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Orientadores: Roger Frigerio Castilho, Anibal Eugenio Vercesi Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A permeabilidade mitocondrial transitória (PMT) tem sido implicada na morte celular em diversos modelos de desordens neurodegenerativas, incluindo hipoglicemia, isquemia e trauma cerebral. No presente trabalho, estudamos a PMT em mitocôndrias isoladas de cérebro de rato. A PMT induzida por Ca2+ foi estimulada por Na+ e prevenida pela combinação de ADP e ciclosporina A (CsA), inibidores da PMT. EGTA, um quelante de Ca2+,ou a inibição da captação de Ca2+por vermelho de rutênio, revertem parcialmente a dissipação do potencial de membrana mitocondrial associada à PMT. Esta foi significantemente inibida por catalase, indicando a participação de espécies reativas de oxigênio (EROs) neste processo. Pela detecção de EROs por meio da oxidação do marcador diclorodihidrofluoresceína(H2DCF), observamos um aumento de EROs após a captação de Ca2+pela mitocôndria;este aumento de produção de EROs foi estimuladopor Na+ e totalmente revertido pela adição de ADP e CsA, indicando que a PMT promove estresse oxidativo mitocondrial. Este processo pode ser, em parte, explicado pela depleção de NAD(P)H na indução da PMT induzida por Ca2+,em mitocôndrias de cérebro de rato. Sabe-se que NADPH mantém a função antioxidante dos sistemas glutationa redutase/peroxidase e tioredoxina redutase/peroxidase. Além disto, a PMT está associada com a peroxidação lipídica de membrana. Estes resultados indicam que a PMT, decorrente do aumento de EROs induzido por Ca2+em mitocôndrias isoladas de cérebro, leva a danos oxidativos secundários, como a peroxidação lipídica. Para estudar o envolvimento da PMT e proteínas Bcl-2 na excitotoxicidade mediada pelo receptor de glutamato N-metil-D-aspartado (NMDA), foram realizadas em camundongos transgênicos que hiperexpressam Bcl-2 e em ratos, injeções intra-estriatais de ácido quinolínico, um agonista específico deste receptor. O ácido quinolínico causou uma degeneração de aproximadamente 50% do volume estriatal em ratos e camundongos. Camundongos transgênicos que hiperexpressam a proteína Bcl-2, uma proteína que inibe estímulos apoptóticos, e o tratamento de ratos com CsA não mostraram redução da toxicidade ao ácido quinolínico. Mitocôndrias isoladas de cérebro de ratos tratados com CsA mostraram resistência à indução de permeabilização induzida por Ca2+, indicando proteção contra a PMT. Concluímos que a excitotoxicidade estriatal mediada por ácido quinolíniconão é dependente da PMT e da morte celular por apoptose, sensívela Bcl-2. Mudanças na integridade mitocondrial, liberação de ERas e homeostase de Ca2+ estão envolvidas na patogênese de várias desordens neurológicas, incluindo a acidemia metilmalônica e a doença de Huntington (HD). Estas desordens neurodegenerativas cursam com inibição parcial do complexo II da cadeia respiratória itocondrial.Neste trabalho, nós estudamos os mecanismos pelos quais os inibidores do complexo 11 da cadeia respiratória, malonato (MA), metilmalonato (MMA) e 3-nitropropionato (3-NP) afetam a função mitocondrial e a sobrevivência neuronal in vitro. Observou-se que estes três inibidores, em concentrações que inibem aproximadamente 50% a respiração, induzem permeabilização mitocondrial quando na presença de concentrações micromolares de ci+. ADP, CsA e catalase preveniram este efeito, indicando que é mediado por ERas e PMT.Os efeitos de MA, MMA e 3-NP também foram observados em mitocôndrias isoladas de figado e rim, mas necessitaram uma maior inibição respiratória. Em cérebro, a PMT promovida por inibidores do complexo II foi estimulada pelo aumento da captação/liberação de Ca2+ mitocondrial e foi inibida quando a mitocôndria foi précarregada com Ca2+ou a entrada de Ca2+na matriz mitocondrial foi somente passiva. Em adição aos experimentos com mitocôndrias isoladas, o efeito de MMA também foi estudado em cultura de células PC12 e fatias de estriado de ratos adultos. MMA promoveu morte celular nas fatias de estriado e cultura de células PC12, num mecanismo sensível à CsA e bongkrekato, e não diretamente relacionado à inibição respiratória. Conclui-se que, em condições em que o complexo II da cadeia respiratória mitocondrial está parcialmente inibidano sistema nervoso central, a morte neuronal envolve a participação da PMT Abstract: Mitochondrial permeability transition (MPT) may be involved in several central nervous system disorders including ischemic and hypoglicemic neuronal death. In this study, we show that Ca2+-induced brain mitochondrial PT was stimulated by Na+ and tota1ly prevented by the combination of ADP and cyclosporinA (CsA). Removal of Ca2+ITom the mitochondria suspension by EGTA or inhibition of Ca2+uptake by ruthenium red partia1ly reverted the dissipation ofthe membrane potential associated with PT. Ca2+-inducedbrain mitochondrial PT was significant1yinhibited by catalase, indicating the participation of reactive oxygen species (ROS) in this processoAn increased detection of ROS, measured through dichlorodihydrotluorescein oxidation, was observed after mitochondrial Ca2+ uptake. Ca2+-induced dichlorodihydrotluorescein oxidation was enhanced by Na+ and prevented by ADP and CsA, indicating that PT enhances mitochondrial oxidative stress. This could be at least in part a consequence of the extensive depletion in NAD(p)H that accompanied Ca2+-inducedbrain mitochondrial PT. NADPH is known to maintain the antioxidant function of the glutathione reductase/peroxidase and thioredoxin reductase/peroxidase systems. In addition, the occurrence of mitochondrial PT was associated with membrane lipid peroxidation. Our results showed that PT further increases Ca2+-inducedoxidative stress in brain mitochondrialleading to secundary damage such as lipid peroxidation. We studied the participation of PT and the Bcl-2-sensitive apoptotic cell death pathway in glutamate receptor-mediated excitotoxicity. Intrastriatal infusions of the N-methyl-Daspartate (NMDA) receptor agonist quinolinic acid caused massive striatal neurodegeneration in both rats and mice. Interestingly, transgenic mice overexpressing human Bcl-2 and rats systemica1lytreated with CsA did not exhibit reduced sensitivity to quinolinic acid-induced striatal toxicity. In addition, isolated brain mitochondrial ITom CsA-treated rats showed resistance to Ca2+-induceddissipation ofthe membrane potential, indicating protection against PT. We conclude that quinolinic acid-mediated striatal excitotoxicity is not dependent on PT and Bcl-2-sensitiveapoptotic cell death pathways. Changes in mitochondrial integrity, reactive oxygen species release and Ca2+handling are proposed to be involved in the pathogenesis of many neurological disorders including methy1malonic acidemia and Huntington's disease (HD), which exhibit partial mitochondrial complex II inhibition. We studied the mechanisms by which the respiratory chain complex II inhibitors malonate (MA), methyl-malonate (MIMA) and 3- nitropropionate (3-NP) affect mitochondrial function and neuronal survival. We observed that all three inhibitors, at concentrations which inhibit respiration by 50%, induced mitochondrial permeabilization when in the presence of low Ca2+ concentrations. ADP, CsA and catalase prevented this effect, indicating it is mediated by ROS and PT. The effects of MA, MMA and 3-NP were also present in mitochondria isolated ftom liver and kidney, but required more significant respiratory inhibition. In brain, PT promoted by complex II inhIoitors was stimulated by increasing Ca2+ cycling and absent when mitochondria were pre-Ioaded with Ca2+or when only passive Ca2+uptake was present. In addition to the experiments on isolated mitochondria, we determined the effect ofMMA on cultured neural cells model and fteshly prepared brain slices. MMA promoted cell death in striatal slices and PC12 cells, in a manner attenuated by CsA and bongkrekate and unrelated to direct respiratory inhibition. We propose that under conditions in which complex 11is partially inhibited in the central nervous system, neuronal cell death involves the inductionofM PT Doutorado Ciências Biomédicas Doutor em Ciências Médicas

Orientadores: Anibal Eugênio Vercesi, Karina Gottardelo Zecchin Texto em português e inglês Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Recentemente mostramos que os inibidores da enzima ácido graxo sintase (FASN - EC 2.3.1.85), cerulenina e orlistat, reduzem a proliferação e induzem apoptose em células B16-F10 de melanoma murino via mecanismos mitocondriais. Neste presente estudo investigamos os efeitos desses inibidores de FASN em linhagem celular não-tumorigênica derivada de melanoblastos de camundongos (melan-a). O tratamento in vitro de células melan-a com 5 µg/mL de cerulenina ou com 30 µM de orlistat inibiu a proliferação celular, com acúmulo da proteína supressora de tumor p21WAF1/Cip1, assim como induziu a via intrínseca da apoptose com liberação de citocromo c e ativação de caspases-3 e -9, sem ativação da caspase-8. Os inibidores de FASN não alteram o conteúdo de ácidos graxos livres nas células melan-a, verificados por espectrometria de massas, sugerindo que o tratamento com cerulenina ou orlistat induz apoptose independente da inibição desta enzima. Análise das funções da bioenergética mitocondrial das células melan-a mostraram inibição da respiração, seguido por aumento da produção de superóxido. A inibição da respiração, promovida pelo tratamento com cerulenina ou orlistat, foi restrita à oxidação de substratos ligados a NADH (39,9% DMSO x cerulenina; ou 60,8% EtOH x orlistat) e succinato (45,8% DMSO x cerulenina; ou 51,8% EtOH x orlistat), e não foi significativa quando as mitocôndrias estavam respirando com substrato do complexo IV, N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilenodiamina. A proteção conferida pelo sequestrador de radicais livres N-acetil cisteína (NAC) sugere que a disfunção mitocondrial provocada por estes compostos está associada a estresse oxidativo e é provável que seja mediada pela ação de superóxido na cadeia respiratória nos níveis de complexos de I e II. Análise proteômica de mitocôndria dessas células também mostra alterações ligadas ao estresse oxidativo. Nossos dados em conjunto sugerem que cerulenina e orlistat induzem apoptose em células não tumorais como resultado de uma disfunção mitocondrial e de maneira independente de FASN Abstract: We have previously reported that the fatty acid synthase (FASN) inhibitors, cerulenin or orlistat, induce apoptosis in B16-F10 mouse melanoma cells mediated by mitochondria. Here we investigate the effects of these inhibitors on the non-tumorigenic mouse cell line melan-a. Cerulenin or orlistat treatment decreased cells proliferation, accompanied by increased amounts of the tumor suppressor protein p21WAF1/Cip1, as well as induced apoptosis, but not necrosis, in melan-a cell line. Mitochondrial cytochrome c release and activation of caspases-9 and -3 were detected in melan-a-treated cells. siRNAi for FASN did not culminate in apoptosis, and FASN inhibitors treatment did not alter free fatty acids content in the non-tumorigenic cells, as verified by mass spectrometry, suggesting that cerulenin or orlistat induces apoptosis independent on FASN inhibition. Analysis of energy-linked functions of melan-a mitochondria showed inhibition of respiration followed by large stimulation of superoxide production. Respiratory inhibition after cerulenin or orlistat treatment, respectively, was restricted to the oxidation of NADH-linked substrates (39.9 or 60,8%) and succinate (45.8 or 51.8%) and was not significant when mitochondria were respiring on the complex IV substrate, N,N,N?,N?-tetramethyl-p-phenylendiamine. The protection conferred by the free radical scavenger NAC suggests that the mitochondrial dysfunction caused by these compounds is associated with oxidative stress and is mediated by the action of superoxide on the respiratory chain at the levels of complexes-I and II. Proteomic analysis of mitochondria melan-a cells also indicate major changes linked to oxidative stress. Taken together, the present results show that cerulenin or orlistat induces apoptosis in non-tumorigenic cells via mitochondrial dysfunction, independent on FASN inhibition Doutorado Fisiopatologia Médica Doutor em Ciências

Orientador: Roger Frigério Castilho Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A capacidade do sistema transportador de elétrons mitocondrial em células intactas é estimada pela taxa máxima de consumo de oxigênio (OCRmax) induzida por protonóforos. Esta estimativa geralmente é precedida pelo uso de inibidores da ATP sintase. O presente trabalho objetivou reportar e elucidar o mecanismo pelo qual inibidores da ATP sintase causam subestimação do OCRmax e, consequentemente, da capacidade de reserva respiratória (SRC, diferença entre o OCRmax e basal). Ainda, objetivou-se o estabelecimento de um protocolo experimental que permitisse a estimativa do OCRmax na presença de inibidores da ATP sintase. Os experimentos foram realizados com linhagens de células, sendo a maior parte deles com células originárias de glioblastoma humano (T98G e U-87MG). O consumo de oxigênio por células em suspensão foi estimado em oxígrafo de alta resolução equipado com eletrodo de Clark, enquanto para células aderidas utilizou-se um sistema automatizado de leitura de placas contendo sensores de detecção fluorimétrica de oxigênio. Os resultados demonstraram que a presença dos inibidores da ATP sintase oligomicina (0,3¿3 µg/mL) ou citreoviridina (20 µM) leva a subestimação do OCRmax com consequente diminuição do SRC em células em suspensão ou aderidas, em meio contendo 5,5 ou 11 mM de glicose. A presença ou ausência de bicarbonato de sódio e soro fetal bovino durante as análises não teve influência no efeito inibitório de bloqueadores da ATP sintase no OCRmax, bem como no SRC. O efeito inibitório da oligomicina sobre o OCRmax foi abolido quando somente glutamina foi utilizada como substrato respiratório ou quando o inibidor glicolítico 2-deoxi-glicose esteve presente. A concentração de ATP diminuiu e a razão ADP/ATP aumentou em células tratadas com protonóforos, mas essas alterações foram minimizadas quando a oligomicina esteve presente. Este efeito da oligomicina indica a participação da atividade reversa da ATP sintase na diminuição dos níveis de ATP e aumento da razão ADP/ATP em células tratadas com protonóforos. Tal conclusão foi corroborada utilizando-se duas concentrações de citreoviridina, onde uma baixa concentração (5 µM), que afeta apenas a atividade de síntese da ATP sintase não levou a subestimação do OCRmax, enquanto uma alta concentração (20 µM), que inibe tanto a atividade de síntese como o reverso da ATP sintase, resultou em subestimação do OCRmax. A exposição de células permeabilizadas com digitonina a ATP exógeno, mas não a ADP, resultou em inibição parcial do OCRmax induzido por protonóforos. Por fim, foi estabelecido que uma adição prévia de 2-deoxi-glicose à titulação do protonóforo, mesmo após a inibição do OCR basal pela oligomicina, permite que os parâmetros OCRmax e SRC sejam determinados sem o efeito inibitório ocasionado por inibidores da ATP sintase. Concluímos que a subestimação do OCRmax e SRC quando há inibição da ATP sintase está associada a uma alta atividade glicolítica e que o ATP glicolítico pode ter um efeito inibitório sobre o metabolismo de substratos respiratórios e/ou na atividade da citocromo c oxidase. Diante de situações onde a mitocôndria está desacoplada por protonóforos, inibidores da ATP sintase preservam o ATP intracelular pela inibição da atividade reversa deste complexo Abstract: The capacity of the mitochondrial electron transport system in intact cells is frequently estimated by promoting protonophore-induced maximal oxygen consumption (maxOCR) preceded by the addition of the ATP synthase inhibitor oligomycin. This study sought to report and elucidate how ATP synthase blockers lead to underestimation of maxOCR and spare respiratory capacity (SRC, i.e. the difference between maxOCR and basal). Also, it was aimed to establish an experimental protocol that would allow the estimation of maxOCR in the presence of ATP synthase inhibitors. The experiments were performed with cell lines, mostly with human glioblastoma cell lines (T98G and U-87MG). The oxygen consumption by suspended cells was estimated in a high-resolution oxygraph equipped with a Clark electrode, while for attached cells an automated plate reader system equipped fluorimetric oxygen sensors was used. The results demonstrated that the presence of oligomycin (0.3-3.0 µg/mL) or citreoviridin (20 µM) led to underestimation of maxOCR and a consequent decrease in SRC values in suspended or attached cells in medium containing 5.5 or 11 mM glucose. The presence or absence of sodium bicarbonate and fetal bovine serum during analyzes had no influence on the inhibitory effect of ATP synthase blockers on maxOCR as well as on SRC. The inhibitory effect of oligomycin on CCCP-induced maxOCR did not occur when glutamine was the metabolic substrate or when the glycolytic inhibitor 2-deoxy-glucose was present. ATP concentration was reduced and ADP/ATP ratio increased in cells treated with protonophores, but these changes were minimized when oligomycin was present. This effect of oligomycin suggests the participation of the reverse activity of ATP synthase in the decrease of ATP levels and increase in ADP/ATP ratio in protonophore-treated cells. This conclusion was corroborated by using two concentrations of citreoviridin, where a low concentration (5 ?M), which only affects the forward activity of ATP synthase, did not lead to underestimation of maxOCR, whereas a high concentration (20 ?M), which inhibits both the forward and reverse activity of ATP synthase, resulted in an underestimation of maxOCR. Exposing digitonin-permeabilized cells to exogenous ATP, but not ADP, resulted in partial inhibition of protonophore-induced maxOCR. Finally, it was established that an addition of 2-deoxy-glucose previous to protonophore titration, even after inhibition of basal OCR by oligomycin, allows the determination of maxOCR and SRC without the inhibitory effect caused by oligomycin. We conclude that underestimation of maxOCR and SRC in tumor cells when ATP synthase is inhibited is associated with high glycolytic activity and that the glycolytic ATP yield may have an inhibitory effect on the metabolism of respiratory substrates and cytochrome c oxidase activity. Under conditions where mitochondria are uncoupled by protonophores, inhibitors of ATP synthase preserve intracellular ATP levels by inhibiting the reverse activity of this complex Doutorado Fisiopatologia Médica Doutora em Ciências FAPESP 2011/50400-0 FAPESP; 2017/17728-8 CAPES

Orientadores: Anibal Eugênio Vercesi, Helena Coutinho Franco de Oliveira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: No tratamento da hipercolesterolemia familiar, os medicamentos mais prescritos são as estatinas, de modo que, sua principal ação consiste em inibir a via de biossíntese do colesterol. Estudos anteriores relatam o aumento do estresse oxidativo e da transição de permeabilidade mitocondrial (TPM) em diversos modelos experimentais submetidos a diversos tipos de tratamentos com estatinas. O objetivo do presente estudo foi investigar se o tratamento crônico com a pravastatina induz hepatotoxicidade em camundongos knockout para o receptor de LDL (LDLr -/-), um modelo para a hipercolesterolemia familiar humana. Foram avaliadas as taxas de respiração e produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), liberação de cálcio mitocondrial sensível à ciclosporina A, atividades das enzimas antioxidantes em mitocôndrias de fígado ou homogenatos obtidos de camundongos LDLr-/- tratados com pravastatina por três meses. Observamos que a pravastatina induziu o aumento da taxa de produção de H2O2 (40%), a diminuição da atividade da aconitase (28%), enzima do ciclo de Krebs sensível ao superóxido e o aumento da susceptibilidade a TPM induzida por Ca2+ (32%) nas mitocôndrias do fígado. Entre várias enzimas antioxidantes, apenas a atividade da glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) foi aumentada (44%) no fígado de camundongos tratados. O conteúdo total de glutationa e a razão de glutationa reduzida pela oxidada foram aumentados nos fígados de camundongos tratados com pravastatina (1,5 e 2 vezes, respectivamente). A presença de espécies lipídicas oxidadas foi detectada no grupo da pravastatina, mas os marcadores de oxidação protéica (grupos carbonila e SH-) não foram alterados. A suplementação dietética com os antioxidantes CoQ10 ou creatina reverteu totalmente todos os efeitos da pravastatina (redução na geração de H2O2, suscetibilidade a TPM e aconitase normalizada e atividade da G6PD). Em conjunto, esses resultados sugerem que 1- a pravastatina induz desequilíbrio redox mitocondrial hepático que pode explicar os efeitos colaterais hepáticos relatados em um pequeno número de pacientes, e 2- o co-tratamento com antioxidantes seguros neutraliza esses efeitos colaterais Abstract: Statins are the preferred therapy to treat hypercholesterolemia. Their main action consists of inhibiting the cholesterol biosynthesis pathway. Previous studies report mitochondrial oxidative stress and membrane permeability transition (MPT) of several experimental models submitted to diverse statins treatments. The aim of the present study was to investigate whether chronic treatment with the hydrophilic pravastatin induces hepatotoxicity in LDL receptor knockout mice (LDLr-/-), a model for human familial hypercholesterolemia. We evaluated respiration and reactive oxygen production rates, cyclosporine-A sensitive mitochondrial calcium release, antioxidant enzyme activities in liver mitochondria or homogenates obtained from LDLr-/- mice treated with pravastatin for three months. We observed that pravastatin induced higher H2O2 production rate (40%), decreased activity of aconitase (28%), a superoxide-sensitive Krebs cycle enzyme, and increased susceptibility to Ca2+-induced MPT (32%) in liver mitochondria. Among several antioxidant enzymes, only glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) activity was increased (44%) in the liver of treated mice. Total glutathione content and reduced to oxidized glutathione ratio were increased in livers of pravastatin treated mice (1.5- and 2-fold, respectively). The presence of oxidized lipid species were detected in pravastatin group but protein oxidation markers (carbonyl and SH-groups) were not altered. Diet supplementation with the antioxidants CoQ10 or creatine fully reversed all pravastatin effects (reduced H2O2 generation, susceptibility to MPT and normalized aconitase and G6PD activity). Taken together, these results suggest that 1- pravastatin induces liver mitochondrial redox imbalance that may explain the hepatic side effects reported in a small number of patients, and 2- the co-treatment with safe antioxidants neutralize these side effects Doutorado Fisiopatologia Médica Doutora em Ciências FAPESP 2011/50400-0, 2017/17728-8 CAPES CNPQ

Orientadores: Anibal Eugênio Vercesi, Fernanda Garcia Sampaio Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Nosso trabalho teve como objetivo caracterizar a bioenergética mitocondrial do Pacu tendo como referência mitocôndrias de ratos e verificar os efeitos do sulfato de cobre nas mitocôndrias desses animais. Os animais foram mantidos em condições padrões de laboratório. O isolamento de mitocôndrias hepáticas foi realizado utilizando-se técnica padrão. As medidas de consumo de oxigênio foram realizadas em oxígrafo com eletrodo do tipo Clark. A atividade da enzima citrato sintase foi realizada por leitura de absorbância em leitor de microplacas. As medidas de potencial de membrana, captação e retenção de cálcio e metabolização de peróxido orgânico foram realizadas em espectrofluorímetro. Não houve diferença no controle respiratório, embora o consumo de oxigênio e a razão ADP/O tenham sido menores nas mitocôndrias de pacu. Ambas as mitocôndrias foram capazes de desenvolver e sustentar potencial de membrana na mesma ordem de grandeza. As mitocôndrias de pacu apresentaram uma maior afinidade pelo ADP, necessitam de uma quantidade maior de FCCP para desacoplamento da cadeia respiratória e possuem uma menor atividade da enzima citrato sintase. Apesar das mitocôndrias de pacu terem sido capazes de captar e reter uma maior quantidade de íons cálcio na presença de fosfato inorgânico, o mesmo não foi observado na presença de acetato. Observamos que as mitocôndrias de pacu possuem uma quantidade menor de NAD(P) e a metabolização de peróxido orgânico ocorre de forma mais lenta nessas mitocôndrias. As mitocôndrias de pacu apresentaram uma IC50 menor para o sulfato de cobre, porem em ambos os animais as mitocôndrias apresentaram respostas semelhantes na presença do composto. Nossos maiores achados foram as diferenças na afinidade pelo ADP, a maior habilidade de captação de retenção de cálcio pelas mitocôndrias de pacu e a inibição da respiração causada pelo sulfato de cobre. Essas diferenças nos permitem propor que a alta afinidade pelo ADP pode estar relacionada à capacidade desses animais de sobreviver em ambientes sujeitos à grandes flutuações na concentração de oxigênio dissolvido bem como a menor susceptibilidade a TPM poderia representar um mecanismo de defesa destes peixes de viver em ambientes poluídos. A inibição causada pelo sulfato de cobre demonstra que esse composto é um importante poluente em ambientes aquáticos, capaz de inibir a fosforilação oxidativa e consequentemente a produção de energia Abstract: Our study had as objective to characterize the mitochondrial bioenergetics of Pacu having as reference mitochondria of rats and investigate the effects of copper sulfate in the mitochondria of these animals. The animals were kept in standard laboratory conditions. The isolation of liver mitochondria was performed using standard technique. The oxygen consumption measurements were performed in oxigrafo with type Clark electrode. The citrate synthase enzyme activity was performed by reading absorbance microplate reader. The membrane potential steps, calcium uptake and retention, and metabolism of organic peroxide were conducted in spectrofluorimeter. There was no difference in respiratory control, although the oxygen consumption and the ADP/O ratio were lower in the pacu mitochondria. Both mitochondria were able to develop and maintain the membrane potential in the same order of magnitude. The pacu mitochondria exhibited a greater affinity for ADP, require a greater amount of FCCP to uncoupling of the respiratory chain and have a lower activity of citrate synthase enzyme. Despite the mitochondria of pacu were able to capture and retain a greater amount of calcium ions in the presence of inorganic phosphate, the same result was not observed in the presence of acetate. We observed that pacu mitochondria possess a lesser amount of NAD(P) and metabolization of the organic peroxide occurs more slowly in these mitochondria. The pacu mitochondria had a lower IC 50 for copper sulfate, however, in both animals mitochondria showed similar responses in the presence of the compound. Our main findings were the differences in affinity for ADP, the greater ability retention of calcium uptake into pacu mitochondria and respiration inhibition caused by copper sulfate. These differences allow us to propose that the high affinity for ADP may be related to the ability of these animals to survive in environments subject to large fluctuations in the dissolved oxygen concentration and the lower susceptibility to MPT could represent a defense mechanism of these fish to live in polluted environments. The inhibition caused by copper sulfate demonstrates that this compound is an important pollutant in aquatic environments, capable of inhibiting the oxidative phosphorylation and hence the energy production Mestrado Fisiopatologia Médica Mestra em Ciências CNPQ 132830/2014-1 FAPESP

I The stability of a biological membrane depends on its biochemical composition. The membranes are formed by a lipid bilayer where proteins are integrally or peripherically embedded. The intrinsic stabilities of the lipid bilayer and membrane proteins will determine the overall stability of the membrane. In this literature review, we discuss some factors that can affect the membrane stability, as the nature of the fatty acids present in the membrane lipids and the effect of chaotropic and stabilizing solutes. An emphasis is given to the action of ethanol on the biological membranes. ABSTRACT - II Amostras de sangue provenientes de 12 voluntários do gênero masculino (20-28 anos) foram incubadas com 0 a 34 g.dl-1 de etanol e estudadas por espectrofotometria e microscopia de luz. Em 1.56 g.dl-1 de etanol os eritrócitos foram visualizados em um estado intacto ou expandido (R), e em 25 g.dl-1 de etanol, os eritrócitos apareceram em um estado contraído ou apertado (T), embora algumas estruturas sofreram ruptura nesta concentração de etanol. A dependência da percentagem de hemólise com a concentração de etanol mostrou três transições de natureza sigmoidal em toda extensão da concentração de etanol: uma desnaturação (D50R), uma estabilização (S50) e outra transição de desnaturação (D50T), com seus respectivos pontos médios em 11,17±0,078 (D50R), 20,73±0,056 (S50) e 27,20±0,097 g.dl-1 (D50T) de etanol em 0.9% de NaCl. A incubação com 0.6% de NaCl alterou os valores de D50R, S50 e o D50T para 10,35±0,25 (P