Search

Los virus son partículas que infectan a todas las formas de vida. Los virus bacteriófagos, que infectan bacterias, fueron descubiertos antes que los antibióticos. A pesar de su tamaño pequeño, han contribuido al desarrollo científico desde hace décadas, como en el descubrimiento de numerosas enzimas con aplicaciones en la biología molecular1. En este trabajo se analizarán aspectos generales de la biología de los virus bacteriófagos, su contribución a la salud y se presentarán algunos casos exitosos de la terapia antimicrobiana usando bacteriófagos en humanos y animales. Aunque la terapia con bacteriófagos no cuenta con autorización para su uso global, ya existen formulaciones comerciales de bacteriófagos para la industria alimentaria. Se describirá el arma principal de los bacteriófagos, la endolisina, enzima que “revienta” a las bacterias. Las endolisinas se consideran una alternativa más segura que los bacteriófagos, al carecer de material genético. Los bacteriófagos y las endolisinas tienen aplicaciones revolucionarias en la medicina, como vehículos de transporte de moléculas y generación de vacunas, de fantasmas bacterianos, o en la detección diagnóstica de bacterias patógenas.

La mastitis es una enfermedad que afecta al ganado bovino lechero a nivel mundial, provocando una disminución en la calidad y cantidad de la leche producida, lo cual genera pérdidas económicas considerables. Esta enfermedad es causada por una variedad de microorganismos, entre los cuales Staphyloccocus aureus es uno de los más importantes. El objetivo del trabajo fue caracterizar 20 aislamientos de Staphylococcus spp. obtenidos de la glándula mamaria de vacas lactantes con mastitis en un sistema de producción de traspatio, mediante el uso de polimorfismos derivados de la amplificación al azar de ADN (RAPD’s) y su sensibilidad hacia trece antibióticos y 1 detergente. Las pruebas de sensibilidad a los 13 antibióticos demostraron que todos los aislamientos fueron resistentes a penicilina y sensibles a cefalotina, eritromicina y trimetoprim. Todos los aislamientos fueron susceptibles a una concentración menor de 6 µg/ml de bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB). La caracterización molecular permitió determinar que los aislamientos SA7 y SA8, SA30 y SA32, presentaron una similitud superior al 90 % en el patrón de bandas obtenida por RAPD, mientras que los aislamientos SA35 y SA36 fueron idénticos, sin embargo, el resto de los aislamientos presentaron perfiles de amplificación distintos. Los aislamientos SA7 y SA8, SA30 y SA32, SA35 y SA36, tuvieron patrones de resistencia a antibióticos y de RAPD similares, por lo que probablemente se trató de reaislamientos. Los aislamientos de Staphylococcus de Tarímbaro, Michoacán presentaron una diversidad de perfiles de amplificación.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas The transcription factor Nrf2 is essential to decrease the concentration of reactive oxygen species (ROS) produced in the inflammatory response caused by tissue damage, due to oxidative stress. The disrupt of interaction between Keap1 and Nrf2, by means of inhibitors, has been a strategy that has made it possible to promote the exogenous activation of Nrf2, thus inducing the expression of antioxidant genes. These inhibitors can be used as adjuvants for the treatment or prevention of various conditions associated with inflammation, such as kidney and cardiovascular diseases, diabetes, Alzheimer's, Parkinson's and cancer. Experimental and computational studies of molecular docking in our laboratory have suggested that the anti-inflammatory peptide IDR-1002 (VQRWLIVWRIRK-NH2) activates the translocation to the nucleus of Nrf2, through its binding with the Keap1 interaction region, specifically in the low affinity motif DLG. Computational results of atomistic molecular dynamics (DM) simulations show that the amino acids of IDR-1002 that mainly contribute to this binding are R3, R9 and R11.With the idea of exploring the importance of these amino acid residues in the Nrf2-IDR-1002 interaction, it was decided to mutate each of these residues by A. Subsequently, the interaction between IDR-1002 and each of the points mutants IDR-1002-R3A, IDR-1002-R9A and IDR-1002-R11A with Nrf2 was simulated by DM for a period of 1000 ns. The results indicate that the R9A mutation caused a more significant conformational change in the binding of the peptide with Nrf2, losing the previously established interaction with D27 and D29 of Nrf2. I El factor de transcripción Nrf2 es fundamental para disminuir la concentración de especies reactivas de oxígeno (ERO) producidas en la respuesta inflamatoria causada por daño tisular, debido al estrés oxidante. El bloqueo de la interacción entre Keap1 y Nrf2, por medio de inhibidores, ha sido una estrategia que ha permitido promover la activación exógena de Nrf2, induciendo así la expresión de genes antioxidantes. Estos inhibidores pueden usarse como coadyuvantes para el tratamiento o prevención de varios padecimientos que cursan con inflamación, como enfermedades renales, cardiovasculares, diabetes, Alzheimer, Parkinson y cáncer. Estudios experimentales y computacionales de acoplamiento molecular en nuestro laboratorio han sugerido que el péptido antiinflamatorio IDR-1002 (VQRWLIVWRIRK-NH2) activa la translocación al núcleo de Nrf2, mediante su unión con la región de interacción a Keap1, específicamente en el motivo de baja afinidad DLG. Resultados computacionales de simulaciones atomísticas de dinámica molecular (DM) muestran que los aminoácidos de IDR-1002 que contribuyen principalmente a esta unión son R3, R9 y R11. Con la idea de explorar la importancia de estos residuos de aminoácidos en la interacción Nrf2-IDR-1002, se decidió mutar cada uno de estos residuos por A. Posteriormente, se procedió a simular por DM durante un periodo de 1000 ns la interacción entre IDR-1002 y cada una de las mutantes puntuales IDR-1002-R3A, IDR-1002-R9A y IDR-1002-R11A con Nrf2. Los resultados indican que la mutación R9A causó un cambio conformacional más significativo en la unión del péptido con Nrf2, perdiéndose la interacción establecida previamente con D27 y D29 de Nrf2. En las otras dos mutantes puntuales se mantienen las interacciones entre IDR-1002-R3A y E35 de Nrf2 y IDR-1002-R11A con D29 de Nrf2.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas In recent years, there have been an startling increase in antimicrobial resistance in pathogenic bacteria. That is the case for Staphylococcus aureus, which is known to present several mechanisms to resist antibiotics, and for being the causal agent of mutliple infections both in humans and other animals. In this work we proposed the heterologous expresión of LysK, and endolysin from bacteriophage for the treatment and control of infections caused by S. aureus. Advantages over endolysins over other antimicrobial agents are that there are no reports of resistance in bacteria and that they may be the subject of genetic engineering to widen host range. Escherichia coli was proposed as a model for the expression of LysK, due to the great amount of knowledge of this microorganism as a tool for gene expression. Lactic acid bacteria were also used due to its inocuity for human been, thus eliminating the potential risk of other bacteria as expression vectors. An expression vector was designed for lactic ácid bacteria. LysK endolysin was expressed and purified in E. coli using a commercial expression vector. En los últimos años se ha presentado un incremento alarmante en la resistencia a antimicrobianos por parte de bacterias patógenas. Tal es el caso de Staphylococcus aureus, la cual es conocida por poseer una serie de mecanismos que le confieren resistencia a los anibióticos, y por ser el agente causal de multiples infecciónes, no solo en humanos, si no también en animales. En este trabajo se propone la expresión heterologa de LysK una endolisina de bacteriofago para el tratamiento y control de infecciones causadas por S. aureus. Las ventajas que tienen las endolisinas sobre el uso de otros agentes antimicrobianos es que hasta la fecha no se ha reportado resistencia por parte de las bacterias, y es posible diseñarlas genéticamente y ampliar el rango de hospedero. Como modelo de expresión se proponen Escherichia coli, debido al amplio conocimiento que se tiene sobre este microorganismo como herramienta para la expresión de genes. También su utilizaron bacterias ácido lácticas, debido a que estas son inocuas para el ser humano, con lo que se elimina el riesgo potencial que representa el uso de otras bacterias como vectores de expresión. Se diseñó y evaluó un vector de expresión para bacterias ácido lácticas. La endolisina LysK se expresó y purificó de E. coli en un vector de expresión comercial.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas Oxidative stress refers to a condition in which the concentration of reactive oxygen species (ROS) surpasses the capacity of antioxidant cellular defenses. This causes alterations in the structure and function of biomolecules and increases the probability of developing chronic degenerative diseases. Nrf2 (Nuclear Factor Erythroid 2-related factor) is an essential transcription factor that induces the expression of genes gainst oxidative stress. Its regulation occurs mainly in the cytoplasm through its association with the protein Keap-1 (Kelch-like ECH-associated protein 1), and the E3 ubiquitin ligase complex (Cullin 3-Rbx1 proteins) that allows Nrf2 to separate from the complex and translocate to the nucleus when ROS concentrations are high. Lack of Nrf2 may increase production of pro-inflammatory cytokines by indirectly activating the NF-B transcription factor, leading to inflammation. The innate defense regulator (IDR) peptides are chemically synthetized and cationic constituted by twelve amino acids derived from defense peptides of natural origin. El término estrés oxidante se refiere a una condición cuando las concentraciones de especies reactivas de oxígeno (ERO) se elevan significativamente y sobrepasan la capacidad de las defensas celulares antioxidantes, lo que provoca alteraciones en la estructura y función de biomoléculas y con ello la probabilidad de desarrollar diversas enfermedades crónicas-degenerativas. El factor de transcripción Nrf2 (Nuclear Factor Erythroid 2-related factor) es esencial en la expresión de genes que protegen a la célula contra el estrés oxidante. Su regulación ocurre principalmente por su asociación en el citoplasma con el complejo formado por la proteína Keap-1 (Kelch-like ECH-associated protein 1) y el complejo de ubiquitín ligasa E3 (formado por Cullin 3 y la proteína Rbx1) que le permiten a Nrf2, cuando hay concentraciones altas de ERO, separarse del complejo y translocarse al núcleo donde activará los genes citoprotectores antioxidantes. Se ha reportado que la ausencia de Nrf2 puede incrementar la producción de citocinas y con ello la inflamación, al favorecer la actividad del factor transcripcional NF-B. Los péptidos reguladores de la defensa inmunitaria innata (IDR) son péptidos sintéticos y catiónicos de doce aminoácidos derivados de péptidos de defensa de origen natural.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Instituto de Investigaciones sobre los Recursos Naturales. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Doctorado en Ciencias Biológicas Inflammation is the main mechanism of the innate immune system against the harmful effects of pathogenic microorganisms. Although inflammation is considered a physiological response that is critical to protect and restore the tissue homeostasis, its control and resolution are fundamental to avoid chronic inflammatory conditions. During the last decade many research groups worldwide have made valuable progress on the molecular mechanisms that regulate inflammation. Their principal goal has been to design anti-inflammatory drugs that specifically inhibit pro-inflammatory molecular targets. The innate defense regulator (IDR) cationic peptides are promising anti-inflammatory drugs because they selectively and specifically modulate the innate immune system, effectively eliminate pathogenic bacteria such as Staphylococcus aureus and Escherichia coli from the infected tissues, and control inflammation. Although several reports have documented the anti-inflammatory properties of one of these peptides, IDR-1002, the inhibition mechanisms of pro-inflammatory cytokines expression and anti-inflammatory cytokines activation is not known in detail. Due to the important function of macrophages as regulatory cells of the inflammatory response, we decided to explore the role of the proinflammatory transcription factor NF-?B and the anti-inflammatory transcription factor CREB in the regulation of the pro- and anti-inflammatory cytokines expression, respectively when macrophages are treated with IDR-1002. We found that macrophages stimulated with lipopolysaccharide (LPS) expressed high amounts of the NF-?B-dependent genes TNF-? and COX-2; however, in the presence of IDR-1002 we observed a significant expression reduction of both pro-inflammatory molecules because this peptide strongly inhibited the I?B? phosphorylation and subsequently the NF-?B nuclear translocation. Furthermore, IDR-1002 induced an increase in the relative abundance of CREB phosphorylated at Ser133 through a mechanism that involved the activation of the protein kinases p38, ERK1/2, and MSK1. La inflamación es el principal mecanismo de respuesta del sistema inmune innato, que nos defiende en primera instancia contra los efectos dañinos de microorganismos patógenos. Aunque la respuesta inflamatoria se considera un mecanismo fisiológico que se pone en marcha para proteger la integridad del tejido, su control y resolución son fundamentales para evitar situaciones inflamatorias crónicas que pueden provocar enfermedades degenerativas. En los últimos años el estudio de los mecanismos moleculares que controlan la inflamación ha llegado a ser un tema de frontera que permitirá diseñar fármacos que puedan regular la respuesta inflamatoria. Dentro de estos fármacos se encuentran los péptidos catiónicos sintéticos, denominados IDR (Innate Defense Regulator). Uno de estos péptidos, IDR-1002 regula selectivamente el sistema inmune, induce la eliminación eficaz de bacterias como Staphylococcus aureus y Escherichia coli de los tejidos y controla efectivamente la inflamación. Sin embargo, el mecanismo molecular que IDR-1002 activa para regular la expresión diferencial de citocinas pro- y antiinflamatorias no ha sido analizado en detalle. Debido a la importancia de los macrófagos en la regulación de la respuesta inflamatoria, decidimos explorar en este tipo celular la participación de CREB y NF-?B en el mecanismo activado por IDR-1002. Los macrófagos estimulados con LPS respondieron con un incremento significativo de TNF-? y COX-2; sin embargo, en presencia de IDR-1002 se observó una disminución significativa de estas dos moléculas pro-inflamatorias. La causa de esta disminución fue que IDR-1002 inhibió la translocación al núcleo de NF-?B, mediante la inhibición de la fosforilación de I?B?. Además, IDR-1002 causó un aumento en la abundancia relativa de CREB fosforilado en Ser133, por un mecanismo dependiente de la activación de p38, ERK1/2 y MSK1.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Instituto de Investigaciones sobre los Recursos Naturales. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Doctorado en Ciencias Biológicas In mammals the enzyme glycogen synthase kinase 3 (GSK3) participates in various cellular processes such as differentiation, apoptosis and inflammation. During episodes of inflammation caused by bacterial infections, the GSK3 enzyme is inhibited by phosphorylation, which leads to changes in expression of IL-8 (pro-inflammatory) and IL-10 (anti-inflammatory) interleukins by activating NF-?B and CREB, respectively. Two GSK3 enzyme paralogs called GSK3? and GSK3? have been identified. Although the role of GSK3? as a regulator of cytokine production is well established in models of lipopolysaccharide stimulated monocytes (LPS), there are no studies demonstrating the involvement of GSK3? isoform in this process. Previously, our team observed that during bovine endothelial cell (BEC) infections with the pathogen Staphylococcus aureus, a preferential inhibition of the GSK3? isoform was detected. The aim of this study was to assess if during endothelial cell infections with S. aureus, the GSK3? isoform controls cytokine expression and, as a consequence, inflammation. In temporary courses of infection, a preferential inhibition by phosphorylation of the GSK3? isoform was observed, compared to the inhibition of the GSK3? isoform, during the first 40 minutes of infection NF-?B phosphorylation was increased in Ser536 (phospho-NF-?B), its translocation to the nucleus and interaction with the CBP co- activator, which resulted in an induction of IL-8 expression. However, after the initial 40 minutes of infection, GSK3? gradually lost its constituent activity, CREB activation by phosphorylation increased in Ser133 and its interaction with the CBP co-activator, resulting in an increase in IL-10 expression. Simultaneously, the relative abundance of phospho-NF-?B was gradually reduced and its presence in the nucleus also decreased. En mamíferos la enzima glucógeno sintasa cinasa 3 (GSK3) participa en diversos procesos celulares como la diferenciación, la apoptosis y la inflamación. Durante la inflamación producida por infecciones bacterianas, la enzima GSK3 se inhibe por fosforilación, lo que conduce a cambios en la expresión de genes que codifican para las interleucinas IL-8 (pro-inflamatoria) e IL-10 (anti-inflamatoria) mediante la activación de NF-?B y CREB, respectivamente. Se han identificado dos parálogos de la enzima GSK3 llamados GSK3? y GSK3?. Aunque la función de GSK3? en la producción de citocinas está bien establecida en modelos de monocitos estimulados con lipopolisacárido (LPS), no hay estudios que demuestren la participación de la isoforma GSK3? en este proceso. Previamente, nuestro equipo de trabajo observó que durante las infecciones de células de endotelio bovino (CEB) con el patógeno Staphylococcus aureus ocurre la inhibición preferencial de la isoforma GSK3?. El objetivo de este trabajo fue demostrar que durante las infecciones de células endoteliales por S. aureus, la isoforma GSK3? controla la expresión de citocinas y como consecuencia de ello, la inflamación. En cursos temporales de infección, se observó una inhibición preferencial por fosforilación de la isoforma GSK3?, comparada con la inhibición de la isoforma GSK3? durante los primeros 40 min de infección se incrementó la fosforilación de NF-?B en Ser536 (fosfo-NF-?B), su translocación al núcleo y la interacción con el co-activador CBP, lo que resultó en una mayor expresión de IL-8. Sin embargo, transcurridos los 40 min iniciales de infección, GSK3? pierde gradualmente su actividad constitutiva, incrementa la activación de CREB por fosforilación en Ser133 y su interacción con el co-activador CBP, lo que produjo un incremento en la expresión de IL-10. Simultáneamente, se redujo de manera gradual la abundancia relativa de fosfo-NF-?B y disminuyó también su presencia en el núcleo.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Instituto de Investigaciones sobre los Recursos Naturales. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Doctorado en Ciencias Biológicas Strains of Staphylococcus spp. used in this work were obtained from cases of bovine mastitis in dairy backyard systems. Dichotomous data base, in order to determine the biological risk factors and relation of multi-resistance between strains was developed. Restriction polymorphism was analyzed and the statistical association between different allelic profiles and bovine subclinical mastitis, as well as the discrimination index of PCR-RFLP of adhesin genes fnbA, fnbB, clfA and clfB of S. aureus. Four hundred and forty isolates were obtained using salt–mannitol agar (SMA, Bioxon), Staphylococcus-110 agar (S110, Bioxon), CHROMAgar Staph aureus (CSA, BD-BBL) and sheep’s blood agar (SBA, BDBBL). All bacterial isolates were identified by their typical colony morphology in the respective media, by secondary tests (for coagulase and b-haemolysis) and by partial 16S rRNA (rrs) gene sequencing as a gold standard test. SMA was the culture medium that was best for isolating and identifying S. aureus from cases of bovine mastitis followed by S110, CSA and SBA. S. aureus, S. haemolyticus, S. saprophyticus, S. sciuri, S. epidermidis, S. hominis, S. xylosus and SIG were associated as risk factors biological in subclinical bovine mastitis cases. We do not identify mecA gene and mecALGA251 (mecC) gene in strains of S. aureus, however, we detected the presence of the mecA gene in strains of S. hominis, S. xylosus, S. sciuri, S. haemolyticus and SIG. It was evident the presence of a complex of Staphylococcus spp. Related epidemiological and pharmacologically to bovine subclinical mastitis. Analysis of restriction of adhesins of S. aureus, revealed that some cluster adhesins were statistically associated with bovine subclinical mastitis and using PCR-RFLP with a combination of four adhesins, was obtained the maximum value of the discrimination index. Las cepas de Staphylococcus spp. usadas en este trabajo se obtuvieron de casos de mastitis bovina de sistemas lecheros de traspatio. Se elaboró una base de datos dicotómicos, con la finalidad de determinar los factores de riesgo biológico y relación de multiresistencia entre cepas. Se analizó el polimorfismo de restricción y se estableció la asociación estadística entre los diferentes perfiles alélicos y la mastitis subclínica bovina, así como el índice de discriminación de PCR-RFLP de las adhesinas fnbA, fnbB, clfA, clfB de S. aureus. 440 aislados fueron obtenidos de Agar Sal y Manitol (SMA, Bioxon®), Agar Staphylococcus-110® (S110, Bioxon®), CHROMAgar Staph Aureus® (CSA, BD-BBL) y Agar sangre de carnero (SBA, BD-BBL). Todas las bacterias aisladas fueron identificadas por su morfología colonial típica en el medio respectivo, por pruebas secundarias (coagulasa y β-hemolisis) y por secuenciación parcial del gen del 16S rRNA (rrs) como la prueba de oro. SMA fue el medio de cultivo que mejor aisló e identifico S. aureus en casos de mastitis bovina seguido de S110, CSA y SBA, respectivamente. S. aureus, S. haemolyticus, S. saprophyticus, S. sciuri, S. epidermidis, S. hominis, S. xylosus y Grupo de Staphylococcus intermedius se asociaron como factores de riesgo biológico en casos de mastitis subclínica bovina. No fueron identificados los genes mecA y mecALGA251 (mecC) en cepas de S. aureus, sin embargo, se detectó la presencia del gen mecA en cepas de S. haemolyticus, S. hominis, S. xylosus, S. sciuri y SIG. Fue evidente la presencia de un complejo de Staphylococcus spp. relacionados epidemiológica y farmacológicamente a la mastitis subclínica bovina. El análisis de restricción de adhesinas de S. aureus, reveló que algunos alotipos de adhesinas se asociaron estadísticamente a mastitis subclínica bovina y usando PCR-RFLP con la combinación de cuatro adhesinas, se obtuvo el máximo valor del índice de discriminación.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas Milking industry is one of the main economical activities in Michoacán. However, important losses have been quantified due to bovine mastitis. Dissemination of Staphylococcus aureus is considered a public health problem because it has been associated with bovine mastitis, mainly, in animals, but it also causes community- and hospital-acquired infections in humans. The diversity and environmental adaptation of S. aureus strains had lead to failure in successful control and treatment. In this work S. aureus isolated from mastitic cows and humans working in the milk production system in the municipality of Tarímbaro, Michoacán were subject to molecular characterization. 13 backyard farms were analyzed. The prevalence of mastitis was 44.58% (subclinical 42.03, clinical 2.54%). From multilocus sequence typing analysis (MLST) 6 reported Sequence- Type (STs), 4 new alleles (Nas) and 12 new STs (NSTs) were identified. The most ubiquitous ST was NST-4. It was identified in isolates from bovine, human and fomites. Most of the bovine isolates and one human isolate were grouped in the Clonal Complex 97 (CC97), associated to bovine. The ST8, which has been associated with community infections in humans, was found in two bovine isolates. The analysis of strains distribution pointed to NST-4 as the founder strain, from which some of the rest NSTs in bovine have evolved. These findings suggest a transmission between hosts. A statistical correlation was found between coagulase and STs genotypes with the grade of mastitis. Genotypes coa A and D and ST1476 were related to subclinical mastitis and, in clinical mastitis, genotypes coa B and STs 188, NST-1 and NST-12 were involved. La industria lechera es una actividad económica importante en el estado de Michoacán. La diseminación de Staphylococcus aureus es un grave problema de salud pública, ya que es el principal agente causal de mastitis bovina e infecciones nosocomiales y de comunidad abierta en humanos. Su control y tratamiento han fracasado, debido a la diversidad de cepas existentes y a la ubicuidad del microorganismo. En este trabajo se caracterizaron molecularmente aislados de Staphylococcus aureus provenientes de vacas con mastitis y de humanos involucrados en la producción lechera del municipio de Tarímbaro, Michoacán. El estudio se realizó en 13 granjas familiares. La prevalencia de mastitis fue del 44.58% (subclínica 42.03%, clínica de 2.54%). Mediante el análisis de secuencias multilocus (MLST) se identificaron 6 Secuencias Tipo (STs) reportados y, 4 alelos (Nas) y 12 STs nuevos (NSTs). El NST-4 fue el ST más ubicuo, ya que se identificó en aislados de S. aureus de origen bovino, humano y fomite. La mayoría de los aislados de bovino y un aislado de humano se agruparon en el complejo clonal 97 (CC97) reportado como asociado a bovinos. Se encontraron dos aislados de bovinos con ST8, la cual se ha reportado como asociada a infecciones de comunidad en humanos. Análisis de distribución de las cepas sugieren que el NST-4 se comporta como la clona fundadora de la cual se derivan varios de los NSTs encontrados en bovinos. Estos hallazgos sugieren una transmisión entre hospederos, representando un riesgo para la salud pública. Se encontró una correlación estadísticamente significativa entre genotipos específicos de coagulasa y/o STs y la forma de presentación de mastitis. Los genotipos asociados a mastitis subclínica fueron aquellos con alotipos A y D del gen coa y ST1476 y, en el caso de mastitis clínica los genotipos con alotipo B del gen coa y los STs 188, NST-1 y NST-12.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Instituto de Investigaciones sobre los Recursos Naturales. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Doctorado en Ciencias Biológicas Antimicrobial peptides (AP) are important components of the eukaryotic innate immune response. They have effects on the plasmatic membranes (PM) of bacteria, fungi and mammalian cells. Plant defensins (PD) are an AP group which have main activity against phytopathogenic fungi, although some PD have activity against Gram positive, Gram negative bacteria and tumoral cells. The increase in the selection of resistant microorganisms to conventional antibiotics and fungicides has propitiated the development of new antimicrobial or antifungal compounds. In this sense, PD represent a therapeutic alternative against mammalian pathogenic microorganisms, mainly from humans, for example Candida albicans. In this work, we generated a construction containing the cDNA of γ-thionin defensin from chile habanero (Capsicum chinense) cloned into the EcoRІ site from the mammalian expression vector pTracerC. This construction was used to transfect by lipofection the immortal bovine endothelial cell line BVE-E6E7 and was named pTCγ. The transfected cells were selected by fluorescence emission and zeocine resistance, and a polyclonal population with a stable integration (Co) was obtained. From this population, 9 clones were isolated (S1-S9) and 2 of them were selected, S1 and S2, in relation to their antifungal and cytotoxic activity. The expression of the mRNA for γ-thionin was confirmed in Co, S1 and S2 clones by RT-PCR and sequence analysis. The conditioned media (CM) from these clones were obtained, and their antifungal, antibacterial and cytotoxic activities were evaluated on the fungi C. albicans (ATCC 10231), the Gram positive bacterium Staphylococcus aureus (ATCC 27543), the Gram negative bacterium Klebsiella pneumoniae (ATCC 4352) and the tumoral cell lines MCF-7, A549 y HeLa. The endocytosis of C. albicans into the selected clones was also tested. Los péptidos antimicrobianos (PA) son componentes importantes de la inmunidad innata de los eucariotes que actúan principalmente sobre las membranas plasmáticas (MP) de las bacterias, los hongos y las células de mamíferos. Las defensinas de plantas (DP) son un grupo de PA con un mecanismo de acción que favorece su actividad en contra de hongos fitopatógenos, aunque algunas DP poseen actividad contra bacterias Gram positivas, Gram negativas y células tumorales. La selección de cepas de microorganismos resistentes a los antibióticos convencionales y el incremento en el número de individuos inmunocromprometidos, han motivado la búsqueda y el desarrollo de nuevos compuestos con actividad antimicrobiana o antifúngica que presenten una baja toxicidad para el hospedero. En este sentido las DP representan una alternativa terapéutica contra microorganismos patógenos de mamíferos, particularmente los de humano como Candida albicans; sin embargo, existe poca investigación al respecto. En este trabajo se generó la construcción de integración al azar pTCγ que contiene el ADNc de la defensina γ-tionina de chile habanero (Capsicum chinense) clonado en el sitio EcoRІ del vector de expresión para mamíferos pTracerC. Esta construcción se utilizó para transfectar por lipofección la línea celular inmortal de endotelio bovino BVE- E6E7. Las células se seleccionaron por emisión de fluorescencia y resistencia a zeocina, y se obtuvo una población policlonal con integración estable (Co). A partir de esta se aislaron 9 clonas (S1-S9) y se seleccionaron dos: S1 y S2, con base en su actividad antifúngica y citotóxica. En estas clonas se confirmó la expresión del ARNm de la γ-tionina por RT-PCR y secuenciación del fragmento de ADNc amplificado.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas The functions of different types of cells that constitute a multicellular organism are regulated by signal transduction pathways, whose final goal is target genes regulation. The Notch signaling pathway is mainly involved in early and late embryo development, and recently, has been described its participation in the adult organism proper function. Hairless, a protein member of the Notch signaling pathway, modulates negatively this transduction signal pathway. Despite efforts to detect Hairless in higher animals, it has not been able to identify a homologue protein. The identification of a homologue protein is essential for the understanding of the regulatory processes during embryo development and other pathological processes where Notch pathway is involved. The Hairless counterparts described in insects have at least three highly conserved domains, where the suppressor of Hairless binding domain is the most conserved. Using analysis in silico and molecular biology techniques was identified and delimited a potentially immunogenic peptide from the Suppressor of Hairless binding domain of Hairless protein from Drosophila melanogaster. This peptide was used as antigen to generate polyclonal antibodies in rabbits and chickens. The sera were tested against total protein extract from embryos of the fruitfly. La vía de señalización Notch es una de las rutas de comunicación celular, que se utiliza principalmente durante el desarrollo temprano de los individuos, ya que participa en la diferenciación celular y por lo tanto en la organogénesis, y en conjunto con otras vías de transducción de señales, permite las complejas organizaciones espacio-temporales que orquestan y diseñan a los organismos multicelulares. La proteína Hairless es el principal regulador negativo de esta vía y por lo tanto funciona como un antagonista de la misma. Si bien ha sido caracterizada en Drosophila melanogaster y otros insectos, esta proteína de vital importancia para la vía, no cuenta con un homólogo reportado en mamíferos. Hairless cuenta con varios dominios conservados entre los diferentes homólogos conocidos en insectos y uno de estos dominios en particular, le sirve como sitio de enlace a Supresor de Hairless, factor transcripcional de la vía, que cuenta con un homólogo en mamíferos, CBF-1 (RBPJκ). Mediante PCR se amplificó el dominio de unión a Supresor a Hairless de la proteína Hairless de Drosophila melanogaster para producir un péptido in vitro que se usó como antígeno en la inmunización de conejos y gallinas y producir anticuerpos policlonales contra esta región. Posteriormente los sueros se probaron en proteína total de Drosophila melanogaster para detectar Hairless mediante Western Blot. Estos anticuerpos serán probados en proteína total de mamífero con la intención de identificar alguna proteína que conserve la función de Hairless de Drosophila melanogaster o se una a los homólogos de Supresor de Hairless conocidos en estas especies.

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Instituto de Investigaciones sobre los Recursos Naturales. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Doctorado en Ciencias Biológicas Endothelial cells have a key role in the inflammatory response. Different approaches in vitro have demonstrated that endothelial cells can be invaded by many microorganisms, such as Staphylococcus aureus. In this work we evaluated the effect of the pro- inflammatory cytokines TNF-α (2.5 ng/ml) and IL-1β (20 ng/ml) on the S. aureus phagocytosis and intracellular survival in bovine endothelial cells (BEC). Simultaneously, we performed assays with S. epidermidis with the aim to compare the BEC response toward a pathogen bacterium versus an opportunistic-pathogen bacterium. BEC were able to phagocytize both S. aureus and S. epidermidis, although with a different pattern. The BEC treatment with TNF-α or IL-1β increased S. aureus phagocytosis, but decreased that of S. epidermidis. These cytokines activate signaling pathways such as those that involve NF-κB, JNK, and p38. Therefore the participation of each of these molecules in S. aureus and S. epidermidis phagocytosis was evaluated. S. aureus phagocytosis is associated with the activity state of NF-κB whereas S. epidermidis phagocytosis is associated with the basal activity of JNK and p38. Interestingly, we found that S. aureus activated the nuclear translocation of NF-κB. It is known that the protein A (SpA) of S. aureus binds to TNFR1 and activates NF-κB in airway epithelial cells. The treatment of CEB with SpA decreased their phagocytic capacity, although this behavior was reversible because the phagocytic capacity of BEC was recovered when BEC were cultured for a period of 2 and 6 h without additional treatment. The recovery of the phagocytic capacity was improved by treatment of BEC with TNF-α or IL-1β after a culture period of 2 h. BEC were also able to kill intracellular staphylococci. Las células endoteliales juegan un papel clave en la respuesta inflamatoria. Estudios in vitro han demostrado que las células endoteliales pueden ser invadidas por diferentes microorganismos patógenos, entre ellos Staphylococcus aureus. La infección de la glándula mamaria bovina por esta bacteria, induce la expresión de citocinas pro- inflamatorias como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y la interleucina 1 beta (IL- 1β), por lo que en este trabajo se evaluó el efecto de estas citocinas sobre la fagocitosis y supervivencia intracelular de S. aureus (bacteria patógena) y Staphylococcus epidermidis (bacteria patógena oportunista) en células endoteliales de bovino (CEB). Las CEB fueron capaces de fagocitar tanto a S. aureus como a S. epidermidis, aunque con un patrón diferente. El tratamiento de las CEB con el TNF-α (2.5 ng/ml) o con la IL-1β (20 ng/ml) indujo un incremento en la fagocitosis de S. aureus y una disminución en la fagocitosis de S. epidermidis. Estas citocinas activan vías de señalización que involucran al factor de transcripción NF-κB, a la cinasa JNK y a la cinasa p38. Por lo tanto, se analizó la participación de cada una de estas moléculas en la fagocitosis de ambas bacterias. La fagocitosis de S. aureus está asociada con la activación de NF-κB, mientras que la fagocitosis de S. epidermidis está asociada con la activación de JNK y de p38. De manera interesante, se encontró que S. aureus activa la translocación de NF-κB al núcleo. Se sabe que la proteína A de S. aureus (SpA) se une al receptor 1 de TNF (TNFR1) y esto activa a NF-κB en células epiteliales de pulmón. El tratamiento de las CEB con SpA disminuyó la capacidad fagocítica de las CEB, aunque de manera reversible, ya que después del tratamiento con SpA y después de un tiempo de incubación sin tratamiento adicional, la capacidad fagocítica de las CEB se recuperó.