321-R from the Spanish Agencia Estatal de Investigacion (AEI) and Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), and the Prometeo Program GV2015/010 from the Generalitat Valenciana.

[ES] Los virus de plantas poseen la capacidad de parasitar células vegetales y poner a su disposición la maquinaria celular de la planta para la síntesis de sus propias proteínas. Aprovechando esta capacidad, la ingeniería genética ha dirigido muchos de sus esfuerzos en la modificación del genoma viral para utilizar los virus de plantas como vectores de expresión de proteínas de interés humano. Los potyvirus son un grupo de virus de plantas ampliamente estudiado y utilizado en biotecnología. Su genoma está formado por un RNA de cadena sencilla que codifica, principalmente, una poliproteína que se procesa para dar aproximadamente 10 proteínas maduras. En diferentes posiciones intercistrónicas se pueden insertar cDNAs que codifican proteínas de interés, las cuales se producen junto al resto de productos de la poliproteína. Si además estos cDNAs se flanquean por secuencias que codifican los sitios de procesamiento específicos de las proteasas virales, las proteínas heterólogas se liberan eficientemente de la poliproteína viral. Así, la inserción de un cDNA correspondiente al factor de transcripción Rosea1 de la ruta de las antocianinas en distintos potyvirus resulta en la biosíntesis de estos compuestos en las células vegetales infectadas. Las antocianinas son compuestos flavonoides coloreados que se pueden observar a simple vista, por lo que la expresión de Rosea1 es una herramienta biotecnológica muy útil para seguir la infección de virus de plantas. En esta Tesis se han investigado diferentes aplicaciones biotecnológicas basadas en la expresión del factor de transcripción Rosea1 y la consecuente acumulación de antocianinas en el contexto de la biología de los potyvirus. Primero, se construyó un clon del virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV) etiquetado con Rosea1 (ZYMV-Ros1). El ZYMV es capaz de replicarse a nivel local pero no de moverse a larga distancia en plantas de Nicotiana benthamiana. Un análisis de la infección por ZYMV-Ros1 en una serie de plantas transgénicas de N. benthamiana silenciadas en distintas RNasas de tipo Dicer (DCL) permitió profundizar en el conocimiento de los mecanismos defensivos de la planta frente a este virus. Los resultados indicaron que DCL4 está implicada en restringir el movimiento sistémico del virus, ya que en plantas con este gen silenciado el virus es capaz de moverse a larga distancia. Además, las antocianinas tienen un gran interés nutricional, farmacéutico e incluso industrial, por su gran actividad antioxidante. Un clon viral derivado del virus Y de la patata (PVY) que expresaba Rosea1 (PVY-Ros1) indujo la acumulación de más antocianinas que las que contienen frutas y verduras que son fuente rica de estos valiosos antioxidantes. Este mismo clon PVY-Ros1 también se utilizó para estudiar la transmisión del virus mediante áfidos vectores, observándose como estos provocan frecuentemente el inicio de la infección en el tejido vascular. Este mismo clon viral permitió mostrar visualmente el efecto antiviral que tienen las nanopartículas de plata en plantas. Por último, en esta Tesis se combinó el factor de transcripción Rosea1 con distintas proteasas de los potyvirus para crear circuitos lógicos de regulación génica en plantas. Se observó que la fusión de distintas proteínas virales, como la proteína de inclusión nuclear b (NIb) de los potyvirus o fragmentos de ella, al extremo carboxilo terminal de Rosea1 inhibía la actividad del factor de transcripción. Sin embargo, la acumulación de antocianinas se pudo restablecer insertando sitios de reconocimiento de proteasas virales entre ambas partes y coexpresando tales proteasas. La especificidad de corte y la eficiente actividad catalítica de las proteasas de inclusión nuclear a (NIaPro) del virus del grabado del tabaco (TEV) y del virus de las venas moteadas del tabaco (TVMV) permitió construir circuitos genéticos basados en regulación postranscripcional que son capaces de realizar algunas operaciones lógicas básicas (YES, OR y AND) en tejidos vegetales., [CA] Els virus de plantes posseeixen la capacitat de parasitar cèl·lules vegetals i posar a la seva disposició la maquinària cel·lular de la planta per a la síntesi de les seves pròpies proteïnes. Aprofitant aquesta capacitat, l'enginyeria genètica ha dirigit molts dels seus esforços a la modificació del genoma viral per utilitzar els virus de plantes com a vectors d'expressió de proteïnes d'interès humà. Els potyvirus són un grup de virus de plantes àmpliament estudiat i utilitzat en biotecnologia. El seu genoma està format per un RNA de cadena senzilla que codifica, principalment, una poliproteïna que es processa per donar aproximadament 10 proteïnes madures. En diferents posicions intercistróniques es poden inserir cDNAs que codifiquen proteïnes d'interès, les quals es produeixen alhora amb la resta de productes de la poliproteïna. Si a més aquests cDNAs es flanquegen per seqüències que codifiquen els llocs de processament específics de les proteases virals, les proteïnes heteròlogues s'alliberen eficientment de la poliproteïna viral. Així, la inserció d'un cDNA corresponent al factor de transcripció Rosea1 de la ruta de les antocianines en diferents potyvirus resulta en la biosíntesi d'aquests compostos en les cèl·lules vegetals infectades. Les antocianines són compostos flavonoides colorits que es poden observar a simple vista, de manera que l'expressió de Rosea1 és una eina biotecnològica molt útil per seguir la infecció de virus de plantes. En aquesta Tesi s'han investigat diferents aplicacions biotecnològiques basades en l'expressió del factor de transcripció Rosea1 i la conseqüent acumulació d'antocianines en el context de la biologia dels potyvirus. Primer, es va construir un clon del virus del mosaic groc del carbassó (ZYMV) etiquetat amb Rosea1 (ZYMV-Ros1). El ZYMV és capaç de replicar-se a nivell local però no de moure's a llarga distància en plantes de Nicotiana benthamiana. Un anàlisi de la infecció per ZYMV-Ros1 en una sèrie de plantes transgèniques de N. benthamiana silenciades en diferents RNases de tipus Dicer (DCL) va permetre aprofundir en el coneixement dels mecanismes defensius de la planta front aquest virus. Els resultats van indicar que DCL4 està implicada en restringir el moviment sistèmic del virus, ja que en plantes amb aquest gen silenciat el virus és capaç de moure's a llarga distància. A més, les antocianines són objecte d'un gran interès nutricional, farmacèutic i fins i tot industrial, per la seva gran activitat antioxidant. Un clon viral derivat del virus Y de la patata (PVY) que expressava Rosea1 (PVY-Ros1) va induir l'acumulació de més antocianines que les que contenen fruites i verdures que són font rica d'aquests valuosos antioxidants. Aquest mateix clon PVY-Ros1 es va utilitzar per estudiar la transmissió del virus mitjançant àfids vectors, observant com aquests provoquen freqüentment l'inici de la infecció en el teixit vascular. Aquest mateix clon viral també va permetre mostrar visualment l'efecte antiviral que tenen les nanopartícules de plata en plantes. Finalment, en aquesta Tesi es va combinar el factor de transcripció Rosea1 amb diferents proteases dels potyvirus per crear circuits lògics de regulació gènica en plantes. Es va observar que la fusió de diferents proteïnes virals, com la proteïna d'inclusió nuclear b (NIb) dels potyvirus o fragments d'ella, a l'extrem carboxil terminal de Rosea1 inhibia l'activitat del factor de transcripció. No obstant això, l'acumulació d'antocianines es va poder restablir inserint llocs de reconeixement de les proteases virals entre les dues parts i coexpressant aquestes proteases. L'especificitat de tall i l'eficient activitat catalítica de les proteases d'inclusió nuclear a (NIaPro) del virus del gravat del tabac (TEV) i del virus de les venes clapejades del tabac (TVMV) va permetre construir circuits genètics basats en regulació postranscripcional que són capaços de realitzar algunes operacions lògiques bàsiques (YES, OR i AND) en teixits vegetals., [EN] Plant viruses have the ability to parasitize plant cells and use the plant cellular machinery for the synthesis of their own proteins. Taking advantage of this capacity, genetic engineering has focused many of its efforts in modifying the viral genome in order to use modified plant viruses as expression vectors of proteins of human interest. These proteins are stored in host plants that act as low-cost and highly secure biofactories. Potyviruses are a group of plant viruses widely studied and used in biotechnology. Their genome consist of a single-stranded RNA that mainly encodes a polyprotein that is processed in approximately 10 mature proteins. cDNAs flanked by protease specific processing sequences can be inserted in different intercistronic positions and efficiently processed by the viral proteases to produce proteins of interest together with the rest of the viral polyprotein products. Thus, the insertion of the cDNA corresponding to the transcription factor Rosea1 of the anthocyanin pathway in different potyviruses results in the biosynthesis of these compounds in infected plant cells. Anthocyanins are colored flavonoid compounds that can be observed with the naked eye, and thus, the expression of Rosea1 is a very useful biotechnological tool to follow the infection of plant viruses. In this work, we provided different biotechnological applications based on the expression of this transcription factor and the consequent accumulation of anthocyanins in the context of potyvirus biology. First, a zucchini yellow mosaic virus (ZYMV, genus Potyvirus) clone tagged with Rosea1 (ZYMV-Ros1) was constructed. ZYMV is able to replicate locally but not to move long distances in Nicotiana benthamiana plants. We analyzed the infection by ZYMV-Ros1 in a series of N. benthamiana transgenic plants in which the different Dicer-like (DCL) RNases were slilenced. The results showed that DCL4 is involved in restricting the systemic movement of the virus in N. benthamiana plants. This study allowed to deepen the knowledge of the defense mechanisms of the plant against this virus. Besides their biotechnological potential as markers of biological activities, anthocyanins have great nutritional, pharmaceutical and even industrial interest due to their high antioxidant activity. We found that a potato virus Y clone (PVY; genus Potyvirus) expressing Rosea1 (PVY-Ros1) induced the accumulation of a higher amount of anthocyanins than those contained in fruits and vegetables that are a rich source of these valuable antioxidants. The PVY-Ros1 clone was also used to study the transmission of the virus by aphid vectors. We observed that aphids frequently initiate infection in vascular tissue. This viral clone also allowed to visually show the antiviral effect of silver nanoparticles in plants. Finally, in this work, the Rosea1 transcription factor was combined with different potyvirus proteases to create genetic circuits in plants. We observed that the fusion of the nuclear inclusion protein b (NIb) of potyviruses, or fragments of it, to the carboxyl terminal end of Rosea1 inhibited the activity of the transcription factor. However, the accumulation of anthocyanins could be restored by inserting viral protease recognition sites in between NIb and Rosea1 and co-expressing those proteases. The cleavage specificity and the efficient catalytic activity of nuclear inclusion a proteases (NIaPro) of tobacco etch virus (TEV; genus Potyvirus) and tobacco spotted vein virus (TVMV; genus Potyvirus) allowed the construction of genetic circuits based on post-transcriptional regulation that are capable of performing some basic logical operations (YES, OR and AND) in plant tissues., This work was supported by the Spanish Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) through grants BIO2014-54269-R and AGL2013-49919-EXP, and by the Greek Ministry for Education and Religious Affairs (Program Aristeia II, 4499, ViroidmiR; ESPA 2007-2013). This research was supported by the Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (Spain) grants AGL2013-49919-EXP, BIO2014-54269-R, BFU2015-66894-P and BIO2017-83184-R (co-financed FEDER funds) and by the Engineering and Physical Sciences Research Council and the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (UK) grant BB/M017982/1.

Las tecnologías de secuenciación masiva, también conocidas como NGS o HTS (Next-Generation Sequencing, High-Throughput Sequencing), tienen varias ventajas sobre los enfoques biológicos, serológicos y moleculares tradicionales, tanto para el diagnóstico de enfermedades como para la detección de virus específicos en plantas leñosas. Entre las ventajas más importantes está que esta técnica no requiere un conocimiento a priori sobre los virus que infectan la planta. Esto significa que no es necesario conocer la secuencia genómica de un virus para poder ser detectado, a diferencia de las técnicas de amplificación basadas en la PCR o isotermas, cuyo requisito es el conocimiento de la secuencia genética a detectar para diseñar cebadores o sondas. También presenta ventajas sobre las técnicas ELISA, que se restringen a la detección de virus para los que haya disponibilidad de anticuerpos para el diagnóstico serológico. Estas dos formas de detección, las moleculares y las serológicas tradicionales, son muy específicas y, por tanto, no pueden identificar virus desconocidos o posibles variantes muy divergentes que podrían estar involucrados en la etiología de una enfermedad.